CN107043803A - 药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物学检测方面的质量控制领域，特别涉及一种药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品及其制备方法。药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品包括目标菌群和背景菌群，所述目标菌群由霉菌和酵母菌组成，所述背景菌群由大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌组成。本发明均匀性、稳定性符合能力验证要求，可以最大程度保证测试样品的稳定性；样品的制备方法，工艺简单，成功率高。

Description

药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物学检测方面的质量控制领域，特别涉及一种药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品及其制备方法。
背景技术
药品微生物学检验领域非常特殊。目前，虽然国内外已有认可机构组织药品微生物 学能力验证的先例，但针对霉菌和酵母菌总数计数样品制备方法，以及均匀性和稳定性研究 的数据却并不详尽，即霉菌和酵母菌总数计数标准样品仍属空白领域。
霉菌在自然界分布极广，土壤、水域、空气、动植物体内外都可生长霉菌，霉菌和酵母也可造成中腐败变质。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。如果制备的霉菌和酵母菌总数计数样品中，目标菌群易发生变化(繁殖和死亡等)，就会导致样品的保存期短，样品的均匀性和稳定性差。因此，综合考虑 细菌的生化特性，选取性质相对稳定的菌群作为目标菌群对保证样品的均匀性和稳定性十分重要。霉菌和酵母菌总数计数样品制备的工艺技术要求比较高，并且样品的均匀性和稳定性 与冻干的菌种、冻干的工艺条件、冻干保护剂的使用、再水化的介质等均有密切的关系。
药品中霉菌和酵母菌总数计数指标，直接反映着药品的卫生质量与潜在致病风险。如果霉菌和酵母菌总数计数数超过一定限量，会导致患者感染甚至有致命的风险。因此，制备均匀性与稳定性俱佳的霉菌和酵母菌总数计数样品，可以避免霉菌和酵母菌总数计 数检验的随意性和不确定性，真实地反映检测实验室的能力。这对提高实验室质量控制水 平，保障药品安全，甚至于打破国际贸易壁垒、提高我国药品国际竞争力都具有特殊重要的 意义。
发明内容
本发明的目的是克服霉菌和酵母菌总数计数测定样品中总的活的细菌数目在运输、储存和测试等过程中菌落数都可发生变化的问题，提供一种药品中霉菌和酵母菌总数计 数能力验证样品，均匀性、稳定性符合能力验证要求，本发明的另一个目的是提供该样品的 制备方法，工艺简单，成功率高。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验 证样品，其特征是：包括目标菌群与背景菌群，所述目标菌群为药品中或生产过程中易污染 的霉菌和酵母菌，所述背景菌群由大肠埃希菌(E.coil)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapnenmoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)组成。
所述霉菌为黑曲霉(Aspergillusnige)、酵母菌为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
所述样品以海藻糖、脱脂奶粉和无菌水为基质，其中海藻糖的体积分数为12％、脱脂奶粉的体积分数为0.5％。
所述样品中目标菌群的目标浓度为102～103CFU/mL，背景菌群的目标浓度为102CFU/mL。
一种药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品的制备方法，其特征是：包括样品 添加菌株的选择、冻干保护剂的配制、样品冻干、样品的均匀性和稳定性试验四个步骤，其 中样品冻干过程为：菌株复苏传代—增菌—菌悬液配制—冻干和包装—储存，具体过程为： (1)菌株复苏传代
将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株 进行鉴定；
(2)增菌
目标菌群培养至对数生长期末，背景菌群培养至稳定期，从斜面刮取菌落，加到10mL的冻 干保护剂中制成相应单一菌种的菌液；
(3)菌悬液配制
将上一过程得到的菌液与冻干保护剂混合，按目标菌群的目标浓度102～103CFU/mL和背景 菌群的目标浓度102CFU/mL配制菌悬液，分别配制2个目标菌的菌悬液和4个背景菌的菌 悬液，分别按1:1体积比混合形成目标菌群悬液和背景菌群悬液，再将目标菌群悬液与背景 菌群悬液按1:1体积比混合，得到混合菌悬液，置于磁力搅拌器上不断搅拌下分装到样品瓶 中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要盖实；
(4)冻干和包装
将装有混合菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中，冷冻干燥40～50h，当样品冷冻干燥结束 后，直接进行箱内加塞，关闭机器，样品瓶中样品为真空状态；
(5)储存
将样品放置在-18℃条件下避光保存，从全部样品中随机挑选样品进行均匀性和稳定性试 验，满足要求后发放给参试实验室进行实验室间比对。
所述冻干保护剂为含有海藻糖和脱脂奶粉的无菌水，其中体积分数分别为：海藻糖12％、脱脂奶粉0.5％。
所述样品的均匀性和稳定性试验按照CNAS—GL03《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》进行。
本发明菌种的选择采用黑霉菌、酿酒酵母作为霉菌和酵母菌总数计数样品的目标菌群，以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌作为背景菌群。以黑霉菌、酿酒酵母作为目标菌群，可以最大程度保证测试样品的稳定性，即使在运输及储存中大肠埃希菌的含量发生变化，在统计学意义上也不会影响霉菌和酵母菌总数计数的总量。
本发明的霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品具有以下优势特性：活的微生物、数 量不发生变化、生化特征不发生变异，从满足特殊运输的条件着手，通过特殊工艺的研究、 稳定性和均匀性的研究等形成一套完善的能力验证的样品制备技术，完全适合开展药品中霉 菌和酵母菌总数计数(定量)项目的考核，正确评价能力验证结果。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
图2为4℃条件下样品霉菌和酵母菌总数计数的稳定性试验结果图。
图3为在不同温度下样品的稳定性试验结果图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明并不局限于具体 实施例。
实施例1
药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品，包括目标菌群与背景菌群，所述目标菌群由黑 曲霉(Aspergillusnige)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)组成，所述背景菌群由大肠 埃希菌(E.coil)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapnenmoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)组成。
所述样品以海藻糖、脱脂奶粉和无菌水为基质，其中海藻糖体积分数为12％、脱脂奶粉体积分数为0.5％。
所述样品中目标菌群的浓度为102～103CFU/mL，背景菌群的浓度为102CFU/mL。
实施例2
如图1所示，一种实施例1中药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品的制备方法，包括 样品添加菌株的选择、冻干保护剂的配制、样品冻干、样品的均匀性和稳定性试验四个步 骤，具体步骤如下：
1、样品添加菌株的选择
按照目标菌群：黑曲霉(Aspergillusnige)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，背景菌 群：大肠埃希菌(E.coil)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapnenmoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)选择标准菌株，所有标准菌株均购于政府指定的机构，并附有菌株证书，保证了菌株的溯源性。
2、冻干保护剂的配制
样品以海藻糖、脱脂奶粉和无菌水为基质(体积分数：海藻糖12％，脱脂奶粉0.5％)配制 冻干保护剂。
3、样品冻干
(1)菌株复苏传代
将标准菌株接种到营养琼脂培养基中，在36±1℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行 鉴定；
(2)增菌
目标菌群培养至对数生长期末，背景菌群培养至稳定期，从斜面刮取菌落，得到含有相应单 一菌种的菌液；
(3)菌悬液配制
将上一过程得到的菌液与冻干保护剂混合，按目标菌群的目标浓度102～103CFU/mL和背景 菌群的目标浓度102CFU/mL配制菌悬液。为保证得到的最终样品中含有以上目标浓度的菌 株，本实施例中按照目标菌103CFU/mL分别配制2个目标菌的菌悬液，按1:1体积比混合，形成目标菌群悬液；背景菌按102CFU/mL配制4个背景菌的菌悬液，按1:1体积比混 合，形成背景菌群悬液；背景菌群悬液与目标菌群悬液按1:1体积比混合，得到混合菌悬 液，采用比浊法检查菌株含量；置于磁力搅拌器上不断搅拌下取1.0mL分装到样品瓶(西林 瓶)中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要盖实；
(4)冻干和包装
将装有混合菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中，冷冻干燥机参数按如下设置：
冷冻速度(CoolingRate)0.5℃/min
早期冷冻点(IncipientFreezingPoint)-1℃15min
冷冻温度(Coolingtemperature)-40℃
共熔点(MeltingPointEutectictemperature)-29℃
加热温度(Heatingtemperature)20℃120min
启动冷冻干燥机，机器直接进入程序化的冷冻干燥过程，整个冻干过程40h；
当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞；关闭机器。剔除塞子不紧的西林瓶，西林瓶中样品为真空状态；
(5)储存
将样品放置在-18℃条件下避光保存，并对保存的样品进行适当管理和检测，从全部样品中 随机挑选样品进行均匀性和稳定性试验，满足要求后发放给参试实验室进行实验室间比对。
4、样品的均匀性和稳定性试验
对样品中目标菌的均匀性和稳定性检查是验证样品制备过程有效性的主要方法。检查样品均 匀性和稳定性按照CNAS—GL03《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》进行。
所得样品均匀性和稳定性检测方法及结果如下：
分别随机选取12个样品，采用中国药典2015年版四部通则1105非无菌产品微生物限度检 查：微生物计数法，在重复条件测试2×12份样品的霉菌和酵母菌总数计数。结果数据用单 因素方差分析(ANOV)进行统计处理，统计步骤及结果如下：
表1方差分析公式
上表中，
表2样品均匀性检测结果
表3样品均匀性试验方差分析结果
结论：在95％置信概率下，与其他因素对测试结果的影响相比，样品的不均匀性是可接受 的。
采用两种类型的稳定性试验：一种是在短期贮存温度(4℃)下的稳定性试验，另一种 是在高的温度(模拟样品的运输条件)下的稳定性试验，选用三个温度点，分别为20℃、36℃和45℃。定期检测样品，针对不同温度点不同的保存时间测试3个样本，将2×3份样 品结果的均值(对数转化后)与均匀性测试结果比较，之间的绝对差值除以测试计划中能力评价用稳健标准差S*，比值小于0.3为原则确定在不同温度条件下符合能力验证样品要求的 最长保存时间。稳定性试验结果见图2和图3。
实施例3
本实施例中所述的药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品的制备方法的各步骤均与 实施例2中相同，不同的技术参数为：菌株培养基选用营养琼脂斜面培养基；菌悬液配制 中，目标菌群悬液中各目标菌的浓度按照5×103CFU/mL配制，背景菌群悬液中各背景菌的 浓度按照103CFU/mL配制；冻干过程45h。
实施例4
本实施例中所述的药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品的制备方法的各步骤均与实施 例3中相同，不同的技术参数为：菌悬液配制中，目标菌群悬液中各目标菌的浓度按照4.5 ×103CFU/mL配制；冻干过程50h。

Claims (7)

1.药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品，其特征是：包括目标菌群与背景菌群，所述目标菌群为药品中或生产过程中易污染的霉菌和酵母菌，所述背景菌群由大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌组成。
2.根据权利要求1所述的药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品，其特征是：所述霉菌为黑曲霉、酵母菌为酿酒酵母。
3.根据权利要求1所述的药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品，其特征是：所述样品以海藻糖、脱脂奶粉和无菌水为基质，其中海藻糖的体积分数为12％、脱脂奶粉的体积分数为0.5%。
4.根据权利要求1或2所述的药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品，其特征是：所述样品中目标菌群的目标浓度为102～103 CFU/mL，背景菌群的目标浓度为102 CFU/mL。
5.根据权利要求1所述的药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品的制备方法，其特征是：包括样品添加菌株的选择、冻干保护剂的配制、样品冻干、样品的均匀性和稳定性试验四个步骤，其中样品冻干过程为：菌株复苏传代—增菌—菌悬液配制—冻干和包装—储存，具体过程为：
（1）菌株复苏传代
将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定；
（2）增菌
目标菌群培养至对数生长期末，背景菌群培养至稳定期，从斜面刮取菌落，加到10mL的冻干保护剂中制成相应单一菌种的菌液；
（3）菌悬液配制
将上一过程得到的菌泥与冻干保护剂混合，按目标菌群的目标浓度102～103 CFU/mL和背景菌群的目标浓度102 CFU/mL配制菌悬液，分别配制2个目标菌的菌悬液和4个背景菌的菌悬液，分别按1:1体积比混合形成目标菌群悬液和背景菌群悬液，再将目标菌群悬液与背景菌群悬液按1:1体积比混合，得到混合菌悬液，置于磁力搅拌器上不断搅拌下分装到样品瓶中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要盖实；
（4）冻干和包装
将装有混合菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中，冷冻干燥40～50h，当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞，关闭机器，样品瓶中样品为真空状态；
（5）储存
将样品放置在-18℃条件下避光保存，从全部样品中随机挑选样品进行均匀性和稳定性试验，满足要求后发放给参试实验室进行实验室间比对。
6.根据权利要求5所述的药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品的制备方法，其特征是：所述冻干保护剂为含有海藻糖和脱脂奶粉的无菌水，其中体积分数分别为：海藻糖12%、脱脂奶粉0.5%。
7.根据权利要求5所述的药品中霉菌和酵母菌总数计数能力验证样品的制备方法，其特征是：所述样品的均匀性和稳定性试验按照CNAS—GL03《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》进行。
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