CN116499839B - 一种含有赭曲霉毒素a的葡萄酒基质标准样品及其制备方法 - Google Patents
一种含有赭曲霉毒素a的葡萄酒基质标准样品及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品及其制备方法，属于食品检测技术领域。制备方法经过葡萄的清洗、除梗破碎、分离残渣汁液、分别接种培养、残渣灭菌冻干粉碎、混匀葡萄酒与冻干粉、低温膜过滤、二次混匀、包装等一系列步骤制成，该法制备的基体标准样品经过了严格的均稳性检验，具有均匀性好、稳定性高的优点。经检验证明，本标准品无论是在冷冻还是高温情况下运输均可以保证产品质量，满足不同区域的运输要求，保质期长，是一种有效可靠的实体标准样品，可用于相关的检测分析领域的质量控制，还可作为一种手段对参加检测的实验室或技术人员的分析能力进行认证考核，具有显著的经济价值和市场竞争力。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品及其制备方法，属于食品检测技术领域。
背景技术
赭曲霉毒素A（OTA）主要由曲霉属或青霉属的一些真菌产生，是一种无色结晶化合物，可溶于极性有机溶剂和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水。其苯溶剂化物熔点94～96℃，二甲苯中结晶熔点169℃，有很高的化学稳定性和热稳定性。赭曲霉毒素A是一种毒性较强的真菌毒素，被国际癌症研究机构归为对人类可能致癌的毒素（2B）。
OTA污染的问题经常发生。根据有关报道，我国葡萄酒中OTA的含量范围为0.1～5.65μg/L。葡萄酒中的OTA会通过影响酵母菌的生长代谢而给产品品质带来不利影响。我国在发布的国标GB2761-2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中也规定了葡萄酒中OTA的最大限量值为2.0μg/kg。因此对葡萄酒中赭曲霉毒素A进行检测是十分有必要的。目前的质量控制手段是将待测葡萄酒样品中添加纯的赭曲霉毒素A标准品后进行检测分析，但这种方式会受标准品的准确度和实验人员的操作能力的影响，而且由于OTA大部分是因为吸附作用残存在固体果渣和生物体中，直接加标的方式无法真实反映毒素在葡萄酒中的存在状态，因此方法的准确性不能得到保证。目前，已有研究证明在葡萄酒的罐装储存过程中也会有一定程度OTA降解，这使得OTA在葡萄酒基质中长期真实且稳定存在较为困难。因此需要研发一种以葡萄酒为基体的赭曲霉毒素A标准样品作为检测的质控手段。
发明内容
本发明的目的是，针对现有技术存在的问题，本发明提供一种含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品的制备方法，该法经过葡萄的清洗、除梗破碎、分离残渣汁液、分别接种培养、残渣灭菌冻干粉碎、混匀葡萄酒与冻干粉、低温膜过滤、二次混匀、包装等一系列步骤制成，该法制备的基体标准样品经过了严格的均稳性检验，具有均匀性好、稳定性高的优点。
本发明的另一目的是，提供一种含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品，具有均匀性好、稳定性高的优点。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，将炭黑曲霉菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上培养，待充分产孢后，洗下孢子，过滤除掉菌丝，得到孢子菌悬液；然后用无菌水调节菌悬液浓度为1×106个/mL备用；
步骤二，取成熟葡萄，用酒精清洗灭菌；
步骤三，将表面晾干后的葡萄进行除梗，再对葡萄进行破碎，破碎后的葡萄进行压榨，分离汁液与残渣；
步骤四，将制备好的菌悬液均匀喷洒在残渣表面，在25℃的无菌培养箱中培养7天，残渣厚度为1cm，菌悬液喷洒量为1mL/cm2；
步骤五，将培养后的残渣经121℃、20分钟灭菌后，待冷却至室温后，进行冷冻干燥，冻干后粉碎，过30目筛子，筛下物混匀后，得到冻干粉；
步骤六，将酵母活化后，按0.1g/L接种至汁液中发酵，发酵温度15-20℃，不密封发酵8天后，添加乙醇溶液调整酒精度为16%，4℃贮藏，获得发酵葡萄酒；
步骤七，将冻干粉与发酵葡萄酒混匀，发酵葡萄酒和冻干粉的混合比例为75mL发酵葡萄酒/g冻干粉，混匀后在2-4℃下过滤，获得葡萄酒；
步骤八，将葡萄酒进行二次混匀搅拌，灌装后置于2~8℃下冷藏保存。
步骤一中，炭黑曲霉菌的培养温度为25℃，培养时间为6天；过滤为用无菌纱布过滤。
步骤二中，酒精的浓度为75%。
步骤三中，破碎的方法为采用破壁机进行破碎；压榨的方法为采用压榨机进行压榨。
步骤五中，灭菌的方法为采用高压灭菌锅进行灭菌；冷冻干燥的方法为：-80℃冰箱预冻10h、-40℃冷冻干燥1h、-30℃冷冻干燥4h、-20℃冷冻干燥8h、-10℃冷冻干燥8h、0℃冷冻干燥4h、10℃冷冻干燥2h、20℃冷冻干燥1h；粉碎的方法为：刀质粉碎机中，以2000r/min，粉碎30min；筛下物混匀的方法为：用高效混合机以1000r/min混合20min。
步骤六中，酵母为X16菌株，酵母活化方法为：在35℃下活化2h。
步骤七中，混匀的方法为：通过顶置搅拌器500r/min搅拌30min。
步骤七中，过滤的方法为：通过板式膜过滤器过膜过滤，板式膜过滤器的滤膜为聚四氟乙烯PTFE滤膜，滤膜的大小为0.35-10μm。
步骤二中，葡萄种类包括赤霞珠。
本发明的制备方法获得的含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品，其特征在于，标准样品在4-50℃储存环境下有效期为6个月，标准值为4.00μg/kg。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供了一种葡萄酒中赭曲霉毒素A基体标准样品的制备方法，结合按照葡萄酒的生产过程，经过葡萄的清洗、除梗破碎、分离残渣汁液、分别接种培养、残渣灭菌冻干粉碎、混匀葡萄酒与冻干粉、低温膜过滤、二次混匀、包装等一系列步骤制成。本发明制备的基体标准样品经过了严格的均稳性检验，具有均匀性好、稳定性高的优点。经检验证明，本标准品无论是在冷冻还是高温情况下运输均可以保证产品质量，满足不同区域的运输要求，保质期长，是一种有效可靠的实体标准样品，可用于相关的检测分析领域的质量控制，还可作为一种手段对参加检测的实验室或技术人员的分析能力进行认证考核，具有显著的经济价值和市场竞争力。
2.本发明的含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品将主要应用于实验室能力验证、内部质控、方法验证等活动；有助于实验室质量控制，使定量检测结果准确性得到保证；有助于加强葡萄酒生产质量安全控制，提升检验检测机构农药残留检测水平。
3.均匀性是标准物质的基本属性。真实的实物标准样品由于其制备方法困难，投入资金高，投入时间长，目标成分代谢规律不明确等等多种因素影响，要获得均匀性合格的标准样品比较困难。而本发明确定了在规定的条件下，对葡萄压榨后的汁液和残渣分离处理，通过添加配料、加压过滤工艺制备的样品能够获得较好的均匀性。
4.稳定性也是标准物质的基本属性，标准样品从制备到使用涉及贮存和运输过程，这可能会导致标准样品稳定性的变化，因此需要进行两方面的稳定性评估，一是依据样品包装和运输的形式，选择短期稳定性评估的温度。通常是在不同的温度条件下进行，考察温度对于标准物质特性值的影响；二是在规定的贮存条件下，在较长周期内定期对标准物质特性值进行检测，考察其保持在规定范围内的能力。按本发明制备的标准样品短期稳定性和长期稳定性均符合要求，在4-50℃储存环境下有效期为6个月。本发明实施例1的A样品经8家实验室检测，确定标准值为4.00μg/kg。
附图说明
图1为本发明含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品上机图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
在不同工艺参数下制备含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品：
A组：一种含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品的制备方法，其具体制备方法如下：
从山东烟台选购同一时间采集的赤霞珠种类葡萄，挑选成熟度良好的葡萄，将其用75%酒精清洗灭菌晾干后，将晾干后的葡萄进行人工除梗，采用破壁机对葡萄进行破碎，破碎后的葡萄通过压缩机进行压榨，分离汁液与残渣备用。将炭黑曲霉菌在培养基平板（马铃薯葡萄糖琼脂培养基（广东环凯））上培养，培养温度为25℃，培养时间为6天，待充分产孢后，洗下孢子，用无菌纱布过滤除掉菌丝，得到孢子菌悬液，然后再用无菌水调节菌悬液浓度为1×106个/mL备用。将制备好的菌悬液均匀喷洒在残渣表面，残渣厚度为1cm，喷洒量为1mL/cm2，在25℃的无菌培养箱中培养7天。将残渣经高压灭菌锅121℃20分钟灭菌后，待冷却至室温后，进行冷冻干燥，冻干程序为-80℃冰箱预冻10h、-40℃冷冻干燥1h、-30℃冷冻干燥4h、-20℃冷冻干燥8h、-10℃冷冻干燥8h、0℃冷冻干燥4h、10℃冷冻干燥2h、20℃冷冻干燥1h。冻干后移入刀质粉碎机中，以2000r/min，粉碎30min，粉碎成粉末，过30目筛子，筛下物用高效混合机以1000r/min混合20min，得到冻干粉。在葡萄汁（即汁液）中按0.1g/L接种活化好的酵母（法国Laffort公司-X16菌株）发酵，发酵温度20℃，不密封发酵8天，酵母活化方法为在35℃下活化2h，发酵结束后，添加乙醇溶液调整酒精度为16%，4℃贮藏。将冻干粉与发酵后的葡萄酒通过顶置搅拌器500r/min搅拌30min混匀，每克冻干粉与75mL发酵后的葡萄酒混匀，混匀后在2℃通过板式膜过滤器加压过10μm滤膜。将葡萄酒进行二次混匀搅拌，顶置搅拌器500r/min搅拌20min，灌装后置于2℃下冷藏保存。
B组：与A组不同的是，B组不进行酒精度的调整。
C组：与A组不同的是，C组采用15μm的滤膜。
D组：与A组不同的是，D组采用0.3μm的滤膜。
E组：与A组不同的是，E组不进行二次混匀搅拌。
如图1所示，为本实施例的制备方法获得的含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品。
均匀性检验
对上述各组样品进行均匀性检验。检测方法采用GB 5009.96-2016《食品安全国家标准 食品中赭曲霉毒素A的测定》（第三法 免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法）。统计方法采用单因子方差统计分析法，通过采用F检验对三个水平样品进行均匀性检验。具体方法为从上述各组制备的样品中随机抽取30瓶，每个样品作为独立子样进行检测，每个子样也需进行三次平行结果测定，实验结果取平行测量的平均值。所有样品以随机次序在重复性条件下进行测试。
检验结果见表1-表5。
表1、A组样品均匀性评估测量结果记录表
表2、B组样品均匀性评估测量结果记录表
表3、C组样品均匀性评估测量结果记录表
表4、D组样品均匀性评估测量结果记录表
/>
表5、E组样品均匀性评估测量结果记录表
/>
稳定性检验
对满足均匀性要求的样品进行稳定性的检测，选择A组的样品进行实验。根据JJF1343-2022《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》确定稳定性检验的统计方法为t分析检验法，采用特性值随时间变化曲线来判断样品特性值是否具有单方向变化趋势，用线性拟合模型评估标准样品的稳定性。稳定性检测包含两个方面：长期稳定性（贮藏稳定性）和的短期稳定性（运输稳定性）。按照先密后疏的抽样原则进行抽样，其中短期稳定性共设置6个取样时间点，4℃、20℃、40℃贮藏，长期稳定性检测共设置6个取样时间点，2-8℃贮藏。每个取样时间点随机抽取A组的3个样品，每个样品做两次平行，取三个子样的平均值来分析A组样品中赭曲霉毒素A的含量。
检验结果见表6-表13。
表6、4℃下A组样品中赭曲霉毒素A短期稳定性结果
表7、20℃下A组样品中赭曲霉毒素A短期稳定性结果
表8、40℃下A组样品中赭曲霉毒素A短期稳定性结果
表9、A组样品中赭曲霉毒素A长期稳定性结果
表10、4℃下B组样品中赭曲霉毒素A短期稳定性结果
表11、20℃下B组样品中赭曲霉毒素A短期稳定性结果
表12、40℃下B组样品中赭曲霉毒素A短期稳定性结果
表13、B组样品中赭曲霉毒素A长期稳定性结果
通过样品的均匀性试验可以看出，D组的样品的检测结果低于定量限，赭曲霉毒素A损失程度过大，因此不具备作为标准样品的价值。将上述数据进行单因素方差分析，可得出以下方差分析结果：在置信概率为0.95，自由度f1=29，f2=60情况下，通过F检验表可以得出，F0.05（29，60）=1.65，A组和B组样品中F值<临界值F0.05（29，60），表明两组样品的组内和组间没有显著性差异，样品是均匀的，具备作为质量控制样品的要求。而C组、D组和E组样品中的F值均大于临界值F0.05（29，60），表明样品是不均匀的。A组、B组的稳定性试验可以看出，样品在短期时间内均保持稳定，但B组样品在长期稳定性试验中表现出不稳定。说明膜过滤、以及二次混匀对本方法最终制备的基质标准样品均匀性影响显著。
从表6-表9可以看出，采用本发明方法制备的A组样品在短期稳定性和六个月的长期稳定性考察中|b1|均小于 t0.95，n-2×s(b1)，该基体标准样品中的赭曲霉毒素A的含量趋于稳定，2-8℃储存环境下可确定为该基质标准样品的保存环境，有效期为6个月。
定值
依据JJF 1343-2022《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》的要求对A组的样品进行定值。采用8家实验室协同定值的方法进行该基质标准样品的定值，参加定值的实验室均为通过资质认定的实验室。检测结果需检测数据是否服从正态分布，其次用格拉布斯检验各实验室内的数据是否有可疑值，采用科克伦检验判断各实验室间的数据是否具有同等精度，在满足上述要求的情况下，数据才具有代表性，方可参与定值结果统计分析。
检验结果见表14。
表14、制备的A组标准样品实验室间测定数据
正态性检验采用夏皮洛-威尔克检验法，查表可得W(n，p)=0.842（其中n=10，p=0.95）。由于各家实验室数据经的W值均大于0.842。因此可以认为接受各家实验室检测数据为正态分布。
采用格拉布斯检验法检验各实验室组内检测结果是否具有可疑值，由格拉布斯临界值表可知λ（0.05,10）=2.290。结果表明检测结果最大残值绝对值均小于λ（0.05,10）*S，*代表乘号×，表明各家实验室定值结果之间无异常值，不存在可疑值，因此所有数据予以保留，可参与定值结果统计。
采用科克伦检验判定各家实验室定值结果之间是否等精度。科克伦检验要求C小于等于C(α,m,n)，表明各组数据平均值间为等精度，否则判定为离群值，计算定值结果时应去除该组数据。查临界表可知，C(0.05,8,10)=0.2829。表14显示科克伦检验的C值为0.1896，小于临界值，则实验室检测结果组间数据为等精度，所有数据应予以保留，可参与定值结果统计。8家实验室平均值检验结果见下表15。
表15、8家实验室平均值检验结果
根据JJF 1343-2022《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》的要求，在对各家实验室定值结果进行可疑值检验、等精度检验之后，还需对各家实验室定值结果的平均值检验是否存在显著性差异，是否满足数据分布的正态性。经计算，8家实验室平均值之间不存在显著性差异且符合正态性检验，数据满足统计要求，则A组制备的含赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品的标准值取各家实验室平均结果的均值，即A组制备的含赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品的标准值为4.00 mg/kg。
不确定度
根据JJF 1343-2022《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》，标准物质的定值结果的不确定度由3部分组成：标准物质不均匀性引起的不确定度Ubb、标准物质不稳定性引起的不确定度Usts、标准物质定值过程引起的不确定度Uchar。通过计算各部分的不确定度可以确定合成不确定度U（y），置信度为95%水平，扩展不确定度U为两倍的合成不确定度：
/>
均匀性引入的不确定度
根据JJF 1343-2022《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》，A组样品的瓶内方差小于样品的瓶间方差（ ），因此可估计得到瓶间均匀性标准偏差sbb等同于瓶间不均匀性导致的不确定度分量Ubb。故Ubb=0.00165mg/kg。但由于Ubb<s2，表明估计得到的瓶间标准偏差小于重复性标准偏差对瓶间标准偏差的影响，此时标准物质不均匀性导致的不确定性可用下述公式计算。
其中：
MSwithin--瓶间均匀性评估中的测量重复性方差；
n--组内测量次数；
--MSwithin的自由度。
经计算，最终得到的均匀性导致的不确定度分量Ubb为0.02931μg/kg。
稳定性引入的不确定度
根据JJF 1343-2022《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》的要求，实施例1的样品稳定性变化趋势不明显。采用趋势分析法进行稳定性检验时，可按照公式：Usts=s(β1)·X计算稳定性引入的不确定度。已知本次标准物质稳定性监测的s(β1)=0.00760 ，X=6个月，故Usts=0.0456μg/kg。
定值引入的不确定度
A组样品定值采用的方式为使用多种已确证准确性的方法，由多个实验室合作定值。每个实验室仅提供一系列的观测值。根据标准要求，原则上，此种定值模式下平均值的标准偏差就是定值不确定度Uchar。
s值是八家实验室定值结果均值的标准偏差，p值是参与定值定值实验室总数，为8，经计算，最终得出实验室联合定值引入的标准不确定度Uchar=0.0071μg/kg。
故计算可得总合成不确定度为U（y）为0.0547mg/kg，扩展不确定度U为0.1094mg/kg。A组的葡萄酒粉基质标准样品中赭曲霉毒素A的最终确定的特性值为4.00±0.1094μg/kg（k=2）。
实施例2
本实施例与实施例1中A组的区别仅在于：酵母发酵温度15℃；在4℃下通过板式膜过滤器过膜过滤；滤膜的大小为0.35μm。
本实施例获得的基体标准样品经过了严格的均稳性检验，具有均匀性好、稳定性高的优点。
应当理解，为了精简本公开并帮助理解各个发明方面中的一个或多个，在上面对本发明的示例性实施例的描述中，本发明的各个特征有时被一起分组到单个实施例、图、或者对其的描述中。然而，并不应将该公开的方法解释成反映如下意图：即所要求保护的本发明要求比在每个权利要求中所明确记载的特征更多特征。更确切地说，如权利要求书所反映的那样，发明方面在于少于前面公开的实施例的所有特征。因此，遵循具体实施方式的权利要求书由此明确地并入该具体实施方式，其中每个权利要求本身都作为本发明的单独实施例。
尽管根据有限数量的实施例描述了本发明，但是受益于上面的描述，本技术领域内的技术人员明白，在由此描述的本发明的范围内，可以设想其它实施例。此外，应当注意，本说明书中使用的语言主要是为了可读性和教导的目的而选择的，而不是为了解释或者限定本发明的主题而选择的。因此，在不偏离所附权利要求书的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。对于本发明的范围，对本发明所做的公开是说明性的，而非限制性的，本发明的范围由所附权利要求书限定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，将炭黑曲霉菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上培养，待充分产孢后，洗下孢子，过滤除掉菌丝，得到孢子菌悬液；然后用无菌水调节菌悬液浓度为1×106个/mL备用；
步骤二，取成熟葡萄，用酒精清洗灭菌；
步骤三，将表面晾干后的葡萄进行除梗，再对葡萄进行破碎，破碎后的葡萄进行压榨，分离汁液与残渣；
步骤四，将制备好的菌悬液均匀喷洒在残渣表面，在25℃的无菌培养箱中培养7天，残渣厚度为1cm，菌悬液喷洒量为1mL/cm2；
步骤五，将培养后的残渣经121℃、20分钟灭菌后，待冷却至室温后，进行冷冻干燥，冻干后粉碎，过30目筛子，筛下物混匀后，得到冻干粉；
步骤六，将酵母活化后，按0.1g/L接种至汁液中发酵，发酵温度15-20℃，不密封发酵8天后，添加乙醇溶液调整酒精度为16%，4℃贮藏，获得发酵葡萄酒；
步骤七，将冻干粉与发酵葡萄酒混匀，发酵葡萄酒和冻干粉的混合比例为75mL发酵葡萄酒/g冻干粉，混匀后在2-4℃下过滤，获得葡萄酒；
步骤八，将葡萄酒进行二次混匀搅拌，灌装后置于2~8℃下冷藏保存；
步骤七中，过滤的方法为：通过板式膜过滤器过膜过滤，板式膜过滤器的滤膜为聚四氟乙烯PTFE滤膜，滤膜的大小为0.35-10μm。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，炭黑曲霉菌的培养温度为25℃，培养时间为6天；过滤为用无菌纱布过滤。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，酒精的浓度为75%。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤三中，破碎的方法为采用破壁机进行破碎；压榨的方法为采用压榨机进行压榨。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤五中，灭菌的方法为采用高压灭菌锅进行灭菌；冷冻干燥的方法为：-80℃冰箱预冻10h、-40℃冷冻干燥1h、-30℃冷冻干燥4h、-20℃冷冻干燥8h、-10℃冷冻干燥8h、0℃冷冻干燥4h、10℃冷冻干燥2h、20℃冷冻干燥1h；粉碎的方法为：刀质粉碎机中，以2000r/min，粉碎30min；筛下物混匀的方法为：用高效混合机以1000r/min混合20min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤六中，酵母为X16菌株，酵母活化方法为：在35℃下活化2h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤七中，混匀的方法为：通过顶置搅拌器500r/min搅拌30min。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，葡萄种类包括赤霞珠。
9.根据权利要求1~8任意一项所述的制备方法获得的含有赭曲霉毒素A的葡萄酒基质标准样品，其特征在于，标准样品在4-50℃储存环境下有效期为6个月，标准值为4.00μg/kg。
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