CN114395512B - 一株可降解生物胺的乳酸菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域,涉及一株可降解生物胺的乳酸菌及其应用,所述乳酸菌为NXU‑Q12,该菌株的保藏编号为:CGMCC No.23704,保藏日期为2021年11月01日。本发明筛选得到的乳酸菌NXU‑Q12能够降解多种生物胺,还具有一定的耐酸耐乙醇能力,能够用于制备葡萄酒和枸杞果醋。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,涉及一株可降解生物胺的乳酸菌及其应用。
背景技术
生物胺(Biogenic Amines,简称BA)是一类广泛存在于发酵食品中的低分子量含氮有机化合物,主要由微生物产生的氨基酸脱羧酶作用于氨基酸脱羧生成根据结构可以把BA分成3类:杂环族、芳香族和脂肪族。生物胺普遍存在于发酵食品中,适量生物胺有助于人体的正常生理活动,过量生物胺的摄入则会引起动脉血管和微血管的扩张,导致腹泻、头痛、腹部痉挛、呕吐等不良生理反应甚至会导致死亡。目前对于食品中生物胺的降解有一定的局限性,同时难以保证食品安全性。
食品中的生物胺主要来源于食品本身和食品加工贮藏两部分,且大部分生物胺是在食品加工贮藏中由微生物生长代谢产生的,所以发酵食品中生物胺的含量普遍偏高。正因如此,可以在食品发酵过程中使用不产生生物胺或者可以降解生物胺的菌株,并使之成为发酵过程中的优势菌株,从而降低食品中生物胺的含量
在果蔬制品发酵过程中,容易产生大量的生物胺,而生物胺的积累会对人体产生危害。目前市场上现有的发酵饮品,如葡萄酒(果酒)和果醋发酵过程中也发现了生物胺的积累现象。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对现有技术的不足,提供了一株可降解生物胺的乳酸菌及其应用,所述乳酸菌为NXU-Q12。所述乳酸菌NXU-Q12降解各生物胺的降解率为:腐胺28.38%,尸胺36.31%,组胺23.11%,酪胺16.85%,精胺12.03%,色胺15.67%,还具有一定的耐酸和耐乙醇能力。
本发明提供了一株可降解生物胺的乳酸菌,所述乳酸菌为NXU-Q12,该菌株的保藏编号为:CGMCC No.23704,保藏日期为2021年11月01日。
进一步的,培养所述乳酸菌的培养基为MRS肉汤液体培养基。
本发明还提供了一种所述的乳酸菌在降解生物胺中的应用。
进一步的,所述生物胺包括腐胺,尸胺,组胺,酪胺,精胺和色胺。本发明还提供了一种所述的乳酸菌在制备发酵食品中的应用。
进一步的,所述乳酸菌能够用于制备葡萄酒。
进一步的,所述葡萄酒的制备过程为:将葡萄去梗破碎后添加60mg/L SO2和20mg/L果胶酶,低温浸渍24h,然后加入酵母菌种子液,25±2℃发酵至残糖<4g/L,获得发酵液,然后经0.45μm孔径的过滤膜过滤除菌,按照体积分数为5%接种量接入活化好的乳酸菌CGMCC No.23704,密封后于20±2℃发酵至苹果酸含量趋于稳定(即苹果酸含量不再下降)后离心去除废渣,获得葡萄酒;
所述酵母菌种子液由商业酵母干粉培养获得。
进一步的,所述乳酸菌能够用于制备枸杞果醋。
所述枸杞果醋的制备过程包括如下步骤:
S1,酵母菌种子液制备:利用酵母菌制备酵母菌种子液;
S2,NXU-Q12种子液制备:将乳酸菌NXU-Q12接种于培养基中,于37±1℃下培养,两次传代后得到的菌液即为NXU-Q12种子液;
S3,巴氏醋酸杆菌种子液制备:将巴氏醋酸杆菌CGMCC 1.41接种于巴氏醋酸杆菌活化培养基中,于30±1℃下培养,两到三次传代后得到的菌液即为巴氏醋酸杆菌种子液;
S4,将枸杞分拣破碎后添加SO2和果胶酶,低温浸渍,然后加入酵母菌种子液,25±2℃发酵至酒精度为7-8°,过滤获得原料酒样。接入产酸发酵剂,密封后于30±2℃下进行发酵,发酵结束,离心去除废渣,获得枸杞果醋;
进一步的,所述产酸发酵剂由NXU-Q12种子液和巴氏醋酸杆菌种子液按照体积比1:1混合而成。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
1、本发明中提供的乳酸菌NXU-Q12可降解多种生物胺:生物胺降解率分别为腐胺28.38%,尸胺36.31%,组胺23.11%,酪胺16.85%,精胺12.03%,色胺 15.67%;同时具有一定的耐酸、耐乙醇能力。
2、本发明中提供的乳酸菌NXU-Q12能够用于制备葡萄酒和枸杞果醋,且能够大大降低葡萄酒和枸杞果醋中的生物胺。
3、本发明中提供的乳酸菌NXU-Q12与巴氏醋酸杆菌制备的产酸发酵剂发酵的枸杞果醋中生物胺含量很低。
4、本发明通过添加具有降解生物胺功能的乳酸菌进行多菌种混合发酵,不仅能在一定程度上提高原料利用率,缩短发酵周期,提高效率,使饮品具有丰富的风味,同时也避免了生物胺积累的风险。
生物材料保藏信息说明
NXU-Q12,在本申请中称作乳酸菌NXU-Q12,已于2021年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.23704,保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所,邮编:100101,分类命名为乳杆菌(Lactobacillus sp.)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中生物胺显色培养基显色反应,其中,标记A表示紫色标记B表示红色,标记C表示黄色;
图2为本发明中乳酸菌NXU-Q12的菌落形态;
图3为本发明中乳酸菌NXU-Q12的革兰氏染色结果;
图4为本发明中六种生物胺标准品混合使用液的高效液相色谱图,其中,1 代表腐胺,2代表尸胺,3代表组胺,4代表酪胺,5代表精胺,6代表色胺。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明,但不应理解为本发明的限制。如无特殊说明,下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
一、菌株的筛选
1、初筛
称取10g酒曲于100mL无菌生理盐水中,于37℃摇床培养箱振荡培养 30min。吸取悬浮液梯度稀释至10-6,吸取100μL适宜梯度稀释液分别均匀涂布于MRS固体培养基,37℃培养32-48h,选取不同形态单菌落进行划线分离纯化并保存。
将纯化的菌株接种于MRS液体培养基中进行活化,调整菌液浓度达到 1×108CFU/mL,预先在96孔无菌板中加入1mL生物胺(显色)培养基,吸取100μL菌液转接于96孔无菌板中,37℃培养48h后,以不接种培养基为空白对照,记录实验结果,观察培养基颜色变化,如图1所示,紫色的(A)或者红色的(B)为阳性(产胺菌),不变色即黄色(C)为阴性(不产胺菌)。做3组平行实验,将阴性菌落挑出,在对应培养基上划线分离纯化3次,得初筛菌株,然后于4℃保藏备用。
所述生物胺(显色)培养基配方为:MgSO4 0.2g,MnSO4·H2O 0.5g, FeSO4 0.4g,柠檬酸三铵2.0g,CaCO3 0.1g,5-磷酸吡哆醛0.05g,K2HPO4 2.0 g,氨基酸(组氨酸、酪氨酸、赖氨酸、色氨酸、精氨酸、鸟氨酸)各1g,溴甲酚紫0.06g,去离子水1L。
2、复筛:将初筛菌株接种于MRS液体培养基中活化2-3次,并调整菌液浓度为108CFU/mL,按接种量2%接入含六种生物胺的MRS液体培养基中,以不接种菌株的含生物胺MRS液体培养基为空白对照,置于37℃培养箱中静置培养24 h。24h后于4℃10000r/min离心5min,取上清液,采用高效液相色谱法测定生物胺含量,并与空白进行对照,选取降解生物胺种类多且降解能力好的菌株,获得乳酸菌NXU-Q12,经分子生物学鉴定为乳杆菌(Lactobacillus sp.),所述的乳酸菌NXU-Q12的菌落形态如图2所示,革兰氏染色结果如图3所示(显紫色),乳酸菌NXU-Q12为革兰氏阳性菌。
(1)含六种生物胺的MRS液体培养基配方:蛋白胨10.0g,牛肉浸粉8.0 g,酵母浸粉4.0g,葡萄糖20.0g,乙酸钠5.0g,柠檬酸二铵2.0g,Tween 80 1.0g,K2HPO4 2.0g,MgSO4·7H2O 0.2g,MnSO4·H2O 0.04g,腐胺100mg、尸胺100mg、精胺100mg、色胺100mg、组胺100mg,酪胺100mg,去离子水 1L。
(2)高效液相色谱条件:色谱柱Agilent 5TC C18(4.6mm×250mm, 5μm),柱温30℃,进样量为20μL,流动相A为乙腈,流动相B为超纯水,流速为0.8mL/min,紫外检测波长254nm。洗脱程序如表1所示。
表1 HPLC洗脱程序
(3)生物胺含量的测定
①生物胺标准溶液的制备:分别准确称取尸胺、腐胺、组胺、色胺、精胺、酪胺各10mg,用0.1moL/L盐酸溶解定容至10mL容量瓶中,混匀,配制成1 mg/mL浓度的生物胺储备液,分别吸取1mL生物胺储备液至10mL棕色容量瓶中并用0.1moL/L盐酸稀释定容,配制成100mg/L的生物胺标准混合使用液。将上述使用液梯度稀释为2.5、10、15、25、50mg/L的生物胺系列标准溶液,临用现配。
②生物胺含量的测定:精确吸取1mL生物胺系列标准溶液及样品溶液,依次加入0.2mL的NaOH溶液(2mol/L)使反应液呈碱性,0.3mL的饱和 NaHCO3缓冲液,及2mL丹磺酰氯衍生溶液(10mg/mL)漩涡振荡60s后置于 40℃水浴锅避光反应45min,期间每15min取出振荡60s,加入100μL氨水终止反应,并于室温下避光静置25min后用乙腈定容至5mL,5500r/min离心5min取上清液,过0.22μm滤膜,在上述液相色谱条件下测定生物胺含量 (如图4所示)。
(4)生物胺降解率的计算:
W=(C1-C2)/C1×100%
式中,W—生物胺降解率,%;
C1—不接种NXU-Q12的样液中生物胺含量,mg/L;
C2—接种NXU-Q12的样液中生物胺含量,mg/L。
乳酸菌NXU-Q12对各生物胺的降解率见表2。
表2菌株NXU-Q12对不同生物胺的降解率(%)
二、乳酸菌NXU-Q12用于葡萄酒的制备
将赤霞珠葡萄去梗破碎后装入10L已灭菌的发酵罐中,添加60mg/L SO2和20mg/L果胶酶,低温浸渍24h,加入酵母菌种子液,25℃自然发酵,直到发酵终止(残糖<4g/L),完成酒精发酵,获得发酵液(即赤霞珠葡萄酒酒样)。将赤霞珠葡萄酒酒样经0.45μm孔径的滤膜进行过滤除菌,按照体积分数为5%的接种量将活化好的乳酸菌NXU-Q12接入葡萄酒中,满瓶密封放置于20℃条件下发酵,直至发酵体系中苹果酸含量趋于稳定(不再下降)即视为发酵结束,离心去除废渣,获得低生物胺的葡萄酒成品。
按照上述步骤,将发酵菌种由乳酸菌NXU-Q12替换为商业乳酸菌O. oenil,制备获得普通葡萄酒成品作为对照。
所述酵母菌种子液的制备过程为:称取适量商业酵母干粉(使用量为 20g/100kg)于10倍体积的蒸馏水中,于37℃下培养30min后即可作为酵母菌种子液。
分别检测低生物胺的葡萄酒成品和普通葡萄酒成品中总生物胺含量,发现与商业乳酸菌O.oenil相比,接种乳酸菌NXU-Q12可使成品中的总生物胺含量降低44.74%。
所述商业乳酸菌O.oenil购买于宁夏诺盟生物科技有限公司。
需要说明的是,苹果酸的测定是采用的L-苹果酸试剂盒,购买于 BioSystem公司。
三、用于枸杞果醋的制备
(1)酵母菌的活化:称取商业酵母干粉于10倍体积蒸馏水中,于37℃下培养30min后即可作为酵母菌种子液;
所述商业酵母干粉使用量为20g/100kg,指的是每100千克原料(枸杞) 需要称量20g酵母干粉。
所述商业酵母干粉购买于宁夏诺盟生物科技有限公司。
(2)乳酸菌NXU-Q12种子液的制备:配制MRS液体活化培养基,按照每10mL分装至各试管内,在微波炉加热1min使培养基充分混匀后,于 121℃灭菌锅中灭菌20min,冷却后备用。从超低温冰箱中取出NXU-Q12菌液解冻后,吸取冻存管中的菌液1mL于活化培养基中,在37℃下培养,两次传代后得到的菌液即可作为乳酸菌NXU-Q12种子液。
(3)巴氏醋酸杆菌种子液的制备:选用巴氏醋酸杆菌CGMCC 1.41进行醋酸发酵,制备巴氏醋酸杆菌活化培养基(各组分质量分数为葡萄糖1%,酵母膏1%,CaCO3 2%,剩余为蒸馏水,在培养基灭菌后冷却至50-60℃加入 2%的无水乙醇),微波炉加热1min后于121℃下灭菌20min,冷却后备用。吸取2mL活化培养基注射入存有巴氏醋酸杆菌冻干粉末的安剖瓶中,混匀,将菌液全部吸出并转入剩余的活化培养基中,于30℃下培养,三次传代后得到的菌液即可作为巴氏醋酸杆菌种子液。
(4)枸杞果醋的制备:将枸杞分拣破碎后装入10L已灭菌的发酵罐中,添加60mg/LSO2和20mg/L果胶酶,低温浸渍24h,加入酵母菌种子液, 25℃条件下发酵,直到酒精度为7-8°,终止发酵,完成酒精发酵阶段。纱布过滤进行皮渣分离,制得原料酒样装到10L已灭菌的发酵罐中,调整pH值。按照一定比例(以体积分数为1%的接种量)接种制备好的产酸发酵剂,所述产酸发酵剂由NXU-Q12种子液和巴氏醋酸杆菌种子液按照体积比为1:1混合而成,8层纱布密封,在30℃下进行有氧发酵,直至发酵体系中醋酸含量不再继续升高即视为发酵结束,离心除去废渣,获得低生物胺的枸杞果醋成品。
按照上述步骤,不接种乳酸菌NXU-Q12,只接种巴氏醋酸杆菌种子液,制备得到普通枸杞果醋成品。
分别检测低生物胺的枸杞果醋成品和普通枸杞果醋成品中总生物胺含量,发现添加乳酸菌NXU-Q12能使枸杞果醋成品的总生物胺含量减少24.57%。
上述获得的发酵饮品中总生物胺含量为用高效液相色谱法检测的各生物胺 (腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺和色胺)的含量之和。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (1)
1.一种乳酸菌在制备低生物胺葡萄酒中的应用,其特征在于,所述乳酸菌为NXU-Q12,该菌株的保藏编号为:CGMCC No .23704,保藏日期为2021年11月01日;所述乳酸菌NXU-Q12用于降解葡萄酒中的腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺和色胺,且具有耐酸、耐乙醇能力;
所述低生物胺葡萄酒的制备过程为:将葡萄去梗破碎后添加SO2和果胶酶低温浸渍,然后加入酵母菌种子液,25±2℃发酵至残糖<4g/L,获得发酵液,然后经过滤膜过滤除菌,按照体积分数为5%接种量接入活化好的乳酸菌NXU-Q12,密封后于20±2℃发酵,发酵结束后离心去除废渣,获得葡萄酒。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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