CN111019860A - 一株降低生物胺的乳酸片球菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株降低生物胺的乳酸片球菌及其应用，属于生物工程发酵技术领域。所述乳酸片球菌已于2019年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18294，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株具有较好的降解生物胺能力，对于豆酱中酪胺、亚精胺的降解率可达59.33％和58.41％，可用于控制豆酱等发酵食品生产过程中的生物胺含量。

Description

一株降低生物胺的乳酸片球菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株降低生物胺的乳酸片球菌及其应用，属于生物工程发酵技术领域。
背景技术
乳酸片球菌的细胞为圆球状，在直角两个平面交替分裂形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。接触酶阴性，不产细胞色素。它能够产酸，调节胃肠道菌群，维持肠道微生态平衡。在动物体内对病原微生物有颉颃作用，可竞争性地抑制病原微生物，增强动物机体的免疫功能，产生有益的代谢产物，激活酸性蛋白酶的活性，参与机体的新陈代谢，防止有害物质产生。
生物胺是一类含氮有机化合物，广泛存在于酱油、豆酱、香肠、鱼露、奶酪、葡萄酒等发酵食品中，通常是微生物利用前体氨基酸进行脱羧作用合成的。例如，尸胺、色胺、苯乙胺、组胺和酪胺分别由相应的前体氨基酸赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和酪氨酸产生。然而，腐胺是由鸟氨酸脱羧酶和胍丁胺脱氨酶产生的，亚精胺和精胺是由腐胺经过胺合成酶产生的，它们可以相互转化。尽管生物胺具有一些生物学功能，如提供获取能量的途径、恢复体内pH值和保护受损DNA等，但过量摄入生物胺可能会导致许多健康问题，如引发头痛、低血压、恶心、潮热、局部炎症、心悸、高血压和消化问题，特别是在那些由于药物治疗而导致胺氧化酶减少的人群中。因此，降低食品中生物胺含量，提高食品安全性是很有必要的。现在大都采用生物学方法去降解生物胺，如在食品发酵过程中添加降解生物胺的菌株或不产生生物胺的优势菌株。因此筛选一株既能适应豆酱生产环境又能高效降解生物胺的菌株，对于制备安全健康的豆酱具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是筛选得到一株乳酸片球菌M28，已于2019年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18294，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的第二个目的是提供所述的乳酸片球菌的培养方法，是将乳酸片球菌M28以10～50mL/L接种量接种至改良MRS培养基中35～40℃，培养20～30h。
本发明的第三个目的是提供一种降低生物胺的方法，所述方法是将所述乳酸片球菌M28以10～50mL/L的接种量接种至含生物胺的液体、半固体或固体中。
本发明的第四个目的是提供一种所述肉葡萄球菌M43的活化方法，所述方法是将肉葡萄球菌M43以10～50mL/L的接种量接种至培养基中。
在本发明的一种实施方式中，所述活化方法的培养条件为30～40℃静置培养20～30h。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基为改良MRS培养基。
本发明的第五个目的是提供一种降低豆酱中生物胺含量的方法，所述方法是在豆酱生产第0天接种所述乳酸片球菌M28。
在本发明的一种实施方式中，所述乳酸片球菌M28的接种量为10～50mL/L，搅拌均匀后30～40℃发酵30～40天。
在本发明的一种实施方式中，所述乳酸片球菌M28在豆酱中菌株浓度为103～109CFU/g。
本发明的第六个目的是提供所述乳酸片球菌制备的调味品。
在本发明的一种实施方式中，所述调味品包括黄豆酱或豆瓣酱或豆面酱。
本发明还提供所述乳酸片球菌在发酵食品领域降低生物胺含量方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包括需要用黄豆、蚕豆或肉类发酵的食品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包括酱油、香肠、鱼露、奶酪。
有益效果：本发明提供的乳酸片球菌M28是来自工厂蚕豆酱样品发酵过程中的无害菌，对于酪胺、亚精胺这2种发酵食品中常见的生物胺具有较明显的降解作用，对于豆酱中酪胺、亚精胺的降解率可达59.33％和58.41％，可用于控制豆酱等发酵食品生产过程中的生物胺含量。另外，利用本发明提供的乳酸片球菌M28酿造的豆酱中与鲜味相关的天冬氨酸与谷氨酸分别比对照高出了13.98％和6.43％，使得本发明的豆酱鲜味更好，同时，该豆酱中的乳酸含量比对照高出了23.2％，使得该豆酱味道更加柔和，从而形成独特的风味。
生物材料保藏
本发明所提供的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)M28，已于2019年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16452，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
生物胺含量测定：使用液相色谱法方法测定，具体步骤参见朱天傲等《国产酱类产品中的生物胺》。
菌株的活化方法：将菌株以20mL/L的接种量接种至培养基中，37℃厌氧培养24h。
实施例1生物胺降解菌株的筛选及鉴定
配制MRS培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，氯化钠50g，酵母粉5g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，磷酸氢二钾2g，吐温-80 1.0mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，去离子水1L，pH 5.6。
配制BAs培养基:磷酸二氢钾2g、柠檬酸铵2g、氯化钠50g、七水合硫酸镁0.4g、硫酸锰0.03g、硫酸亚铁0.04g、硫胺素0.01g、葡萄糖2g、腐胺二盐酸盐100mg、尸胺二盐酸盐100mg、亚精胺100mg、精胺100mg、色胺100mg、苯乙胺100mg、组胺二盐酸盐100mg，酪胺盐酸盐100mg、琼脂20g、去离子水1L，pH5.5。
配制改良MRS培养基：大豆蛋白胨10g，葡萄糖20g，氯化钠50g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温1mL,腐胺二盐酸盐100mg，尸胺二盐酸盐100mg，亚精胺100mg，精胺100mg，色胺100mg，苯乙胺100mg，组胺二盐酸盐100mg，酪胺盐酸盐100mg，去离子水1L，pH 5.5。
取5g酱醅于100mL锥形瓶中，加入50mL生理盐水，于摇床上充分振荡混匀，取悬浮液进行梯度稀释至10-5，每个梯度取100μL悬浮液于BAs固体培养基和改良MRS培养基进行涂布，并于37℃培养箱进行培养，待菌落生长良好，方可分离。
磷酸盐缓冲液中生物胺降解率的测定：首先使用MRS培养基对分离的单菌落进行活化，并调节初始OD值，使其在含有100mg/L生物胺的磷酸盐缓冲液中OD值为0.6，并在37℃培养箱中放置24h，随后4000g离心5min。取上清液经过0.22μm滤膜过滤，取2mL滤液放入10mL离心管中，加入1mL浓度为2mol/L的NaOH溶液后，再加入20μL苯甲酰氯溶液，立即将离心管放入水浴恒温振荡器，30℃，200r/min振荡20min。振荡完毕后加入2mL饱和NaCl溶液停止衍生化反应，再加入3mL无水乙醚进行生物胺的萃取，使用涡旋震荡仪萃取1min，小心吸取上清液置于5mL离心管中，使用氮吹仪吹干。用1mL乙腈溶解管中残留物，0.22μm有机滤膜过滤后上机检测，通过液相方法测定生物胺含量，与空白组对比，测定生物胺的降解率。其中菌株M28在磷酸盐缓冲液中对八种生物胺的降解率分别为13.78±0.31％、8.44±0.25％、6.81±0.17％、6.41±0.28％、8.93±0.36％、4.32±0.18％、14.10±0.98％和14.04±0.55％，被筛选出来在发酵液的环境中作进一步的降解率的测定。
发酵液中生物胺降解率的测定：使用改良MRS培养基对初筛菌株进行活化，并调节初始OD值，使其在含有100mg/L生物胺的改良MRS培养基中OD值为0.1，并在37℃培养箱中放置24h，随后4000g离心5min。取上清液经过0.22μm滤膜过滤，取2mL滤液放入10mL离心管中，加入同体积质量分数为6g/L的三氯乙酸溶液，在30℃，200r/min的水浴恒温振荡器下振荡1h，取上清液进行衍生反应，步骤同上，最终通过液相方法测定生物胺含量，并与空白组对比，测定生物胺的降解率，筛选降解率较高的菌株得到复筛菌株。其中，菌株M28对腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、色胺、苯乙胺、组胺、酪胺的降解率分别为11.32±0.61％、6.97±1.19％、2.10±0.80％、10.57±0.57％、3.68±0.17％、1.75±3.83％、42.18±4.25％和5.80±0.81％。
提取乳酸片球菌M43菌株基因组DNA，使用引物:
27F：5’GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’
1492R:5’CTACGGCTACCTTGTTACGA 3’
进行16S rDNA PCR扩增。反应条件为：94℃预变性5min进入以下循环，94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸90s，34个循环；在72℃延伸10min。送往天霖公司测序，将所得序列在NCBI数据库中进行BLAST序列比对，经鉴定为乳酸片球菌，并命名为M28。
实施例2乳酸片球菌M28在豆酱发酵中的应用
以黄豆、盐水、面粉为原料，加入量分别为38g/100g、50g/100g、12g/100g，30℃恒温24h制曲完成后，入缸第0天接种10mL/L的乳酸片球菌，使得其在酱中菌株浓度为107CFU/g，以没有接入乳酸片球菌的酱醅作为对照，于对照组和实验组分别加入5mL、5g/L的腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、色胺、苯乙胺、组胺、酪胺，并于37℃恒温培养箱静置发酵35天。取样测定发酵35天后豆酱样品中的生物胺的降解率，并以如下公式计算生物胺降解率：
Figure BDA0002324515700000041
其中X为生物胺降解率；C1为未接种菌株样品生物胺浓度；C2为接种实验菌株样品生物胺浓度。
如表1所示，乳酸片球菌M28在黄豆酱发酵过程中进行接种可以有效降低黄豆酱中八种主要生物胺的含量，腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、色胺、苯乙胺、组胺和酪胺的降解率分别为16.92±1.98％、11.02±0.95％、58.41±3.50％、12.02±3.85％、8.95±2.75％、4.54±0.01％、4.49±0.14％和59.33±3.36。
表1乳酸片球菌M28对八种生物胺降解能力
Figure BDA0002324515700000042
对比例1
具体实施方式同实施例2，不同点在于，将M28替换为来源于工厂豆酱样品中的乳酸片球菌M10
表2乳酸片球菌M10对八种生物胺降解能力
Figure BDA0002324515700000043
注：ND表示未检测到
可见，该乳酸片球菌M10对于生物胺的降解能力比较差，对于亚精胺、精胺、色胺、组胺均没有降解能力。
实施例3
将实施例2与对比例1中发酵得到的黄豆酱进行氨基酸含量的测定，氨基酸含量测定方法：用分析天平称取黄豆酱样品1.0000g左右，置于研钵中研磨均匀，使用5g/L三氯乙酸溶液溶解并定容至25mL。放入超声波清洗仪中常温超声20min，结束后至少静置两个小时。使用双层滤纸过滤容量瓶中的溶液，取1mL澄清滤液于1.5mL离心管中，12000rpm离心10min，取上清液约500μL(可通过0.22μm水膜再次过滤)于液相取样瓶。
分析条件：Agillent1100高效液相色谱仪，4.0mm×250mm ODS柱，柱温40℃；流动相A为20mmol醋酸钠，流动相B为20mmol醋酸钠：甲醇：乙腈为l：2：2(V/V)，流动相流速为1.0mL/min；检测波长338nm，脯氨酸以262nm检测。
氨基酸含量见如下表3：
表3不同乳酸片球菌发酵的豆酱中氨基酸含量比较
Figure BDA0002324515700000051
Figure BDA0002324515700000061
其中，经乳酸片球菌M28酿造的豆酱与经乳酸片球菌M10酿造的豆酱相比，谷氨酸与天冬氨酸含量均比较高，分别高出了6.43％和13.98％。天冬氨酸与谷氨酸是主要的呈鲜味氨基酸，证明乳酸片球菌发酵过的黄豆酱鲜味更好。且从氨基酸总量来看，经乳酸片球菌M28酿造的豆酱也比乳酸片球菌M10酿造的豆酱高出了4.59％，反映出实验组的黄豆酱营养价值较高。
实施例4
将实施例2与对比例1中发酵得到的黄豆酱进行有机酸含量的测定，有机酸含量测定方法：称取2g-10g酱醅放入50mL EP管中，加入40mL超纯水浸泡2h，每隔15min震荡一次，7500rpm离心5min。取上清液1mL于2mL EP管中，加入106g/L亚铁氰化钾溶液和硫酸锌溶液各0.4mL去除蛋白质和色素，静止沉淀2h(涡旋振荡)后7500rpm离心3min，取上清液10000rpm离心5min，然后0.22μm滤膜(绿色水系)过膜。
有机酸标样：草酸、丙酮酸、乙酸、乳酸、琥珀酸浓度分别为0.05、0.05、0.50、0.50、0.50和1.00mg/mL。
分析条件：色谱柱：Waters Atlantis T3(5um,4.6×250mm)；柱温：40℃；流动相：精确称取NaH2PO4·2H2O 3.12g，用去离子水定容至1000mL，用H3PO4调节溶液pH值至2.7；进样体积：10uL；流速：0.7mL/min；检测波长：UV210nm。
有机酸含量见如下表4：
表4不同乳酸片球菌发酵的豆酱中有机酸含量比较
Figure BDA0002324515700000062
如表4所示，发酵结束之后的黄豆酱中的有机酸主要为乙酸和乳酸。由于乳酸片球菌M28作用于酱中可发酵碳水化合物生成乳酸较多，比对照高出了23.2％，小分子的乳酸使黄豆酱味道更加柔和，从而形成独特的风味。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，于2019年7月25日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.18294，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.一种培养权利要求1所述乳酸片球菌的方法，其特征在于，将乳酸片球菌以体积比为1％～5％的接种量接种于培养基中，于35～40℃恒温培养箱静置培养20～30h。
3.一种降低生物胺的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1所述的乳酸片球菌接种至含生物胺的液体、半固体或固体中。
4.一种降低豆酱中生物胺含量的方法，其特征在于，所述方法是在豆酱生产过程中接种权利要求1所述乳酸片球菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在豆酱发酵第0天接种所述乳酸片球菌，在30～40℃发酵30～40天。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述乳酸片球菌在豆酱中的浓度为103～109CFU/g。
7.应用权利要求1所述的乳酸片球菌制备的调味品，其特征在于，所述调味品包括黄豆酱或豆瓣酱或豆面酱。
8.权利要求1所述乳酸片球菌在发酵食品领域降低生物胺含量方面的应用。
9.根据权利要8所述的应用，其特征在于，所述食品包括需要用黄豆、蚕豆或肉类发酵的食品。
10.根据权利要8所述的应用，其特征在于，所述食品包括酱油、香肠、鱼露、奶酪。
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