CN106867939A - 一株降低生物胺的解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株降低生物胺的解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于发酵技术领域。所述解淀粉芽孢杆菌已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13215，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株具有较强的降解4种生物胺(腐胺、尸胺、组胺、酪胺)的性能，降解效率可达65.39％。

Description

一株降低生物胺的解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株降低生物胺的解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于发酵技术领域。

背景技术

蚕豆酱是以蚕豆等原料发酵酿制而成的，保持蚕豆酱原形的半流动粘稠体或半固态调味品。蚕豆酱在我国有着悠久的历史，营养丰富，味道鲜美，因此深受广大消费者的欢迎。然而，一方面，目前蚕豆酱还是采用传统的的发酵技术制备，敞口发酵，日晒夜露，发酵菌种来自自然界，本身不可控，可能会带来未知的不安全因素；另一方面，蚕豆富含丰富的蛋白质，大量游离氨基酸一旦被具有脱羧能力的微生物代谢，会生成对人体有害的生物胺。

过量摄入生物胺，可能会引发头痛、头晕、恶心、呼吸窘迫、心悸等各种中毒症状。部分人群因为疾病、遗传缺陷或服用DAO抑制剂药物，解毒能力被大大削弱，对生物胺极度敏感。此外，健康人群同时食用多种高生物胺含量的食品也可能会使酶系过饱和。出于对食品安全的考虑，人们应尽可能降低食品中生物胺的含量。

针对食品中生物胺，目前主要有添加剂、酶制剂、防腐剂、γ-射线照射、冷冻、高温、超高压处理等控制手段。但是，有些添加剂成本较高且可能影响食品风味。酶制剂DAO等主要提取自动物肝脏，成本高昂不适合工业应用。辐射对微生物有灭活作用，不能应用于生物胺大量产生的发酵期。冷冻和高温则会破坏食品风味和质构。与上述控制技术不同的是，合理选择发酵剂，尤其是可以降解生物胺的微生物，可以有效消除食品中已经生成的生物胺。而目前已报道的生物胺降解发酵剂主要分离自水产品和奶酪，不适用豆瓣酱的生产工艺，且可能影响风味。因此，从酱醅中筛选一株既可适应酱类产品的生产环境，又能最大程度上减少对风味的影响，并能高效降解生物胺的菌株，对于制备安全健康的豆瓣酱产品具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13215，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明的第二个目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌的培养方法，是将解淀粉芽孢杆菌按体积比以1～3％的接种量接种至液体培养基，在30～37℃、200～220rpm摇瓶培养12h～24h。

在本发明的一种实施方式中，所述液体培养基为LB培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述液体培养基为LBBA培养基，其配方为：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl 10g/L；腐胺1g/L；尸胺1g/L；组胺1g/L；酪胺1g/L。

本发明的第三个目的是提供一种降低生物胺的方法，所述方法是将所述解淀粉芽孢杆菌按体积以1～3％的接种量接种至含生物胺的液体、半固体、或固体中。

本发明的第四个目的是提供一种降低蚕豆酱中生物胺含量的方法，所述方法是在蚕豆酱生产过程中接种所述解淀粉芽孢杆菌。

本发明的第五个目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌制备的调味品。

在本发明的一种实施方式中，所述调味品为蚕豆酱。

本发明还提供所述解淀粉芽孢杆菌在食品领域降低生物胺含量方面的应用。

有益效果：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌是蚕豆酱发酵过程中的无害菌，能够耐受质量浓度为13％的氯化钠，并对于腐胺、尸胺、组胺、酪胺这4种发酵食品中常见的生物胺具有较明显的降解作用，对腐胺、尸胺、组胺、酪胺的降解效率可达尸胺49.57～65.39％，可用于控制豆瓣酱等发酵食品生产过程中的生物胺含量。

附图说明

图1为菌株在不同盐度培养基中对生物胺的降解率图。

生物材料保藏

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13215，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

具体实施方式

生物胺采用HPLC法进行检测，检测方法公开于2013年题为《不同啤酒生物胺含量的比较》的论文。

生物胺降解率＝(初始浓度-终浓度)/初始浓度。

实施例1解淀粉芽孢杆菌的筛选

从传统发酵豆瓣酱30天左右的酱醅中取1g样品加入到9mL无菌水中，于30℃的摇床上200rpm振荡30min制成悬浊液，将悬浊液梯度稀释，涂布于LBGL(含葡萄糖的LB培养基)平板，37℃好氧培养24h。挑取无紫色光晕或光晕较小的单菌落反复进行平板划线分离，重复三次得到纯化的单菌落，供下一步鉴定用。

以1～2％接种量取-80℃甘油贮存液接种于LB培养基中，37℃振荡静置培养24h，用CTAB法提取基因组DNA。用细菌通用引物对27F/1401R扩增16S rDNA，反应条件为：94℃预变性3min后进入以下循环：94℃变性40s，56℃退火35s，72℃延伸80s，30个循环；72℃延伸10min。经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果良好。将扩增产物寄送上海生工基因测序，如SEQ IDNO.1所示，在NCBI网站上进行BLAST序列比对，确定为解淀粉芽孢杆菌。

实施例2解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.13215对生物胺的降解

配制LBBA培养基：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl 10g/L；腐胺1g/L；尸胺1g/L；组胺1g/L；酪胺1g/L，pH自然。按10mL培养基/50mL三角瓶进行分装，121℃灭菌20min。

以1％接种量(按体积比)取-80℃甘油贮存液接种于新鲜LB液体培养基，37℃摇床培养12小时，转速200rpm。再以1％接种量(按体积比)接种于LBBA液体培养基培养，培养4天后，HPLC法检测培养基中剩余生物胺的浓度，与空白对照相比，接种解淀粉芽孢杆菌的培养基中，生物胺的降解率分别为：腐胺42.91±1.26％、尸胺49.5±71.16％、组胺65.3±90.80％、酪胺59.67±0.69％。

同时，以3％接种量(按体积比)，将解淀粉芽孢杆菌接种于含不同盐浓度的LBBA培养基中，同样条件下培养并检测剩余生物胺的浓度，降解效果如图1所示，在NaCl浓度为1～3％的环境下，生物胺总降解率达46％以上，在NaCl浓度为13％(130g/L)的情况下，解淀粉芽孢杆菌对生物胺的降解率仍高于10％，可以满足在高渗透压环境下的发酵和降解。

实施例3解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.13215对酱醅中生物胺的降解

制备酱醅培养物：向工厂发酵一个月的酱醅中加入10mL浓度分别为1g/L生物胺混合液(腐胺、尸胺、组胺、酪胺)，250mL三角瓶分装30g，121℃灭菌20min。

取3mL按上述方法活化的菌液接种于酱醅培养物中，37℃静置培养10天，采用解淀粉芽孢杆菌SYB-001(保藏编号为CGMCC No.1314，公开于CN1683520A)作为对照，按上述相同方法培养，HPLC法检测培养物中剩余生物胺浓度及主要风味物质。与对照相比，接种解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.13215的酱醅中，生物胺的降解率分别为：腐胺8.35±0.86％，尸胺9.91±0.19％，组胺7.54±0.36％，且未对酱醅的理化指标和主要风味物质造成改变；接种至对照菌株的酱醅中，生物胺未检测到明显降低，而酱醅pH降低，部分理化指标改变。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株降低生物胺的解淀粉芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1361

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagcatggcg gcgtgcctta tacatgcaag tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg 60

atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact 120

ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt gtttgaaccg catggttcag acataarrkg 180

kgsytycggc twmcacttam mrrwkgrmsc scsgcgcryw wkmkmkwkkg tgaggtaacg 240

gctcacmaag gcgacgatgc gtagccgacy krrragggtg atcsgycaca ctgggactga 300

agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag 360

tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta 420

gggaagaaca agtgccgttc aaatagggcg gcacctttga cggtacctaa ccagaaagcc 480

acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt 540

attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa 600

ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac 660

gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg 720

tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta 780

gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag 840

ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt 900

gacgggggcc cgcacaagcg ggtggagcat gtggtttaat ttcgaagcaa cgcgaagamc 960

cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag 1020

agtgacaggt ggtgcatgrt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatkktkgg ktwagtcccg 1080

camsrrgcgc awycmttgat ctwrgttgcc agcattcagt kgsrcwcyyw rwgactgccc 1140

gtgacwrcsg rkkamrrwsc ggakgamsgt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta 1200

tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt 1260

aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa 1320

gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca gcccccagct c 1361

Claims (9)

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13215，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，将解淀粉芽孢杆菌以按体积比1～3％的接种量接种至液体培养基，在30～37℃、200～220rpm培养12h～24h。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为LB培养基。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为LBBA培养基，其配方为：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl 10g/L；腐胺1g/L；尸胺1g/L；组胺1g/L；酪胺1g/L。

5.一种降低生物胺的方法，其特征在于，所述方法是按体积计，将权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌以1～3％的接种量接种至含生物胺的液体、半固体、或固体中。

6.一种降低蚕豆酱中生物胺含量的方法，其特征在于，所述方法是在蚕豆酱生产过程中接种权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌。

7.应用权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌制备的调味品。

8.根据权利要求7所述的调味品，其特征在于，所述调味品为蚕豆酱。

9.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在食品领域降低生物胺含量方面的应用。