CN105132308A - 一种能降低食品中生物胺含量的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能降低食品中生物胺含量的植物乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明所提供的植物乳杆菌具有耐酸性，在体外对8种生物胺(色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺)具有较强的清除能力，将菌体数为1×10¹⁰CFU/mL的植物乳杆菌与8种生物胺(每种生物胺浓度为100mg/L，总胺浓度为800mg/L)共培养24h，总胺含量降低近70％，每种生物胺含量降低30％-100％不等，其中对于毒性最大的组胺清除率达到96.69％，同时具有快速产酸能力，8小时即可将pH降到4以下，具有良好发酵潜力。所述的植物乳杆菌用于降解食品尤其是发酵食品中的生物胺，具有非常广泛的应用前景。

Description

一种能降低食品中生物胺含量的植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种能降低食品中生物胺含量的植物乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

生物胺(Biogenicamines)是一类主要由氨基酸脱羧或者醛和酮氨基化形成的具有生物活性的小分子量含氮化合物，是生物体内正常的生理活性物质，在机体细胞活动中发挥着重要作用。但当人体外源摄入过量的生物胺时，会导致头痛，血压升高，造成人神经系统和心血管系统损伤，有时主要是胃肠功能紊乱，造成腹部痉挛、腹泻和呕吐等。而且生物胺能和亚硝酸盐反应生成致癌物亚硝类化合物。

生物胺是食品中普遍存在的有害物质，尤其是发酵食品中，食品中的生物胺主要是由微生物产生，同时也受游离氨基酸含量、温度、pH值、含盐量等影响。各类食品中生物胺的含量不尽相同，对于肉制品和水产品而言，屠宰后的新鲜肉和新鲜的水产品生物胺含量非常低，但在贮藏过程中会有所上升，而经过发酵之后得到的香肠或腌制品中生物胺普遍存在，且部分含量很高；此外，发酵乳制品中奶酪中生物胺浓度很高，调味品(如鱼露、豆豉、醋等)中有些胺的含量很高，橙汁等果汁类、番茄酱等蔬菜罐头类和咖啡豆等中也发现了生物胺。因为不同生物胺的毒性差别较大，且不同人群对生物胺的解毒能力也相差较大，建立统一的生物胺限量标准非常困难。美国FDA规定水产品中的组胺含量不得超过50mg/kg，并建议酪胺含量不要超过100mg/kg，生物胺总量不要超过1000mg/kg。

生物胺热稳定性好，一般的烹饪过程不能消除食物中的生物胺，现有的控制食品中生物胺含量的方法主要有以下几种：1.生产工艺控制：通过对生产过程中的原料、温度和盐度进行合理选择，抑制生物胺产生菌的生长，以达到抑制生物胺产生的目的，局限性在于加工温度和盐度等因素多由食物特性决定，而低温贮藏会提高设备和能耗费用，且有些微生物低温下也能产生生物胺；2.化学方法：食品添加剂和香料控制，虽然具有一定的生物胺控制效果，但是食品添加剂成本较高，香料强烈的本体风味会限制其应用范围；3.物理方法：超高压处理，一般针对发酵前原料或发酵后产品且可能影响质构，发酵过程中只能采用相对低压，而低压作用不明显；4.生物技术：使用不产生生物胺的微生物作为菌粉生物制剂，令其成为发酵体系中的优势菌，然后通过营养、空间竞争，改变环境pH值以及产生抑菌物质等方式抑制生物胺产生菌的生长，以达到降低生物胺含量的目的。以上方法具有各自不可避免的局限性，而且均不能降解已经产生的生物胺。寻找降解生物胺的菌作为菌粉生物制剂可以解决如上问题。目前分离到的具有生物胺降解功能的微生物还存在很多局限：(1)降解生物胺种类少；(2)降解效果差；(3)安全性存疑等。目前已报道的降解生物胺的微生物有壁画盐单胞菌和酿酒酵母工程菌等，但其用于食品中的安全性有待进一步验证，且并非对于常见的8种生物胺都有很好的降解作用；而采用添加单胺氧化酶的方法降解生物胺不仅成本高，而且可能会对设备有更高的要求。

鉴于以上背景，亟需研发新型的菌粉生物制剂降低生物胺含量。乳酸菌是一类能使碳水化合物发酵并产生乳酸的细菌的统称，广泛存在于自然发酵食品中，且一般在发酵食品中起主导作用。长期科学研究结果表明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的具有重要生理功能的有益菌，其主要生理功能有：防治乳糖不耐症、恢复人体肠道内菌群平衡维护人体健康、抗肿瘤和预防癌症作用、控制人体内毒素水平、保护肝脏并增强肝脏解毒功能等。考虑到乳酸菌具有无二次污染，不损害食品营养，不产生新的毒性物质的优点，加之乳酸菌作为益生菌能在动物体内定植发挥其多种有益于健康的功效，探索乳酸菌在降低食品中生物胺的应用具有重大的实用价值。本发明的植物乳杆菌CGMCCNo.9740，分离自四川内江地区自然发酵泡菜，是可用于食品的安全菌株，用于加工制作发酵类食品的方法具有工艺简洁、成本低廉、适用于大规模工业化生产等特点。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种植物乳杆菌，分类学命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，于2014年09月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9740。

所述植物乳杆菌CGMCCNo.9740能够有效降低生物胺含量，来源于四川省内江市一农家的自制泡菜，其在酸性环境中具有良好的生长特性。植物乳杆菌在我国《可用于食品的菌种名单》上，可在食品加工领域中使用，具有良好的市场前景。

本发明的第二个目的是提供一种菌粉生物制剂，所述菌粉生物制剂是用植物乳杆菌CGMCCNO.9740制备得到的。

本发明的第三个目的是提供一种所述菌粉生物制剂的制备方法，是将植物乳杆菌CGMCCNO.9740活化后洗涤、离心得到活性菌泥；将菌泥和冻干保护剂按质量比1:10-1:20混匀，得到菌体浓度在10⁸-10⁹CFU/mL的植物乳杆菌CGMCCNO.9740悬浮液，预冷后冻干，即得到植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌粉菌粉生物制剂。

所述制备方法中菌株的活化是多次转接MRS肉汤培养基。

所述制备方法中菌泥是由活化洗涤后的植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌液在6000-8000rpm条件下离心5-10min得到的。

所述制备方法中冻干保护剂是水与保护剂原料混合制备得到的含有80-120g/L脱脂奶粉、80-120g/L海藻糖、120-160g/L蔗糖的保护剂。在105℃湿热灭菌10-15min。

所述制备方法中菌体的洗涤是使用无菌生理盐水进行洗涤。

所述制备方法中的冻干是在真空冻干机中冻干。

所述冻干是在冷阱温度-45--55℃、真空度2-6Pa条件下干燥45-50h。

所述制备方法得到的菌粉生物制剂中活菌浓度在10⁸-10¹⁰CFU/g。

本发明的第四个目的是提供所述植物乳杆菌CGMCCNO.9740的用途，可用于发酵乳、泡菜、鱼露等发酵食品的制备。

本发明所提供的植物乳杆菌具有耐酸性，在体外对8种生物胺(色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺)具有较强的清除能力，将菌体数为1×10¹⁰CFU/mL的植物乳杆菌与8种生物胺(每种生物胺浓度为100mg/L，总胺浓度为800mg/L)共培养24h，总胺含量降低近70％，每种生物胺含量降低30％-100％不等，其中对于毒性最大的组胺清除率达到96.69％；同时具有快速产酸能力，8小时即可将pH降到4以下，具有良好发酵潜力。本发明的植物乳杆菌用于降解食品尤其是发酵食品中的生物胺，具有非常广泛的应用前景。

生物材料保藏

一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，于2014年09月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.9740。

附图说明

图1是8种生物胺的高效液相色谱图。

图2是MRS固体培养基上植物乳杆菌CGMCCNO.9740的菌落形态。

图3是40×100倍显微镜下植物乳杆菌CGMCCNO.9740革兰氏染色后的形态。

图4是植物乳杆菌CGMCCNO.9740在MRS液体培养基中的生长曲线及pH值变化图。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)是从四川内江地区自然发酵泡菜中筛选得到的，菌株编号：CGMCCNO.9740，植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌落为乳白色，表面光滑湿润，边缘光滑，在MRS肉汤培养基上生长良好。

实施例1乳酸菌筛选及保存

将取自四川内江地区的优质泡菜的泡菜水用无菌生理盐水进行梯度稀释，选取适当梯度在添加了1.5％的溴甲酚紫溶液(溴甲酚紫溶液浓度为0.5％)的MRS肉汤培养基上培养，37℃下培养48h，挑取变色圈大的菌落接种到MRS液体培养基中静置培养24小时，培养温度37℃。取培养后的菌液1mL至保菌管中，12000rpm，4℃离心2min后取上清，向沉淀中加入1mL60％甘油重悬，置于-80℃中保存。

实施例2植物乳杆菌CGMCCNO.9740对生物胺降解作用试验

1.植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌种的活化

取-20℃保存的植物乳杆菌CGMCCNO.9740，将其在MRS平板上划线培养。在37℃培养48小时后，从生长良好的植物乳杆菌单菌落上挑取乳酸菌细胞接种到MRS液体培养基中静置培养24小时，培养温度37℃。

2.生物胺标准品母液的配制

所述生物胺为生物胺标准品，购于Sigma公司，使用时配制成每种生物胺浓度均为100mg/L的母液。配置方法为：分别准确称取0.0100mg的色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺，溶于100mL无菌生理盐水中，充分混匀溶解，并使用0.22μm有机微孔滤膜进行过滤除菌后贮存于4℃。

3.植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌体的获取

将活化后的菌种按3％接种量接种到MRS液体培养基中于37℃培养箱中静置培养18小时后离心取菌体，得到的菌体重新悬浮于0.85％生理盐水中清洗后再离心获得植物乳杆菌菌体，一共清洗3次。得到植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌体。

4.植物乳杆菌CGMCCNO.9740对八种生物胺降解能力的分析

取10mL的菌液按上述步骤获得菌体后与2mL生物胺母液进行混合，使得菌体浓度达到1×10¹⁰CFU/mL，8种生物胺的浓度均为100mg/L。将共培养混合物置于37℃培养箱中静置培养24h后，于4℃、10000rpm的转速离心10min取上清液，取1mL上清用丹磺酰氯衍生，采用高效液相色谱-质谱联用检测样品中8种生物胺的残留情况。

衍生条件：1mL样品中加入200μL的2mol/L氢氧化钠溶液，使之呈碱性，然后加入300μL饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲，再加入1mL丹磺酰氯溶液(10mg/mL丙酮)，在黑暗中置于40℃水浴45min；取出后加入100μL氨水避光放置30min中断反应并去除多余的丹磺酰氯；最后用乙腈调整到5mL并用0.45μm的有机滤膜过滤后待测定。

检测条件：采用的检测仪器为高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用方法，其中HPLC的型号为Ultimate-3000，MS的型号为QZxactive。HPLC的柱温为30℃，流速5.000μL/s，流动相A为超纯水，流动相B为乙腈(色谱纯)，梯度洗脱程序如下：

表1高效液相色谱洗脱程序

MS检测的条件如下：

表2质谱检测条件1

表3质谱检测条件2

检测结果：8种生物胺在高效液相色谱图上的出峰位置如图1所示，每种生物胺具体出峰时间见表4，色胺，苯乙胺，腐胺，尸胺，组胺，酪胺，亚精胺，精胺的保留时间分别为10.22min，11.10min，11.67min，12.30min，14.93min，15.29min，17.63min和22.95min。

根据峰面积变化可计算出乳酸菌对生物胺的降解情况，具体数据见表5，植物乳杆菌CGMCCNO.9740在对单胺和总胺的降解率上表现都很优异，对色胺，苯乙胺，腐胺，尸胺，组胺，酪胺，亚精胺，精胺的降解率分别为86.74％，38.94％，63.90％，53.12％，96.69％，32.81％，85.68％，92.15％，对总胺的降解率达到67.33％。

表48种生物胺高效液相色谱图上的保留时间

表5CGMCCNO.9740对于8种生物胺和总胺的降解率

实施例3植物乳杆菌CGMCCNO.9740的形态及鉴定结果

取-80℃甘油管中保存的植物乳杆菌CGMCCNO.9740，将其在MRS平板上划线培养。在37℃培养48小时后，可观察到菌落形态为乳白色，表面光滑湿润，边缘光滑，见图2，经革兰氏染色后在40×100倍显微镜下观察，可见植物乳杆菌CGMCCNO.9740为杆状的革兰氏阳性菌，见图3。

进行菌落PCR，用无菌牙签挑取单菌落至混合好的体系中，在PCR仪中进行反应。其中体系包括：10×TaqBuffer5μL，2.5mMdNTPs4μL，5u/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，20μM上、下游引物各0.5μL(16S通用引物27F和1492R)，无菌水38.5μL。反应程序为：94℃，5min→(94℃，30s→50℃,30s→72℃，1min)×30个循环→72℃，5min→4℃，20h。

将PCR产物送至上海某生物公司测序，16SrDNA测序结果(SEQIDNO.1)经BLAST分析比对，CGMCCNO.9740与植物乳杆菌有99％相似度。

实施例4植物乳杆菌CGMCCNO.9740生长曲线的绘制

取甘油管中保存的植物乳杆菌CGMCCNO.9740，将其在MRS平板上划线培养。在37℃培养48小时后，从生长良好的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)单菌落上挑取乳酸菌细胞接种到MRS液体培养基中静置培养24小时，培养温度37℃。然后按3％接种量将此活化后的植物乳杆菌CGMCCNO.9740培养液接种到MRS液体培养基中于温度为37℃，静置培养24小时，每隔2个小时取5mL培养液使用紫外分光光度计测600nm下的OD值，根据结果绘制植物乳杆菌CGMCCNO.9740的生长曲线，其结果如图4所示，从图中可以看出：植物乳杆菌CGMCCNO.9740在MRS培养基中生长迅速，在2h左右进入对数期，12h左右进入稳定期。随着培养时间的延长，菌株生长产酸，pH不断降低，8h即可将pH降到4以下，进入稳定期后，pH下降趋势渐缓。24h培养结束时，培养液的pH值为3.62，培养液中活菌浓度可以达到2.0×10⁹CFU/mL。

实施例5植物乳杆菌CGMCCNO.9740生物制剂的制备

植物乳杆菌CGMCCNO.9740的活化：

从保存于-80℃的甘油管内吸取100-300μL植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌液，接种至800-1200mLMRS肉汤培养基中，于35-40℃恒温孵育24-48h；吸取200-500μL孵育后菌液接种至800-1200mLMRS肉汤培养基中，重复这一步骤2-4次得到活化的植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌液。将活化后的菌液高速离心使菌体沉淀，弃去上清后用无菌生理盐水对菌体沉淀进行洗涤并重悬，重复这一步骤2-3次并弃去上清，得到菌体浓度在10⁹-10¹⁰CFU/g的活性菌泥。

菌粉生物制剂的制备：

选择脱脂乳液作为冻干保护剂，将上一步得到的菌泥和脱脂乳液按质量比1:10-1:20充分混匀，得到菌体浓度在10⁸-10⁹CFU/mL的植物乳杆菌CGMCCNO.9740脱脂乳悬浮液。接着，让该悬浮液在温度37℃的条件下预培养60min，之后将悬浮液置于-80℃冰箱中预冻2-3h，预冻完成后置于真空冻干机中冻干。即得到活菌浓度在10⁸-10¹⁰CFU/g的冻干植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌粉生物制剂。

实施例6植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌粉生物制剂用于发酵乳制备

鲜牛奶或复原乳经净化和过滤处理后，95℃杀菌20min，迅速冷却至40-50℃后，按3-6％添加植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌粉生物制剂，混匀，于42℃培养箱中培养4-6h至全部凝乳，之后置于4℃中后熟过夜，即得含植物乳杆菌CGMCCNO.9740生物制剂发酵乳。

实施例7植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌粉生物制剂用于泡菜制备

在洗净晾干的2mL泡菜坛中加入1kg冷开水，50g泡菜盐，100g花椒，一组添加10g植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌粉生物制剂充分溶解混匀，另外一组(对照组)不添加10g植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌粉生物制剂，分别制成发酵母水。将清洗洁净的黄瓜、莴苣、胡萝卜分别切成厚度1.00cm的长条，与洗净的红椒、仔姜一同投入泡菜坛中至泡菜水液面距离坛口10-15cm。盖上坛子盖，在坛沿加上淡盐水，常温下泡制24小时即可食用。与不添加植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌粉生物制剂的组相比，添加植物乳杆菌CGMCCNO.9740可使发酵泡菜成品中总生物胺的水平降低了30.47％。

实施例8植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌粉生物制剂用于泡椒凤爪制备

参考实施例7制作泡菜母水，然后将鸡爪洗净，剪掉爪尖，剁小块，放热水中煮10-15分钟，之后用冷水洗掉浮油，晾凉后分别放入接种了植物乳杆菌CGMCCNO.9740和没有接种植物乳杆菌CGMCCNO.9740的泡菜水的坛子中，并加入野山椒至泡菜水液面距离坛口10-15cm。盖上坛子盖，在坛沿加上淡盐水，常温下泡制3-5天即可食用，以此来制作泡椒凤爪。与不使用植物乳杆菌CGMCCNO.9740相比，添加植物乳杆菌CGMCCNO.9740可使成品中总生物胺的水平降低了70.47％。由于使用植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌粉生物制剂作为发酵剂，可降解发酵过程中已有及产生的生物胺，使产品更加安全。

实施例9植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌粉生物制剂用于发酵鱼露制备

新鲜黄鲫鱼加入15％(w/w)海盐，混合均匀，然后加入10％(w/w)的植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌粉生物制剂，或者不添加植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌粉生物制剂，混匀后置于发酵容器，六层纱布封口，在35℃下静置发酵，在此期间要进行多次翻拌使鱼逐渐在酶的作用下分解咸汁和渣。分解完毕后，进行露晒，每天翻拌1-2次。日晒1个月左右，逐渐产生香气而趋于成熟。之后抽滤，将竹编长筒插入晒缸中，抽出清液，即得原油。滤渣一般再浸泡过滤二次，鱼渣供作饲料或肥料。最后配制：取不同比例原油、中油、一油混合，即为各级鱼露。与不添加植物乳杆菌CGMCCNO.9740相比，添加植物乳杆菌CGMCCNO.9740能使鱼露成品的总生物胺水平减少了80.25％。植物乳杆菌CGMCCNO.9740菌粉生物制剂的使用可控制生物胺的风险。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，于2014年09月28日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.9740。

2.一种含有权利要求1所述植物乳杆菌CGMCCNo.9740的降解生物胺的生物制剂。

3.一种制备权利要求2所述的用于降解生物胺的生物制剂的方法，其特征在于，将植物乳杆菌CGMCCNo.9740活化培养后离心获得菌体，离心后的菌体经洗涤、离心得到植物乳杆菌CGMCCNo.9740生物制剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括将洗涤、离心得到的菌体用保护剂重悬达到10⁸～10⁹CFU/mL，悬浮培养一段时间后冷冻干燥得植物乳杆菌CGMCCNo.9740菌粉生物制剂。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述保护剂为脱脂乳、海藻糖或蔗糖。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述保护剂是以水为溶剂含有80-120g/L脱脂奶粉、80-120g/L海藻糖、120-160g/L蔗糖的保护剂。

7.权利要求2所述的生物制剂的应用。

8.权利要求1所述植物乳杆菌CGMCCNo.9740在降解食品中的生物胺中的应用方法。

9.权利要求1所述植物乳杆菌CGMCCNo.9740在生产发酵食品中的应用方法。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵食品包括发酵乳、泡菜、泡椒凤爪、鱼露、豆豉、醋。