CN108142890A - 一种可降低传统泡菜生物胺的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及泡菜加工技术领域，具体为一种可降低传统泡菜生物胺的制备方法。该方法包括步骤：1）降解生物胺菌株筛选；2）风味良好的菌株复筛；3）将得到的降解生物胺能力强，且风味好的戊糖乳杆菌和乳酸乳球菌制备成菌泥；4）泡菜原料的辐照处理；5）泡菜的制备；7）葡萄糖、老母水、甘氨酸、葡萄糖内脂等的添加。采用本方法得到的传统四川泡菜生物胺含量低、酸度合适、风味好。

Description

一种可降低传统泡菜生物胺的制备方法
技术领域
本发明属于泡菜加工技术领域，具体为一种可降低传统泡菜生物胺的制备方法。
背景技术
生物胺是一类主要经由氨基酸脱羧或醛、酮经过胺化作用形成的具有生物活性的小分子量含氮化合物的总称。生物胺是生物体内正常的活性成分，具有显著的抗氧化作用、调节血压、调节去甲肾上腺素水平、增加心率、血压和血糖浓度等作用。适量的生物胺有利于人体的健康，但是过量的生物胺会使人体中毒，导致严重的后果，会引起头疼、血压变化、呼吸紊乱、心悸、呕吐等严重反应。水果、蔬菜、肉类、牛奶和鱼等本身就含有低浓度的生物胺；当人体摄入过量的生物胺时，会引起诸如头痛、心悸等过敏反应，严重的还会危及生命；腐胺、尸胺、精胺和亚精胺能够与亚硝酸盐反应产生致癌物质亚硝胺。
目前在肠球菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、埃希氏菌属、变形菌属、假单胞菌属、沙丁氏菌属、链球菌属等菌属中均发现含有氨基酸脱羧酶的基因。泡菜作为我国传统发酵食品，一般自然发酵，但在发酵的过程中由于环境因素或者操作不当，长会使发酵过程中产生大量的生物胺。虽然目前缺乏泡菜中生物胺的限量标准，但共识是应努力减少其中生物胺含量，从而降低泡菜摄入风险，防止其与亚硝酸盐结合产生致癌性的亚硝胺。
随着我国食品产业的兴起和人们对食品安全的关注，食品的安全卫生和品质问题受到广大消费的高度的重视。
发明内容
本发明的发明目的是针对以上技术问题，提供一种可降低传统泡菜生物胺的制备方法。采用本方法得到的传统泡菜(尤其是四川泡菜)中，生物胺含量低、酸度合适、风味好。
为了实现上述目的，本发明的具体技术方案为：
一种可降低传统泡菜生物胺的制备方法，其包括以下步骤：
(1)泡菜水滤液的制备：取成熟的泡菜母水在100目尼龙布下进行过滤，然后进行离心处理，取上清液在0.22-0.45um膜过滤，得到的泡菜水滤液，存放备用；成熟的泡菜母水可采用申请号为201410451973.7中的泡菜母水。
(2)泡菜的制备：将准备制作泡菜的蔬菜清洗干净后溺干，然后密封包装，并进行辐照处理，辐照量为2-5kGy；再将经辐照处理蔬菜和辅料按比例加入灭菌后的泡菜坛中，再向其中加入无菌盐水，并进行搅拌混匀；最后向泡菜坛中添加占蔬菜质量2-5％的甘氨酸和占蔬菜质量0.05-1％的葡糖糖内脂；所述的辅料为老姜、大蒜、红辣椒、花椒和葡萄糖，以新鲜蔬菜的质量计，老姜的添加量为1％，大蒜的的添加量为0.5％，红辣椒的添加量为2％，葡萄糖添加量为1％。无菌盐水的添加量与新鲜蔬菜的质量比为2:1，无菌盐水中食盐的添加量为新鲜蔬菜质量的4％。
(3)菌泥的制备：将筛选出来降解生物胺能力强，且风味好的乳酸乳球菌和戊糖乳杆菌分别制备成菌泥；
(4)菌种的添加和发酵的控制：在泡菜加入乳酸乳球菌菌泥，混匀后达到活菌数为107-108CFU/mL，在20-25℃下发酵24h，然后添加戊糖乳杆菌菌泥，活菌数为106-107CFU/mL，在15-20℃的低温下缓慢发酵，每隔2h摇晃一次泡菜坛，发酵24h后添加泡菜水滤液，提升泡菜风味；以新鲜蔬菜的质量计，所述泡菜水滤液的添加量为5-10％。
(5)发酵成熟的泡菜放入冰箱4℃进行存放，减缓发酵，防止泡菜过酸。
所述降解生物胺能力强，且风味好的乳酸乳球菌和戊糖乳杆菌菌株的筛选方法为：
(1)降解生物胺菌株：将泡菜中筛选的不同菌株在MRS培养基中活化2次，然后在4℃下进行离心5-15min得到菌泥，将菌泥加入含有腐胺、尸胺、组胺、色胺、酪胺、精胺、亚精胺和苯乙胺8种生物胺的蔬菜汁液体培养基中，每种生物胺浓度为100-200mg/L，菌泥混匀后含量为106-107CFU/mL；
(2)风味良好的菌株筛选：将筛选出得降生物胺菌株进行单菌发酵蔬菜，酸度达到0.3％以后进行感官评定，筛选无异味，发酵快的菌株；
(3)将得到的降解生物胺能力强，且风味好的乳酸乳球菌和戊糖乳杆菌进行活化富集，离心后备用。
筛选出来的乳酸乳球菌菌株PCYTY-13，分类命名为Lactococcus lactis，保藏日期为2017年11月20日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.14932。
筛选出来的戊糖乳杆菌菌株PCYSWX-5，分类命名为Lactobacilus pentosus，保藏日期为2016年7月15日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：12793。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的积极效果为：
(一)、可降低传统四川泡菜中的生物胺；
(二)、多菌株组合，降解能力强；
(三)、安全性高，泡菜发酵风味好，酸度适宜。
附图说明
图1为甘氨酸添加量对生物胺的影响曲线图
图2为葡萄糖内脂添加量对生物胺的影响曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
本申请文件中，％如无特殊说明，均表示以新鲜蔬菜质量计，其质量百分含量。
泡菜母水可采用申请号为201410451973.7中的标准进行限定。
本申请中所采用的乳酸乳球菌PCYTY-13，分类命名为乳酸乳球菌Lactococcuslactis，保藏号为CGMCCNo.14932。该菌株已于2017年12月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
戊糖乳杆菌菌株PCYSWX-5，分类命名为Lactobacilus pentosus，保藏日期为2016年7月15日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：12793。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
所述降解生物胺能力强，且风味好的乳酸乳球菌和戊糖乳杆菌菌株的筛选方法为：
菌种的分离与纯化：
取发酵成熟的泡菜母水25mL注入225mL含0.85wt％NaCl的无菌生理盐水中混匀，然后取1mL混匀夜加入9mL的无菌生理盐水中进行梯度稀释；选取3个适宜稀释度(106、107、108)，吸取0.2mL的稀释液加入MRS平板中，涂布棒均匀涂布平板，每个稀释度3个平行；37℃培养48h后选取菌落数在30～300之间的平板记录菌落数。按菌落形态差异(形态、颜色、大小、凸起度、干湿度等)挑选菌落于MRS平板上进行3次划线，然后进行革兰氏染色与接触酶试验，筛选出革兰氏阳性、接触酶阴性的菌株。
降解生物胺菌株的筛选：将从泡菜中筛选出革兰氏阳性、接触酶阴性的不同菌株，在MRS培养基中活化3次后在4℃下进行6000r/min低温离心10min得到菌泥Ⅰ，将菌泥Ⅰ加入各含有100μg/mL的生物胺(腐胺、尸胺、组胺、色胺、酪胺、精胺、亚精胺、苯乙胺)的MRS液体培养基中，混匀后含量为107CFU/mL，37℃发酵24h后测定生物胺残留量，以此作为生物胺降解能力的筛选。
乳酸菌的分离：
将MRS培养基上分离到7株生长状态良好的菌株，分别标记为1号至7号，纯化后进行革兰氏染色和接触酶实验，都为革兰氏阳性和接触酶阴性，初步断定6株都为为乳酸菌。
将乳酸菌分离的7株乳酸菌进行生物胺降解筛选，结果如下表2：
表2泡菜中筛选乳酸菌生物胺降解率(％)
由表可知，每个菌株对不同生物胺的降解能力都不同，选取平均值进行下一步实验。其中4号、6号、7号的降解率达到40％，呈现出6号>7号>4号。
风味筛选：将总生物胺降解能力达到40％的菌株进行泡菜单菌发酵实验，具体为将辐照处理蔬菜和辅料按比例加入灭菌后的泡菜坛中，再向其中加入无菌盐水，并进行搅拌混匀；其辅料可以为老姜、大蒜头、红辣椒、花椒和葡萄糖等。老姜的添加量为1％，大蒜头的的添加量为0.5％，红辣椒的添加量为2％，红辣椒的添加量为2％，葡萄糖添加量为1％，无菌盐水的添加量与新鲜蔬菜的质量比为2:1，无菌盐水中食盐的添加量为新鲜蔬菜质量的4％，然后分别向不同泡菜坛中添加4号、6号、7号的活化后的离心菌泥，混匀后达到107CFU/mL，25℃发酵48h后进行感官评定。6位感官人员对泡菜风味进行打分，结果按平均值计算，实验结果显示7号>6号>4号。
综合分析，选取菌株结果为6号和7号进行后续实验。
筛选菌的分子鉴定：
采用试剂盒(Bacterial DNA Isolation Kit)提取筛选菌株DNA，－20℃保存备用。PCR体系(50μL)：2×PCR Mix 25μL、模板DNA1.5μL、引物27F(AGA GTTTGATCCTGGCTCAG10μmol/L)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT 10μmol/L)各2μL，加双重蒸馏水补充至50μL。反应条件：95℃预热10min；93℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，循环10个周期；接着93℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，循环10个周期；然后，93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环10个周期；最后72℃复延伸5min。PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带为1 500bp左右。将符合16S rDNA片段大小(1500bp左右)的PCR扩增产物送测序公司(成都擎科梓熙生物技术有限公司)测序，测序结果在GenBank数据库中进行比对。发现6号菌为戊糖乳杆菌；7号菌为乳酸乳球菌。
甘氨酸和葡萄糖内脂对生物胺总量的影响，具体结果见图1和图2：
由图1和图2可知，甘氨酸添加量大于2％，可以减少生物胺约40％；葡萄糖内脂添加量达到1％，可以减少生物胺约35％。
在泡菜中加入乳酸乳球菌菌泥，混匀后达到107-108CFU/mL，在20-25℃下发酵24h，然后添加戊糖乳杆菌，混匀后达到107-108CFU/mL，在15-20℃的低温下缓慢发酵每隔2h摇晃一次泡菜坛，以加快发酵。发酵24h添加5-10％泡菜水滤液，提升泡菜风味；发酵成熟的泡菜放入冰箱4℃进行存放。
实施例1：
一种可降低传统泡菜生物胺的制备方法，其步骤如下：
(1)将得到的降解生物胺能力强，且风味好的乳酸乳球菌和戊糖乳杆菌分别进行活化富集，并分别于8000r/min低温离心10分钟后取菌泥备用；
(2)泡菜原料和泡菜母水的预处理：将泡菜清洗干净后溺干然后密封包装，和辅料一起进行辐照处理，辐照量为2kGy。取成熟的泡菜母水在100目尼龙布下进行过滤，然后10000r/min离心10分钟后，取上清液用0.22um膜过滤，得到泡菜水滤液；
(3)泡菜的制备：将辐照处理蔬菜和辅料按比例加入灭菌后的泡菜坛中，再向其中加入无菌盐水，并进行搅拌混匀；其辅料可以为老姜、大蒜头、红辣椒、花椒和葡萄糖等。以新鲜蔬菜质量计，老姜的添加量为1％，大蒜头的的添加量为0.5％，红辣椒的添加量为2％，红辣椒的添加量为2％，葡萄糖添加量为1％，无菌盐水的添加量与新鲜蔬菜的质量比为2:1，无菌盐水中食盐的添加量为新鲜蔬菜质量的4％，然后向泡菜坛中添加蔬菜质量2％的甘氨酸和1％蔬菜质量的葡糖糖内脂；
(4)菌种的添加和发酵的控制：在泡菜加入乳酸乳球菌，混匀后达到108CFU/mL，在25℃下发酵24h，然后添加戊糖乳杆菌，混匀后达到107CFU/mL。在20℃的低温下缓慢发酵每隔2h摇晃一次泡菜坛，以加快发酵。发酵24h添加10％泡菜水滤液，提升泡菜风味；
(5)发酵成熟的泡菜放入冰箱4℃进行存放。
实施例2：
(1)将得到的降解生物胺能力强，且风味好的乳酸乳球菌和戊糖乳杆菌分别进行活化富集，并分别于8000r/min低温离心10分钟后取菌泥备用；
(2)泡菜原料和泡菜母水的预处理：将泡菜清洗干净后溺干然后密封包装，进行辐照处理，辐照量为5kGy。取成熟的泡菜母水在100目尼龙布下进行过滤，然后8000r/min离心10分钟后，取上清液用0.22um膜过滤，得到泡菜水滤液；
(3)泡菜的制备：将辐照处理蔬菜和辅料按比例加入灭菌后的泡菜坛中，再向其中加入无菌盐水，并进行搅拌混匀；其辅料可以为老姜、大蒜头、红辣椒、花椒和葡萄糖等。老姜的添加量为1％，大蒜头的的添加量为0.5％，红辣椒的添加量为2％，红辣椒的添加量为2％，葡萄糖添加量为1％，无菌盐水的添加量与新鲜蔬菜的质量比为2:1，无菌盐水中食盐的添加量为新鲜蔬菜质量的4％，然后向泡菜坛中添加蔬菜质量3％的甘氨酸和2％蔬菜质量的葡糖糖内脂；
(4)菌种的添加和发酵的控制：在泡菜加入乳酸乳球菌菌泥，混匀后达到108CFU/mL，在20℃下发酵24h，然后添加戊糖乳杆菌菌泥，混匀后达到107CFU/mL，在15℃的低温下缓慢发酵每隔2h摇晃一次泡菜坛，以加快发酵。发酵24h添加10％泡菜水滤液，提升泡菜风味；
(5)发酵成熟的泡菜放入冰箱4℃进行存放。
以实施例1和2中制备得到的泡菜为例，测试不同条件下(3天)乳酸菌发酵泡菜对生物胺的降解率，具体见表1：
表1乳酸菌发酵泡菜生物胺含量(mg/kg)
生物胺 自然发酵 实施例1 实施例2
色胺 0.87±0.07 0.29±0.01 0.32±0.05
苯乙胺 - 0.06±0.01 0.08±0.01
腐胺 53.32±2.69 12.66±0.50 11.66±0.91
尸胺 11.85±0.33 6.14±0.20 5.64±0.90
组胺 18.71±1.02 5.33±0.24 4.33±1.17
酪胺 - - -
精胺 - - -
亚精胺 - - -
总生物胺含量 84.75±2.07 24.48±0.54 22.02±2.93
由上表可知，本专利通过辐照、乳酸菌控制发酵处理，添加一定量的甘氨酸和葡糖糖内脂后的泡菜生物胺含量在24.85±0.54mg/kg，而自然发酵泡菜生物胺含量为84.75±2.07mg/kg，此专利方法按例子1得到的泡菜生物胺含量减少约71％，发酵后风味良好，质地脆口。此专利方法按例子2得到的泡菜生物胺含量减少约74％，发酵后风味良好，质地微软。
以上所述实例仅是本专利的优选实施方式，但本专利的保护范围并不局限于此。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利原理的前提下，根据本专利的技术方案及其专利构思，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本专利的保护范围。

Claims (8)

1.一种可降低传统泡菜生物胺的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）泡菜水滤液的制备：取成熟的泡菜母水在100目尼龙布下进行过滤，然后进行离心处理，取上清液用0.22-0.45um膜过滤，得到的泡菜水滤液，存放备用；
（2）泡菜的制备：将准备制作泡菜的蔬菜清洗干净后溺干，然后密封包装，并进行辐照处理，辐照量为2-5kGy；再将经辐照处理蔬菜和辅料按比例加入灭菌后的泡菜坛中，再向其中加入无菌盐水，无菌盐水的添加量与新鲜蔬菜的质量比为2:1，无菌盐水中食盐的添加量为新鲜蔬菜质量的4%，并进行搅拌混匀；最后向泡菜坛中添加一定量的甘氨酸和葡糖糖内脂；
（3）菌泥的制备：将筛选出来降解生物胺能力强，且风味好的乳酸乳球菌和戊糖乳杆菌分别制备成菌泥；
（4）菌种的添加和发酵的控制：在泡菜加入乳酸乳球菌菌泥，混匀后达到活菌数为107-108CFU/mL，在一定温度下发酵24h，然后添加戊糖乳杆菌菌泥，活菌数为106-107CFU/mL，在低温下缓慢发酵，每隔2h摇晃一次泡菜坛，发酵24h后添加泡菜水滤液，提升泡菜风味；
（5）发酵成熟的泡菜放入冰箱4℃进行存放即可。
2.如权利要求1所述可降低泡菜中生物胺的方法，其特征在于：所述的辅料为老姜、大蒜、红辣椒、花椒和葡萄糖，以新鲜蔬菜的质量计，老姜的添加量为1%，大蒜的的添加量为0.5%，红辣椒的添加量为2%，葡萄糖添加量为1%。
3.如权利要求1所述可降低泡菜中生物胺的方法，其特征在于：泡菜坛中添加占蔬菜质量2-5%的甘氨酸和占蔬菜质量0.05-1%的葡糖糖内脂。
4.如权利要求1所述可降低泡菜中生物胺的方法，其特征在于：以新鲜蔬菜的质量计，所述泡菜水滤液的添加量为5-10%。
5.如权利要求1所述可降低泡菜中生物胺的方法，其特征在于：在泡菜中加入乳酸乳球菌菌泥后20-25℃下发酵24h，然后添加戊糖乳杆菌菌泥，在15-20℃的低温下缓慢发酵。
6.如权利要求1所述可降低泡菜中生物胺的方法，其特征在于所述乳酸乳球菌和戊糖乳杆菌菌株筛选方法为：
（1）降解生物胺菌株：将泡菜中筛选的不同菌株在MRS培养基中活化2次，然后在4℃下进行离心5-15min得到菌泥，将菌泥加入含有腐胺、尸胺、组胺、色胺、酪胺、精胺、亚精胺和苯乙胺8种生物胺的蔬菜汁液体培养基中，每种生物胺浓度为100-200mg/L，菌泥混匀后含量为106-107CFU/mL；
（2）风味良好的菌株筛选：将筛选出得降生物胺菌株进行单菌发酵蔬菜，酸度达到0.3%以后进行感官评定，筛选无异味，发酵快的菌株；
（3）将得到的降解生物胺能力强，且风味好的乳酸乳球菌和戊糖乳杆菌进行活化富集，离心后备用。
7.如权利要求6所述可降低泡菜中生物胺的方法，其特征在于：筛选出来的乳酸乳球菌菌株PCYTY-13，分类命名为Lactococcus lactis，保藏日期为2017年11月20日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.14932。
8.如权利要求5所述可降低泡菜中生物胺的方法，其特征在于：筛选出来的戊糖乳杆菌菌株PCYSWX-5，分类命名为Lactobacillus pentosus，保藏日期为2016年7月15日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：12793。
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