CN105274035A

CN105274035A - 一种基于泡菜发酵系统定向筛选益生乳酸菌的方法

Info

Publication number: CN105274035A
Application number: CN201510817503.2A
Authority: CN
Inventors: 伍亚龙; 张其圣; 陈相杰; 李恒; 唐垚
Original assignee: SICHUAN DONGPO CHINESE KIMCHI INDUSTRIAL TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: SICHUAN DONGPO CHINESE KIMCHI INDUSTRIAL TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2015-11-20
Filing date: 2015-11-20
Publication date: 2016-01-27
Anticipated expiration: 2035-11-20
Also published as: CN105274035B

Abstract

本发明属于食品领域，具体为一种基于泡菜发酵系统定向筛选益生菌的方法。该筛选方法为1）低盐常温定向筛选乳酸乳球菌属；2）低盐低温定向筛选魏斯氏菌属；3）中低温低盐筛选肠膜明串珠菌；4）高盐常温筛选植物乳杆菌属。本发明基于泡菜发酵系统筛选所得益生菌，安全性高，可直接用于对人体健康相关保健产品；本发明利用泡菜发酵过程中菌系结构的变化规律，可设计出不同的发酵条件，并在该条件下的特定发酵阶段定向筛选出益生乳酸菌属，方法相对简便，可避免大量分离纯化工作；可避免在菌系结构复杂的泡菜发酵系统中盲选实际所需的益生菌，而且定向筛选出的益生菌属可以按照各自的益生功能，直接进行与之相应的实际应用。

Description

一种基于泡菜发酵系统定向筛选益生乳酸菌的方法

技术领域

本发明属于食品领域，尤其是食品中的泡菜领域，具体为一种基于泡菜发酵系统定向筛选益生菌的方法。

背景技术

益生菌(Probiotic)一词，源自希腊语，其意思是“专管生命"。益生菌的概念最早始于1965年，当时LillyDM首先建议益生菌是指对动物肠道菌群平衡有益的促进物质或微生物。1989年，FullerR等在实验基础上又将益生菌定义为:“益生菌是补充喂养的具有活性的微生物，而且可通过改善肠道菌群的平衡，对宿主动物产生良好的健康效应”；同年，美国食品与药物管理局((FDA)及饲料协会(AAFCO)发布了可以直接饲喂动物的安全菌株41种，其中乳酸菌类17株，双歧杆菌类6株，芽抱杆菌类5株，拟杆菌类4株，霉菌类2株(黑曲霉、米曲霉)，酵母菌类1株，球菌和丙酸菌类6株。

其后随着益生菌相关保健产品的不断出现，益生菌的定义也在不断提出和修正。直到2001年，联合国粮农组织(FAO)与世界卫生组织(WHO)联合专家组将益生菌重新定义为：益生菌，是指经适量服用后，有益于其宿主健康的活的微生物。目前，这一定义被业界公认为益生菌的最适定义。

益生菌广泛存在于自然界，主要来源于人体和动物肠道正常生理性细菌和非肠道细菌。随着对益生菌的不断深入研究，人们从发酵乳制品、发酵肉制品及传统泡菜中也筛选出大量了益生菌，尤其是对人体健康有益的功能性益生乳酸菌。乳酸菌(Lacticacidbacteria)指发酵糖类，主要产物为乳酸的一类无芽抱、革兰氏染色阳性细菌的总称。因其可将碳水化合物发酵成乳酸，故得名。乳酸菌是人及动物肠道中极为重要的生理菌群之一。闫刘慧在其论文《泡菜中乳酸菌特性分析及模拟肠道存活定殖作用研究》提到，目前研究表明乳酸菌可分为43个属，其中较常见的有6个属:链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)、明串珠球菌属(Leucnostoc)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、产抱乳杆菌属(Sporolactobacillus)；其中种数最多的为乳酸杆菌属，有44种，包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)等，主要存在于泡菜等酿造食品、牛乳等发酵乳制品、动物口腔和肠道、腐败肉类中。

随着社会的快速发展，人们生活水平提高的同时也承受着源自各处的压力，随之而来的各种疾病，使得人们对自身的健康越来越重视。而益生乳酸菌对肠道健康非常有益，如增加肠道内乳酸菌量，减少有害菌，防止腹泻；提高机体免疫力、活化巨噬细胞以及产生肿瘤坏死因子、干扰素和IgA等抗体；吸附致癌物及减少粪便中致癌物的浓度，降低与激活致癌物相关的酶活性；降低血清胆固醇以及降血压等。

泡菜，尤其是四川泡菜，历史悠久，工艺成熟，是我国典型的传统发酵食品之一。它是以生鲜蔬菜为原料，添加或不添加辅料，经过低浓度盐水泡渍发酵而成的蔬菜制品。泡菜营养丰富，味道可口，可增加食欲，促进消化，在国内外享有盛誉。大量研究表明，泡菜中乳酸菌代谢产生的高浓度矿物质、乳酸和生物活性物质是构成泡菜独特风味的重要原因。而泡菜中主要的乳酸菌包括乳杆菌属、片球菌属、明串株菌属、链球菌属、乳球菌属。

泡菜中乳酸菌属类在不同发酵阶段中不尽相同。大量相关文献表明，在泡菜发酵初期，好氧微生物占主导地位，异型乳酸菌进行微弱的发酵。随着发酵，产生的乳酸使得体系pH值降低，进而导致果胶酶活性降低，保证泡菜质地脆嫩，使发酵朝正确的方向进行；此时有0.3％-0.4％的乳酸积累量，乳酸菌活性增加，推动发酵进入中期阶段。在发酵中期，随着发酵过程的持续，氧气含量逐渐降低，好氧微生物的生长受到抑制，其中腐败菌大量死亡，而霉菌和酵母生长受到严重阻碍。兼性厌氧微生物数量增加，以同型乳酸菌发酵为主，植物乳杆菌等短乳杆菌发挥主要作用。发酵后期，植物乳杆菌等短乳杆菌的乳酸积累量超过1.0％，此时口感酸爽，为佐餐的最佳配菜。

在泡菜发酵中，温度和盐度是影响乳酸菌种类变化的主要因素。正是因为泡菜在不同盐度、不同温度下的不同发酵阶段中其乳酸菌属类不一致，从而导致在筛选泡菜中益生菌时，不能定向筛选。比如，我们要筛选植物乳杆菌时，如果不确定何种条件(盐度、温度)下的哪个阶段中植物乳杆菌出现并主导发酵的话，就很难筛选出目标菌，甚至可能都筛选不出来。另外，泡菜发酵很快，尤其在老盐水中发酵的泡菜更快，这就使得在泡菜发酵系统中很难筛选出纯的益生乳酸菌属。

发明内容

本发明针对上述技术问题，提出了一种基于泡菜发酵系统定向筛选益生乳酸菌的方法，该方法可定向筛选出泡菜中不同的益生乳酸菌属，简单可行，准确度高，不必反复纯化。

为了实现上述目的，本发明的具体技术方案为：

一种基于泡菜发酵系统定向筛选益生乳酸菌的方法，包括以下步骤：

(1)低盐常温下定向筛选乳酸乳球菌属

乳酸乳球菌也是一类益生菌，可调节肠道微生态，促进营养吸收。乳酸乳球菌细菌素有40多种，目前被广泛应用的只有乳酸链球菌素，因此潜力巨大。在发酵初期，即发酵1～1.5天，于25℃的常温条件下并控制盐度为2～3％，可定向筛选乳酸乳球菌属，乳酸乳球菌的数量可达10⁸cfu/ml。在发酵后期因为不耐酸而逐渐消亡。而在高盐中，本身不利于乳酸乳球菌生长。因此，定向筛选乳酸乳球菌的具体步骤如下：

1)泡菜：将卷心菜切分、洗净，然后装坛(可用1500ml～2000ml的泡菜坛)，再加入用凉开水溶化好的盐水，其中菜：盐水＝1：1(w：w)，最终盐浓度为2～3％(按总质量算，如1kg菜，加1kg盐水，其中盐40～60g，下同)。最后盖好坛盖，加上坛沿水，放入25℃恒温箱中培养；

2)选择培养：泡菜在25℃恒温箱中发酵18～24h，取1ml泡菜发酵液，在生理盐水中进行10倍的梯度稀释。取稀释度为10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8的含菌液0.1ml，均匀涂布在含0.01％(wt％)溴甲酚紫的MRS培养基，然后在37℃恒温箱中培养36h，观察菌落；

3)纯化培养：挑选出使溴甲酚紫MRS培养基变黄的单菌落在MRS平板上划线培养36h，然后挑选出中央隆起、长势较好的乳黄色菌落，进行斜面培养；

4)菌种保藏：斜面培养36h后，接入液体培养MRS培养36h，然后甘油管(其中甘油v：水v＝1:1，加菌液0.8～0.9ml，下同)保藏，-70℃下放置。

(2)低盐低温(10℃)下定向筛选魏斯氏菌属

目前，国内外对魏斯氏菌属的研究还比较有限。但作为乳酸菌的一员，其益生性很值得研究，尤其在β-葡糖苷酶活性、抗真菌性、促进乳杆菌生长等益生作用方面。低盐低温下定向筛选魏斯氏菌属的方法为：在发酵初期，即发酵1～1.5天，于5～10℃的低温条件下并控制盐度为2～3％，定向筛选魏斯氏菌属的具体步骤如下：

1)泡菜：将卷心菜切分、洗净，然后装坛(可用1500ml～2000ml的泡菜坛)，再加入用凉开水溶化好的盐水，其中菜：盐水＝1：1(w：w)，最终盐浓度为2～3％。最后盖好坛盖，加上坛沿水，放入5～10℃恒温箱中培养；

2)选择培养：泡菜在5～10℃恒温箱中发酵24～28h，取1ml泡菜发酵液，在生理盐水中进行10倍的梯度稀释。取稀释度10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8的含菌液0.1ml，均匀涂布在含0.01％(wt％)溴甲酚紫的MRS培养基，然后在37℃恒温箱中培养36h，观察菌落；

3)纯化培养：挑选出使溴甲酚紫MRS培养基变黄的单菌落在MRS平板上划线培养36h，然后挑选出中央扁平、长势较好的暗黄色菌落，进行斜面培养；

4)菌种保藏：斜面培养36h后，接入液体培养MRS培养36h，然后甘油管保藏，-70℃下放置。

(3)中低温低盐下筛选肠膜明串珠菌

肠膜明串珠菌并不能够在肠道系统内定植，而且借助细胞的微生物活动对宿主发挥的积极影响力也非常有限，但是当人体摄入的明串珠菌细胞达到一个相对较高的数量时，其益生效果便能够充分体现。一些研究表明，饮用含有10⁸cfu/mL肠膜明串珠菌的印度达喜酸奶时,可减少儿童的腹泻持续时间。

在泡菜的自然发酵过程中，肠膜明串珠菌肠膜亚种启动泡菜发酵。肠膜明串菌株进行异型乳酸发酵，能够代谢柠檬酸生成双乙酞、CO₂等，可为泡菜坛提供一个厌氧环境，促进同型乳酸发酵。中低温低盐下筛选肠膜明串珠菌的方法为：在发酵起始期，即发酵0～0.5天，于10～15℃的中低温条件下并控制盐度为1.5～2％，定向筛选肠膜明串珠菌属，具体步骤如下：

1)泡菜：将卷心菜切分、洗净，然后装坛(可用1500ml～2000ml的泡菜坛)，再加入用凉开水溶化好的盐水，其中菜：盐水＝1：1(w：w)，最终盐浓度为1.5～2％。最后盖好坛盖，加上坛沿水，放入10～15℃恒温箱中培养；

2)选择培养：泡菜在10～15℃恒温箱中发酵0～12h，取1ml泡菜发酵液，在生理盐水中进行10倍的梯度稀释。取稀释度10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8的含菌液0.1ml，分别在LMM培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养2～3天。然后挑取典型菌落在含有古霉素(30ug/ml)的MRS平板上划线，并置于25℃培养箱中厌氧培养2～3天，观察菌落生长状况。其中LMMP培养基配方为：

成分	含量(g/L或ml/L)
		蔗糖	100.0
酵母膏	2.5
		硫酸铵	0,2
K₂HPO₄	5.0
		MgSO4·7H2O	0.2
NaCl	0.6
		琼脂	14.0
pH＝7.8，114℃，灭菌20min

3)纯化培养：挑选长势较好的单菌落进一步在含有万古霉素的MRS固体培养基上划线分离1～2次，挑选表面光滑边缘整齐的灰白色圆形菌落转入MRS固体斜面培养；

4)菌种保藏：斜面培养48h～60h后，接入液体培养MRS培养48h～60h，然后甘油管保藏，-70℃下放置。

(4)高盐常温下筛选植物乳杆菌属

植物乳杆菌是一种重要的益生菌，它能代谢能产生有机酸、过氧化氢、双乙酞和细菌素等物质，这些物质能够抑制病原菌和腐败菌，是其具有特殊保健功能的原因之一。很多研究表明，在泡菜发酵过程中，最终由植物乳杆菌终止发酵，即在泡菜成熟后期，整个泡菜发酵系统中，植物乳杆菌占绝对优势。同样，高盐常温下筛选植物乳杆菌属的方法为：在发酵的后期，即发酵5～7天，于常温条件下并控制盐度为8～12％，高盐常温条件定向筛选植物乳杆菌的具体步骤如下：

1)泡菜：将卷心菜切分、洗净，然后装坛(实验室可用1500ml～2000ml的泡菜坛)，再加入用凉开水溶化好的盐水，其中菜：盐水＝1：1(w：w)，其中盐浓度为8％。最后盖好坛盖，加上坛沿水，放入25℃恒温箱中培养；

2)选择培养：泡菜在25℃恒温箱中培养7d～10d，取1ml泡菜发酵液，在生理盐水中进行10倍的梯度稀释。取稀释度10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8的含菌液1ml，用倾注于MRS平板中，在37℃恒温箱中培养24h，观察菌落。其中，所用MRS培养基中添加1.5～2％碳酸钙、0.05‰的纳他霉素；

3)纯化培养：挑选出有溶钙圈、呈乳白色、不透明、圆形光滑的单菌落，在MRS平板上划线培养24h，然后挑选出长势较好的乳白色圆形菌落，进行斜面培养；

4)菌种保藏：斜面培养36h后，接入液体培养MRS培养24～28h，然后甘油管保藏，-70℃下放置。

本发明的积极效果为：

(1)本发明基于泡菜发酵系统筛选所得益生菌，安全性高，可直接用于对人体健康相关保健产品；

(2)利用泡菜发酵过程中菌系结构的变化规律，可设计出不同的发酵条件，然后在特定的发酵阶段定向筛选出益生乳酸菌属，方法简便，可避免大量分离纯化工作；

(3)定向筛选出的益生菌属可以按照各自的益生功能，分别进行实际应用，如利用植物乳杆菌进行高质量泡菜制作。这样可避免在菌系结构复杂的泡菜发酵系统中海选一类所需的益生菌；

附图说明

图1为泡菜中乳酸菌、酵母菌、肠杆菌随发酵时间变化的曲线示意图；

图2为本发明中定向筛选益生乳酸菌的流程示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

实施例1：

一种基于泡菜发酵系统定向筛选益生乳酸乳球菌的方法，步骤如下：

1)泡菜：将卷心菜切分、洗净，装800g到2000ml的泡菜坛中。然后称取32g食用碘盐用凉开水定容到800g后加入装好菜的泡菜坛中。最后盖好坛盖，加上坛沿水，放入25℃恒温箱中培养；

2)选择培养：待泡菜在发酵18～24h时，取1ml泡菜发酵液，在生理盐水中进行10倍的梯度稀释。取稀释度10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8的含菌液0.1ml，均匀涂布在含0.01％溴甲酚紫的MRS培养基，然后在37℃恒温箱中培养36h，观察菌落；

4)菌种保藏：斜面培养36h后，接入液体培养MRS培养36h，然后甘油保藏，-70℃下放置。

该方法筛选出的乳酸乳球菌属，不能达到种的级别，如果需要鉴定到种的级别还需要进行相关生理生化实验，但该方法筛选出的乳酸乳球菌属可以直接用于相关保健产品的开发。另外，该方法筛选出的乳酸乳球菌在液体MRS中容易活化，说明活性较高。

实施例2：

一种基于泡菜发酵系统定向筛选魏斯氏菌属的方法，具体步骤如下：

1)泡菜：将卷心菜切分、洗净，装800g到2000ml的泡菜坛中。然后称取32g食用碘盐用凉开水定容到800g后加入装好菜的泡菜坛中。最后盖好坛盖，加上坛沿水，放入5～10℃恒温箱中培养；

2)选择培养：待泡菜发酵24～28h，取1ml泡菜发酵液，在生理盐水中进行10倍的梯度稀释。取稀释度10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8的含菌液0.1ml，均匀涂布在含0.01％溴甲酚紫的MRS培养基，然后在37℃恒温箱中培养36h，观察菌落；

该方法筛选出的魏斯氏菌属，不能达到种的级别，如果需要鉴定到种的级别还需要进行相关生理生化实验，但该方法筛选出的魏斯氏菌属可以直接用于相关保健产品的开发。该方法筛选出来的魏斯氏菌属，低温条件下，可在液体MRS中良好生长。

实施例3：

一种基于泡菜发酵系统定向筛选肠膜明串珠菌的方法，具体步骤如下：

1)泡菜：将卷心菜切分、洗净，装800g到2000ml的泡菜坛中。然后称取32g食用碘盐用凉开水定容到800g后加入装好菜的泡菜坛中。最后盖好坛盖，加上坛沿水，放入10～15℃恒温箱中培养；

2)选择培养：待泡菜发酵0～12h，取1ml泡菜发酵液，在生理盐水中进行10倍的梯度稀释。取稀释度10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8的含菌液0.1ml，分别在LMM培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养2～3天。然后挑取典型菌落在含有古霉素(30ug/ml)的MRS平板上划线，并置于25℃培养箱中厌氧培养2～3天，观察菌落生长状况。其中LMMP培养基配方为：

成分	含量(g/L或ml/L)
		蔗糖	100.0
酵母膏	2.5
		硫酸铵	0,2
K₂HPO₄	5.0
		MgSO₄·7H₂O	0.2
NaCl	0.6
		琼脂	14.0
pH＝7.8，114℃，灭菌20min

4)菌种保藏：斜面培养48h～60h后，接入液体培养MRS培养48h～60h，然后甘油保藏，-70℃下放置。

该方法筛选出的肠膜明串菌株，可利用柠檬酸代谢，虽不能达到种的级别，但也可以作为发酵剂菌种或非发酵剂乳酸菌应用到发酵乳制品当中，来提高产品的感观质量或功能型性效果。但目前国内尚无明串珠菌参与发酵的乳制品，因此选育具有优良性状的肠膜明串株菌种，将会在很大程度上促进国内发酵乳制品种类的多样化，同时提高产品的感观质量和功能效果。

实施例4：

高盐常温下筛选植物乳杆菌属

1)泡菜：将卷心菜切分、洗净，装800g到2000ml的泡菜坛中。然后称取128g食用碘盐用凉开水定容到800g后加入装好菜的泡菜坛中。最后盖好坛盖，加上坛沿水，放入25℃恒温箱中培养；

2)选择培养：待泡菜发酵7d时，取1ml泡菜发酵液，在生理盐水中进行10倍的梯度稀释。取稀释度10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8的含菌液1ml，用倾注于MRS平板中，在37℃恒温箱中培养24h，观察菌落。其中，所用MRS培养基中添加1.5～2％(wt)碳酸钙、0.05‰(wt)的纳他霉素；

4)菌种保藏：斜面培养36h后，接入液体培养MRS培养24～28h，然后甘油保藏，-70℃下放置。

该方法筛选出的植物乳杆菌，在500L发酵罐中发酵后，经过冷冻干燥制成乳酸菌粉，然后用来做直投式乳酸菌泡菜，不但可以促进泡菜成熟，而且可以有效抑制大肠杆菌等有害微生物，同时发酵成熟的泡菜，其风味更加充足，味道更佳可口。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于泡菜发酵系统定向筛选益生乳酸菌的方法，其特征在于：所述的益生乳酸菌为乳酸乳球菌属、魏斯氏菌属、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌属；筛选方法为1）低盐常温下定向筛选乳酸乳球菌属；2）低盐低温下定向筛选魏斯氏菌属；3）中低温低盐下筛选肠膜明串珠菌；4）高盐常温下筛选植物乳杆菌属。

2.根据权利要求1所述的基于泡菜发酵系统定向筛选益生乳酸菌的方法，其特征在于所述1）低盐常温下定向筛选乳酸乳球菌属具体包括以下步骤：于25℃的常温条件下并控制盐度为2~3%，在发酵初期，即发酵1~1.5天，定向筛选乳酸乳球菌属。

3.根据权利要求1所述的基于泡菜发酵系统定向筛选益生乳酸菌的方法，其特征在于所述2）低盐低温下定向筛选魏斯氏菌属具体包括以下步骤：于5~10℃的低温条件下并控制盐度为2~3%，在发酵初期，即发酵1~1.5天，定向筛选魏斯氏菌属。

4.根据权利要求1所述的基于泡菜发酵系统定向筛选益生乳酸菌的方法，其特征在于所述3）中低温低盐下筛选肠膜明串珠菌具体包括以下步骤：于10~15℃的中低温条件下并控制盐度为1.5~2%，在发酵起始期，即发酵0~0.5天，定向筛选肠膜明串珠菌属。

5.根据权利要求1所述的基于泡菜发酵系统定向筛选益生乳酸菌的方法，其特征在于所述4）高盐常温下筛选植物乳杆菌属具体包括以下步骤：在发酵的后期，即发酵5-7天，于常温条件下并控制盐度为8~12%，定向筛选植物乳杆菌属。