CN108077934A - 一种可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊及其制备方法 - Google Patents

一种可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及菌种制备技术领域，具体为一种可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊及其制备方法。该方法包括步骤：1）降解亚硝胺菌株筛选；2）耐酸、耐胆盐菌株筛选；3）将得到的降解亚硝胺能力强，且耐酸和耐胆盐的戊糖乳杆菌和短乳杆菌分别进行冷冻干燥后均匀粉碎；4）将获得的戊糖乳杆菌和短乳杆菌按10:1‑1:2进行复配；5）将果葡糖浆：大豆油：菌粉按比例搅拌混匀制成膏状，上述混合液置于沸腾包衣机中，在物料温度30‑45℃，喷雾压力0.1‑0.50 MPa，流速2‑10 g/min条件下包肠溶衣，取出前干燥2‑10 min，用10‑40目筛选整粒。采用本方法得到的泡菜乳酸菌可降低人体内亚硝胺，解决肠溶性好。

Description

一种可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊及其制备方法
技术领域
本发明涉及菌种制备技术领域，具体为一种可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊及其制备方法。
背景技术
亚硝胺是N-亚硝基化合物的一种，通常是由亚硝酸盐与胺和其他含氮物质在适宜条件下经亚硝基化作用易生成亚硝胺。
常见的食物、化妆品、啤酒、香烟中都含有亚硝胺。在熏腊食品中，含有大量的亚硝胺类物质，人食用后在体内就会有残留，量大就会危害人体健康。某些消化系统肿瘤，如食管癌的发病率与膳食中摄入的亚硝胺数量相关。例如，在习惯吃熏鱼的冰岛、芬兰和挪威等国家，胃癌的发病率非常高。我国的胃癌和食管癌高发区的居民也有喜食烟熏肉和腌制蔬菜的习惯。不合理的加工方式，容易导致食品中亚硝胺过量，危害人体健康。然而常见的乳酸菌剂在人体服用后在胃酸中不耐酸，不耐盐，容易死亡，且胃和肠道中含有许多蛋白酶，容易分解乳酸菌，最后在肠道中的乳酸菌数量很少。
随着我国食品产业的兴起和人们对食品安全的关注，食品的安全卫生和品质问题受到广大消费的高度的重视。
发明内容
本发明的发明目的是针对以上技术问题，提供一种可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊，制备得到的泡菜乳酸菌胶囊适合不同年龄人群，可降低人体内亚硝胺，降解亚硝胺能力强，可解决肠溶性好，耐酸、耐胆盐。
本发明的另外一个发明目的为提供一种以上所述可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊的制备方法。
为了实现以上发明目的，本发明的具体技术方案如下：
一种可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊，其包括以下原料：复合菌粉，果葡糖浆和大豆油；其中，复合菌粉中，戊糖乳杆菌和短乳杆菌的质量比为10:1-1:2，按质量比计，果葡糖浆：大豆油：菌粉＝1：1：1-1:1:10。
以上所述可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊的制备方法，包括以下步骤：
2.1)将戊糖乳杆菌和短乳杆菌按比例复配，并制备成复合菌粉；
2.2)将果葡糖浆：大豆油：复合菌粉按比例搅拌混匀制成膏状，再将其置于沸腾包衣机中，在物料温度30-45℃，喷雾压力0.1-0.50MPa，流速2-10g/min条件下包肠溶衣，取出前干燥2-10min，用10-40目筛选整粒。
所述复合菌粉的制备方法包括以下步骤：
3.1)降解亚硝胺菌株额筛选：将泡菜中筛选的不同菌株在MRS培养基中活化2次，然后在4℃下进行离心5-15min得到菌泥Ⅰ，将菌泥Ⅰ加入含有200-300μg/mL亚硝胺的MRS液体培养基中，混匀后含量为105-106CFU/mL；
3.2)耐酸、耐胆盐筛选：将亚硝胺降解能力达到10-20％以上的菌株进行耐酸、耐胆盐测试，并将1mol/L的HCl溶液涂布在MRS平板表面上，然后取1ml 105-106CFU/mL的菌泥Ⅰ按不同浓度梯度进行稀释，取1mL稀释液涂布在平板上进行培养，观察生产情况，并计数，将上述不同浓度稀释液涂布在含有2.0-5.0g/L的猪胆盐和牛胆盐的MRS平板表面上，观察生产情况，并计数；
3.3)菌粉的制备：将得到的降解亚硝胺能力强，且耐酸和耐胆盐的戊糖乳杆菌和短乳杆菌分别进行冷冻干燥；即分别将菌株在MRS培养基中进行高密度培养，培养后的菌悬液在4℃下进行4000-6000r/min离心5-15min，得到菌泥Ⅱ，再加入冷冻保护剂进行梯度混匀，然后将菌泥混合物分别在4-0℃，0-15℃、-15-30℃、-30-45℃下进行梯度预冷，然后在冻干机中进行冷冻干燥，厚度在0.5cm，冻干后进行均匀粉碎；所述冷冻的条件为:冷井温度-20-35℃、板温30-50℃、冻干时间20-45h，分别得到戊糖乳杆菌粉和短乳杆菌粉。所述的冷冻保护剂按质量计，菌泥Ⅱ：脱脂奶粉：山梨醇：海藻糖：吐温＝100:2-5:0.2-1:1-3:0.5-1。
3.4)菌粉的复配：将获得的戊糖乳杆菌粉和短乳杆菌粉按质量比10:1-1:2进行复配，得复合菌粉。
以上所述的戊糖乳杆菌和短乳杆菌均可直接采用保藏的菌种，分别进行活化，然后接入MRS培养基，经增殖培养、离心分离，添加保护剂和冷冻干燥后分别得戊糖乳杆菌粉和短乳杆菌粉。
戊糖乳杆菌，其菌株为PCYSWX-5，分类命名为戊糖乳杆菌的菌株Lactobaciluspentosus，保藏日期为2016年7月15日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：12793。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
短乳杆菌，其菌株为PCYTY-7，分类命名为短乳杆菌Lactobacilus brevis，保藏日期为2016年7月15日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：12792。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的积极效果体现在：
(一)、可降低人体内亚硝胺；
(二)、多菌剂组合，降解亚硝胺能力强；
(三)、可解决肠溶性好，耐酸、耐胆盐；
(四)、适合不同年龄人群。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
本申请文件中，％如无特殊说明，均表示wt％。
泡菜母水可采用申请号为201410451973.7中的标准进行限定。
一种可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊，其包括以下原料：复合菌粉，果葡糖浆和大豆油；其中，复合菌粉中，戊糖乳杆菌和短乳杆菌的质量比为10:1-1:2，按质量比计，果葡糖浆：大豆油：菌粉＝1：1：1-1:1:10。
以上所述可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊的制备方法，包括以下步骤：
2.1)将戊糖乳杆菌粉和短乳杆菌粉按比例复配，并制备成复合菌粉；
2.2)将果葡糖浆：大豆油：复合菌粉按比例搅拌混匀制成膏状，再将其置于沸腾包衣机中，在物料温度30-45℃，喷雾压力0.1-0.50MPa，流速2-10g/min条件下包肠溶衣，取出前干燥2-10min，用10-40目筛选整粒，得可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊。
实施例1：
一种可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊，其包括以下原料：复合菌粉，果葡糖浆和大豆油；其中，复合菌粉中，戊糖乳杆菌粉和短乳杆菌粉的质量比为4:1，按质量比计，果葡糖浆：大豆油：复合菌粉＝1：1：5。
实施例2：
一种可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊，其包括以下原料：复合菌粉，果葡糖浆和大豆油；其中，复合菌粉中，戊糖乳杆菌粉和短乳杆菌粉的质量比为2:1，按质量比计，果葡糖浆：大豆油：复合菌粉＝1：1：5。
实施例3：
测试戊糖乳杆菌粉和短乳杆菌粉按照不同比例复配后对人体内亚硝胺降解率的影响。
以实施例1为例，其余参数保持不变，仅改变戊糖乳杆菌粉和短乳杆菌粉的质量比，测试同样条件下乳酸菌复配后亚硝胺的降解率，具体见表3：
表3乳酸菌复配后亚硝胺降解率
由上表可知，戊糖乳杆菌粉和短乳杆菌粉按质量比2:1进行复配得到的复合菌粉降低人体内亚硝胺的效果最佳。
进一步的，按照以上具体实施方式中的方法进一步制备得到可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊，继续测定该胶囊的效果，经试验证明，胶囊具有与复合菌粉相同的功效，且胶囊更适合长期保藏，还可以减少菌在胃中的溶解。
实施例4：戊糖乳杆菌粉和短乳杆菌粉的制备
菌种的筛选：
取发酵1年以上的泡菜母水1ml注入9mL含0.85％NaCl的无菌生理盐水中，梯度稀释；选取3个适宜稀释度，吸取0.1mL的稀释液加入MRS平板中，涂布棒均匀涂布平板，每个稀释度3个平行；37℃培养48h后选取菌落数在30～300之间的平板记录菌落数。按菌落形态差异(形态、颜色、大小、凸起度、干湿度等)挑选菌落于MRS平板上进行3次划线，然后进行革兰氏染色与接触酶试验，筛选出革兰氏阳性、接触酶阴性的无芽孢纯培养物。
降解亚硝胺菌株的筛选：将从泡菜中筛选出革兰氏阳性、接触酶阴性的无芽孢纯培养物中的不同菌株，在MRS培养基中活化2次后在4℃下进行6000r/min离心5min得到菌泥Ⅰ，将菌泥Ⅰ加入含有200μg/mL含亚硝胺(NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR)的MRS液体培养基中，混匀后含量为106CFU/mL，以此作为亚硝胺降解能力的筛选。
乳酸菌的分离：
将MRS培养基上分离到6株生长状态良好的菌株，分别标记为1#至6#，纯化后进行革兰氏染色和接触酶实验，都为革兰氏阳性和接触酶阴性，初步断定6株都为为乳酸菌。
将筛选的6株乳酸菌进行亚硝胺降解，结果如下表1：
表1泡菜中筛选乳酸菌亚硝胺降解率
由表可知，每个菌株对不同亚硝胺的降解能力都不同，选取平均值进行下一步实验。其中2号、5号、6号的降解率达到20％，呈现出2号>6号>5号。
耐酸、耐胆盐筛选：将总亚硝胺降解能力达到20％的菌株进行耐酸、耐胆盐测试，具体为将1mol/L的HCl溶液涂布在MRS平板表面上，然后取1ml106CFU/mL的菌泥按不同浓度梯度进行稀释，取1mL稀释液涂布在平板上进行培养，观察生产情况，并计数。将上述不同浓度稀释液涂布在含有2.0g/L的猪胆盐和牛胆盐的MRS平板表面上，观察生产情况，并计数。
将2号、5号、6号菌株进行耐酸、耐胆盐测试，结果如下表
表2耐酸耐胆盐实验结果
通过耐胆盐实验，发现3株菌MRS数量处于同一个数量级，6号>2号>5号，耐酸实验呈现6号>5号>2号，综合分析，耐酸耐胆盐菌株结果为6号>5号>2号。
筛选菌的分子鉴定：
采用试剂盒(Bacterial DNA Isolation Kit)提取筛选菌株DNA，－20℃保存备用。PCR体系(50μL)：2×PCR Mix 25μL、模板DNA1.5μL、引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 10μmol/L)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT 10μmol/L)各2μL，加双重蒸馏水补充至50μL。反应条件：95℃预热10min；93℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，循环10个周期；接着93℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，循环10个周期；然后，93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环10个周期；最后72℃复延伸5min。PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带为1 500bp左右。将符合16S rDNA片段大小(1500bp左右)的PCR扩增产物送测序公司(成都擎科梓熙生物技术有限公司)测序，测序结果在GenBank数据库中进行比对。发现6号菌为戊糖乳杆菌，同植物乳杆菌类似，序列如下：
(ACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGAGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCACCCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAGTCGCGGATCAGCATGCCGCGTGATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACATGAGAGTTTGTACACCAAAGTCGGTGGGGTACTTTTAGGATCAGCCGCCTAGGTGGACAGATGATTAGGTGAGTCGTACAAGGTAACC)；
5号菌为短乳杆菌，序列如下：
(CGGCTGACTCCCGAAGGTTATCTCACCGGCTTTGGGTGTTAAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTAGCCTCACGACTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGTCTTATCTCTAAGATTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACTAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAACCCTTGAACAGTTACTCTCAAAGGTGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCATTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATCGTCTTGGTGGGCCTTTACCTCACCAACTAACTAATACGCCGCGGGATCATCCAGAAGTGATAGCCGAAGCCACCTTTCAAACAAAATCCATGCGGATTTTGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTGCTTCTGGGCAGATTCCCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGCTTCATTGTGAAATCAGTGCAAGCACGTCATTCAACGGAAGCTC)。
(3)复合菌粉的制备：将得到的降解亚硝胺能力强，且耐酸和耐胆盐的戊糖乳杆菌和短乳杆菌分别进行冷冻干燥。
分别将菌株在MRS培养基中进行高密度培养，培养后的菌悬液在4℃下进行6000r/min离心5min，分别得到菌泥Ⅱ，再分别按重量比为5％脱脂奶粉、0.5％山梨醇、2％海藻糖、0.5％吐温进行梯度混匀(分为4次)，然后将菌泥混合物分别在0℃，-10℃、-20℃、-30℃下进行梯度预冷，再在冻干机中进行冷冻干燥，厚度在0.5cm，仪器条件为:冷井温度-35℃、板温45℃、冻干时间30h。冻干后进行均匀粉碎，分别得到戊糖乳杆菌粉和短乳杆菌粉。
以上所述实例仅是本专利的优选实施方式，但本专利的保护范围并不局限于此。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利原理的前提下，根据本专利的技术方案及其专利构思，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本专利的保护范围。

Claims (5)

1.一种可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊，其特征在于包括以下原料：复合菌粉，果葡糖浆和大豆油；其中，复合菌粉中，戊糖乳杆菌粉和短乳杆菌粉的质量比为10：1-1：2，按质量比计，果葡糖浆：大豆油：复合菌粉=1：1：1-1：1：10。
2.根据权利要求1所述可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
2.1）将戊糖乳杆菌粉和短乳杆菌粉按比例复配成复合菌粉；
2.2）将果葡糖浆：大豆油：复合菌粉按比例搅拌混匀制成膏状，再将其置于沸腾包衣机中，在物料温度30-45℃，喷雾压力0.1-0.50 MPa，流速2-10 g/min条件下包肠溶衣，取出前干燥2-10 min，用10-40目筛选整粒得可降低人体内亚硝胺的泡菜乳酸菌胶囊。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述复合菌粉的制备方法包括以下步骤：
3.1）降解亚硝胺菌株的筛选：将泡菜中筛选的不同菌株在MRS培养基中活化2次，然后在4℃下进行离心5-15min得到菌泥Ⅰ，将菌泥Ⅰ加入含有200-300μg/mL亚硝胺的MRS液体培养基中，混匀后含量为105-106 CFU/mL；
3.2）耐酸、耐胆盐筛选：将亚硝胺降解能力达到10-20%以上的菌株进行耐酸、耐胆盐测试，并将1mol/L的HCl溶液涂布在MRS平板表面上，然后取1ml 105-106 CFU/mL的菌泥Ⅰ按不同浓度梯度进行稀释，取1mL稀释液涂布在平板上进行培养，观察生产情况，并计数，将上述不同浓度稀释液涂布在含有2.0-5.0 g/L的猪胆盐和牛胆盐的MRS平板表面上，观察生产情况，并计数；
3.3）菌粉的制备：将得到的降解亚硝胺能力强，且耐酸和耐胆盐的戊糖乳杆菌和短乳杆菌分别进行冷冻干燥；即分别将菌株在MRS培养基中进行高密度培养，培养后的菌悬液在4℃下进行4000-6000 r/min离心5-15min，得到菌泥Ⅱ，再加入冷冻保护剂进行梯度混匀，然后将菌泥Ⅱ混合物分别在4-0℃，0-15℃、-15-30℃、-30-45℃下进行梯度预冷，然后在冻干机中进行冷冻干燥，厚度在0.5cm，冻干后进行均匀粉碎；分别得戊糖乳杆菌粉和短乳杆菌粉；
3.4）菌粉的复配：将获得的戊糖乳杆菌粉和短乳杆菌粉按质量比10:1-1:2进行复配，得复合菌粉。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述冷冻的条件为: 冷井温度-20-35℃、板温30-50℃、冻干时间20-45h。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的冷冻保护剂按质量计，菌泥Ⅱ：脱脂奶粉：山梨醇：海藻糖：吐温=100：2-5：0.2-1：1-3：0.5-1。
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