CN105670974A - 一种高效降解亚硝酸盐的乳酸菌及其在泡菜盐中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体为一种高效降解亚硝酸盐的乳酸菌及其在泡菜盐中的应用。该乳酸菌的分类命名为植物乳杆菌<i>Lactobacillus？plantarum</i>，所述植物乳杆菌的菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？NO：M？2015184，该植物乳杆菌的菌株在发酵液中48h内的产酸速率为3.0×10^-2至4.0×10^-2g/100mL.h，对亚硝酸盐的降解率为88.0-98.0%。本申请中筛选获得的乳酸菌菌株产酸能力强、能高效降解亚硝酸盐，将其通过喷雾干燥制备成活菌菌剂，添加至食用盐中制成泡菜盐，用于泡菜腌制，具有乳酸发酵迅速、降解亚硝酸盐能力强的特点，可极大提高泡菜食用安全性。

Description

一种高效降解亚硝酸盐的乳酸菌及其在泡菜盐中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体为一种高效降解亚硝酸盐的乳酸菌及其在泡菜盐中的应用。

背景技术

我国民间腌制泡菜的历史非常久远，许多地方都具有一家一户自产自食的传统消费习惯。家庭腌制泡菜采用自然发酵，即将蔬菜洗净晾干后用8％(w/v)左右NaCl浓度的食用盐水进行发酵腌制。期间，蔬菜本身附着的乳酸菌发酵产生乳酸，同时还有大量其他的微生物包括一些有害菌等参与，但随着乳酸菌产酸量的增加，泡菜盐水pH值降低，杂菌的生长会受到抑制。不过如果仅靠蔬菜本身附着的乳酸菌发酵产生乳酸，其速度较慢，这就给混杂其中的有害菌提供了生长繁殖的机会，这些有害菌胞内的硝酸盐还原酶会将蔬菜中的硝酸盐还原成亚硝酸盐，造成泡菜亚硝酸盐含量较高的现状，极大地影响了泡菜的食用安全性，给人们的健康带来了不利的影响。

上个世纪八十年代，添加有食品防腐剂苯甲酸钠以及乳酸钙做保脆剂的泡菜盐深受市场青睐。但是，在2000年农业部发布了NY/T392-2000《绿色食品食品添加剂使用准则》，规定禁止在绿色食品中使用苯甲酸钠。所以该产品随之被淘汰，而目前市场销售的所谓泡菜盐仅仅是其粒径大于普通食用盐而已。而将产酸能力强、高效降解亚硝酸盐的乳酸菌通过喷雾干燥制备成活菌菌剂，并将其添加至食用盐中制备成泡菜盐，这一技术和产品还未见报道。将该泡菜盐用于家庭腌制泡菜，可彻底改变自然发酵过程中乳酸发酵缓慢、亚硝酸盐含量高带来的泡菜使用安全性现状，具有重要的经济效益和社会效益。

发明内容

本发明正是针对以上技术问题，提供一种高效降解亚硝酸盐的乳酸菌，该乳酸菌产酸能力强、可高效降解亚硝酸盐，提高泡菜食用安全性。

本发明的另外一个目的是提供一种以上所述高效降解亚硝酸盐的乳酸菌在泡菜盐中的应用。

本发明的具体技术方案如下：

一种高效降解亚硝酸盐的乳酸菌，该乳酸菌的分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，该植物乳杆菌的菌株于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM2015184，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

所述的乳酸菌在MRS培养基中，利用MRS液体培养基对乳酸菌进行富集培养，该菌株在发酵液中48h内的产酸速率为3.0×10^-2至4.0×10^-2g/100mL.h，对亚硝酸盐的降解率为88.0-98.0％。

该植物乳杆菌的筛选：

利用MRS液体培养基对自然发酵泡菜样品中的乳酸菌进行富集培养，将培养液进行十倍系列稀释，用添加2.0％(w/v)CaCO₃的MRS培养基作为分离培养基制备浇注平板，于37℃的条件下培养48h，挑选透明圈直径和菌落直径比较大的菌落进行分离纯化，经纯化后的菌株进行乳酸定性试验，即纸层析试验，确认菌株产乳酸。将分离菌株接种至MRS液体培养基中，37℃培养48h，采用电位滴定法测定各分离菌株发酵液总酸，复筛出高产乳酸菌株。将高产乳酸菌株接种于含有亚硝酸盐40.00μg/mL的MRS培养基中，对其降解亚硝酸盐能力进行测定，筛选出产酸能力强、高效降解亚硝酸盐能力的乳酸菌株。

所述的植物乳杆菌通过喷雾干燥制备成活菌菌剂的方法，包括以下步骤：

菌泥制备：将植物乳杆菌菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养18h至生长对数末期，4000r/min离心10min，用质量百分浓度为0.85％的NaCl溶液冲洗3次，收集菌泥。

乳酸菌活菌菌剂干燥：将4.0-6.0％(w/V)脱脂乳、4.0-6.0％(w/V)海藻糖、2.0-4.％(w/V)谷氨酸钠作为喷雾干燥复配保护剂，于蒸馏水中加热溶解，冷却后将菌泥与保护剂按比例1:3(g:L)重悬于复配保护剂中，进行干燥；干燥条件：进口温度为130℃，进样量60mL/h，风机功率90％，清洗喷嘴频率4，pH值为4.47。

该菌剂中植物乳杆菌的存活率为82.3％，活菌数为2.7×10⁸cfu/mL。

将所述的植物乳杆菌添加至食用盐制备成泡菜盐的方法：将植物乳杆菌活菌菌剂按0.15％(w/w)-0.60％(w/w)添加至食用盐中制得预混小样，再将预混小样与其余食盐在混料机中缓慢、匀速混匀，即制得泡菜盐。

所述泡菜盐的使用方法：将泡菜盐按6.0-8.0％(w/v)的浓度加至冷却至室温的冷开水中，蔬菜洗净晾干后加入其中，密闭，腌制成熟即可使用，作为优选，建议蔬菜的加入量kg：冷开水体积L＝1:2。

所述泡菜盐在泡菜腌制过程中，发酵7d，泡菜乳酸生成速率可达1.0×10^-3至1.5×10^-3g/100mL.h，亚硝酸盐含量为0.026-1.301mg/kg，降解率为95.0-99.9％。

本发明的积极效果体现在：

(一)本申请中筛选获得的乳酸菌菌株产酸能力强、能高效降解亚硝酸盐。

(二)将其通过喷雾干燥制备成活菌菌剂，并添加至食用盐中制成泡菜盐，用于泡菜腌制，具有乳酸发酵迅速、降解亚硝酸盐能力强的特点，可极大提高泡菜食用安全性。

附图说明

图1为各分离菌株发酵产酸速率曲线图。

图2为亚硝酸盐标准曲线图。

图3为分离菌株对亚硝酸盐降率曲线图。

图4为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)16SrDNA的系统发育树。

图5为含不同乳酸菌菌剂添加量泡菜盐在泡菜腌制过程中产酸速率曲线图。

图6为含不同乳酸菌菌剂添加量泡菜盐在泡菜腌制过程中对亚硝酸盐降解率曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

实施例1：

产酸能力强的菌株的筛选

利用MRS液体培养基对自然发酵泡菜样品中的乳酸菌进行富集培养，将培养液进行十倍系列稀释，用添加2.0％(w/v)CaCO₃的MRS培养基作为分离培养基制备浇注平板，37℃培养48h，挑选透明圈直径和菌落直径之比较大菌落进行分离纯化，经纯化后的菌株进行乳酸定性试验即纸层析试验，确认菌株产乳酸。将分离菌株接种至MRS液体培养基中，37℃培养48h，采用电位滴定法测定各分离菌株发酵液总酸，各分离菌株发酵产酸速率见图1。从中获得三株产酸能力强的菌株，即A1、A2、A3。

高效降解亚硝酸盐乳酸菌菌株的筛选

将筛选出的产酸能力较强的菌株A1、A2、A3接种于含有亚硝酸盐40.00μg/mL的MRS培养基中，对其降解亚硝酸盐能力进行测定。测定步骤为：(1)亚硝酸盐标准曲线的测定：准确移取0、1、2、3、4、5、6、7、8、9mL4μg/mL的亚硝酸盐标准使用液于25mL带塞比色管中，于标准管与试样管中分别加入2mL4g/L对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置3-5min后，各加入1mL2g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用分光光度计在OD₅₄₀下测定吸光度，绘制标准曲线，同时做试剂空白，见图2所示；(2)降解亚硝酸盐能力测定：样品前处理：称取10g经绞碎混匀的试样，置于烧杯中，加12.5mL硼砂饱和液，搅拌均匀，以70℃左右的水将试样洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出冷却至室温，加入5mL亚铁氰化钾溶液，同时转动摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液，沉淀蛋白质，加水至刻度，摇匀，放置30min，过滤，弃去初滤液30mL，滤液备用。

亚硝酸盐测定步骤同亚硝酸盐标准曲线的测定除将亚硝酸盐标准使用液换成泡菜样品处理液。

$X=\frac{A\&times;1000}{m\&times;1000\&times;\frac{V_2}{V_1}}$

亚硝酸盐含量计算公式：

式中，X为试样中亚硝酸盐的含量，单位为mg/kg；m为试样质量，单位为g；A为测定用样液中亚硝酸盐的质量，单位为ug；V₁为试样处理液总体积，单位为mL；V₂为测定用样液体积，单位为mL。亚硝酸盐标准曲线见图2。

各分离菌株对亚硝酸盐降解能力结果见图3。由图3可知，MRS培养基发酵液中亚硝酸盐残留量最少为A2菌株，该菌株在48h内降解率可高达96.88％，由此可确定A2菌株即为产酸能力强、高效降解亚硝酸盐能力的乳酸菌株。

产酸能力强、高效降解亚硝酸盐的菌株的分子生物学鉴定

对获得的产酸能力强、高效降解亚硝酸盐的乳酸菌株进行分子生物学鉴定，将分离菌株测出的序列在NCBI网站上进行序列比对，并构建系统发育树，见图4，确定所筛得的乳酸菌株的种属。将菌株保藏于中国典型微生物保藏中心，乳酸菌株种属及保藏编号：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CCTCCM：2015184。

乳酸菌活菌菌剂的制备

菌泥制备：将植物乳杆菌菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养18h至生长对数末期，4000r/min离心10min，用0.85％的NaCl溶液冲洗3次，收集菌泥；悬浮液制备：将4.0-6.0％(w/V)脱脂乳、4.0-6.0％(w/V)海藻糖、2.0-4.0％(w/V)谷氨酸钠作为喷雾干燥复配保护剂，于蒸馏水中加热溶解，冷却后将菌泥与保护剂按比例1:3(g:L)重悬于复配保护剂中，进行干燥；干燥条件：进口温度为130℃，进样量60mL/h，风机功率90％，清洗喷嘴频率4，pH值为4.47，此时植物乳杆菌的存活率为82.3％，活菌数为2.7×10⁸cfu/mL。

泡菜盐配方的确定

将泡菜盐按6.0-8.0％(w/v)的浓度加至冷却至室温的冷开水中，蔬菜洗净晾干后加入其中，密闭，腌制成熟即可使用，蔬菜的加入量kg：冷开水体积L＝1:2。将乳酸菌活菌菌剂按0.00％、0.15％、0.30％、0.45％、0.60％(w/w)添加至食用盐中，混合均匀，制备成泡菜盐，以泡菜腌制过程中泡菜产酸速率和亚硝酸盐降解率为指标，将确定泡菜盐配方，结果见图5、图6。由图5可知，添加有该泡菜盐的试验组产酸速率明显比未添加该泡菜盐组高，产酸速率高可抑制泡菜中腐败菌的生长，延长泡菜的保质期，且酸能分解亚硝酸盐，降低泡菜中亚硝酸盐、增加泡菜的食用安全性。由图6可知，该试验组的最终亚硝酸盐降解率大多能达到99％以上(除了接种量为0.15％的试验组降解率为78.96％)，而泡菜盐接种量为0.00％(w/w)的泡菜亚硝酸盐降解率仅为41.25％，从泡菜盐生产成本、泡菜乳酸含量及亚硝酸盐降解率等方面考虑，该泡菜盐在泡菜制作工艺中最适添加量选择0.45％(w/w)为宜。

Claims (6)

1.一种高效降解亚硝酸盐的乳酸菌，其特征在于：该乳酸菌的分类命名为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，所述植物乳杆菌的菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2015184。

2.根据权利要求1所述的高效降解亚硝酸盐的乳酸菌，其特征在于具有如下特征：该植物乳杆菌的菌株在发酵液中48h内的产酸速率为3.0×10^-2至4.0×10^-2g/100mL.h，对亚硝酸盐的降解率为88.0-98.0%。

3.一种根据权利要求1所述的高效降解亚硝酸盐的乳酸菌在泡菜盐中的应用，其特征在于：泡菜盐在泡菜腌制过程中，发酵7d，泡菜乳酸生成速率为1.0×10^-3至1.5×10^-3g/100mL.h，亚硝酸盐含量为0.026-1.301mg/kg，降解率为95.0-99.9%。

4.根据权利要求3所述高效降解亚硝酸盐的乳酸菌在泡菜盐中的应用，其特征在于：将植物乳杆菌活菌菌剂按0.15%(w/w)-0.60%(w/w)添加至食用盐中制得预混小样，再将预混小样与其余食盐在混料机中缓慢、匀速混匀，即制得泡菜盐。

5.根据权利要求4所述高效降解亚硝酸盐的乳酸菌在泡菜盐中的应用，其特征在于所述的植物乳杆菌通过喷雾干燥制备成活菌剂，具体包括以下步骤：

（1）菌泥制备：将植物乳杆菌菌株接种于MRS液体培养基中，于37℃培养18h至生长对数期的末期，4000r/min离心10min，用质量百分含量为0.85%的NaCl溶液冲洗3次，收集菌泥；

（2）乳酸菌活菌菌剂干燥：将4.0-6.0%（w/V）脱脂乳、4.0-6.0%（w/V）海藻糖、2.0-4.0%（w/V）谷氨酸钠作为喷雾干燥复配保护剂，于蒸馏水中加热溶解，冷却后将菌泥与保护剂按比例1:3（g:L）重悬于复配保护剂中，进行干燥后得活菌剂，该菌剂中植物乳杆菌的存活率为82.3%，活菌数为2.7×10⁸cfu/mL。

6.根据权利要求5所述高效降解亚硝酸盐的乳酸菌在泡菜盐中的应用，其特征在于步骤（2）中所述的干燥，其干燥条件为：进口温度为130℃，进样量60mL/h，风机功率90%，清洗喷嘴频率4，pH值为4.47。