CN105420128A - 一种富硒胶红酵母菌株fxy-7及其培养方法和在虾饲料添加剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富硒胶红酵母<i>Rhodotorulamucilaginosa</i>？FXY-7的筛选、制备方法及作为虾饲料添加剂的应用，属于微生物技术领域。从泡菜中筛选出富硒能力强的胶红酵母菌，然后通过物理诱变（Co60？诱变）方法，获得了富硒胶红酵母<i>Rhodotorulamucilaginosa</i>？FXY-7，其保藏编号为CCTCC？NO：M？2015687，该菌株能在生长繁殖过程中富硒，从而在饲料中实现有机硒的补给，增加虾产品中的有机硒含量，增加其附加值，节省有机硒在饲料中的添加量，从而有效降低饲料生产成本。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种富硒胶红酵母RhodotorulamucilaginousFXY-7及其培养方法和作为鳌虾饲料添加剂的应用。
背景技术
硒（Se）是动物体必需的微量元素，在维护动物健康方面发挥着重要作用，但过量的硒会对机体产生毒害作用，因此硒在动物饲料中最适添加量的研究得到了广泛开展。鳌虾稻田模式养殖过程中，一些致病菌，特别是肠道条件性致病菌，能迅速繁殖，进而引发病害。目前，主要是通过在饲料中添加抗生素的方法来控制和减弱应激。抗生素补给后可以抑制虾肠道致病菌的生长繁殖、有利于有益菌的生长，从而维持肠道的正常微生物群落结构。然而，抗生素在饲料中的大量使用存在着严重的弊端，比如抗生素引起内源性感染和二重感染、耐药菌株的产生、免疫力下降和水产品及环境中残留等。益生菌具有安全、无污染、具有增强免疫功能等优点，成为抗生素替代品的首选，而酵母更是益生菌中使用最广泛的一种微生态制剂。
充分发挥富硒胶红酵母增强免疫和促进生长的活性，筛选得到富硒能力强的酵母，对鳌虾稻田模式养殖具有重要的现实意义。本专利筛选具有增强免疫和抗应激功能的富硒能力强的胶红酵母菌株；同时，饲料中添加该菌株后，可以降低抗生素在饲料中的添加量，从而有效降低饲料生产成本。目前，高产富硒胶红酵母在鳌虾养殖饲料中的应用尚未有报道。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种富硒胶红酵母，然后通过物理诱变方法，获得了1株高产富硒胶红酵母FXY-7。通过鉴定，该菌株不仅具有胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)的生理生化特性，且同时具备高富硒能力和益生属性，该菌株已于2015年11月20日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7，保藏编号：CCTCCNO：M2015687，地址：中国·武汉·武汉大学(武汉市武昌珞珈山)。
本发明还有一个目的是在于提供了一种富硒胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7的制备方法，其步骤如下：
将泡菜汁样品稀释后涂布到YEPD(10g酵母粉，20g蛋白胨，20g葡萄糖，1L水，15g琼脂，pH6.0)培养基的平板上，28℃下培养，每隔一段时间观察菌落生长状态，并挑取单菌落转接到YEPD斜面上保存，然后用含Na2SeO3(终浓度为0.5g/L)的YEPD培养基中进行富硒酵母菌的筛选，随后将初筛得到的酵母菌用YEPD培养基进行培养，每株菌分为空白组和实验组进行培养，在实验组中加入Na2SeO3(终浓度为0.5g/L)，空白组中不加入，培养24h后，采用国家标准方法(GB5009.93-2010)—原子荧光光度计法测定硒元素含量，获得1株富硒能力最强的酵母原始菌株，经物理诱变后与生理生化鉴定后被命名为富硒胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7，该细菌已于2015年11月20日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：富硒胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7；保藏编号：CCTCCNO：M2015687；地址：中国·武汉·武汉大学(武汉市武昌珞珈山)。
本发明的最后一个目的是在于提供了一种富硒胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7在制备虾饲料添加剂中的应用，为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案：
（1）将胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7在摇瓶中进行发酵培养，发酵温度为28～30℃，pH值为6.0～6.8，转速为180～200r/min，发酵时间为24～32h，摇瓶发酵培养基为YEPD液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。
（2）摇瓶发酵结束后在发酵罐中进行中试发酵，取摇瓶发酵种子液接种到10L发酵罐中，接种量为发酵培养基体积的为6～8%，接种浓度108CFU/ml，发酵罐中装4～7L的培养基，发酵温度为28～30℃，pH值为6.3～6.8，搅拌速度为220-260r/min，发酵28～32h，通气比为1:1，发酵结束后将发酵培养液置于4℃备用，其中，发酵培养基为：乳糖15g、蛋白胨20g、酵母粉10g、硝酸钾2g、Na2SeO30.5g、去离子水1000ml，pH6.5～6.8。
(3)将胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7发酵液直接在商业虾饲料中添加，添加量为1×106-1010CFU/Kg虾饲料。所述试验动物可以为蓝白对虾与鳌虾。
与现有技术相比，本发明具有如下的优点：（1）本发明的胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7具有显著增强免疫、促生长的功能。并通过鳌虾试验验证其对其生长和健康的作用。从而节省养殖成本，提高经济效益，具有良好的应用前景。（2）本发明的胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7能在生长繁殖过程中富硒，从而在饲料中实现有机硒的补给。（30本发明的胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7添加到饲料中后，可以增加虾产品中的有机硒含量，增加其附加值，节省有机硒在饲料中的添加量，从而有效降低饲料生产成本。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围，如未特别说明，本发明所用方法为常规技术，所用试剂均购自生化商店。
实施例1：一种富硒胶红酵母FXY-7，其获得方式如下：
将泡菜汁样品稀释后涂布到YEPD培养基的平板上，28℃下培养，每隔一段时间观察菌落生长状态，并挑取单菌落转接到YEPD斜面上保存。经过初筛筛选到如下酵母菌株：FXY-1、FXY-3,、FXY-7、FXY-5、FXY-7、FXY-10、FXY-11、FXY-19、FXY-21、FXY-23、FXY-24、FXY-25、FXY-38、FXY-72、FXY-73、FXY-74、FXY-76、FXY-77、FXY-79、FXY-50、FXY-53、FXY-55、FXY-56。
在含Na2SeO3(终浓度为0.5g/L)的YEPD平板上涂布进行富硒酵母菌的筛选，随后将初筛得到的酵母菌用YEPD培养基进行培养，每株菌分为空白组和实验组进行培养，在实验组中加入Na2SeO3(终浓度为0.5g/L)，空白组中不加入。培养24h后，采用国家标准方法(GB5009.93-2010)—原子荧光光度计法测定硒元素含量，获得1株富硒能力最强的酵母原始菌株。原始菌株在YEPD培养基中，30℃培养到对数生长期，将培养物在25℃下用500Gray/h的Co60射线照射1h后，再将诱变后的培养物取200μL涂布在含Na2SeO3(终浓度为0.5g/L)的YEPD平板上，30℃培养48h后，将单菌落挑取到含Na2SeO3(终浓度为0.5g/L)的YEPD液体培养基中，最后采用原子荧光光度计法(GB5009.93-2010)测定硒含量。得到1株富硒能力最强的酵母诱变菌株，经过18SITSRNA序列测定与生理生化鉴定后被命名为富硒胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7，该细菌已于2015年11月20日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：富硒胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7；保藏编号：CCTCCNO：M2015687；地址：中国武汉武汉大学。
实施例2：富硒胶红酵母FXY-7的18SITSrRNA基因序列分析
1、染色体DNA（小量）的提取:
（1）取1.5mL菌液（培养24h）于1.5mLEppendorf管中，12000r/min离心5min；（2）弃上清，900μL磷酸缓冲液（PBS）重悬沉淀，4℃12000r/min离心5min；（3）弃上清，加入300TE和200μL10mg/mL溶菌酶，吹吸混匀，37℃温育1h，每隔15min颠倒混匀一次；（4）向沉淀加入600TENS裂解液（200mmol/LNaCl，100mmol/LTril-HClpH8.0，2.0%SDS，50mmol/LEDTA，0.5%TritonX-100）和20mg/mL蛋白酶K10μL，颠倒混匀，55℃温育1h，每隔15min颠倒混匀一次；（5）4℃12000r/min离心5min，取上清；（6）向上清中加入等体积的P:C:I（25:24:1）充分混匀，4℃12000r/min离心10min；（7）重复步骤6；（8）将上清转入新的EP管中，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠，2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃下放置60min，4℃12000r/min离心10min；（9）弃上清，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体后风干，加入30μL无菌水和10mg/mLRNaseA0.5μL，-20℃保存。
2、18SITSrRNA基因序列的PCR扩增
（1）PCR扩增：
2×premixTaq酶25μL，上游引物（20μmol/L）1μL，下游引物（20μmol/L）1μL、模板DNA（200ng/μL1μL、去离子水22μL，总体积50μL。
PCR扩增条件：Step1预变性94oC、10min；Step2×30循环：变性94oC、30s，复性60oC、1min，延伸72oC、1min，30个循环；Step3延伸72oC、10min。
（2）18SITSrRNA基因PCR产物的纯化（参照OmegaBio-tek公司PCR产物纯化试剂盒说明书）
步骤1：将PCR的产物从琼脂糖胶上相应的位置切下回收至Eppendorf管中，加人Bindingbuffer（1g/mL），在65℃水浴7min直到完全溶解。
步骤2：将溶液转移至吸附柱中，10000r/min离心1min，弃去收集管中废液。
步骤3:加入300μL的Bindingbuffer，10000r/min离心1min，弃收集管中废液。
步骤4:加入700μL的SPWbuffer，室温下放置2-3min，10000r/min离心1min，弃去收集管中废液，重复一次。
步骤5:10000r/min空柱离心2min，弃去收集管中废液。
步骤6:将吸附柱放入一个干净的Eppendorf管中，加入30-50μL的Elutionbuffer，12000r/min离心2min收集产物。
（3）18SITSrRNA基因的测序：18SITSrRNA基因序列测定由上海英骏公司完成，测序结果见序列表中的序列1。
酵母FXY-7的18SITSrRNA基因序列（593bp）
GTGGCCGGGATAGGACGTCCACTTACTTGGAGTCCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCACTTGTTTGGGATAGTAACTCTCGCAAGAGAGCGAACTCCTATTCACTTATAAACACAAAGTCTATGAATGTATTAAATTTTATAACAAAATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATACTTCAACCCTCCTCTTTCTTAATGATTGAAGAGGTGTTTGGTTTCTGAGCGCTGCTGGCCTTTACGGTCTAGCTCGTTCGTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGAATTCTAGTCTTCGGACTAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCAGAATGTCTACATTTTAAGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCCGGAGGAAAGG
（4）18SITSrRNA基因序列相似度分析
将测序后的18SITSrRNA基因序列通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网页中的比对程序进行同源性分析。
通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网页中的比对程序进行同源性分析，得出同源性排名前十的菌种如下表1，由此可知，该菌种属于假丝酵母属，我们将其命名为FXY-7。
表1同源性比对分析
| Strain | Accession | Pairwise Similarity % | |
| 1 | Rhodotorula mucilaginosa strain Y9-1 | KF646193 | 99 |
| 2 | Rhodotorula mucilaginosa strain YD3 | KF646195 | 99 |
| 3 | Rhodotorula mucilaginosa isolate OMA Y14 | KR264902 | 99 |
| 4 | Rhodotorula mucilaginosa isolate PKU Y1 | KC113304 | 99 |
| 5 | Rhodotorula mucilaginosa strain KDLYC24-1 | HQ909092 | 99 |
| 6 | Rhodotorula mucilaginosa isolate KDLYL10-1 | JX174412 | 99 |
| 7 | Rhodotorula mucilaginosa strain ASU2 | KP960513 | 99 |
| 8 | Rhodotorula mucilaginosa strain PMM08-1716L | KP132583 | 99 |
| 9 | Rhodotorula mucilaginosa strain SN27 | FJ515192 | 99 |
| 10 | Rhodotorula mucilaginosa CRUB 1100 | EF174512 | 99 |
实施例3：富硒胶红酵母FXY-7的BioMérieuxVITEK2自动鉴定分析
挑取待测菌株菌苔接种于YEPD平板上，30℃培养至对数生长期。用灭菌棉签蘸取试剂盒中Vitek液体后将平板上菌苔刮下，再溶入1.8mlVitek液体中，振荡混匀；使用浊度仪调浊度至指定范围（2MacF）；再用移液枪将菌悬液加入Vitek鉴定板中，菌液搞好装满鉴定孔；然后30℃培养24-48h时取出鉴定板，用BioMérieuxVITEK2自动鉴定分析仪对鉴定板进行数据读取和分析，结果见表2。此生理生化结果与胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)典型生理生化反应相同。
表2酵母FXY-7其生理生化特性
| 生理生化特征 | FXY-7 | 生理生化特征 | FXY-7 |
| L-赖氨酸芳胺酶 | - | D-山梨糖同化 | + |
| L-苹果酸同化 | + | L-鼠李糖同化 | + |
| 亮氨酸芳胺酶 | + | 木糖醇同化 | + |
| 精氨酸GP | + | D-山梨醇同化 | + |
| 赤藻糖醇同化 | - | 蔗糖同化 | + |
| 丙三醇同化 | + | 尿素酶 | -4 --> |
| 酪氨酸芳胺酶 | - | α-葡萄糖苷酶 | - |
| β-N-乙酰葡萄糖胺酶 | - | D-羽红糖同化 | - |
| 杨梅酸同化 | - | D-海藻糖同化 | + |
| 苦杏仁苷同化 | - | 硝酸盐同化 | - |
| α-半乳糖同化 | + | L-阿拉伯糖同化 | + |
| 龙胆二糖同化 | + | D-半乳糖醛同化 | - |
| D-葡萄糖同化 | + | 七叶灵水解 | - |
| 乳糖同化 | + | L-谷氨酸盐同化 | + |
| 甲基葡萄糖甙同化 | - | 木糖同化 | + |
| D-纤维二糖同化 | + | DL-乳酸盐同化 | + |
| γ-谷氨酰转移酶 | + | 醋酸盐同化 | + |
| D-麦芽糖同化 | + | 柠檬酸盐同化 | - |
| D-棉子糖同化 | + | 葡糖醛酸同化 | + |
| PNP-N-乙酰-BD-半乳糖氨酶 | - | L-脯氨酸同化 | + |
| D-甘露糖同化 | + | 2-酮基-葡萄糖酸盐同化 | - |
| D-蜜二糖同化 | - | N-乙酰-氨基葡萄糖同化 | - |
| D-松三糖同化 | + | D-葡萄糖酸盐同化 | + |
注：-表示显阴性，+表示显阳性。
实施例4：一种富硒胶红酵母FXY-7的制备方法，其过程如下：
胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7的培养液2ml（活菌浓度为108-1010CFU/ml），接种于100ml培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为30℃，pH值为6.8，转速为200r/min，发酵时间为24h。摇瓶发酵培养基为YEPD液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。
摇瓶发酵结束后进行发酵罐中试试验，取100ml摇瓶发酵种子液（种子液的浓度为108CFU/ml）接种到10L发酵罐中，装液量5L，发酵温度为30℃，pH值为6.8，搅拌速度为300r/min，发酵24h，通气比为1:1。发酵罐中试培养基与摇瓶发酵培养基成分一致，发酵结束后将发酵培养液置于4℃备用。
实施例5：一株胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7富硒能力分析，其步骤如下：
在每瓶YEPD液体培养基中加10mL硒标液（5‰），空白组不加硒。每个摇瓶中都加入一环活化后的菌种FXY-7，全部的摇瓶在30℃、180r/min环境下培养36h。将长好的菌体加入离心管中，在5000r/min下离心5min，离心后倒掉上清液，再加入去离子水洗涤菌体，震荡摇匀后再离心，一共重复上述操作5次，将菌体清洗干净。将洗涤好后的菌体放入烘箱中烘干。
称取烘干后的菌体0.5g(精确至0.1mg)，放入100ml烧杯中,加10mLHNO3浸泡过夜,再加入2mLHCIO4，同时作空白对照，摇匀，于电热板上低温加热消化至白烟冒尽，如果消解液为黑色或酱褐色，则补加HNO3继续消化至黑色或酱褐色消失且溶液呈淡黄色，剩余约1mL溶液时，加入5mL6moI/LHCI,加热微沸5~10min，冷却，洗入25mL容量瓶中，用6mol/LHCI稀释至刻度。采用国家标准方法（GB5009.93-2010）——原子荧光光度计法测定硒元素含量，测得菌体FXY-7硒含量为4.72mg/g。
实施例6：一种富硒胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7在制备虾饲料添加剂中的应用，其应用过程如下：
试验采用400头体重接近，健康的鳌虾（约12.00g/头）做为实验动物。随机分成4个处理组，每个处理4个重复，每个重复25头。处理1为对照组，商业饲料，不含任何药物添加剂；处理2为抗生素组，在商业饲料中添加一定量抗生素；处理3为低量添加富硒胶红酵母FXY-7组，在商业饲料中补给本发明中的富硒胶红酵母FXY-7（饲料中终浓度1×108CFU/Kg）；处理4为高量添加富硒胶红酵母FXY-7组，在商业饲料中补给本发明中的富硒胶红酵母FXY-7（饲料中终浓度1×1010CFU/Kg）。日投食量按照体重的5%，每天投食2次。喂食30天后，测定鳌虾生长与免疫指标。由试验结果可知，添加富硒胶红酵母均能显著提高鳌虾生长与免疫学指标。
表3.富硒胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7对鳌虾生长的影响
| 项目 | 对照组 | 抗生素组 | 低量添加酵母 | 高量添加酵母 |
| 初始平均体重//g | 12.56±0.32 | 12.40±0.45 | 12.44±0.53 | 12.39±0.60 |
| 终末平均体重//g | 13.70±0.62 | 14.90±0.58 | 14.77±0.63 | 17.15±0.81 |
表4.富硒胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7对鳌虾免疫系统的影响
| 项目 | 对照组 | 抗生素组 | 低量添加酵母 | 高量添加酵母 |
| 血淋巴PO活性//U/ml | 1.70 | 1.78 | 3.21 | 3.58 |
| 血淋巴SOD活性// U/ml | 350 | 367 | 460 | 517 |
实施例7：喂食富硒胶红酵母FXY-7后，对虾肉中硒含量的影响
称取实施例6中鳌虾3.00g(精确至0.1mg)，放入100ml烧杯中，加10mLHNO3浸泡过夜,再加入2mLHCIO4，同时作空白对照，摇匀，于电热板上低温加热消化至白烟冒尽，如果消解液为黑色或酱褐色，则补加HNO3继续消化至黑色或酱褐色消失且溶液呈淡黄色，剩余约1mL溶液时，加入5mL6moI/LHCI，加热微沸5~10min，冷却，洗入25mL容量瓶中，用6mol/LHCI稀释至刻度。国家标准方法（GB5009.93-2010）——原子荧光光度计法测定硒元素含量。测得鳌虾虾肉中硒含量较对照组分别增加了2.09mg/kg，达到富硒食品硒含量大于0.2mg/kg的标准。
Claims (3)
1.一种富硒胶红酵母菌株，其特征在于，该菌株已于2015年11月20日在中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：富硒胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7，保藏编号：CCTCCNO：M2015687。
2.如权利要求1所述的一种富硒胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7的培养方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)将胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7在摇瓶中进行发酵培养，发酵温度为28～30℃，pH值为6.0～6.8，转速为180～200r/min，发酵时间为24～32h；
(2)摇瓶发酵结束后在发酵罐中进行中试发酵，取摇瓶发酵种子液接种到发酵罐中，接种量为发酵培养基体积的6～8％，接种浓度108CFU/ml，发酵温度为28～30℃，pH值为6.3～6.8，搅拌速度为220-260r/min，发酵28～32h，通气比为1:1，发酵结束后将发酵培养液置于4℃备用，所述的培养基为：乳糖15g、蛋白胨20g、酵母粉10g、硝酸钾2g、Na2SeO30.5g、去离子水1000ml，pH6.5～6.8。
3.如权利要求1所述的一种富硒胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7作为虾饲料添加剂的应用，其特征在于，将胶红酵母RhodotorulamucilaginosaFXY-7发酵液直接添加在虾饲料中，添加量为1×108～1010CFU/Kg虾饲料。
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2015
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| CN105420128B (zh) | 2018-09-25 |
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