CN110241049A - 一株具有溶藻能力的假交替单胞菌及其对米氏凯伦藻赤潮的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株具有溶藻能力的假交替单胞菌及其在控制米氏凯伦藻赤潮中的应用，属于有害赤潮处理的微生物学领域。该溶藻菌命名为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas flavipulchra)FDHY‑MQ5，已于2019年5月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2019371。该菌种的发酵液以体积比1%加入指数生长期的米氏凯伦藻中，24小时杀藻率为94.3‑98.2%，经发酵条件优化后，每升的菌液可产出菌粉为18‑20g，菌粉质量分数0.04%加入量在24小时处理条件下对米氏凯伦藻溶藻率为99.67‑100%。

Description

一株具有溶藻能力的假交替单胞菌及其对米氏凯伦藻赤潮的 应用

技术领域

本发明涉及环境微生物领域，具体涉及一株具有溶藻能力的假交替单胞菌及其应用。

背景技术

近几十年来，我国近海由富营养化引起的赤潮发生频率和规模呈现明显增加趋势。最新的调查研究结果显示，近年来全球气候变化和近海环境进一步恶化所引起的海水中二氧化碳浓度和水温的升高，对主要有害赤潮藻类生理造成极大影响，导致主要赤潮原因种由无毒有害种类逐渐演化为多种有毒有害甲藻赤潮物种。目前，米氏凯伦藻已经演化成为我国近海爆发面积最大的有毒有害赤潮藻种，其爆发面积仅次于无毒有害种东海原甲藻，给我国近海的生态系统、生态安全和人民的健康及生命安全带来严重的影响。

米氏凯伦藻是一种典型的鱼毒性有害藻种，对于鱼类等养殖动物具有较高的急性毒性效应，对海水养殖业造成严重破坏。如2005年5月-6月在东海浙江海域发生上万平方千米的米氏凯伦藻赤潮，对南麂岛等地的养殖鱼类造成了毁灭性的打击，直接经济损失达2000万元；2012年5月至6月，福建近岸海域发生米氏凯伦藻赤潮，部分海域赤潮持续时间长达21天，影响面积近300平方千米，期间赤潮发生海域出现养殖鲍鱼大面积死亡，总经济损失达20.11亿元（2012年福建省海洋环境状况公报），为世界上目前报道的赤潮经济损失之最。由于米氏凯伦藻赤潮发生频率逐渐增加、规模不断扩大，引起政府、科研人员和公众的高度关注（中国海洋灾害公报（1997-2016年）），开展米氏凯伦藻赤潮防控方面的研究尤为迫切和必要。

对于赤潮的防控目前主要有物理学、化学以及生物学方法。物理方法机械耗能高并且极有可能对底栖生物造成负面影响，并且无法从根本上治理赤潮。化学方法，包括改良黏土方法，是目前相较之下最有效的方法，会在杀死赤潮生物的同时对非赤潮生物也造成一定程度上的伤害，对海洋环境存在破坏作用。溶藻菌直接来源于目标水体，拥有较好的生态安全性以及高效的溶藻效果，逐渐被应用于赤潮防治的生物制剂开发与研究领域中。另外也有科研人员吸取了传统除藻剂和溶藻细菌制剂两者间的长处，研制出了新型的溶藻制剂。通过分离筛选出具有高效溶藻能力的细菌，并且开发出经济、高效、安全的溶藻菌剂已然成为治理赤潮与水华现象的新思路。生物法符合了各项生态安全的标准，并且具有高效、快速，且负面影响小的特点，溶藻菌作为治理水华与赤潮的生物学方法之一，近年来得到了越来越多人的重视。因此众多的学者认为对溶藻细菌的进行研究和开发利用，对赤潮的预防和治理具有着重要的意义。然而目前尚未有高效杀灭米氏凯伦藻的溶藻菌及菌剂报道。

发明内容

本发明提供一株具有溶藻能力的假交替单胞菌及其应用，并对该菌株进行优化培养和发酵培养，将发酵产物进行菌粉研制用于米氏凯伦藻赤潮的控制。

为实现上述目的采用以下技术方案：

一株具有溶藻能力的假交替单胞菌，为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas flavipulchra) FDHY-MQ5，已于2019年5月20日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：M 2019371，地址为武汉，武汉大学。

所述的假交替单胞菌，菌种生物学特征如下：杆状，单个，革兰氏染色呈阴性，菌落形态为圆形或椭圆形，不透明，菌落呈淡黄色，表面光滑湿润，挑起为粘稠状。

所述的具有溶藻能力的假交替单胞菌的培养方法，包括以下步骤：

（1）菌种：采用所述的假交替单胞菌FDHY-MQ5；

（2）斜面培养：将步骤（1）中的菌种接种于2216E固体斜面培养基上，在25℃条件下培养24小时；

（3）用15 mL无菌海水洗脱菌苔，菌悬液再按体积比 1：20 的比例接种到100 mL 2216E液体培养基中，25 ℃、150 r/min置于恒温振荡器中培养24 h，获得初级培养菌液。

（4）发酵培养：将步骤（3）培养的菌液接种于2000 mL发酵液（组成：2216E液体培养基、果糖终浓度1.0wt.%、蛋白胨终浓度0.5wt.%，pH值调至8.5）中，接种量为5% v/v，20℃，150rpm装液体积百分比30%，培养48小时后，收集发酵液，每升菌液获得菌粉干物质为18-20g。

假交替单胞菌的溶藻菌粉制备方法：

发酵液采用小型喷雾干燥机进行脱水干燥，喷雾口温度120℃，发酵液流速200mL/h,处理10分钟后逐步调整到450mL/h。菌粉制备好后密封，4度保存备用。

所述交替单胞菌在溶解藻类中的应用。所述藻类包括米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi）、赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）、亚历山大藻（Alexandrium tamarense）。

本发明提供了上述假交替单胞菌FDHY-MQ5在控制米氏凯伦藻赤潮中的应用。

上述应用，可将制备的溶藻菌粉按照质量分数0.04%，应用在米氏凯伦藻赤潮现场，24小时溶藻率为99.67-100%；

本发明的主要效果及优点：

1、所筛选的假交替单胞菌FDHY-MQ5对米氏凯伦藻溶藻效果好，对其它常见赤潮藻也有一定的溶藻效果。细菌发酵液对米氏凯伦藻的溶藻性能在24小时内达到94%以上。

2、用交替单胞菌FDHY-MQ5制成的菌粉溶藻率更高，以质量分数0.04%施入，在24小时内溶藻率达99%以上。

3、假交替单胞菌FDHY-MQ5来源于海洋环境，对环境友好，使用过程中不会造成二次污染，在控制米氏凯伦藻赤潮方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1为假交替单胞菌FDHY-MQ5电镜观察图。

图2 体积比1%添加假交替单胞菌FDHY-MQ5菌液对米氏凯伦藻的溶藻效果。

图3不同浓度的假交替单胞菌FDHY-MQ5菌液对米氏凯伦藻的溶藻率。

图4假交替单胞菌FDHY-MQ5菌液1%浓度对常见赤潮的溶藻效果。

图5 不同碳源对假交替单胞菌FDHY-MQ5生长（A）及溶藻率（B）的影响。

图6 不同氮源对假交替单胞菌FDHY-MQ5生长（A）及溶藻率（B）的影响。

图7 不同培养温度对假交替单胞菌FDHY-MQ5生长（A）及溶藻率（B）的影响。

图8 不同发酵时间对假交替单胞菌FDHY-MQ5生长（A）及溶藻率（B）的影响。

图9 不同培养pH值对假交替单胞菌FDHY-MQ5生长。

图10 不同发酵溶氧量对假交替单胞菌FDHY-MQ5生长。

图11 质量分数0.04%的假交替单胞菌FDHY-MQ5菌粉对米氏凯伦藻在不同处理时间的溶藻率。

图12 假交替单胞菌FDHY-MQ5菌粉对米氏凯伦藻现场赤潮的溶藻作用（A）及溶藻率（B）。

具体实施方式

实施例1溶藻细菌的筛选

在福建连江县一次米氏凯伦藻赤潮事件后期，采取表层海水水样连续稀释10倍，将0.1mL各稀释液涂布在2216E固体培养基上，然后在25℃温育。取不同形态颜色大小的菌落进行单菌落的分离纯化。将得到的各菌落培养物接种到2216E液体培养基中进行培养，温度为25℃，转速为150 r/min。再将菌液以2%v/v的比例与米氏凯伦藻藻液进行共培养，48小时后，使藻液呈现黄化的菌株认为是溶藻菌。选取了对米氏凯伦藻溶藻效果最好的一株细菌进行进一步研究，并将该株细菌代号为FDHY-MQ5。

米氏凯伦藻培养条件：米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi）用L1培养基进行培养，盐度3.0%，培养于20℃光照培养箱中，光照强度100 μmol photons·m⁻²·s⁻¹，光暗周期14h:10 h。

溶藻效率计算方法：溶藻效率（%）=（1- 实验组藻细胞浓度/对照组藻细胞浓度）×100%。其中米氏凯伦藻的藻细胞浓度用0.1mL水样计数板通过显微镜计数。

实施例2假交替单胞菌FDHY-MQ5菌株鉴定

对FDHY-MQ5菌株进行形态观察和生理生化反应，结果显示FDHY-MQ5细菌有如下生物学特征：杆状，单个，革兰氏染色呈阴性，菌落形态为圆形或椭圆形，不透明，菌落呈淡黄色，表面光滑湿润，挑起为粘稠状 （图1）。

扩增FDHY-MQ5菌株的16s rRNA，对基因序列进行克隆和序列分析，结果显示其与Pseudoalteromonas flavipulchra strain CSMA-N1 同源性为99%，因此鉴定为假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.，命名为交替单胞菌FDHY-MQ5。该菌株已于2019年5月20日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：M 2019371。菌株的16s rRNA序列在GenBank中的登录号为MK968367。

实施例3不同浓度交替单胞菌FDHY-MQ5对米氏凯伦藻的溶藻效果

将溶藻细菌FDHY-MQ5初级培养的产物以体积浓度0.5 %、1 %、2 %的量和藻液进行共培养。设置空白对照，对照组为加入0.5 %、1 %、2 %体积无菌的2216E培养基的同时期藻液。实验组与对照组均设置3个重复。在0 h、6 h、24 h、48 h取样，每次取2 mL培养液，进行藻细胞浓度计数，并进一步计算溶藻率（表1），其中1 %体积浓度溶藻效果见图2，不同浓度溶藻效果见图3。

表1 不同浓度溶藻菌对米氏凯伦藻的溶藻效率

从表1可知，以0.5%初始菌浓度将菌株FDHY-MQ5发酵培养的产物加入对数期生长期的米氏凯伦藻中，72h 溶藻率为75.51%，以1%初始菌浓度添加时，24 h溶藻效果为96.59%，48h为99.22%，到72h 可达100%。以2%浓度添加时，24 h溶藻活性可达100%。可见交替单胞菌FDHY-MQ5对米氏凯伦藻具有较高的溶藻效率。

实施例4假交替单胞菌FDHY-MQ5对常见赤潮藻的杀灭作用

将溶藻细菌FDHY-MQ5发酵培养的产物以体积浓度1%的量接种于无菌的对数生长期的东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense) 、赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）、亚历山大藻（Alexandrium tamarense）、强壮前沟藻（Amphidinium carterae hulburt）、中肋骨条藻（Skeletonema costatum）和三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）藻液中，每个藻种的处理设置三个重复，在处理后的24 h取样，每次取2 mL培养液，进行藻细胞浓度计数，并进一步计算溶藻率（图4）。可见假交替单胞菌FDHY-MQ5除了对米氏凯伦藻有较高的溶藻活性外，对赤潮异弯藻也具有较高的溶藻活性，24小时溶藻率达92.60%，另外对亚历山大藻也有一定的溶藻活性，24小时溶藻率为49.70%。

实施例5假交替单胞菌FDHY-MQ5菌株溶藻方式的研究

将假交替单胞菌FDHY-MQ5初级培养液平均分成三份，其中一份菌液经8000 rpm 离心8min，将上清用0.22 μm微滤膜过滤，所得滤液为FDHY-MQ5分泌物溶液，备用；其中一份经上述条件离心后，去掉上清，用等体积的无菌海水重悬，得到FDHY-MQ5菌体，备用；另外一份用于菌液直接溶藻。取等体积以上三份备测样品，用于对数期米氏凯伦藻溶藻实验，接种体积比为2%，以直接加入等体积2216E液体培养基的样品作为对照。处理24小时后，每个样品取2mL培养液，进行藻细胞浓度计数，并进一步计算溶藻率，菌液和上清处理的样品溶藻率为100%，菌体处理的样品基本没有溶藻现象，因此FDHY-MQ5通过细菌分泌物溶藻。

实施例6 假交替单胞菌FDHY-MQ5菌株发酵培养基最佳碳源、氮源筛选

使用2216E作为基础液体培养基，分别加入单一碳源，碳源添加量为培养基的0.5%，其余成分不变。供试碳源为葡萄糖、果糖、木糖、乳糖和甘露醇。同样使用2216E作为基础培养基，以相同的量将基础培养基中的氮源替换成供试氮源，供试氮源分别为蛋白胨、酵母粉、豆饼粉、玉米浆干粉、硝酸铵、脲。

将溶藻菌FDHY-MQ5在2216E斜面培养基上培养1 d，然后每个斜面用15 mL的无菌海水洗脱菌苔，菌悬液在按照体积比1：20的比例接种到100 mL的不同碳源成分、氮源成分的培养基中，25 ℃、150 rpm置于恒温振荡器中发酵培养24 h，然后测取OD600记录细菌生物量和细菌干重，并用所得发酵液测定各种培养条件的溶藻效果。

不同碳源对MQ5细菌的生长影响与溶藻效果见图5。根据细菌生长情况和细菌溶藻效果的多重比较的结果来看，果糖作为碳源效果显著，菌液吸光值为3.90，与2216E培养基相比较。使细菌生长量提升了30.99%。

不同氮源对MQ5细菌生长影响与溶藻效果见图6。供试氮源中，当氮源为蛋白胨时菌液吸光值为2.84，细菌生长与溶藻效果对比其他氮源效果显著。可以得出在MQ5培养过程中，选择果糖为最佳碳源、蛋白胨为最佳氮源对于MQ5有较良好的作用。

实施例7 假交替单胞菌FDHY-MQ5菌株最佳发酵温度实验

将溶藻菌FDHY-MQ5菌种体积比1：10接种于100 mL的2216E基础培养基中，然后分别置于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃五个温度中以150 rpm置于恒温振荡器中发酵24 h，取出发酵液测OD600 nm，记录细菌生物量和细菌干重，并且用所得发酵液测定各实验组的溶藻效果。

温度对溶藻细菌MQ5的生长情况与溶藻效果影响较大，温度为35、40 ℃时溶藻效果表现出衰退的趋势，分别为89.36%和22.83%。与其他温度相比，当温度为20、25、30 ℃时溶藻效果最佳（图7），由于当温度为20 ℃时细菌生长情况最佳，吸光值为3.36。所以使用20℃作为本实验的最佳发酵温度。

实施例8 假交替单胞菌FDHY-MQ5菌株最佳发酵时间实验

将溶藻菌FDHY-MQ5菌种以体积比1：10接种于100 mL的2216E基础培养基中，以25 ℃、150 rpm置于恒温振荡器中发酵培养，分别取培养12、24、48、72、96、120 h的发酵液测OD600nm记录细菌生物量和细菌干重，并用所得发酵液测定各实验组的溶藻效果。

当MQ5生长至24 h时菌生长情况最佳并且最有良好的溶藻效果，随着发酵时间增加，溶藻效果逐渐减弱，为24 h＞48 h＞12 h＞72 h＞96 h＞120 h （图8）。因此选择24 h作为最佳发酵时间，后续正交优化实验选取24h、36h、48 h作为因素条件。

实施例9 假交替单胞菌FDHY-MQ5菌株最佳发酵pH实验

将2216E基础培养基的pH值分别调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，将溶藻菌FDHY-MQ5菌种液以1：10接种于100 mL2216E培养基中，以25 ℃、150 rpm置于恒温振荡器中发酵培养24 h，取出发酵液测OD600 nm，记录细菌生物量和细菌干重，并且用所得发酵液测定各实验组的溶藻效果。

随着发酵pH值的增加MQ5生长情况以及溶藻效果都有所增加（如图9），当pH为5.0、6.0时溶藻效果降低细菌生长密度仅为2.76和2.84。发酵液在pH值为8.0的时获得细菌干重最高，因此选择发酵pH值为8.0作为最佳发酵pH值。

实施例10 假交替单胞菌FDHY-MQ5菌株最佳发酵溶氧量实验

将之前配好的2216E培养基，用250 mL三角瓶，按照发酵体积为容器的1:5、3：10、2：5、1：2、3：5分装，以25 ℃、150 rpm置于恒温振荡器中发酵培养24 h，取发酵液测OD600 nm，记录细菌生物量和细菌干重，并且用所得发酵液测定该实验的溶藻效果。

当溶氧量为3：10时，MQ5细菌发酵生长情况最佳，吸光值为3.40 (图10)。当发酵溶氧量为3：10、2：5、1：2时并没有显著性，所以选用细菌生长情况最佳的溶氧量3：10进行后续正交优化实验。

实施例11 假交替单胞菌FDHY-MQ5菌株最佳发酵条件正交实验

根据以上实验设计正交表，如表2。使用果糖为最佳碳源、蛋白胨为最佳氮源、20 ℃为最佳发酵温度，150 rpm为最佳转速，设置碳源和氮源添加量为0.5%、1%、1.5%，pH值设置为8、8.5、9，发酵时间设置为24h、36h、48 h，溶氧量为3：10。经比较最佳发酵条件为碳源、氮源添加量分别为1%、0.5%，pH值为8.5，发酵时间为48 h。

表2 假交替单胞菌FDHY-MQ5菌株最佳发酵条件正交实验设计表

实施例12假交替单胞菌FDHY-MQ5菌粉的制备

利用以上述优化后的发酵条件对假交替单胞菌FDHY-MQ5进行发酵培养，培养物采用小型喷雾干燥机进行脱水干燥，喷雾口温度120摄氏度，发酵液流速200 mL/h，后续逐渐增加流速到450mL/h。结果显示每升的发酵液可以产出18-20g的菌粉，菌粉制备好后密封，4度保存备用，用于米氏凯伦藻溶藻试验。

实施例13假交替单胞菌FDHY-MQ5菌粉实验室溶藻研究

将上述得到的菌粉0.4g添加到1L的指数生长期的米氏凯伦藻中，设置3个生物学重复，在不同的时间点进行藻细胞浓度计数，并进一步计算溶藻率（附图11），结果显示处理24小时平均溶藻率为99.67-100%。

实施例14 假交替单胞菌FDHY-MQ5菌粉在米氏凯伦藻赤潮爆发现场应用研究

2019年5月24日，对福建省平潭县苏澳码头采取的米氏凯伦藻赤潮水样进行FDHY-MQ5的现场溶藻实验，菌粉添加比例为0.04%，以未处理的现场海水为对照，设置3个生物学重复，在不同的时间点进行藻细胞浓度计数（附图12A），并进一步计算溶藻率（附图12B），结果显示处理12个小时后溶藻率为75.86-91.42%。经24小时处理后，3个生物学重复均未见米氏凯伦藻细胞检出，即溶藻率为100%。

上述结合附图表对本发明的具体实施方式进行了描述，然而这些并非对本发明保护范围的全部。应当理解，本领域的技术人员在本发明的技术方案基础上不需要付出创造性劳动即可做出的各种变形和修改仍在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一株具有溶藻能力的假交替单胞菌，为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas flavipulchra) FDHY-MQ5，已于2019年5月20日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：M 2019371。

2.如权利要求1所述的具有溶藻能力的假交替单胞菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）菌种：采用权利要求1所述的假交替单胞菌FDHY-MQ5；

（2）斜面培养：将步骤（1）中的菌种接种于固体斜面培养基上，在25℃条件下培养24小时；

（3）用15 mL无菌海水洗脱菌苔，菌悬液再按体积比 1：20 的比例接种到100 mL培养液中，25 ℃、150 r/min置于恒温振荡器中培养24 h，获得初级培养菌液；

（4）发酵培养：将步骤（3）培养的菌液接种于2000 mL发酵液中，接种量为5%v/v，25℃，150rpm装液体积百分比30%，培养48小时后，收集发酵液。

3.根据权利要求2所述的具有溶藻能力的交替单胞菌的培养方法，其特征在于步骤（2）所用的培养基为2216E固体培养基，步骤（3）所用的培养基为2216E液体培养基，步骤（4）中所述发酵液配方为2216E液体培养基加入终浓度1.0wt.%的果糖，0.5wt.%的蛋白胨，pH值调至8.5。

4.一种包含权利要求1所述假交替单胞菌的溶藻菌菌粉制备方法。

5.根据权利要求4所述的菌粉制备方法，其特征在于，将发酵液采用小型喷雾干燥机进行干燥脱水，喷雾口温度120摄氏度，发酵液流速200mL/小时，菌粉制备好后密封，4度保存备用。

6.如权利要求1所述交替单胞菌在溶解藻类中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述藻类包括米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi）、赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）、亚历山大藻（Alexandrium tamarense）。

8.如权利要求1所述假交替单胞菌在控制米氏凯伦藻赤潮现场中的应用。