CN111621431A

CN111621431A - 具有溶藻能力的海口小单胞菌及其对米氏凯伦藻的应用

Info

Publication number: CN111621431A
Application number: CN201911355817.XA
Authority: CN
Inventors: 李菲; 覃仙玲; 牙韩争; 陈波; 潘信利; 李喆; 姜发军
Original assignee: Guangxi Academy of Sciences
Current assignee: Guangxi Academy of Sciences
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN111621431B

Abstract

本发明公开一株具有溶藻能力的海口小单胞菌及其在杀灭米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)应用，属于有害赤潮处理的微生物学领域。该溶藻菌命名为Micromonospora haikouensis B2572(以下称海口小单胞菌B2572或菌株B2572)，分离自广西钦州市茅尾海红树林自然保护区中的无瓣海桑根际，已于2019年5月22日保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2019382。本发明所提供的新菌株对北部湾海域优势藻种米氏凯伦藻具有很好的抑制及杀灭效果，24h处理条件下溶藻率达90％以上，在大面积水体爆发的有害藻华事件中应用前景更为广阔。

Description

具有溶藻能力的海口小单胞菌及其对米氏凯伦藻的应用

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，尤其涉及一种具有溶藻能力的海口小单胞菌及其对米氏凯伦藻的应用。

背景技术

米氏凯伦藻为世界广布种，能分泌溶血性毒素和细胞性毒素危害鱼类和海洋无脊椎动物，已成为我国主要赤潮优势藻种。有数据显示，米氏凯伦藻赤潮呈现不断增长趋势，且持续时间长、波及范围广。此外，米氏凯伦藻时常与东海原甲藻形成双相赤潮，严重破坏海洋生态系统。因此，开展米氏凯伦藻赤潮的防控研究尤为迫切和必要。

对于赤潮的控制目前主要有物理法、化学法和生物法。物理方法虽然见效很快并且不会对生态环境造成危害，但对底栖生物极可能造成负面影响，且无法从根本上治理赤潮。化学方法是目前相较之下最有效的方法，但是它容易对环境造成二次污染，无法针对性的只对赤潮生物产生影响，会在杀死赤潮生物的同时对非赤潮生物也造成一定程度上的伤害。溶藻微生物由于直接分离于目标水体，具有生态安全性好、除藻效果稳定而高效等特点，近年来逐渐被应用于水华防治生物制剂的开发与研究领域。同时，也有研究人员结合传统除藻剂与溶藻微生物制剂的优点，开发出新型的溶藻制剂。通过分离、鉴定出高效溶藻细菌并最终开发经济、高效、安全的溶藻细菌菌剂已成为控制赤潮问题的新思路。然而，目前尚未有高效杀米氏凯伦藻的溶藻菌及菌剂报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有溶藻能力的海口小单胞菌及其对米氏凯伦藻的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

新菌株，保藏编号为CCTCC NO：M 2019382，分类命名为Micromonosporahaikouensis B2572。

上述新菌株在治理赤潮或水华中的应用。

上述新菌株在溶藻方面的应用。

上述新菌株的发酵液用于制备溶藻药剂。

上述新菌株用于抑制或灭杀米氏凯伦藻。

上述新菌株的发酵液用于制备米氏凯伦藻抑制剂或灭杀剂。

上述抑制剂或灭杀剂，发酵液的终浓度为0.5-1％，或者发酵液以改性硅藻土为载体。

上述新菌株的培养方法，将该菌接种于ISP2培养基中，在28-30℃，pH6-7.5的条件下进行培养。

上述培养方法，包括以下步骤：

(1)斜面培养：将新菌株接种于固体斜面培养基上，在28℃条件下培养72h；

(2)初级培养：无菌条件下取培养好的斜面，用接种环取一环于100mL液体培养基中，28℃，摇床200rpm培养72h，获得初级培养菌液；

(3)扩大培养：将初级培养菌液接种于500mL液体培养基中，接种量为5％，28℃，摇床200rpm培养48h，获得扩大培养菌液。

液体培养基的配方为：酵母提取粉2.0g/L，麦芽提取粉2.0g/L，葡萄糖2.0g/L，121℃ 高温蒸汽灭菌20min；固体斜面培养基为液体培养基中添加终浓度1.3％的琼脂粉。

发明人在广西钦州市茅尾海红树林自然保护区中的无瓣海桑根际分离得到本发明的溶藻微生物，该溶藻菌命名为Micromonospora haikouensis B2572(以下称海口小单胞菌 B2572或菌株B2572)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019382。该菌株筛选简单、容易培养，发明人还建立了相应培养方法。研究表明，海口小单胞菌B2572的溶藻效果好，其发酵液对北部湾海域优势藻种米氏凯伦藻具有很好的抑制及杀灭效果，24h处理条件下溶藻率达90％以上。由于海口小单胞菌B2572来自广西钦州海域红树林的根际土壤，因而还具有生态安全性好等特点，使用过程中不会造成二次污染。该菌株的发现丰富了我国的可利用微生物资源，其除藻效果稳定、高效、环境友好的优势，在控制米氏凯伦藻赤潮方面具有很好的应用前景，也为水华防治生物制剂的开发与研究领域奠定了坚实的基础，今后将在大面积水体爆发的有害藻华事件中大有所为。

附图说明

图1是本发明菌株B2572细胞的扫描电镜照片。

图2是本发明菌株B2572的16S rDNA序列通过BLAST比对，相关序列于Blast进行序列比对分析，最后用MEGA5.0构建的系统发育树。

图3是本发明菌株B2572的生长曲线。

图4是米氏凯伦藻的生长曲线。

图5是添加B2572菌液后米氏凯伦藻的叶绿素a变化图，图中：a菌液添加量为1:100， b菌液添加量为1:200。

图6是现场围隔试验的叶绿素a的变化。

保藏信息说明

Micromonospora haikouensis B2572，保藏编号为CCTCC NO：M 2019382，保藏日期： 2019年05月22日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。

菌株B2572的生物学特征如下：革兰氏阳性菌，好氧，中温放线菌，能形成发育良好的基底菌丝，无气丝菌丝。菌落形态为圆形，呈现鲜橙黄色至深橙黄色。明胶液化、H₂S 产生均呈阴性；纤维素水解、淀粉水解、葡萄糖、半乳糖、棉子糖、鼠李糖、水杨酸、蔗糖和海藻糖反应为阳性。

具体实施方式

实施例

1、溶藻细菌的筛选

收集无瓣海桑根须表面附着的土壤(距离根须5mm以内)，称取2.0g土壤样品装于20ml无菌水(内有玻璃珠)的锥形瓶中，手动摇匀；依次制成10^-2和10^-3稀释度的样液，接种于AGG固体培养基中，28℃培养3d。将长出的每个单菌落接种于改良的ISP2液体培养基中，28℃、200rpm培养3d。取0.1mL菌液接种到5mL处于经过无菌处理的对数生长期米氏凯伦藻藻液中，20℃培养2、4、6、12、24和48h，各取1mL藻液，使用水样计数板进行藻细胞的计数，造成藻细胞大量死亡的菌株认为是溶藻菌。

选取了其中溶藻效果最好的一株细菌进行进一步研究，并将该株细菌编号为B2572。

2、B2572细胞的扫描电镜图

在扫描电镜能谱制样过程中，样品要经过反复清洗、脱水、镀膜等步骤，收集生长对数期的B2572菌体，置于5000rpm离心5min，去离子水清洗3次，加入25％戊二醛(V 样品：V溶剂＝1:40)，静置2h，12000rpm离心1min，弃上清，反复清洗3次，加入超纯水重悬，获得细菌悬浮液，滤纸过滤，用30％、50％、70％、80％和90％的乙醇水溶液脱水置换，每个梯度7min，再用叔丁醇置换3次，冷冻干燥后样品进行扫描电子显微镜 (SEM)分析，结果如图1。

3、海口小单胞菌B2572的生长曲线

(1)初级培养：无菌条件下取培养好的平皿，用接种环取0.5cm³大小菌体于100mL液体培养基中，28℃，摇床200rpm培养72h，获得初级培养菌液；

(2)平行培养：将30mL初级培养菌液接种于300mL液体培养基中，每12h取出两瓶，冰冻至-20℃，直至取到128h结束实验。将每个样进行13000rpm离心，除去上清液，将菌体110℃烘干，烘干至前后两次重量小于0.01g，记录干菌体重量。根据菌体-时间的关系，画出B2572的生长曲线，如图3。

4、米氏凯伦藻的生长曲线

米氏凯伦藻培养条件：米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)用f/2培养基进行培养，培养于20℃光照培养箱中，光照强度100μmol photons·m^-2·s^-1，光暗周期14h:10h(光：暗)。

米氏凯伦藻生长曲线绘制：取处于对数生长期的藻液，用新鲜配置的f/2海水培养基接种，使藻细胞初始密度为4×104cells/mL。每隔24h取样计数一次，每次取3个平行，取至15天，终止取样。用0.1mL的浮游植物计数框进行计数，绘制米氏凯伦藻的生长曲线。

5、B2572对米氏凯伦藻的溶藻效果

将溶藻细菌B2572发酵培养的产物以体积终浓度为0.5％和1％加入200mL处于生长对数期的米氏凯伦藻液中。以0.5％和1％体积无菌的ISP2液体培养基添加至同时期藻液作为对照组。实验组与对照组均设置3个重复。分别在加入0h、6h、12h和24h后取样，每次取1mL培养液进行藻细胞密度计数，并过滤20mL培养液于GF/F膜上用于叶绿素a 测定(结果见表1和图5)。

溶藻效率计算方法：溶藻效率(％)＝(1-实验组藻细胞密度/对照组藻细胞密度)× 100％。其中米氏凯伦藻的藻细胞浓度用0.1mL水样计数板通过显微镜计数。同时，测定其叶绿素a的含量，溶藻效率(％)＝(1-处理组叶绿素a浓度/对照组叶绿素a浓度)×100。

表1菌液含量为1％时的溶藻效果

表2菌液含量为0.5％时的溶藻效果

结果：添加B2572菌液至米氏凯伦藻液中，培养6h后，菌液添加量为0.5％和1％的溶藻效果均超过50％；培养12h后，两个实验组的溶藻率接近90％；培养24h后，溶藻活性可达97％以上。可见，B2572对米氏凯伦藻具有较高的溶藻效率。

6、固定化除藻菌剂的制备

(1)改性硅藻土的制备：称取硅藻土1000g，分散于5000mLAl(NO₃)₃水溶液中， Al(NO₃)₃·9H₂O浓度为12.7mg/mL，磁力搅拌均匀，缓慢加入3000mL0.4mol/L的NaOH 水溶液。混合均匀且反应完全的悬浮液进行真空抽滤，过滤好的硅藻土平铺至托盘中，放置60℃鼓风干燥箱中干燥完全，即为改性好的硅藻土。

(2)菌液的制备：无菌条件下取培养好的平板，用接种环取一块1×1cm²的琼脂块于100mL液体培养基中，28℃，摇床180rpm培养72h，获得初级培养菌液；再将初级培养菌液接种于500mL液体培养基中，接种量为3％，28℃，摇床180rpm培养8d，获得扩大培养菌液，共计发酵5000mL。

(3)除藻菌剂的制备：将改性硅藻土按1:5的量加入到发酵好的菌液中，室温下磁力搅拌7h，反应完全的悬浮液进行真空抽滤，过滤好的含菌硅藻土平铺至托盘中，放置-80℃ 冰箱中冷冻4h，再进行冷冻干燥，干燥完全后即为制好的除藻菌剂。

7、模拟现场围隔试验

搭建好5个围隔，编号1-5。每个围隔泵入约1000L的水，注入完成后，取每个围隔的水样用于浮游植物叶绿素含量测定；然后按照f/2培养基的量在1-4号围隔中加入N、P 营养盐，再加入60L处于对数生长期的米氏凯伦藻液，5号围隔不加营养盐，作为空白对照。搅拌均匀后取水样测定叶绿素含量，记下取样时间，每隔24h取水样一次。投入米氏凯伦藻液4d后，1-2号围隔加入除藻菌剂，海水：除藻菌剂为1000:1(L:kg)，3-4号围隔不加除藻菌剂。加除藻菌剂后分别于6h，24h和48h取水样测定叶绿素a含量。

结果：

实验前，海水水色微黄色，加入藻后2d海水变为褐色；添加除藻菌剂后2d，海水恢复澄清呈微黄色。

如图6所示，6h后，与对照组相比，叶绿素a含量分别下降了45.08％和53.29％；24h后，与对照组相比，叶绿素a含量分别下降了74.94％和88.04％；48h后，与对照组相比，叶绿素a含量分别下降了96.74％和96.65％。

Claims

1.一种新菌株，保藏编号为CCTCC NO：M 2019382，分类命名为Micromonosporahaikouensis B2572。

2.权利要求1所述新菌株在治理赤潮或水华中的应用。

3.权利要求1所述新菌株在溶藻方面的应用。

4.权利要求1所述新菌株的发酵液用于制备溶藻药剂。

5.权利要求1所述新菌株用于抑制或灭杀米氏凯伦藻。

6.权利要求1所述新菌株的发酵液用于制备米氏凯伦藻抑制剂或灭杀剂。

7.根据权利要求6所述的抑制剂或灭杀剂，其特征在于：所述发酵液的终浓度为0.5-1％，或者所述发酵液以改性硅藻土为载体。

8.权利要求1所述新菌株的培养方法，其特征在于：将该菌接种于ISP2培养基中，在28-30℃，pH6-7.5的条件下进行培养。

9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于：所述液体培养基的配方为：酵母提取粉2.0g/L，麦芽提取粉2.0g/L，葡萄糖2.0g/L，121℃高温蒸汽灭菌20min；所述固体斜面培养基为液体培养基中添加终浓度1.3％的琼脂粉。