CN110255719A - 一种假交替单胞菌防控米氏凯伦藻引发赤潮的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种假交替单胞菌防控米氏凯伦藻引发赤潮的方法，通过共培养实验，从河流入海口土壤环境分离到一株能够显著抑制赤潮微藻米氏凯伦藻生长的假交替单胞菌；将假交替单胞菌发酵液、菌体、滤液和发酵培养基分别加入米氏凯伦藻液中进行共培养；4％假交替单胞菌发酵液滤液为最低抑制浓度；4％假交替单胞菌发酵液滤液处理12h，可将米氏凯伦藻藻细胞周期阻滞在G2期，使其无法进入分裂期；8％滤液作用3h时，藻细胞内活性氧水平达到最高，荧光显微镜下观察到此时藻细胞完整呈现红色；作用6h时，藻细胞活性氧水平下降，此时藻细胞破裂呈现黄绿色。本发明的有益效果是实现对赤潮微藻米氏凯伦藻引发的赤潮防治。

Description

一种假交替单胞菌防控米氏凯伦藻引发赤潮的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及假交替单胞菌及其在防控米氏凯伦藻引发赤潮中的应用。
背景技术
有害藻华(harmful algal blooms，HABs)分为淡水水华和海洋赤潮，是一种水生生态异常现象：当含有大量营养物质的生活污水、工业废水和农业废水流入海洋或湖泊后，在特定的环境条件下(如洋流、温度和海域的封闭程度等)，赤潮生物(浮游植物、原生动物或细菌)、水华生物(蓝藻、绿藻或硅藻等)便会急剧繁殖形成藻华。有害藻爆发能够破坏水生生态系统，对水环境、人类健康及各国经济构成严重威胁。海洋赤潮、淡水水华的防治刻不容缓，已成为当前研究的热点和前沿科学问题。寻找能够有效防治HABs的方法是现阶段水生生态保护与修复领域的重要研究内容。当前，物理方法和化学方法已被广泛用于藻华治理，具有良好的治理效果。然而，外来添加物质不可避免会造成二次环境问题，且对其他生物产生直接或间接副作用，如广泛使用的化学抑藻剂CuSO4不仅能加速藻毒素的释放，且高浓度的铜离子会造成水体重金属污染，导致浮游植物及水生动物的死亡；物理方法中大量使用的粘土悬浮于海水或沉积于海底，淤渣量过大对虾夷扇贝的生长及存活有较大的影响。现阶段，环境友好型藻华防治新技术日益受到人们的重视，如利用大型海藻或微生物与微藻间的相互作用来防治藻华。其中，微生物因其分布广、种类多、代谢繁殖快及环境友好等特点，在有害藻华防治方面表现出巨大潜力。米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)是一种分布广泛的有毒甲藻，是赤潮优势藻之一，能够分泌溶血毒素和鱼毒素，对海洋生态安全具有严重威胁。
发明内容
本发明的目的在于提供一种假交替单胞菌防控米氏凯伦藻引发赤潮的方法，本发明的有益效果是利用微生物与微藻间的相互作用来防控赤潮微藻，实现对赤潮微藻米氏凯伦藻引发的赤潮防治，在有害藻华防治方面表现出巨大潜力，是一种环境友好型赤潮防治方法。
本发明所采用的技术方案是通过共培养实验，从河流入海口土壤环境分离到一株能够显著抑制赤潮微藻米氏凯伦藻生长的细菌，经16S rRNA鉴定为假交替单胞菌；
将假交替单胞菌发酵液、菌体、滤液和发酵培养基分别加入米氏凯伦藻液中进行共培养；
将假交替单胞菌无菌滤液与赤潮微藻米氏凯伦藻共培养，4％假交替单胞菌发酵液滤液为最低抑制浓度，即滤液开始表现出抑藻效果，此时藻细胞生长停滞；继续增加滤液至8％，大量藻细胞出现破裂现象；
通过流式细胞术检测藻细胞周期，发现4％假交替单胞菌发酵液滤液处理12h，可将米氏凯伦藻藻细胞周期阻滞在G2期，使其无法进入分裂期；滤液体积增大至8％，出现30％Sub-G1峰，表明此时藻细胞基因组DNA片段出现丢失现象，细胞开始凋亡；
8％滤液作用3h时，藻细胞内活性氧水平达到最高，荧光显微镜下观察到此时藻细胞完整呈现红色；作用6h时，藻细胞活性氧水平下降，此时藻细胞破裂呈现黄绿色。
进一步，所述步骤1中米氏凯伦藻抑藻菌的富集分离过程如下：向100mL无菌米氏凯伦藻藻液中加入河流入海口岸堤土壤5g，将其放入光照恒温培养箱中20℃培养7d；取5ml上述富集培养物转接到新的100mL无菌米氏凯伦藻藻液中光照恒温培养箱中20℃培养7d；取1ml上述培养物，用0.9％无菌生理盐水稀释成不同的浓度梯度，取100μL涂布于2216E固体培养基上，将其倒置于20℃培养箱中培养至菌落形成；挑取单菌落接种于无菌2216E液体培养基中，20℃培养3d；取上述培养液5ml接种到100mL无菌米氏凯伦藻藻液中，光照恒温培养箱中20℃培养7d，通过血球计数板计数藻细胞数量，计算抑藻率；2216E固体培养基：蛋白胨0.5g，酵母膏0.1g，磷酸高铁0.001g，海水100mL。将获得的抑藻菌提基因组，对其16SrRNA序列进行测序分析，结果表明该菌株隶属于假交替单胞菌。
附图说明
图1是不同假交替单胞菌发酵液滤液加入量对赤潮藻米氏凯伦藻生长的影响；
图2是不同假交替单胞菌发酵液滤液加入量对赤潮藻米氏凯伦藻数量及形态影响；
图3是不同假交替单胞菌发酵液滤液加入量对赤潮藻米氏凯伦藻细胞周期分布；
图4是不同假交替单胞菌发酵液滤液加入量对赤潮藻米氏凯伦藻细胞内活性氧水平的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明如下步骤：
1通过共培养实验，从河流入海口土壤环境分离到一株能够显著抑制赤潮微藻米氏凯伦藻生长的细菌。米氏凯伦藻抑藻菌的富集分离过程如下：向100mL无菌米氏凯伦藻藻液中加入河流入海口岸堤土壤5g，将其放入光照恒温培养箱中20℃培养7d；取5ml上述富集培养物转接到新的100mL无菌米氏凯伦藻藻液中光照恒温培养箱中20℃培养7d；取1ml上述培养物，用0.9％无菌生理盐水稀释成不同的浓度梯度，取100μL涂布于2216E固体培养基上，将其倒置于20℃培养箱中培养至菌落形成；挑取单菌落接种于无菌2216E液体培养基中，20℃培养3d；取上述培养液5ml接种到100mL无菌米氏凯伦藻藻液中，光照恒温培养箱中20℃培养7d，通过血球计数板计数藻细胞数量，计算抑藻率。2216E固体培养基：蛋白胨0.5g，酵母膏0.1g，磷酸高铁0.001g，海水100mL。将获得的抑藻菌提基因组，对其16S rRNA序列进行测序分析，结果表明该菌株隶属于假交替单胞菌。
2将假交替单胞菌发酵液、菌体、滤液和发酵培养基分别加入米氏凯伦藻液中进行共培养。结果表明，假交替单胞菌主要通过分泌抑藻物质以间接作用方式实现对赤潮微藻米氏凯伦藻生长的抑制。发酵培养基为(蛋白胨0.5g，酵母膏0.1g，磷酸高铁0.001g，海水100mL)。
3将假交替单胞菌无菌滤液与赤潮微藻米氏凯伦藻共培养，发现4％假交替单胞菌发酵液滤液为“最低抑制浓度”，即滤液开始表现出抑藻效果，此时藻细胞生长停滞；继续增加滤液至8％，大量藻细胞出现破裂现象。
4通过流式细胞术检测藻细胞周期，发现4％假交替单胞菌发酵液滤液处理12h，可将米氏凯伦藻藻细胞周期阻滞在G2期，使其无法进入分裂期；滤液体积增大至8％，出现30％Sub-G1峰，表明此时藻细胞基因组DNA片段出现丢失现象，细胞开始凋亡。
58％滤液作用3h时，藻细胞内活性氧水平达到最高，荧光显微镜下观察到此时藻细胞完整呈现红色；作用6h时，藻细胞活性氧水平下降，此时藻细胞破裂呈现黄绿色。
图1是不同假交替单胞菌发酵液滤液加入量对赤潮藻米氏凯伦藻生长的影响；图2是不同假交替单胞菌发酵液滤液加入量对赤潮藻米氏凯伦藻数量及形态影响(倒置荧光显微镜观察)；图3是不同假交替单胞菌发酵液滤液加入量对赤潮藻米氏凯伦藻细胞周期分布；图4是不同假交替单胞菌发酵液滤液加入量对赤潮藻米氏凯伦藻细胞内活性氧水平的影响。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (2)

1.一种假交替单胞菌防控米氏凯伦藻引发赤潮的方法，其特征在于：
1、通过共培养实验，从河流入海口土壤环境分离到一株能够显著抑制赤潮微藻米氏凯伦藻生长的假交替单胞菌；
2、将假交替单胞菌发酵液、菌体、滤液和发酵培养基分别加入米氏凯伦藻液中进行共培养；
3、将假交替单胞菌无菌滤液与赤潮微藻米氏凯伦藻共培养，4％假交替单胞菌发酵液滤液为最低抑制浓度，即滤液开始表现出抑藻效果，此时藻细胞生长停滞；继续增加滤液至8％，大量藻细胞出现破裂现象；
4、通过流式细胞术检测藻细胞周期，发现4％假交替单胞菌发酵液滤液处理12h，可将米氏凯伦藻藻细胞周期阻滞在G2期，使其无法进入分裂期；滤液体积增大至8％，出现30％Sub-G1峰，表明此时藻细胞基因组DNA片段出现丢失现象，细胞开始凋亡；
5、8％滤液作用3h时，藻细胞内活性氧水平达到最高，荧光显微镜下观察到此时藻细胞完整呈现红色；作用6h时，藻细胞活性氧水平下降，此时藻细胞破裂呈现黄绿色。
2.按照权利要求1所述一种假交替单胞菌防控米氏凯伦藻引发赤潮的方法，其特征在于：所述步骤1中米氏凯伦藻抑藻菌的富集分离过程如下：向100mL无菌米氏凯伦藻藻液中加入河流入海口岸堤土壤5g，将其放入光照恒温培养箱中20℃培养7d；取5ml上述富集培养物转接到新的100mL无菌米氏凯伦藻藻液中光照恒温培养箱中20℃培养7d；取1ml上述培养物，用0.9％无菌生理盐水稀释成不同的浓度梯度，取100μL涂布于2216E固体培养基上，将其倒置于20℃培养箱中培养至菌落形成；挑取单菌落接种于无菌2216E液体培养基中，20℃培养3d；取上述培养液5ml接种到100mL无菌米氏凯伦藻藻液中，光照恒温培养箱中20℃培养7d，通过血球计数板计数藻细胞数量，计算抑藻率；2216E固体培养基：蛋白胨0.5g，酵母膏0.1g，磷酸高铁0.001g，海水100mL。将获得的抑藻菌提基因组，对其16S rRNA序列进行测序分析，结果表明该菌株隶属于假交替单胞菌。
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