CN107904187A - 对迟缓爱德华氏菌具有高拮抗作用的融合魏斯氏菌3dw - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种对迟缓爱德华氏菌具有高拮抗作用的融合魏斯氏菌3DW（Weissella confusa），已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏代号为CGMCC 14656。融合魏斯氏菌3DW（Weissella confusa）对于迟缓爱德华氏菌抑菌圈直径与菌落直径差值为8.17mm，可有效防治水产品因迟缓爱德华氏菌而感染的各种疾病。同时本发明的菌株能够显著降低水体pH，可应用于微生态制剂降低盐碱地养殖池塘水体的pH，适用于盐碱地池塘养殖。
Description
技术领域
本发明涉及一种融合魏斯氏菌株，尤其是一种能够显著降低水体pH且对迟缓爱德华氏菌具有高拮抗作用的融合魏斯氏菌3DW。
背景技术
迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda属于革兰氏阴性病原菌，可感染包括鱼类、两栖动物、爬行动物和哺乳动物在内的多种动物，其中感染鱼类的一般临床症状有眼球突出和浑浊、皮肤坏死和肌肉溃烂、肛门突出、肌肉和内脏器官产生脓肿等现象，具有流行面积广、发病率及死亡率高等特点。目前，防治细菌性疾病最常用的方法是使用抗生素，不仅可引起鱼的菌群失调、耐药株增多、免疫功能下降，而且还会造成鱼产品中药物等有害物质残留，导致食品安全问题。微生态类产品具有天然、低毒、残留少、不产生抗药性等特点，利用独特的靶位定植原理，对致病菌、病毒等病原物有一定的抑制和防御功能，已替代部分抗生素，可保障动物源性食品的安全。但是，迄今为止并没有能够显著降低水体pH且对迟缓爱德华氏菌具有高拮抗作用菌株的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种能够显著降低水体pH且对迟缓爱德华氏菌具有高拮抗作用的融合魏斯氏菌3DW。
本发明的技术解决方案是：一种对迟缓爱德华氏菌具有高拮抗作用的融合魏斯氏菌Weissella confusa，已保藏在中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，属于魏斯氏菌，菌株代号3DW，保藏代号为CGMCC No.14656，保藏日期2017年9月21日。
所述融合魏斯氏菌3DW的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO：1 所示。
本发明提供的融合魏斯氏菌3DW（Weissella confusa）对于迟缓爱德华氏菌具有高拮抗作用，迟缓爱德华氏菌抑菌圈直径与菌落直径差值为8.17mm，可有效防治水产品因迟缓爱德华氏菌而感染的各种疾病。同时本发明的菌株能够显著降低水体pH，可应用于微生态制剂降低盐碱地养殖池塘水体的pH，适用于盐碱地池塘养殖。
附图说明
图1是本发明融合魏斯氏菌3DW的革兰氏染色结果示意图。
图2是本发明融合魏斯氏菌3DW与现有技术对迟缓爱德华氏菌的抑菌效果图。
菌种保藏日期：2017年9月21日。
菌种保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：中国北京
菌种保藏代号：CGMCC No.14656。
具体实施方式
1. 菌株的分离纯化：
以盘锦地区盐碱地池塘水环境为细菌的分离源，按照十倍梯度稀释的方法处理样品，选取合适的稀释度水样涂布于盐度为10的MC固体培养基上，选取MC培养基上有溶钙圈的菌落，纯化培养，获得单个纯菌落，划线于MC固体培养基上，28 ℃恒温培养24~36 h，获得一株产酸菌，命名为3DW。
2. 菌株3DW的鉴定
对于菌株3DW革兰氏染色结果如图1所示。
对菌株3DW进行生理生化特征的鉴定，菌株3DW理化试验结果见表1：
表1
注：“+”：阳性反应； “-”：阴性反应；
提取细菌总DNA，采用16S rDNA通用引物F27和R1492扩增细菌的16S rDNA，将PCR扩增产物收后进行测序，结果如SEQ ID NO：1 所示。再将得到的碱基序列在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列BLAST分析。结合菌株3DW的生理生化结果与分子生物学特征，最终鉴定为融合魏斯氏菌。命名为融合魏斯氏菌Weissella Cconfusa，该菌株已保藏在中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏代号CGMCC No.14656，保藏日期：2017年9月21日。
实验：
1. 融合魏斯氏菌3DW对迟缓爱德华氏菌拮抗作用的测定
采用双层平板法与点种法结合检测乳酸菌的抑菌活性：以10ml盐度为10的MRS固体培养基作为底层培养基倒入培养皿中，凝固后，将本发明的融合魏斯氏菌3DW点种于MRS底层平板上，倒置于28℃培养箱培养12h。同时将迟缓爱德华氏菌接入盐度为30的营养肉汤培养基，28℃，180r/min，过夜培养得迟缓爱德华氏菌种子液。配制盐度为30的半固体培养基，灭菌后待其冷却至50℃，将迟缓爱德华氏菌种子液混入上述半固体培养基，使混入指示菌的终浓度约108cfu/ml，将其倒入上述带有融合魏斯氏菌3DW的底层平板，待其凝固后倒置于28℃培养箱，6~8h后测量抑菌圈直径与菌落直径大小。
同时将购于中国普通微生物菌种保藏管理中心的耐盐魏斯氏菌，赫伦魏斯氏菌，坎氏魏斯氏菌，绿色魏斯氏菌作为对比实验。各菌株在中国普通微生物菌种保藏管理中心的编号、中文菌名、拉丁学名分
别如下：
1.2494 绿色魏斯氏菌 Weissella viridescens 。
1.2474 坎氏魏斯氏菌 Weissella kandleri。
1.2513 赫伦魏斯氏菌 Weissella hellenica。
1.2440 耐盐魏斯氏菌 Weissella halotoleran。
实验结果如图2所示；抑菌圈直径与菌落直径差值如表2。
表2
图2中，融合魏斯氏菌3DW位于中间，坎氏魏斯氏菌、耐盐魏斯氏菌分别位于上面的左右两侧，赫伦魏斯氏菌、绿色魏斯氏菌分别位于下面的左右两侧。
结果表明：融合魏斯氏菌3DW对于迟缓爱德华氏菌具有较强的拮抗作用，抑菌圈直径与菌落直径差值为8.17mm。
2. 融合魏斯氏菌3DW在盐水中发酵的终点pH值
挑取融合魏斯氏菌3DW单菌落将其接种于盐度为10 的MRS 液体培养基中，置于转速为150 r/min，温度为28 ℃的摇床培养6 h，即制备出了发酵用的种子液。使用海水（盐度为35）和自来水（盐度为0）按照1：2的比例配成盐水，调节其pH值至7.0，向其中接种体积比为2％的种子液。28 ℃恒温培养，分别于24、48、72 h测定pH值，每组三个平行，体积比2％的MRS液体培养基作为空白对照组，结果如表3。
表3
注：数据为平均值±标准差。
结果表明本发明的融合魏斯氏菌3DW分泌酸性物质。
3.融合魏斯氏菌3DW应用于养殖水体对pH调控
发酵液的制备：从划线的MC平板上挑取融合魏斯氏菌3DW的单菌落接种到装有50 ml的MRS液体培养基的离心管中，置于28 ℃，恒温培养24 h，作为种子液。将种子液按照质量比5％接种于灭菌池塘水中，并添加红糖至终浓度达到0.04 g/m3，扩大发酵培养72小时，使细菌浓度在1×109 个/ml左右，备用。细菌发酵液的发酵48小时、72小时pH值见表4。
表4
在三个90 L的水槽中分别添加60 L的对虾养殖池塘水（水的盐度为3，碱度为6.24mmol/L，COD为2.128 mg/L，氨氮和亚硝酸盐为0，无藻类），分为实验组及2个对照组，每组三个平行。实验组在实验开始时加入60 ml的细菌发酵液及24 g红糖；对照1不加任何上试剂为空白对照，对照组2只加24 g红糖。实验开始后24 h时，实验组再添加60 ml的细菌发酵液及24 g，对照组1仍然不添加，对照组2只添加24 g红糖。实验过程中温度控制在（25±2℃），实验时间为72 h。分别于实验前、实验后每隔12 h以及每次添加菌后0 h测量水体pH值，结果如表5。
表5
结果表明：对照组2水体pH值在实验进行到24 h之后开始低于对照组1，但是实验组水体的pH值始终都低于对照组。第一次泼菌后立即测定水体的pH值，下降了0.11，而在12 h到24h水体的pH值出现了上升的趋势。但第二次泼菌后立即测定水体的pH值，下降0.18，之后，水体的pH值一直在下降，72h实验组pH值降低至7.94。即本发明的融合魏斯氏菌3DW可有效降低水体的pH值，适用于盐碱地池塘养殖。
序列表
<110> 大连海洋大学
<120> 对迟缓爱德华氏菌具有高拮抗作用的融合魏斯氏菌3DW
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1350
<212> DNA
<213> 融合魏斯氏菌3DW(Weissella confusa)
<400> 1
Claims (2)
1. 一种对迟缓爱德华氏菌具有高拮抗作用的融合魏斯氏菌3DW（Weissella confusa），已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏代号为CGMCC14656。
2.根据权利要求1所述的对迟缓爱德华氏菌具有高拮抗作用的融合魏斯氏菌3DW，其特征在于：所述融合魏斯氏菌3DW的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO：1 所示。
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