CN104109643B

CN104109643B - 一种具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌

Info

Publication number: CN104109643B
Application number: CN201410164779.0A
Authority: CN
Inventors: 王静雪; 林洪; 穆罕默德·纳西姆·可汗; 王伟宇
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2014-04-23
Filing date: 2014-04-23
Publication date: 2017-07-21
Anticipated expiration: 2034-04-23
Also published as: CN104109643A

Abstract

一种具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌，该菌株命名为Bacillus sp.DK1‑SA11，已于2013年11月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2013589。本发明的具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌能够产生具有较强的广谱抗菌作用，对多种致病菌具有较好的抑制作用的抑菌物质，为开发新的抗菌药物提供了可能。

Description

一种具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌

技术领域

本发明涉及一种新的芽孢杆菌，特别涉及一种具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌。

背景技术

芽孢杆菌（Bacillus），细菌的一科，能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌。包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢杆菌（bacillus）杆菌科的一属细菌。

目前因滥用抗生素导致耐药致病菌株的大量增加等问题已引起人们的高度重视。所以，寻找抗生素替代品迫在眉睫。抗生素是某些微生物通过酶促反应将初级代谢产物转变为结构性的次生代谢产物，诸如短杆菌肽等通过酶促反应把氨基酸转变为结构复杂的化合物。而Nisin( 乳酸链球菌素) 等细菌素则需要通过核糖体来合成，从而是真正的蛋白类物质。细菌素与抗生素的根本差别是：大部分细菌素只对近缘关系的细菌有损害作用，且具有无毒、无副作用、无残留、无耐药性，同时也不污染环境等优点。

使用微生态制剂解决抗生素问题，已经从机理上得到证明：有益微生物在其生长代谢过程中，会产生多种抑菌物质，主要包括芽孢杆菌类产生的抗菌肽、乳酸菌类生成的细菌素等。有益菌通过这些物质一方面抑制如大肠杆菌、沙门氏菌等的生长，另一方面为自身的活化、定植提供有利条件。

枯草芽孢杆菌所产的枯草菌素具有抑制一些革兰氏阳性菌，不产生耐药性，无残留，不污染环境等优点，因此，枯草芽孢杆菌代谢产物作为抗生素的替代品，其研究和开发意义重大，市场前景广阔。目前，现有的枯草芽孢杆菌存在以下缺陷：具有抑菌活性的代谢产物的产量不高，抑菌能力一般，抑菌谱较窄，急需光谱且抑菌活性较高的枯草芽孢杆菌菌种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌，是来源于贝类的新种，能够产生具有较强的广谱抗菌作用，对多种致病菌具有较好的抑制作用的抑菌物质，为开发新的抗菌药物提供了可能。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌，该菌株命名为Bacillus sp.DK1-SA11，已于2013年11月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2013589。

一种具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌用于生产抑菌物质的用途。

一种具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌用于生产微生物生态制剂的用途。

本发明的有益效果是：本发明的具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌能够产生具有较强的广谱抗菌作用，对多种致病菌具有较好的抑制作用的抑菌物质，为开发新的抗菌药物提供了可能。

附图说明

图1是本发明菌株DK-SA11的显微放大图。

图2是本发明菌株DK-SA11 和相近菌株的RecA基因序列进行同源性比对构建的系统进化树。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

本发明的菌株DK1-SA11生理生化特征为：革兰氏阳性菌，杆状（见附图1），大部分连成串，内含芽孢，长度在20-30微米之间，运动，耐盐高达16%，高盐浓度下可呈现丝状生长，55℃生长停止，pH4-11均可生长，pH7为最适pH。在2216E琼脂培养基上培养，菌落圆形，不透明，具有运动性。

根据伯杰氏细菌鉴定手册第九版，本发明的菌株DK1-SA11的形态和生理生化特征均不同于已知菌，是从海洋环境分离出的新种。

通过API细菌鉴定系统，及recA、gyrA和gyrB基因序列分析，对DK1-SA11菌种进行生化和分子鉴定，API 20E（市售试剂盒）, API coryne（市售试剂盒），API 50CHB（市售试剂盒）和API ZYM（市售试剂盒）的API试剂盒生化鉴定结果（见表1）和recA, gyrA和gyrB基因的系统进化分析得知DK1-SA11为一株新菌株，不属于短杆菌属。利用序列分析发现DK1-SA11菌株与枯草芽孢杆菌斯皮兹仁亚种相应核苷酸序列具有很高的同源性，其序列相似性为 96-99.9%。

表1 API试剂盒鉴定结果

特性	DK1-SA11
		吡嗪酰胺酶	阴性
吡咯烷酮基芳基酰胺酶	阳性
		碱性磷酸酶	阳性
β葡萄糖醛酸酶	阴性
		β半乳糖苷酶	阴性
α葡萄糖醛酸酶	阳性
		N乙酰β氨基葡萄糖苷酶	阴性
β葡萄糖苷酶	阳性
		尿素酶	阴性
水解	阳性
		D葡萄糖	阳性
D核糖	阳性
		D木糖	阳性
D甘露糖	阳性
		D麦芽糖	阳性
D乳糖	阴性
		D蔗糖	阳性
淀粉	阳性

通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定DK1-SA11属于芽孢杆菌属，为枯草芽孢杆菌。

市售的2216E液体培养基最有利于DK1-SA11的培养和抑菌产物的生成，最佳培养条件为25℃，pH 7.0，180r/min振荡培养60-72小时，盐浓度为1%时抑菌物质产生最多。

DK1-SA11具有广谱抗菌性，对革兰氏阴性、革兰氏阳性、致病酵母菌以及一些超级细菌均有抑制作用。

本发明的菌株DK1-SA11的分离获得：

（1）本发明的菌株DK1-SA11由中国青岛黄海（北纬36°03′35.5″，东经120°18′34.4″）贻贝表面筛选得到。采样之前装有冰的箱子已经用70%乙醇消毒，样品（贻贝）在用海水洗过后装入无菌袋后放入冰箱子直到到达实验室，然后将样品放入4℃冰箱直至实验。样品称好放入无菌海水然后进行稀释直至10^-6。然后取0.1ml涂布于2216E琼脂培养基（市售培养基），48h后挑取单菌落再次在2216E琼脂培养基划线纯化。纯化好的单菌落（即为本发明的菌株DK1-SA11）保存在含有30%甘油的2216E液体培养基（市售）中，储存于-80℃。

（2）将步骤（1）获得的DK1-SA11涂布于2216E琼脂培养基上30℃培养3天获得含菌平板。

培养了18h的试验菌单核细胞增生性李斯特菌、霍乱弧菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌分别与无菌的沙氏BHI琼脂（市售）混合，使溶液在600nm的吸光值到达0.2，此时菌数为10⁸CFU/ml，整个过程保持45℃然后分别倒在含菌平板上。将半固体BHI琼脂培养基（市售）作为阴性对照倒在含菌平板上。凝固后所有倒好的所有平板放置在4℃，4小时使抑菌物质扩散到表层，然后倒有单核细胞增生性李斯特菌的平板放置于30℃，其余平板放置于37℃培养24h。次日检测出现不用程度的抑菌圈，说明初步筛选到一株具有抑菌活性的菌株。

（3）对筛选到的菌种进行分子鉴定：

提取菌株基因组DNA，然后使用引物

recA F [5’- TGAGTGATCGTCAGGCAGCCTTAG -3’]（SEQ ID NO.1）和 recA R [5'-TTCTTCATAAGAATACCACGAACCGC -3’] （SEQ ID NO.2）进行PCR扩增，进行DNA琼脂糖凝胶电泳，然后市售试剂盒回收纯化PCR产物，然后在含有1μl pUCmT载体质粒（市售）、1μl T4DNA连接酶（市售）、5μl快速链接缓冲液2×（市售）以及3μl纯化的PCR产物的离心管中进行连接反应。16℃下12-16h后连接产物转移到感受态大肠杆菌中，然后取200μl涂布在含有X-GAL（市售）、IPTG（市售）以及氨苄西林（市售）的LB琼脂平板（LB固体培养基）上。平板37℃培养过夜。然后放置在4℃4h让其产生颜色。挑选重组体然后在含有100μg/ml的氨苄西林的LB液体培养基中培养过夜。采用市售试剂盒提取质粒。然后于青岛派诺森公司进行测序，测序结果进行blast对比，然后建立系统进化树（见附图2）。同理对gyrA基因和gyrB基因进行测序以及blast对比。RecA基因序列（SEQ ID NO.3）与枯草芽孢杆菌斯皮兹仁亚种具有99.9%的相似性，gyrA基因（序列见SEQ ID NO.4）和gyrB基因（序列见SEQ ID NO.5）blast结果与不同枯草芽孢杆菌斯皮兹仁亚种具有96%-99.7%的相似性。

通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定DK1-SA11属于枯草芽孢杆菌斯皮兹仁亚种。

（4）对本发明的菌株DK1-SA11的发酵液进行抑菌活性测定，具体步骤如下：

1、DK1-SA11的活化：在超净工作台中无菌操作，用接种环挑取DK1-SA11，在平板培养基(2216E琼脂培养基) 上用接种环划线，在25℃培养箱中进行培养2d。

2、供试细菌的活化：用接种环挑取供试菌：白色念珠菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、单核细胞增生李斯特菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、腐败希瓦氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌于无菌环境下，接种于3mlBHI液体培养基（现有常规培养基），30℃120转/min过夜培养。然后将培养液在BHI琼脂培养基（现有常规培养基）上划线，30℃120转/min培养1d。

3、DK1-SA11发酵样品的制备：将活化的DK1-SA11菌种接于3ml 2216E液体培养基中，28℃摇床120转/min培养24小时后转接1ml到100ml 2216E液体培养基，28℃摇床120转/min培养72小时。培养液用冷冻离心机4℃、9000g离心15分钟去除菌体，上层清液0.22微米过滤得发酵上清液。将上清液进行真空干燥成粉末状得提取物，用纯水将提取物配制成0.1mg/ml上清提取物溶液，并且调pH为7。

4、含菌平板制备：将按照上述步骤2操作活化2-3 次的供试细菌接种于3ml BHI液体培养基（现有常规培养基）37℃过夜培养然后600nm吸光值稀释到0.2，大约10⁸cfu/ml，然后用无菌棉棒涂布于0.7%的BHI琼脂得含菌平板。

采用牛津杯法进行抑菌实验：将灭菌牛津杯置于含菌平板上，然后每个牛津杯加入100μl 0.1g/ml的上清提取物溶液。把含菌平板置于4℃放置两小时使溶液充分扩散，然后将所有含菌平板放置在指示菌最适生长温度下24h。没有加入菌的2216E液体培养基作为阴性对照接入牛津杯，10μl 10mg/ml的新霉素以及10μl 100μg/ml的氨苄西林作为阳性对照加入牛津杯。用抑菌圈的直径作为抑菌强弱的指标结果见表2。

表2

。

试验结果表明：DK1-SA11具有较强的广谱抗菌作用，对多种致病菌具有较好的抑制作用，为开发新型抗菌药提供了依据。

本发明的具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌可用于生产抑菌物质。

本发明的具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌也可用于生产微生物生态制剂。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国海洋大学

<120> 一种具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌

<130> 2014.04.04

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgagtgatcg tcaggcagcc ttag 24

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttcttcataa gaataccacg aaccgc 26

<210> 3

<211> 882

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属（Bacillus）

<400> 3

ttgagtgatc gtcaggcagc cttagatatg gctcttaaac aaatagaaaa acagttcggc 60

aaaggttcta ttatgaaact gggagaaaag acagatacaa gaatttctac tgtcccaagc 120

ggctccctcg ctcttgatac agcactagga attggcggat atccgcgcgg acggattatt 180

gaagtatatg gtcctgaaag ctcaggtaaa acaactgtgg cgcttcatgc gattgctgag 240

gttcagcagc agggcggaca agccgcgttt atcgatgcgg agcatgcgtt agatccggta 300

tacgcgcaaa agcttggagt caatatcgaa gagcttttac tgtctcagcc tgacacaggt 360

gagcaggcgc ttgaaattgc ggaagcgctg gttcgaagcg gtgcagttga cattgttgtt 420

gtcgactctg tggcggctct cgttccgaaa gcggaaattg aaggcgacat gggagattcg 480

catgtcggtt tacaagctcg cttaatgtct caagcgcttc gtaagctttc aggggccatt 540

aacaaatcga agacaatcgc gattttcatt aaccaaattc gtgaaaaagt cggcgttatg 600

ttcgggaacc cggaaacaac tcctggcggc cgcgcgctga aattctactc ttccgtgcgt 660

cttgaagtgc gccgtgctga acagctgaaa caaggcaacg acgtaatggg gaacaaaacg 720

aaaatcaaag tcgtgaaaaa caaggtagct ccgccgttcc gtacagccga ggttgacatt 780

atgtacggag aaggcatctc aaaagaaggc gaaatcattg atcttggaac tgaacttgat 840

atcgtgcaaa aaagcggttc gtggtattct tatgaagaaa ag 882

<210> 4

<211> 993

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属（Bacillus）

<400> 4

tcgtcattct tggattatgc aatgagcgtt attgtgtccc gtgctcttcc agatgttcgt 60

gatggtttaa agccggttca tagacggatt ttgtatgcta tgaatgattt ggggatgacg 120

agtgacaagg cttataaaaa atccgcgcgt atcgttggag aagttatcgg gaaataccac 180

ccacacggtg attcagcggt atatgaatcc atggtcagaa tggcgcagga tttcaactat 240

cgttatatgc tcgttgacgg tcacggaaac ttcggttctg ttgacggaga ctcagcggct 300

gccatgcgtt atacagaagc aagaatgtct aagatctcga tggaaattct tcgagatatc 360

acaaaagaca caattgatta tcaggataac tatgatgggt cagaaagaga acctgttgtt 420

atgccttcaa ggttcccgaa tctgctcgtg aacggtgctg ccggtattgc ggtaggtatg 480

gcaacaaaca ttcctccgca ccagcttggg gaaatcattg acggtgtact tgctgtcagt 540

gagaacccgg acattacaat cccggagctt atggaattca ttccagggcc tgatttcccg 600

actgcgggtc aaatcttggg acgaagcggt atacggaagg catacgaatc tggccgaggc 660

tcaattacga ttcgagcaaa agctgagatc gaacaaacgt cttcaggtaa agaaagaatt 720

atcgttacag agttacctta ccaagtaaat aaggcgaaat taatcgagaa aattgctgat 780

ctcgttagag acaaaaagat agagggcatc acagatctgc gtgatgagtc agatcgtaca 840

ggtatgagaa ttgtcattga aatcagacgc gatgccaatg caaatgttat tctaaacaac 900

ctatacaaac aaactgcgct acaaacgtct tttggtatca acctgcttgc gcttgttgac 960

ggtcagccga aagttttaaa tctaaagcaa tgc 993

<210> 5

<211> 1100

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属（Bacillus）

<400> 5

ggtgcgtcag tcgtaaacgc gctttcaact gagcttgttg tgacggtaca ccgtgacggt 60

aaaatccacc gtcaaaccta taaacgtgga gttccggttt cagaccttga aatcattggc 120

gaaacagatc atacaggaac gacgacacat tttgtccctg atcctgagat ttttacagaa 180

acaactgtgt atgattatga tctgcttgct aaccgcgtgc gcgaattagc ctttttgaca 240

aaaggcgtaa acatcacgat tgaagataaa cgtgaaggac aagaacgcaa aaatgagtac 300

cattacgaag gcggaattaa aagttatgta gagtatttaa accgttctaa agaagttgtc 360

cacgaagagc caatttacat tgaaggtgaa aaggacggca ttacggttga agtggcttta 420

caatacaatg acagctacac aagcaacatt tactcattta caaataacat taacacgtat 480

gaaggtggta cccacgaagc gggctttaaa actggtctga ctcgtgttat caacgattac 540

gccagaaaaa aaggactcat aaaagaaaat gatccaaact taagcggaga tgacgtaaga 600

gaagggctga ccgcgattat ttcaatcaaa caccctgatc cgcagttcga aggccaaacg 660

aaaacaaaac taggcaactc agaggcgcgg acgatcacag atacgttatt ttctgcggcg 720

ttggaaacat ttatgctgga aaatccagac gcggctaaaa aaattgtcga taaaggttta 780

atggcggcaa gagcaagaat ggctgcgaaa aaagcacgtg aattaacacg ccgcaagagt 840

gctttggaaa tttcaaacct tcctggtaag ttagcggact gctcttcaaa agacccgagc 900

atctccgagt tgtatatcgt agagggtgat tctgccggag gatctgctaa acagggacgc 960

gacagacatt ttcaagccat tttgccgctt agaggtaaaa tcctgaacgt tgaaaaagca 1020

agactggata aaatcctttc aaataacgaa gttcgctcta tgattacagc gctcggcaca 1080

ggtatcgggg aagatttcaa 1100

Claims

1.一种具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌，其特征在于：该菌株命名为Bacillus sp.DK1-SA11，已于2013年11月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2013589。

2.一种权利要求1所述的具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌用于生产抑菌物质的用途。

3.一种权利要求1所述的具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌用于生产微生物生态制剂的用途。