CN110564878A - 维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测方法及所用引物、探针、试剂盒 - Google Patents

维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测方法及所用引物、探针、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测引物、探针、试剂盒及方法。本发明设计了一种维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测引物，所述生产菌株为枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM‑10445，引物的核苷酸序列为：正向引物为5’‑CGA GCT TTT GCG CGT ATA‑3’，其反向引物为5’‑GCC ATT CCA ATA CAAAAC CAC ATA‑3’，以及探针、试剂盒和检测方法。本发明能精确检测维生素B2产品中枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM‑10445生产菌株残留DNA，开发了一种检测所涉及的引物、探针、试剂盒及检测方法。

Description

维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测方法及所用引物、探 针、试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测方法及所用引物、探针、试剂盒。
背景技术
维生素B2是维持人和动物机体正常物质代谢所必须的营养物质，在呼吸和生物氧化中起着重要的作用。维生素B2的生产工艺主要有4种：植物体提取法、化学合成法、微生物发酵法和半微生物发酵合成法，其中微生物发酵法由于一系列的优点目前已成为维生素B2工业化生产的主要方法。微生物发酵法生产维生素B2主要用的生产菌种有阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，B.subtilis)等。由于天然菌合成维生素B2的发酵周期长(6-8天)、自身存在反馈抑制导致维生素B2的生产效率低，但随着分子生物学研究的深入以及基因操作技术的日益成熟，目前已经成功构建出用于维生素B2发酵的基因工程菌，主要是以枯草芽孢杆菌(B.subtillis)作为受体菌进行基因改造以用于发酵合成高产维生素B2。基因工程菌发酵合成维生素B2的三个明显优势在于：首先，基因工程菌生产速率快，而且维生素B2的合成是生长相关型的，可以缩短发酵周期，大大提高生产效率；其次，基因工程改造修饰相对于诱变选育，具有更大的潜力和操作空间；最后，基因工程菌发酵过程中使用可再生资源，生产过程污染少，产品纯度高，安全性好，使得其在维生素B2的微生物发酵生产中显示了强大的生命力。但是基因工程菌在构建过程中，常常需要引入外源抗性基因作为筛选的标记，这些抗生素抗性基因可能会造成新型的环境污染物。一方面，在自然界中这些抗性基因片段存在转移到其它细菌中的可能性，使得抗性基因在自然界的细菌中扩散，从而导致目前人类所使用的抗生素失效，威胁到人类和动物的健康，另一方面，终产品中生产菌株的DNA残留可能会引起动物和人的过敏反应，同时抗性基因可能会发生转移，随着被污染生物的繁殖而得到增殖再扩散造成基因污染。因此要严格控制微生物发酵产品的质量，在最终产品中，既不能检测到生产菌株，也不能检测出完整的抗性基因和生产菌株的DNA，防止基因污染，保护产品的安全性和使用安全性。所以，对维生素B2产品中基因工程菌残留DNA进行限量检测，确定产品质量确保使用安全是非常有必要的，具有深远意义。
实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术是在PCR反应体系中加入荧光标记基团，利用收集荧光信号的累积来实时监控整个PCR扩增，最后得到扩增荧光信号阈值循环数(Ct)，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其中，Tapman探针因其具有极高的特异性和准确性、良好的重复性，使得其在高特异性qPCR中应用广泛。实时荧光定量PCR技术将核酸的扩增和杂交技术、光谱分析技术和实时检测技术融合在一起，具有灵敏度高、特异性强、高通量和定量准确等特点，使得其应用非常广泛，不仅可以定性检测医学领域的病原DNA，还可定量检测病原量，且食品药品行业可以检测致病菌、DNA残留等，在植物学领域还可以检测植物病原菌。
发明内容
为了实现维生素B2中生产菌株残留DNA的定量检测，尤其是枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM-10445(以下简称GM B.subtilis)工程菌菌株残留DNA，分析维生素B2产品中DNA残留状况，提高检测灵敏度，利用全基因组序列数据建立了一种针对枯草芽孢杆菌基因组中氯霉素抗性基因(cat)整合位点的结构特异性实时荧光PCR分析方法用来检测生产菌株的DNA残留，对维生素B2品中的DNA残留检测和维生素B2作为药物、营养添加剂、饲料添加剂等发酵产品质量检测保证使用安全具有深远意义。
本发明提供了维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测引物、探针、试剂盒及方法，能有效检测维生素B2中生产菌株(GM B.subtilis)的残留DNA并判断维生素B2产品质量是否安全。
本发明提供的技术方案为一种维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测引物，所述生产菌株为枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM-10445，引物的核苷酸序列为：正向引物为5’-CGA GCT TTT GCG CGT ATA-3’，其反向引物为5’-GCC ATT CCA ATA CAA AAC CAC ATA-3’。
一种维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测探针，探针序列为FAM-CGG ATC TAACGC ATG CTC CGC A-BBQ。
一种维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测试剂盒，包括上述引物、上述探针和qPCR扩增组件。
上述试剂盒在检测维生素B2中生产菌株残留DNA的应用。
其中，上述试剂盒检测维生素B2中生产菌株残留DNA的方法为，首先提取游离DNA，进行连续梯度稀释，再使用引物、探针和荧光定量PCR扩增组件组成的试剂盒进行qPCR分析，根据所得Ct值与其对应的标准品的对数值得到了qPCR分析的标准曲线及相关系数R2和扩增效率E进行判断。
而且，所述提取游离DNA为从维生素B2样品中提取生产菌株DNA，包括以下步骤：
步骤1：称取1g核黄素样品，置于50mL离心管中；
步骤2：加入2.5mL裂解缓冲液A和25μL RNA酶，加入25μL溶菌酶，盖上管并涡旋振荡，在37℃水浴孵育15min；
步骤3：加入1.25mL裂解缓冲液B，涡旋振荡10-15s，然后将试管在22–25℃的室温下孵育10min；
步骤4：加入3.75mL沉淀液，剧烈涡流；
步骤5：以3000-5000×g的速度旋转10min；
步骤6：将上层清液转移到新的50mL试管中，加入定量的B.subtilis KCCM-10445基因组DNA，混合均匀；
步骤7：取一瓶磁珠混合液颠倒15-30s使磁珠彻底重悬；
步骤8：向上清液添入100μL重悬好的磁珠悬浮液，然后涡流振荡；
步骤9：加入0.8体积的异丙醇后将管子颠倒10-15次混匀，然后室温下静置5min；
步骤10：将管子放磁力架上，待上清液变清澈后，弃上清液；
步骤11：从支架上取下管子，加入1.25mL裂解缓冲液B，将管子颠倒2-3次混匀，然后将管子放回磁力架上，待上清液变清澈后，弃上清液；
步骤12：加入5mL洗涤液，将试管放在支架上1min，弃上清液，再重复两次，共洗3次；使用移液器除去并丢弃液体；
步骤13：干燥磁珠，在室温下干燥15-30min或在65℃下干燥10min；
步骤14：加入100-400μL无核酸酶水，涡旋，并在65℃下放置5min，把管子放在磁性支架上，待上清液变清澈后，将上清液转移到另一个离心管中。
而且，qPCR在25μL的PCR反应体系中进行；所述进行连续梯度稀释为将B.subtilisKCCM-10445全基因组DNA梯度稀释为10ng/g，1ng/g，10-1ng/g，10-2ng/g，10-3ng/g，10-4ng/g，10-5ng/g，10-6ng/g八个不同浓度，作为后续qPCR扩增的模板；PCR反应体系中含有12.5μL2x Taq TM探针混合液、每个引物0.4mM、0.1mM探针和2μL模板DNA，qPCR扩增热循环条件为先在95℃变性10min，然后再经过45个94℃变性40s、60℃复性延伸的循环扩增出目的片段。
与现有技术相比，该技术方案的有益效果在于：本发明能精确检测维生素B2产品中枯草芽孢杆菌GM B.subtilis生产菌株残留DNA，并开发了一种检测所涉及的引物、探针、试剂盒及检测方法。该方法具有高的灵敏度、低的检测限，能特异性定量检测维生素B2中的DNA残留，该方法学的检测限低至0.1ng/g，且在实际样品测试中具有高的特异性和稳定性。
附图说明
图1为生产菌株的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1是Marker，泳道2是生产菌株基因组DNA；
图2为通过琼脂糖凝胶电泳分析qPCR产物，1是Marker，其中最下方条带代表100bp，2、3和4泳道是扩增不同浓度基因组DNA的qPCR产物；
图3为qPCR产物的序列。
图4为开发的结构特异性qPCR分析的标准曲线、相关系数(R2)和PCR扩展效率(E)。
具体实施方式
针对维生素B2产品中枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM-10445(简称GMB.subtilis)生产菌株残留DNA的检测，根据其携带氯霉素抗性基因设计了维生素B2中枯草芽孢杆菌GM B.subtilis生产菌株残留DNA的qPCR检测引物，引物的核苷酸序列为：正向引物为5’-CGA GCT TTT GCG CGT ATA-3’，其反向引物为5’-GCC ATT CCA ATA CAA AAC CACATA-3’。以及维生素B2中枯草芽孢杆菌GM B.subtilis生产菌株残留DNA的qPCR检测探针，其探针序列为FAM-CGG ATC TAA CGC ATG CTC CGC A-BBQ。如表1所示：
表1 引物和探针序列
针对维生素B2产品中枯草芽孢杆菌GM B.subtilis生产菌株残留DNA的检测，设计了维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测试剂盒，该试剂盒包括上述引物、权利探针和qPCR扩增组件。
上述引物是根据枯草芽孢杆菌GM B.subtilis生产菌株特有的序列设计的，通过GM B.subtilis与B.subtilis 168的全基因组序列比对，发现了一个含有完整的氯霉素抗性基因的外源基因插入片段,该片段是同源重组时随机整合进去的，野生型菌株和其他菌株不存在，根据其携带氯霉素抗性基因片段的插入位点两侧的DNA序列设计了检测引物和探针。
为了建立qPCR检测方法以及验证方法的可行性，我们首先验证引物和探针的特异性。首先提取GM B.subtilis生产菌株总DNA，将提取到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度法测定了基因组DNA的质量和浓度，OD260/OD280的值为1.950，从图1的凝胶电泳可以看出基因组DNA完整无降解，无RNA或蛋白质污染。
将提取到的生产菌株基因组DNA稀释成三个不同的浓度进行qPCR扩增，再用琼脂糖凝胶电泳对qPCR产物进行分析，结果如图2所示，三条清晰的条带为qPCR产物(76bp)，且再无任何其他产物的条带，说明qPCR扩增为特异性扩增，引物特异性非常强。将PCR产物克隆到pMD-18T载体上并测序。测序结果如表2和图3所示。该序列确认是我们的目标序列。
表2 qPCR产物序列
利用直接从枯草芽孢杆菌GM B.subtilis生产菌株提取的基因组DNA，验证上述维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测引物和探针的特异性。
枯草芽孢杆菌GM B.subtilis生产菌株基因组DNA提取方法，根据美基试剂盒protocol进行操作，具有以下步骤：
1.将GM B.subtilis工程菌在含抗生素的培养基中过夜培养。室温下，取3mL培养液在12000×g条件下离心1min。
2.加入220μL STE缓冲液、5μL RNA酶和30μL溶菌酶至细菌沉淀团中。涡旋充分重悬细菌，37℃水浴10min。
3.加入20μL SDS缓冲液和10μL蛋白酶K至细菌重悬液中。涡旋混匀，65℃水浴消化30min。
4.加入250μL DL缓冲液和250μL无水乙醇至裂解液中。最高速度涡旋30秒。注：这一步若有絮状沉淀出现，用移液枪吸打几次尽量打散沉淀。
5.把DNA纯化柱装在2mL收集管中。把第五步获得的混合液(包括沉淀)转移至柱子中。10000×g离心1min。
6.倒弃流出液，把柱子装回收集管中。加入500μL洗涤液GW1(已用乙醇稀释)至柱子上洗涤去除蛋白质和其它杂质。10000×g离心1min。
7.倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入650μL洗涤液GW2(已用乙醇稀释)至柱子中洗涤去除盐分。10000×g离心1min，倒弃流出液，重复三次。
8.把柱子装回收集管中，10000×g离心2min；这一步可去除柱子中残留的乙醇。
9.将柱子装在新的1.5mL离心管中。加入30-50μL预热至65℃缓冲液AE至柱子膜中央。放置3min。10000×g离心1min，重复一次。
10.丢弃DNA结合柱，把DNA保存2-8℃，长期保存需保存于-20℃
对枯草芽孢杆菌GM B.subtilis基因组DNA的qPCR分析如下：
qPCR在25μL的PCR反应体系中进行，将GM B.subtilis全基因组DNA梯度稀释为10ng/g，1ng/g，10-1ng/g，10-2ng/g，10-3ng/g，10-4ng/g，10-5ng/g，10-6ng/g八个不同浓度，作为后续qPCR扩增的模板。
PCR反应体系中含有12.5μL 2x TaqTM探针混合液(TaqTM探针即Taqman探针，是一种检测寡核苷酸的荧光探针)、每个引物0.4mM，0.1mM探针和2μL模板DNA。qPCR扩增热循环条件为先95℃变性10min，然后经过45个循环(94℃变性40s，60℃复性延伸)扩增出目的片段。
为了测定该结构特异性qPCR法的可行性及适用性。我们将提取到的基因组DNA进行连续梯度稀释(从108拷贝数到10拷贝数)，再使用所述的引物、探针和所述的荧光定量PCR组件组成试剂盒进行qPCR分析，根据所得Ct值与其对应的标准品的对数值得到了图4所示的qPCR分析的标准曲线及相关系数R2和扩增效率E。标准曲线的相关系数R2为0.9995，qPCR的扩增效率E为92％，与用于检测生产中生产菌株的基因组DNA残留的qPCR定量方法所确定的可接受范围相一致(R2≧0.98，E的范围在90％-110％)，进一步说明引物的特异性。
将生产菌株GM B.subtilis中提取的基因组DNA进行不同浓度稀释，然后加入到维生素B2(98％)中混合，再用DNA提取试剂盒从含已知量DNA的样品(维生素B2+基因组DNA)中提取DNA，进行qPCR检测，直至DNA检测不到为止，其中以水作为阴性对照，每个样品重复测定21次。提取前1g样品中加入0.1ng基因组DNA的Cq平均值为37.62，总重复次数(n＝21)的阳性率为100％，提取前1g样品分别加入10-2ng和10-3ng基因组DNA的Cq值分别为40.38和41.61，总重复次数(n＝21)的阳性率分别为66.7％和14.3％(表3)。LOD定义为分析物的最低浓度，给出概率为95％的为阳性结果。结果表明，qPCR检测出的检测限为0.1ng基因组DNA，检出限阈值确定21次。
表3 测定qPCR的检测限
注：(a).每个浓度测得的Cq值正信号的平均值和百分比是重复21次所得结果。(b)N/A：不适用；na：不适用；阴性对照：水。
利用该试剂盒设计检测维生素B2中生产菌株残留DNA的应用及方法，首先提取GMB.subtilis生产菌株DNA，进行连续梯度稀释，再使用引物、探针和荧光定量PCR扩增组件组成的试剂盒进行qPCR分析，根据所得Ct值与其对应的标准品的对数值得到了qPCR分析的标准曲线及相关系数R2和扩增效率E进行判断。
提取GM B.subtilis生产菌株DNA是指从维生素B2样品中提取生产菌株DNA，所用试剂盒为普格麦格DNA纯化系统(PromegaMagnetic DNA Purification System)，具体操作步骤为：
1.称取1g核黄素样品，置于50mL离心管中。
2.加入2.5mL裂解缓冲液A(用于使可能存在的菌溶解)和25μL RNA酶，加入25μL溶菌酶(10mg/mL)，盖上管并涡旋振荡，在37℃水浴孵育15min。
3.加入1.25mL裂解缓冲液B(用于使核酸与其他生物大分子物质如蛋白质等分离)，涡旋振荡10-15s，然后将试管在室温(22–25℃)下孵育10min。
4.加入3.75mL沉淀液，剧烈涡流或涡旋振荡。
5.以3000-5000×g的速度旋转10min。
6.将上层清液(液相)转移到新的50mL试管中，加入定量的GM B.subtilis基因组DNA，混合均匀。
7.取一瓶MagneSilTM PMP磁珠混合液颠倒15-30s使磁珠彻底重悬。
8.向上清液添入100μL重悬好的磁珠悬浮液，然后涡流振荡。
9.加入0.8体积的异丙醇后将管子颠倒10-15次混匀，然后室温下静置5min。
10.将管子放磁力架上，待上清液变清澈后，弃上清液。
11.从支架上取下管子，加入1.25mL裂解缓冲液B。将管子颠倒2-3次混匀，然后将管子放回磁力架上。待上清液变清澈后，弃上清液。
12.加入5mL洗涤液，将试管放在支架上1min。弃上清液。再重复两次，共洗3次。使用移液器，尽可能地除去并丢弃液体。
13.干燥磁珠(室温下15-30min或65℃下10min)。
14.加入100-400μL无核酸酶水，涡旋，并在65℃下放置5min。把管子放在磁性支架上。待上清液变清澈后，将上清液转移到另一个1.5mL离心管中。
为了验证维生素B2中GM B.subtilis生产菌株DNA残留的qPCR引物和Taqman探针的特异性，我们选取了GM B.subtilis进行qPCR，同时以其他菌作为对照，包括其他芽孢杆菌属野生型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefacien)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、缓慢牙孢杆菌(Bacillus lentus)、其他维生素B2生产菌株阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)及其他菌株大肠杆菌(Escherichia coli)等进行特异性测定，同时以水作为阴性对照，因为这些菌可能存在于环境、物料和饲料基质中。提取所有样品的基因组DNA，包括GM B.subtilis，然后将其稀释至10ng/g，用该qPCR试剂盒进行qPCR特异性测试，每组样品平行测定三次。结果如表4所示，仅能检测GM B.subtilis的基因组DNA。这种结果是可以预料的，也进一步证明所设计的引物和探针具有高的特异性，无交叉反应。
菌种 Cq(平均值) 结果
Bacillus subtilis KCCM-10445 21 100
Bacillus subtilis CICC 10012 N/A N/A
Bacillus amyloliquefacien CICC 10036 N/A N/A
Bacillus licheniformis CICC 10037 N/A N/A
Bacillus cereus CICC 10040 N/A N/A
Bacillus lentus CICC 10365 N/A N/A
Eremothecium ashbyii CICC 1788 N/A N/A
Ashbya gossypii BNCC 216061 N/A N/A
Escherichia coli CICC 20658 N/A N/A
negative control na N/A
表4 不同菌株的qPCR测试结果
注：(a)每个浓度测得的Cq值正信号的平均值和百分比是重复3次所得结果。(b)N/A：不适用；na：不适用；阴性对照：水。
由上表可知，本方法针对维生素B2产品中枯草芽孢杆菌GM B.subtilis生产菌株残留DNA的检测，非常精确。本发明能精确检测维生素B2产品中枯草芽孢杆菌GMB.subtilis生产菌株残留DNA，并开发了一种检测所涉及的引物、探针、试剂盒及检测方法。该方法具有高的灵敏度、低的检测限，能特异性定量检测维生素B2中的DNA残留，该方法学的检测限低至0.1ng/g，且在实际样品测试中具有高的特异性和稳定性。
序列表
<110> 湖北广济药业股份有限公司
<120> 维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测方法及所用引物、探针、试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgagcttttg cgcgtata 18
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccattccaa tacaaaacca cata 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggatctaac gcatgctccg ca 22

Claims (7)

1.一种维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测引物，所述生产菌株为枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM-10445，其特征在于引物的核苷酸序列为：正向引物为5’-CGA GCT TTTGCG CGT ATA-3’，其反向引物为5’-GCC ATT CCA ATA CAA AAC CAC ATA-3’。
2.一种维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测探针，其特征在于：探针序列为FAM-CGGATC TAA CGC ATG CTC CGC A-BBQ。
3.一种维生素B2中生产菌株残留DNA的qPCR检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的引物、权利要求2所述的探针和qPCR扩增组件。
4.权利要求3所述的试剂盒在检测维生素B2中生产菌株残留DNA的应用。
5.权利要求3所述的试剂盒检测维生素B2中生产菌株残留DNA的方法，其特征在于：首先提取游离DNA，进行连续梯度稀释，再使用引物、探针和荧光定量PCR扩增组件组成的试剂盒进行qPCR分析，根据所得Ct值与其对应的标准品的对数值得到了qPCR分析的标准曲线及相关系数R2和扩增效率E进行判断。
6.根据权利要求5所述的试剂盒检测维生素B2中生产菌株残留DNA的方法，其特征在于：所述提取游离DNA为从维生素B2样品中提取生产菌株DNA，包括以下步骤：
步骤1：称取1g核黄素样品，置于50mL离心管中；
步骤2：加入2.5mL裂解缓冲液A和25μL RNA酶，加入25μL溶菌酶，盖上管并涡旋振荡，在37℃水浴孵育15min；
步骤3：加入1.25mL裂解缓冲液B，涡旋振荡10-15s，然后将试管在22–25℃的室温下孵育10min；
步骤4：加入3.75mL沉淀液，剧烈涡流；
步骤5：以3000-5000×g的速度旋转10min；
步骤6：将上层清液转移到新的50mL试管中，加入定量的B.subtilis KCCM-10445基因组DNA，混合均匀；
步骤7：取一瓶磁珠混合液颠倒15-30s使磁珠彻底重悬；
步骤8：向上清液添入100μL重悬好的磁珠悬浮液，然后涡流振荡；
步骤9：加入0.8体积的异丙醇后将管子颠倒10-15次混匀，然后室温下静置5min；
步骤10：将管子放磁力架上，待上清液变清澈后，弃上清液；
步骤11：从支架上取下管子，加入1.25mL裂解缓冲液B，将管子颠倒2-3次混匀，然后将管子放回磁力架上，待上清液变清澈后，弃上清液；
步骤12：加入5mL洗涤液，将试管放在支架上1min，弃上清液，再重复两次，共洗3次；使用移液器除去并丢弃液体；
步骤13：干燥磁珠，在室温下干燥15-30min或在65℃下干燥10min；
步骤14：加入100-400μL无核酸酶水，涡旋，并在65℃下放置5min，把管子放在磁性支架上，待上清液变清澈后，将上清液转移到另一个离心管中。
7.根据权利要求5所述的试剂盒检测维生素B2中生产菌株残留DNA的方法，其特征在于：qPCR在25μL的PCR反应体系中进行；所述进行连续梯度稀释为将B.subtilis KCCM-10445全基因组DNA梯度稀释为10ng/g，1ng/g，10-1ng/g，10-2ng/g，10-3ng/g，10-4ng/g，10-5ng/g，10- 6ng/g八个不同浓度，作为后续qPCR扩增的模板；PCR反应体系中含有12.5μL 2x Taq TM探针混合液、每个引物0.4mM、0.1mM探针和2μL模板DNA，qPCR扩增热循环条件为先在95℃变性10min，然后再经过45个94℃变性40s、60℃复性延伸的循环扩增出目的片段。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1504564A (zh) * 2002-12-05 2004-06-16 Gj��ʽ���� 生产核黄素的微生物和利用其生产核黄素的方法
CN104109643A (zh) * 2014-04-23 2014-10-22 中国海洋大学 一种具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1504564A (zh) * 2002-12-05 2004-06-16 Gj��ʽ���� 生产核黄素的微生物和利用其生产核黄素的方法
CN104109643A (zh) * 2014-04-23 2014-10-22 中国海洋大学 一种具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANASTASSIADOU M等: "EFSA statement on the risk posed to humans by a vitamin B2 produced by a genetically modified strain of Bacillus subtilis used as a feed additive", 《EFSA JOURNAL》 *
BAMPIDIS V等: "Safety of vitamin B2 (80%) as riboflavin produced by Bacillus subtilis KCCM-10445 for all animal species", 《EFSA JOURNAL》 *
PARACCHINI V等: "Molecular characterization of an unauthorized genetically modified Bacillus subtilis production strain identified in a vitamin B2 feed additive", 《FOOD CHEM》 *
PARACCHINI V等: "登录号：LT622644.1", 《GENBANK》 *

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