CN113201599B - 一种基于PCR和nanopore测序检测脑脊液感染哪些病原体的方法 - Google Patents

一种基于PCR和nanopore测序检测脑脊液感染哪些病原体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于PCR和nanopore测序检测脑脊液感染哪些病原体的方法。实验证明，采用本发明提供的方法检测脑脊液，可以准确判断中枢神经系统感染的病原体为Enterovirus、Lymphocytic choriomeningitis virus、Neisseria meningitidis、Cytomegalovirus、Mycobacrterium tuberculosis、Nocardia Farcinica、Herpes simplexvirus 1、Human herpesvirus 6、Listeria monocytogenes和Herpes simplex virus2中的哪一种或哪几种。本发明为中枢神经系统感染提供准确而迅速的病原学诊断，具有很高的临床应用价值。

Description

一种基于PCR和nanopore测序检测脑脊液感染哪些病原体的 方法
技术领域
本发明属于生物信息学领域，具体涉及一种基于PCR和nanopore测序检测脑脊液感染哪些病原体的方法。
背景技术
脑膜炎是严重威胁生命的脑膜和蛛网膜下腔炎症，由于它们在解剖学上的接近，炎症也可能累及大脑皮质和脊髓，需要立即就医和处理。脑膜炎症会引起血管痉挛，并可能导致脑小动脉和动脉的血栓形成以及可能的脑静脉阻塞。细菌和嗜中性粒细胞的多种炎性产物可穿过血脑屏障，引起神经元坏死或压迫颅神经。脑膜炎在世界范围内发生，并在各个年龄段的个体中发展，并导致高的发病率和死亡率。
脑膜炎病原体包括细菌、真菌、病毒等，传统培养的方法周期长、灵敏度低，并且常规临床微生物实验室不能培养病毒，不能完全满足临床的需求。准确而迅速的检测中枢神经系统感染哪些病原体，对于临床工作具有体重要的应用价值。
Nanopore测序为单分子实时测序技术，具有低成本、高通量、非标记和测序长度长、快速等优势。
发明内容
本发明的目的是检测中枢神经系统是否感染Enterovirus、Lymphocyticchoriomeningitis virus、Neisseria meningitidis、Cytomegalovirus、Mycobacrteriumtuberculosis、Nocardia Farcinica、Herpes simplex virus 1、Human herpesvirus 6、Listeria monocytogenes和/或Herpes simplex virus2。
本发明首先保护一种高通量检测若干中枢神经系统分别感染何种病原体的方法，包括如下步骤：
(1)获得10种病原体的marker基因；
10种病原体分别为Enterovirus、Lymphocytic choriomeningitis virus、Neisseria meningitidis、Cytomegalovirus、Mycobacrterium tuberculosis、NocardiaFarcinica、Herpes simplex virus 1、Human herpesvirus 6、Listeria monocytogenes和Herpes simplex virus2；
(2)完成步骤(1)后，分别合成用于扩增10种病原体marker基因的特异引物对且各个特异引物对的靶序列长度为400-600bp；每个特异引物对由上游引物和下游引物组成；
(3)完成步骤(2)后，分别以来源于中枢神经系统的待测组织的cDNA为模板，采用步骤(2)合成的10个特异引物对进行多重PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(4)完成步骤(3)后，将所有PCR扩增产物混合，进行Nanopore扩增子测序，得到测序数据；
(5)完成步骤(4)后，将测序数据分别与10种病原体marker基因进行比对，进行如下判断：如果测序数据与某病原体的marker基因匹配，则相应的中枢神经系统感染该病原体；如果测序数据与某病原体的marker基因不匹配，则相应的中枢神经系统未感染该病原体；
所述方法用于非疾病的诊断与治疗。
所述步骤(1)中，获得10种病原体的marker基因的步骤依次可如下：
(1-1)从数据库下载所述10种病原体的CDS序列；
(1-2)将所有CDS序列进行两两间的相互比对，去除比对上的基因；
(1-3)去除600bp以下的CDS序列；
(1-4)使用minimap2与细菌、寄生虫、真菌和人的基因组序列进行比对，去除能比对上多个物种的CDS序列；
(1-5)根据每种病原体保留的序列数目进行marker筛选，获得marker基因；筛选原则为：如果该病原体仅有一条序列，则直接选择作为marker基因；如果该病原体有多条序列，进一步与NT数据库进行比对去除重复，之后随机选择一条作为marker基因。
所述步骤(1-1)中，数据库可为NCBI数据库。
上述方法中，Enterovirus的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。Lymphocytic choriomeningitis virus的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。Neisseria meningitidis的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。Cytomegalovirus的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。Mycobacrteriumtuberculosis的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。Nocardia Farcinica的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。Herpes simplex virus 1的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。Human herpesvirus 6的marker基因的核苷酸序列如SEQID NO:8所示。Listeria monocytogenes的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。Herpes simplex virus 2的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
所述步骤(2)中，用于扩增Enterovirus的marker基因的特异引物对由SEQ ID NO:11所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:12所示的单链DNA分子组成。用于扩增Lymphocyticchoriomeningitis virus的marker基因的特异引物对由SEQ ID NO:13所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:14所示的单链DNA分子组成。用于扩增Neisseria meningitides的marker基因的特异引物对由SEQ ID NO:15所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:16所示的单链DNA分子组成。用于扩增Cytomegalovirus的marker基因的特异引物对由SEQ ID NO:17所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:18所示的单链DNA分子组成。用于扩增Mycobacrteriumtuberculosis的marker基因的特异引物对由SEQ ID NO:19所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:20所示的单链DNA分子组成。用于扩增Nocardia Farcinica的marker基因的特异引物对由SEQ ID NO:21所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:22所示的单链DNA分子组成。用于扩增Herpes simplex virus 1的marker基因的特异引物对由SEQ ID NO:23所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:24所示的单链DNA分子组成。用于扩增Human herpesvirus 6的marker基因的特异引物对由SEQ ID NO:25所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:26所示的单链DNA分子组成。用于扩增Listeria monocytogenes的marker基因的特异引物对由SEQ ID NO:27所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:28所示的单链DNA分子组成。用于扩增Herpes simplex virus2的marker基因的特异引物对由SEQ ID NO:29所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:30所示的单链DNA分子组成。
所述步骤(3)中，所述待测组织可为脑脊液。
所述步骤(4)中，测序数据可为将Nanopore扩增子测序获得的原始数据进行过滤获得的。所述过滤可为去掉长度小于300bp的read。
本发明还保护上述任一所述方法在检测中枢神经系统感染Enterovirus、Lymphocytic choriomeningitis virus、Neisseria meningitidis、Cytomegalovirus、Mycobacrterium tuberculosis、Nocardia Farcinica、Herpes simplex virus 1、Humanherpesvirus 6、Listeria monocytogenes和Herpes simplex virus2中的至少一种的应用；所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
本发明还保护一种用于检测中枢神经系统感染何种病原体的试剂盒，由特异引物对1—特异引物对10组成；特异引物对1由SEQ ID NO:11所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:12所示的单链DNA分子组成；特异引物对2由SEQ ID NO:13所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:14所示的单链DNA分子组成；特异引物对3由SEQ ID NO:15所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:16所示的单链DNA分子组成；特异引物对4由SEQ ID NO:17所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:18所示的单链DNA分子组成；特异引物对5由SEQ ID NO:19所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:20所示的单链DNA分子组成；特异引物对6由SEQ ID NO:21所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:22所示的单链DNA分子组成；特异引物对7由SEQ ID NO:23所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:24所示的单链DNA分子组成；特异引物对8由SEQ ID NO:25所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:26所示的单链DNA分子组成；特异引物对9由SEQ ID NO:27所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:28所示的单链DNA分子组成；特异引物对10由SEQ ID NO:29所示的单链DNA分子和SEQID NO:30所示的单链DNA分子组成。
上述试剂盒中，所述病原体可为Enterovirus、Lymphocytic choriomeningitisvirus、Neisseria meningitidis、Cytomegalovirus、Mycobacrterium tuberculosis、Nocardia Farcinica、Herpes simplex virus 1、Human herpesvirus 6、Listeriamonocytogenes和Herpes simplex virus2中的至少一种。
应用所述试剂盒检测中枢神经系统感染何种病原体的使用方法为：(1)以来源于中枢神经系统的待测组织的cDNA为模板，采用试剂盒中的10个特异引物对进行多重PCR扩增，得到PCR扩增产物；(2)将PCR扩增产物Nanopore扩增子测序，得到测序数据；(3)将测序数据分别与10种病原体marker基因进行比对，进行如下判断：如果测序数据与某病原体的marker基因匹配，则相应的中枢神经系统感染该病原体；如果测序数据与某病原体的marker基因不匹配，则相应的中枢神经系统未感染该病原体。Enterovirus的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。Lymphocytic choriomeningitis virus的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。Neisseria meningitidis的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。Cytomegalovirus的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。Mycobacrterium tuberculosis的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。NocardiaFarcinica的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。Herpes simplexvirus 1的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。Human herpesvirus 6的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。Listeria monocytogenes的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。Herpes simplex virus 2的marker基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示。所述来源于中枢神经系统的待测组织可为脑脊液。
所述试剂盒可以同时检测若干中枢神经系统分别感染何种病原体，其使用方法与上述检测单个中枢神经系统的区别仅在于Nanopore扩增子测序。检测若干中枢神经系统的Nanopore扩增子测序方法为：将多重PCR扩增扩增得到的各个PCR扩增产物混合，之后Nanopore扩增子测序。
本发明还保护上述任一所述试剂盒在检测中枢神经系统感染Enterovirus、Lymphocytic choriomeningitis virus、Neisseria meningitidis、Cytomegalovirus、Mycobacrterium tuberculosis、Nocardia Farcinica、Herpes simplex virus 1、Humanherpesvirus 6、Listeria monocytogenes和Herpes simplex virus2中的至少一种的应用；所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
实验证明，采用本发明提供的方法检测脑脊液，可以准确判断中枢神经系统感染的病原体类型。本发明为中枢神经系统感染提供准确而迅速的病原学诊断，具有很高的临床应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，脑脊液的提供者对实验均知情同意。
实施例1、高通量同时检测多个脑脊液样本感染哪些病原体的方法的建立
一、脑脊液的RNA的获得
1、采集脑脊液(采集过程中避免污染)，置于DNA/RNA Shield(Zymo，Catalog Code为R1100-50)中保存。
2、完成步骤1后，将脑脊液剪成小块，得到目标样本。
3、取Glass PowerBead Tube，加入200μL步骤2得到的目标样本和600μL PM1/β-ME，置于Qiagen匀浆器中最大转速震荡10min；之后室温、13000g离心1分钟，收集上清液。
4、取2ml收集管，加入步骤3收集的上清液和150μL IRS液体涡旋混匀，4℃孵育5分钟；之后13000g离心1分钟，收集上清液(避免接触沉淀)。
5、取2ml收集管，加入步骤4收集的上清液、600μL PM3液体和600μL PM4液体，涡旋混匀，得到混合液体。
6、取MB Spin Column柱子，加入步骤5得到的混合液体，13000g离心1分钟，去除流出液；之后加入600μL PM5液体，13000g离心1分钟，去除流出液；之后加入600μL PM4液体，13000g离心1分钟，去除流出液；之后13000g离心2分钟。
7、完成步骤6后，将所述MB Spin Column柱子放到一新的2ml收集管中，加入50μLRNase-free水，孵育3分钟；之后13000g离心1分钟，收集液体，即为脑脊液的RNA。
脑脊液的RNA置于-70℃保存。
二、脑脊液的cDNA的获得
1、制备逆转录反应体系。
逆转录反应体系为10μl，由0.5μlPrimeScriptTMRTase(浓度为200U/μl)、2μl5×PrimeScriptTMBuffer、0.5μlRandom 6mers(浓度为100μM)、1μl脑脊液的RNA(浓度为1μg/μl)和RNase free ddH2O组成。
2、取所述逆转录反应体系，进行逆转录，得到脑脊液的cDNA。
逆转录反应条件为：37℃1h。
三、用于扩增病原体marker基因的特异引物对的制备
1、从NCBI数据库下载引起中枢神经系统感染的10种病原体的CDS序列。
10种病原体分别为Enterovirus、Lymphocytic choriomeningitis virus、Neisseria meningitidis、Cytomegalovirus、Mycobacrterium tuberculosis、NocardiaFarcinica、Herpes simplex virus 1、Human herpesvirus 6、Listeria monocytogenes和Herpes simplex virus2。
2、将步骤1下载的所有CDS序列进行两两间的相互比对，去除比对上的基因。
3、完成步骤2后，去除600bp以下的CDS序列。
4、完成步骤3后，使用minimap2与细菌、寄生虫、真菌和人的基因组序列进行比对，去除能比对上多个物种的CDS序列。
5、完成步骤4后，根据每种病原体保留的序列数目进行marker筛选，获得marker基因。
筛选原则如下：如果该病原体仅有一条序列，则直接选择作为marker基因；如果该病原体有多条序列，进一步与NT数据库进行比对去除重复，之后随机选择一条作为marker基因。
10种病原体的marker基因如下：Enterovirus的marker基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示；Lymphocytic choriomeningitis virus的marker基因的核苷酸序列如SEQID NO:2所示；Neisseria meningitidis的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；Cytomegalovirus的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；Mycobacrteriumtuberculosis的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；Nocardia Farcinica的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；Herpes simplex virus 1的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；Human herpesvirus 6的marker基因的核苷酸序列如SEQID NO:8所示；Listeria monocytogenes的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；Herpes simplex virus2的marker基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
6、设计并人工合成用于扩增病原体marker基因的特异引物对(由上游引物和下游引物组成)，特异引物对的靶序列长度均为500bp左右。
扩增每个病原体marker基因的特异引物对的引物序列见表1。
表1
Figure BDA0003098862670000051
Figure BDA0003098862670000061
四、PCR扩增
1、制备反应体系。反应体系为50μl，由25μl2×SuperPlex Premix(Takara)、2.5μl上游引物混合液(由表1中10个病原体的上游引物混合而成)、2.5μl下游引物混合液(由表1中10个病原体的下游引物混合而成)、5μl脑脊液的cDNA和PCR-Grade Water组成。反应体系中，各个上游引物和各个下游引物的浓度均为4μM。
2、取反应体系，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应程序为：95℃2min；95℃10sec，55℃10sec，35cycles；72℃15sec；4℃Hold。
每个脑脊液样本进行上述步骤一至四，得到相应的PCR扩增产物。
五、Nanopore扩增子测序
将步骤四得到的多个脑脊液样本的PCR扩增产物进行Nanopore扩增子测序，得到原始数据。具体步骤如下：
1、PCR扩增产物定量并采用琼脂糖凝胶电泳测DNA完整度。
结果表明，步骤四得到的PCR扩增产物均为20-30kb左右。
2、分别取步骤四得到的PCR扩增产物，用水稀释至1-3ng/μl，得到产物稀释液。
3、完成步骤2后，取产物稀释液，打断并加PCR接头，得到Tagmented DNA。具体为：将3μl产物稀释液和1μl FRM(转座酶)轻弹混匀，瞬离；之后30℃1min(打断)，80℃1min(灭活)，4℃∞。
4、完成步骤3后，进行PCR扩增，得到PCR样品。
反应体系为50μl，由20μl去离子水、4μl Tagmented DNA、1μl RLB(barcode)和25μl LongAmp Taq 2×master mix(NEB)组成。
反应程序为：95℃3min；95℃15s，56℃15s，65℃6min，30cycles；65℃6min，4℃∞。
5、磁珠纯化，获得建库纯化产物
(1)将30μl XP磁珠和50μlPCR样品混匀，静置10min(让DNA挂到磁珠上，不要放在磁力架上)。
(2)瞬离后放到磁力架上，直至澄清。
(3)去除上清(留一点)(在磁力架上操作)。
(4)加入500μl 75％(v/v)酒精水溶液洗涤，旋转EP管。
(5)去除上清，再用75％(v/v)酒精水溶液洗涤一次，去除上清，瞬离，再吸干净，开盖放置30s，晾干。
(6)用10mM Tris-HCl pH8.0 with 50mM NaCl洗脱DNA。
洗脱液由980μl H2O、10μl 5mM NaCl和10μl 1M Tris-HCl组成。
从磁力架上取下EP管，加入13μl10mM Tris-HCl pH8.0 with 50mM NaCl洗脱DNA，室温放置2min。
(7)将EP管重新放回磁力架上，液体澄清后，吸取10μl放入一个干净的EP管中(不要碰到磁珠)。
(8)Qubit定量浓度。
6、混样测序
(1)将10μl DNA文库(总量50-100fmol)和1μl RAP(马达蛋白接头)混合，室温放置5min。
DNA文库为多个脑脊液样本的建库纯化产物等量混合而成。
(2)配制priming mix(测序mix)。将30μl FLT直接加到1管FB中。
(3)将1000μl加样枪调到780μl，1μl慢慢的往上调排气泡，枪尖里有液体即可(大约调到800μl)。
(4)用1000μl的加样枪吸取800μl的priming mix，缓慢注入flow cell里，避免气泡，放置5min。
(5)配文库。由34μl SQB、25.5μl LB、4.5μl水和11μl DNA文库(来自上个步骤)组成。
(6)轻轻的打开SpotON sample port的盖，用1000μl的加样枪吸取200μl的priming mix，从priming port缓慢注入flow cell里，避免气泡。
(7)用200μl的加样枪吸取75μl文库一滴一滴加入到SpotON sample port里。
(8)盖上盖上机(放10min左右loading后上机)。
7、MinKnow操作
(1)Experiment：输入实验名。
(2)Kit：选择对应的建库kit。
(3)Basecalling：Fast basecalling(电脑性能不够好时用此模式)
Basecalling and barcoding处于“ON”状态。
(4)Run options：
Time:72h Bias voltage(mV):-180Active channel selection:“ON”，1.5h扫描1次；
(5)Start Run。
六、生物信息学分析
1、数据过滤
取步骤五得到的原始数据，去掉长度小于300bp的read。
2、比对
将步骤1获得的数据分别与10种病原体的marker基因进行比对，进行如下判断：如果测序数据与某病原体的marker基因匹配，则脑脊液感染该病原体；如果测序数据与某病原体的marker基因不匹配，则脑脊液未感染该病原体。
实施例2、检测实施例1建立的方法准确性
待测样本1为临床已确诊为感染Neisseria meningitidis的患者1的脑脊液。
待测样本2为临床已确诊为感染Cytomegalovirus的患者2的脑脊液。
待测样本3为临床已确诊为感染Listeria monocytogenes的患者3的脑脊液。
待测样本4为健康人1的脑脊液。
待测样本5为健康人2的脑脊液。
按照实施例1建立的方法检测待测样本1—待测样本5。结果表明，待测样本1感染Neisseria meningitidis，待测样本2感染Cytomegalovirus，待测样本3感染Listeriamonocytogenes，待测样本4和待测样本5均未感染Enterovirus、Lymphocyticchoriomeningitis virus、Neisseria meningitidis、Cytomegalovirus、Mycobacrteriumtuberculosis、Nocardia Farcinica、Herpes simplex virus 1、Human herpesvirus 6、Listeria monocytogenes和Herpes simplex virus2。
检测结果与预期结果完全一致。
由此可见，实施例1建立的方法具有较高的准确性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110>北京大学人民医院
<120>一种基于PCR和nanopore测序检测脑脊液感染哪些病原体的方法
<160>30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6585
<212> DNA
<213>Enterovirus
<400> 1
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<211>6633
<212> DNA
<213>Lymphocytic choriomeningitis virus
<400>2
atggatgaaa tcatctcaga attgagagag ttatgtttaa actatataga acaggatgag 60
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<210>3
<211>2283
<212> DNA
<213>Neisseria meningitidis
<400>3
atggacttaa tccaaacccc gaataagcaa tttgtcgacg gcgaccgccg cacgcccggt 60
actcccgtac ccgcatggtg gctgaaccag ttacaaggcg agttgtacag cattttaaac 120
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tcgtcaaata ttgcacttgg cgcaggcgcg atggctggta ctgctccagt cggttttagt 1020
ggcgacattg aagttttttg gccgtcttcg acctcaagaa caatcgcaat cggcgaggct 1080
gtcttgcaaa catatcaggg ccgcgccgct caaaccgcaa ttggtgccaa tgcggcgcga 1140
aatacaaaaa aggccgaaaa agttaccgca atcggttctg ccgcgatgga gaatcttgag 1200
cgaaaccgcg ccccaaatgg cggagatgtt gtctggacgg gaacggaagc aggtacctac 1260
gcccaatctg gaaaaaacat cacgcttaca tttcccaaca ttcgcggtgc gcaagcgact 1320
tattgggtgg gcatccgcct tacatcaggc acggcgcaaa ccttacaaaa cgacgtcgta 1380
ccggctcagg tcgtatcagt gaatggcaat acattaatca tccaaagctc aaaagagctg 1440
accgccaccg gcgcggccga actgaaatac gtttattctg taaattcaac cgctactaaa 1500
aacgaagagt tgaccatcat cggcgcgaac gccatgaata aggcattgac cgcaggatac 1560
tcaactatca tcggcgtaga tgccgcgttg ttgggagaca attatcaaaa aacaaccgca 1620
atcggcgcat catctttacg aacaggtagt catatttcca caactgctat tgggtattgg 1680
gtaatccctt tggcaagtag tgagaaatgt gttgccattg gagatagtgc gggctatcgg 1740
aacgttcaag gcgacttttt gactgggaaa ataacaaact ccatcgccat cggatatggc 1800
gcaagaataa acggcgataa cgaaatccaa atcggtacga cagggcaaac tttatatgct 1860
ccaaccgcgg tgaacatccg ttctgacggc cgcgacaaag cagatgttaa gccgttgacg 1920
aacggtttag attttgtaat gaagctcaag ccgatgactg gctactacga ccgccgggat 1980
tcctacgttg acgaattatt caaagacttg ccggcagatg aacgagcgga caaagtccgc 2040
gaatggtggg cgaatccaat caaggacggc agtcataaag aagatcggtt gcggcattgg 2100
tttattgccc aggacattgc tgcgctggaa gatgaatatg gtcgattgcc gatggtaaat 2160
aaaacaaacg atacctacac cgtcgaatac gaaacgttca tccccgtttt gactaaagcc 2220
attcaggaaa tggccgcaag aattgaaaca ttagaaaccg aaatgaagga atcgaaaaaa 2280
tga 2283
<210>4
<211>933
<212> DNA
<213>Cytomegalovirus
<400>4
atgccagcca cagacacaaa cagcacccac accacgccgc ttcacccaga ggaccaacac 60
acgttaccct tacaccacag caccacacaa cctcatgtcc aaacttcgga caaacacgcc 120
gacaaacaac accgcacgca gatggagctc gacgccgcgg actacgctgc ttgcgcacag 180
gcccgccaac acctctacgg tcaaacacaa ccccaactac acgcataccc caacgccaac 240
ccacaggaaa gcgctcattt tcgcacagag aatcaacatc aactcacaaa tctacttcac 300
aacataggcg agggcgcagc gctcggctac cccgtccccc gcgcggaaat ccgccgcggc 360
ggtggcgact gggccgacag cgcaagcgac ttcgacgccg actgctggtg catgtgggga 420
cgcttcggaa ccatgggccg ccaacctgtc gtcaccttac tgttggcgcg ccaacgcgac 480
ggcctcgctg actggaacgt cgtacgctgc cgcggaacag gctttcgcgc acacgattcc 540
gaggacggcg tctctgtctg gcgtcagcac ctggtttttt tactcggagg ccacggccgc 600
cgtgtacagt tagaacgacc atccgcggga gaagcccaag ctcgaggcct attgccacgc 660
atccggatca cccccatctc cacatctcca cgcccaaaac caccccagcc caccacatcc 720
accgcatcgc acccacatgc tacggctcgg ccagatcaca cgctctttcc tgtcccttct 780
acaccctcag ccacggttca caatccccga aactacgccg tccaacttca cgccgaaacg 840
acccgcacat ggcgctgggc acgacgcggt gaacgtggcg cgtggatgcc ggccgagaca 900
tttacgtgtc ccaaggataa acgtccctgg tag 933
<210>5
<211>1101
<212> DNA
<213>Mycobacrterium tuberculosis
<400>5
gtgcggcacc gcgcgctcat aatcaccact gtgggcgccg gcgagatgac gttcggtcag 60
gagtaccgat tcgcgacgcg cgcgctcacg gtcactcgca acctggtgcc gctcaaaatc 120
gcgatcggac tgctgtgcct gtcgattgtg gtgttgggga cactcatcca gttccacccg 180
ctgggaccgc atgggttgtg gccgaggctt attcacggtg tgctggtggc gtccgcactt 240
gtggtcggga tgtgctgggt tgtgctgccc tggcccaggc ggcgtgtggc gatcgcattc 300
gtctggtggg ccgacatctc gatggtcgtc ggagcctgca cgctgtcggc acccgcatcg 360
cgactgggcg ccctcgcgca tatgggcctg atcggagttt tcgccgcgtt tctgctggga 420
tggcgagtgt tggcggtgca ctgcgtcttc gcgacggtcg cgatcttcgg cctcatgggc 480
tggaacgtcc gactcggcga ggcgacgtgg ttcgatcagt acgtctacag tgcgcccgca 540
ctgtcctcgg ttgtcctgct acccatcatt attcaggtcg tcgtcgaggg cggtagacgc 600
tccctgaagg ctatatcgct tgctgcgcat caagatccgc tgaccgggct attgaaccgt 660
cgtggcgtac aggtggcgct gagctccctg ctgtccgggc agcgggcaac ccgaattgtc 720
gcggtggtgc tcgtcgacgt ggacgagctg aaagagctca acgacaggct ggggcacgac 780
gccggagacg aatccatccg cgccgtcgcg gcaatgctgg ccaccacgac ccgggccagt 840
gatctcaccg cgcgtatggg cggcgatgag ttcatggtgg tgggcttctt cgaccatgcc 900
gatgaggcga caggcctcat cgaacgcatc ggggccaggc gattcggcat cggtccacac 960
cgggccagcg tcagcatggg atctgccatg cgatccacca gcgtggccgg cttcgacttc 1020
gagtcgctgc gccgggcggc ggatgaggag ctgcggggag caaagatcga gcgccgcaac 1080
ggctttcacg cggttcccta g 1101
<210>6
<211>1128
<212> DNA
<213>Nocardia Farcinica
<400>6
atgggccatc aacgccgact ggccgacccg acctcgagca gcggcgtggc tccgaacgtg 60
gacactctct actccctcgc tttcctcgac ctcgacggag agccgttcac cgtgcggttg 120
ccggatttcg gtactcgcta ctacagcgtc cagatcggcg aggccgattc gtccactgcg 180
gcggtgctcg gccgacgtac gcacgggccg cgggtacccg agatcctcat tcgtcgcgac 240
aaccggccct cacccgcacc ggccggcgcc ctcgtcgtcg cctgccggtc gcgcttcgtg 300
atggtggcgg ttcggatcct cgtcgacccc ggcgacgaac acgacctgcg caccgtcgtc 360
gggctgcagg atcgcatcga agtgaccggg tcgcaccggc ccgatcccgc gacaccacag 420
tctgtggcgg cacgaaaccg cgcggacgaa ctgcaccggc ctgccgcctt cctcgactcg 480
ctggagcacg cttgcgccgg cctgcccgac accgacatcc ccgcctgggt ccggcgggca 540
cgacacgacc tgcgtgcggt gctcgacgat gcaacgctcc tgcctgccat cgcacacggc 600
ctccgggacg ggctcgacgc gatcgagcac cacgtcaaag ccctcggccg aacggtgaac 660
ggctgggcga tcaacacccg cggtacggat ttcggcgatg accacctact tcgcgcggcg 720
gtcgcgtatt cacaggtcta catcaaccct gccgaagaag ccctgtaccc gatctgtgag 780
atggacgatc gaaacgagca gctcaacggc tctcgcgaat accgtctcac cttcgcggcc 840
gaccggtttc cgcccgtcgc attcttctgg tccctcaccg tctaccacat caagggcctg 900
ctctacgaca acgagatcga ccgctatgcc atcagcgatc gaaccgcggg actgcgaccg 960
aatcccgacg gatcattgac catccacctg caaaccgctc gcccgaccga ccccgacgcg 1020
aattggctcc cctgcccgcc cggcgatttc cggttgatga tgcgtctcta cggagttctc 1080
gacccgacct ggagtccgcc gatggtccgt cgtaaacagt gcgactga 1128
<210>7
<211>2328
<212> DNA
<213>Herpes simplex virus 1
<400>7
atggagcccc gccccggagc gagtacccgc cggcctgagg gccgccccca gcgcgagccc 60
gccccggatg tctgggtgtt tccctgcgac cgagacctgc cggacagcag cgactctgag 120
gcggagaccg aagtgggggg gcggggggac gccgaccacc atgacgacga ctccgcctcc 180
gaggcggaca gcacggacac ggaactgttc gagacggggc tgctggggcc gcagggcgtg 240
gatggggggg cggtctcggg ggggagcccc ccccgcgagg aagaccccgg cagttgcggg 300
ggcgcccccc ctcgagagga cggggggagc gacgagggcg acgtgtgcgc cgtgtgcacg 360
gatgagatcg cgccccacct gcgctgcgac accttcccgt gcatgcaccg cttctgcatc 420
ccgtgcatga aaacctggat gcaattgcgc aacacctgcc cgctgtgcaa cgccaagctg 480
gtgtacctga tagtgggcgt gacgcccagc gggtcgttca gcaccatccc gatcgtgaac 540
gacccccaga cccgcatgga ggccgaggag gccgtcaggg cgggcacggc cgtggacttt 600
atctggacgg gcaatcagcg gttcgccccg cggtacctga ccctgggggg gcacacggtg 660
agggccctgt cgcccaccca cccggagccc accacggacg aggatgacga cgacctggac 720
gacgcagact acgtaccgcc cgccccccgc cggacgcccc gcgccccccc acgcagaggc 780
gccgccgcgc cccccgtgac gggcggggcg tctcacgcag ccccccagcc ggccgcggct 840
cggacagcgc ccccctcggc gcccatcggg ccacacggca gcagtaacac caacaccacc 900
accaacagca gcggcggcgg cggctcccgc cagtcgcgag ccgcggcgcc gcggggggcg 960
tctggcccct ccgggggggt tggggttggg gttggggttg ttgaagcgga ggcggggcgg 1020
ccgaggggcc ggacgggccc ccttgtcaac agacccgccc cccttgcaaa caacagagac 1080
cccatagtga tcagcgactc ccccccggcc tctccccaca ggccccccgc ggcgcccatg 1140
ccaggctccg ccccccgccc cgggcccccc gcgtccgcgg ccgcgtcggg acccgcgcgc 1200
ccccgcgcgg ccgtggcccc gtgcgtgcga gcgccgcctc cggggcccgg cccccgcgcc 1260
ccggcccccg gggcggagcc ggccgcccgc cccgcggacg cgcgccgtgt gccccagtcg 1320
cactcgtccc tggctcaggc cgcgaaccaa gaacagagtc tgtgccgggc gcgtgcgacg 1380
gtggcgcgcg gctcgggggg gccgggcgtg gagggtgggc acgggccctc ccgcggcgcc 1440
gccccctccg gcgccgcccc gctcccctcc gccgcctctg tcgagcagga ggcggcggtg 1500
cgtccgagga agaggcgcgg gtcgggccag gaaaacccct ccccccagtc cacgcgtccc 1560
cccctcgcgc cggcaggggc caagagggcg gcgacgcacc ccccctccga ctcagggccg 1620
ggggggcgcg gccagggtgg gcccgggacc cccctgacgt cctcggcggc ctccgcctct 1680
tcctcctctg cctcttcctc ctcggccccg acccccgcgg gggccgcctc ttccgccgcc 1740
ggggccgcgt cctcctccgc ttccgcctcc tcgggcgggg ccgtcggtgc cctgggaggg 1800
agacaagagg aaacctccct cggcccccgc gctgcttctg ggccgcgggg gccgaggaag 1860
tgtgcccgga agacgcgcca cgcggagact tccggggccg tccccgcggg cggcctcacg 1920
cgctacctgc ccatctcggg ggtctctagc gtggtcgccc tgtcgcctta cgtgaacaag 1980
actatcacgg gggactgcct gcccatcctg gacatggaga cggggaacat cggggcgtac 2040
gtggtcctgg tggaccagac gggaaacatg gcgacccggc tgcgggccgc ggtccccggc 2100
tggagccgcc gcaccctgct ccccgagacc gcgggtaacc acgtgatgcc ccccgagtac 2160
ccgacggccc ccgcgtcgga gtggaacagc ctctggatga cccccgtggg gaacatgctg 2220
ttcgaccagg gcaccctagt gggcgccctg gacttccgca gcctgcggtc tcggcacccg 2280
tggtccgggg agcagggggc gtcgacccgg gacgagggaa aacaataa 2328
<210>8
<211>2070
<212> DNA
<213>Human herpesvirus 6
<400>8
atgccgctaa cggtgcgtgc cgggcacgcg ccatatcgtc ttccgctctc caattattgg 60
tggctactct tgggtcgaca ttcccttcgt catgttcatt cctacctgcg tctgcacaag 120
ggtctacgca ttcctttacc ttggcccgag caggaatgcc tacatttaca tcctaagcct 180
tacaagtgtc tcctgcgtta cccctgtata acaagacaac cgcatcttct tcagggctgg 240
cctacgaagt cttctctatg gttcgaccct aaaccctacc atccttcggc cgacagcaag 300
ttgctaccgc tgggcctaat tacgctgtcc gcctgttcca cgcgcgtgtc ggctacgaca 360
cgctggagca gcttccacgc gacagatccg tctctcagct ggctgacagg atcgtcccct 420
tggctcgtga tcctacaagg gcaggggggg tctctgttct gccacgacgt gctgcaaggc 480
cgactctata tcctgtcgca ctccgtgtcg ctctttctaa agacgggcct ccgccactgc 540
gaggccatct atcgcgcacc gctgtggcgc gaccgacccc tgccgagcct gtggacgtgc 600
cgggaccccg acaaggcctt cttgccgaca ttactggcga gaagcgcccg acgcggcctg 660
gccgctttct acgccctgtg gagactgcat ctgggatcgc gctcggagct ctcccacccc 720
gtgttggagt gggagagcac agagctggtc ctgacggact ggagacgcgg gcgaaatgag 780
gcacagagag acgcgcccag cgtcgcggaa cacttcgcga ggtgcagacc gctgctggac 840
gaactgtgcg gagagggcgg atggcttccc ttcgcgtttc tctccacatc tccgcacgtc 900
tggctgatcc taacggaagg aggccccgtc ctggcggttg acgtgaacga cacctccgtg 960
tggcgcatcg cggacgacct ggagctgctg cgtcgcctgg ggagtctgct cctcctctca 1020
ggcctccggc ttcctctccg tcccccgagc gggagcggcg aggcggccgg agagccgggg 1080
tacgaggagg aagagagaag agggagagcg tcgacggcga gcgcgacggc cgcgacgtcg 1140
acgcgcggac cgacccgtcc gacacgggtg acgcgtaagg ggcgtgtggc aaccggaggc 1200
gtccatctct ccgcacgccc cgaatctgag gaacagacag acggccacca cgggcgccag 1260
gagagcagcg acgaccacca gcgcggcggt agcggacgag gacaccgcga tgacggcgcg 1320
caccgccacg cgaatgacaa aacagagccc cagcagcgcg gagagcacga ggaaaggaaa 1380
cagaccgact ccgggcgcca cgagcacgca caggagagcc aggtcgcaag aagagacgag 1440
gaggaaacgg agcagggcga tagcgaaagg agctgcgggg gggcgacgca gacgtacggc 1500
ggcagaggcc gacatgattc ctgcccgtcg atccccctgt ccgtccccgg gcccgatccc 1560
cgcctgtggg tccctccccc tcatctgtta ttcccttccc ctctgccacc gatgacgccc 1620
gtcgacgacg agccgtccgt ccgccctcgg tgtccgccag gtcccgcgga ggaacccccc 1680
acgtgtcgtc cccgtccgcc ccgcccgtcg tccgacaccc cgctgtccgc tgtctcgcgc 1740
ccctccgctc cgcccgtccc cccgccgtcc actgcgcgtg tccgtttctt cctctcttcc 1800
tcctcctcct ccccgtccta ctctcccgct ccgttgtctc cgccctctcc cgtctctccc 1860
tcgtctccca gatctccgtt catccccccc atcagatctc cgggactccg agcgaaaccg 1920
cgggtgtcct ccgggcatcc cgcggcgttc ccgccggcgc cctcgtccgc gccggcccgt 1980
tccgaaagag tcacgtccgt tccctcatcg gcatctccgt ccgcgtcgtg cgtcggcaag 2040
tcacagccgc ccgccgcaca cacggcgtga 2070
<210>9
<211>963
<212> DNA
<213>Listeria monocytogenes
<400>9
atgagcggaa aaataaaatt caatatcgcc gaagctcaaa atattagtct tgagcttaaa 60
attgcagcag gtaggtatac gcaagaaaca gaagagctat taaaagtgct gaaaaataat 120
agtttatgtg ataaagacca agatgtcgtt gaacagaggg gacgaataga gaagaataac 180
caaagactta tagaatatga gaaatttata aacacaaatc tctctaaatc taattcagtt 240
atagaagaat tgtttatgag tgtagaagta ttgtatgcac agcaagtttc tgagtttaga 300
aatcctaact ctgcaggtta taaagaatta atgggtaatg ttaaagcagt agcttatcaa 360
gaactttcaa aggtgtcagg actgaagaga attctcacat cagaaaaagg tgatatacaa 420
aacctaaggg ataccctact agatactttg gtagataatg tgtacacaaa attgattaac 480
gatacagtag aatattatgg ttccagtaag gacattataa atttgtatgg aatggaagac 540
ggtaaattat ttaaaggggg agcaaaagat gtattaaata accctagaaa atatatttca 600
acagcctacc tcatctcaga cacgctaaaa agttttaaca gttatggaaa tagcaaagat 660
tcctctcgac ttgcaggaga tctaacaggt atagcaataa aaaaaggtgc tgattttgct 720
gttgggaaac tagctactac ggcattagct ggttttggtg taagtggtgt taaaggcgct 780
atcgcaggcg ccattatttc cgttgctgca gataaaatta ttgatccgac ggttgaatat 840
gttaaagaga gcaaggtaga agcaaagagg gatgactggg aaacaaaagg tatatataaa 900
ggctggaaaa aaattcgaga tttaaaacta gaatatacag tgggtaacta tcaagcaagt 960
taa 963
<210>10
<211>2037
<212> DNA
<213>Herpes simplex virus2
<400>10
atggccgcac agcgcgcgcg ggcgccggcg atgcggacgc ggggcggcga cgcggcgcta 60
tgcgcccccg aggacggctg ggtgaaggtt caccccaccc ccgggacgat gttgttccgc 120
gagattctcc tcgggcagat ggggtacacc gagggtcagg gggtgtacaa cgtcgtccgg 180
tccagcgagg ccgccacccg acagctgcag gcggcgatct tccacgcgct cctcaacgcc 240
acgacgtacc gggacctgga ggaggactgg cgccgccacg tggtggcccg cggcctccag 300
ccgcagcggc tggttcgcag gtaccggaac gcccgggagg gcgatatcgc cggggtggcc 360
gagcgggtgt tcgacacgtg gcgatgcacg ctcaggacga cgctgctgga ctttgcccac 420
ggggtggtag actgctttgc gccgggcggc ccaagcggac cgaccagctt ccccaaatat 480
atcgactggc tgacgtgtct ggggctggtt cccatattgc gcaagacgcg cgagggggag 540
gcgacgcagc gcctgggggc gtttctcagg cagcacacgc tgccccggca gctggccacg 600
gtcgccgggg ccgcggagcg cgccggcccg gggcttctgg atctggccgt cgcgttcgac 660
tccacgcgca tggcggaata cgaccgcgtg cacatctact acaaccatcg ccggggggag 720
tggctggtgc gcgacccggt cagcgggcag cgcggcgagt gcctggtgct gtgccccccc 780
ctgtggaccg gcgaccgcct ggtcttcgat tcgcccgttc agcggctgtg ccccgagatc 840
gtcgcgtgcc acgccctccg ggaacacgcg cacatctgcc gtctgcgcaa caccgcgtcc 900
gtcaaggtgc tgttggggcg caagagcgac agcgagcgcg gggtggctgg cgccgcgcgg 960
gtcgtcaata aggcgctggg ggaggatgac gagacgaagg ccggctcggc cgcctcgcgt 1020
ctcgtgcggc tcatcatcaa catgaagggc atgcgccacg tgggcgacat caacgacacg 1080
gtacgcgcct acttggacga ggcggggggg cacctgatcg acacccccgc cgtcgaccac 1140
accctccctg ggttcggcaa gggcggcacc ggccgcgggt cggcgcccca ggacccgggg 1200
gcgcgaccgc agcagcttcg ccaggcgttt cagacggccg tggtcaacaa catcaacggc 1260
atgctggagg gctatatcaa taatctcttt ggaaccatag aacgcctgcg agagacgaac 1320
gcgggtctgg cgacccagct gcaggcgcgc gaccgcgagc tgcggcgcgc ccaggcgggg 1380
gcgctggagc gggagcagcg cgcggcggac cgggcggccg ggggaggcgc gggccgcccg 1440
gcggaggcgg atcttctccg ggccgactac gacattatcg acgtcagcaa gtccatggac 1500
gacgacacgt acgtggccaa cagtttccag caccagtaca tccccgcgta cggccaggac 1560
ctcgagcgcc tgtcgcgcct ctgggagcac gagctggtgc gctgcttcaa gattctgcgc 1620
caccgcaaca accagggcca ggaaacgtcg atctcgtact ctagcggggc gatcgcctcc 1680
ttcgtggccc cgtatttcga gtacgtgctt cgcgcccccc gagcgggcgc gctcatcacc 1740
ggctccgatg tcatcctagg ggaggaggag ttatgggagg cggtctttaa gaaaacccgc 1800
ctgcagacgt acctgacaga cgtcgcggcc ctgttcgtgg cggacgtaca gcacgcggct 1860
ctgccccggc ccccctcccc aacccccgcc gatttccggg cgagcgcgtc cccgcggggc 1920
gggtcccggt cccggacccg gacccgatcc cggtcgcccg ggagaacgcc gaggggtgcg 1980
ccggaccagg gctggggcgt cgaacgcagg gatggccgac cccacgcccg ccgatga 2037
<210> 11
<211>21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
agcaactgcc cgtcattgaa a 21
<210> 12
<211>22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
gcctttccac aaatcagtgg ac 22
<210> 13
<211>23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
ccgggaaaga tcatgttagc act 23
<210> 14
<211>23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
cctctggtct ttcgccaaag ata 23
<210> 15
<211>21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
ccgaccatgc ccaagtctta t 21
<210> 16
<211>21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
cagcggcatt caaagtggat a 21
<210> 17
<211>21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 17
acctcatgtc caaacttcgg a 21
<210> 18
<211>24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 18
cgtttatcct tgggacacgt aaat 24
<210> 19
<211>21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 19
gttcggtcag gagtaccgat t 21
<210>20
<211>23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400>20
ctgtagacgt actgatcgaa cca 23
<210>21
<211>21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400>21
tcgctactac agcgtccaga t 21
<210>22
<211>25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400>22
cagggttgat gtagacctgt gaata 25
<210>23
<211>21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400>23
cccatagtga tcagcgactc c 21
<210>24
<211>24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400>24
cccgtgatag tcttgttcac gtaa 24
<210>25
<211>21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400>25
acaagggtct acgcattcct t 21
<210>26
<211>21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400>26
ccttgtagga tcacgagcca a 21
<210>27
<211>25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400>27
ataaagacca agatgtcgtt gaaca 25
<210>28
<211>23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400>28
ctgttagatc tcctgcaagt cga 23
<210>29
<211>21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400>29
ggttcccata ttgcgcaaga c 21
<210>30
<211>23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400>30
gctgacgtcg ataatgtcgt agt 23

Claims (1)

1.检测10种病原体的多重PCR引物组在制备用于检测脑脊液病原的试剂中的用途，其特征在于：所述多重PCR引物组由特异引物对1—特异引物对10组成；特异引物对1由SEQIDNO:11所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:12所示的单链DNA分子组成；特异引物对2由SEQIDNO:13所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:14所示的单链DNA分子组成；特异引物对3由SEQIDNO:15所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:16所示的单链DNA分子组成；特异引物对4由SEQIDNO:17所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:18所示的单链DNA分子组成；特异引物对5由SEQIDNO:19所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:20所示的单链DNA分子组成；特异引物对6由SEQIDNO:21所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:22所示的单链DNA分子组成；特异引物对7由SEQIDNO:23所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:24所示的单链DNA分子组成；特异引物对8由SEQIDNO:25所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:26所示的单链DNA分子组成；特异引物对9由SEQIDNO:27所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:28所示的单链DNA分子组成；特异引物对10由SEQID NO:29所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:30所示的单链DNA分子组成；
所述10种病原体分别为Enterovirus、Lymphocytic choriomeningitis virus、Neisseria meningitidis、Cytomegalovirus、Mycobacrterium tuberculosis、NocardiaFarcinica、Herpes simplex virus 1、Human herpesvirus 6、Listeria monocytogenes和Herpes simplex virus2。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2689306C (en) * 2007-06-01 2019-01-15 Council Of Scientific & Industrial Research A novel method for simultaneous detection and discrimination of bacterial, fungal, parasitic and viral infections of eye and central nervous system
EP3286359A4 (en) * 2015-04-24 2018-12-26 University of Utah Research Foundation Methods and systems for multiple taxonomic classification
AU2016264102A1 (en) * 2015-05-18 2017-12-21 Karius, Inc. Compositions and methods for enriching populations of nucleic acids
CN108368542B (zh) * 2015-10-19 2022-04-08 多弗泰尔基因组学有限责任公司 用于基因组组装、单元型定相以及独立于靶标的核酸检测的方法
CN105331718A (zh) * 2015-11-27 2016-02-17 首都医科大学宣武医院 检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及试剂盒
CN105349664A (zh) * 2015-11-27 2016-02-24 首都医科大学宣武医院 检测中枢神经系统细菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及试剂盒
CN107893083A (zh) * 2017-11-10 2018-04-10 天津大学 一种人类肠道病毒d68型感染性克隆及其构建方法和应用
CN109610008A (zh) * 2018-11-08 2019-04-12 广州华大基因医学检验所有限公司 基于高通量测序的中枢系统感染病原检测文库构建方法、检测方法和试剂盒
CN110468145A (zh) * 2019-07-24 2019-11-19 中国食品药品检定研究院 一种ev-d68型假病毒及其包装方法
CN111763767A (zh) * 2020-06-04 2020-10-13 上海捷诺生物科技有限公司 中枢神经系统感染病原体检测试剂盒及其应用

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