CN104928400B - 一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，属于生物制剂检测技术领域。其包括以下步骤：根据茶刺蛾核型多角体病毒的Lef 11基因设计引物；获取目的片段，进行PCR扩增得到Lef 11基因片段；构建重组质粒；建立检测茶刺蛾核型多角体病毒的标准曲线；提取待测样品基因组，进行荧光定量PCR反应，根据建立的标准曲线求出待测样品的拷贝数，确定待测样品的浓度。本发明突破了传统的生物测定技术，解决了茶刺蛾核型多角体病毒的准确定性问题。与传统生物测定方法相比，本发明毒力指标检测更为精细，毒力评价周期大大缩短，可广泛用于病毒制剂质量的评定，规范茶刺蛾核型多角体病毒的生产应用。

Description

一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法
技术领域
本发明属于生物制剂检测技术领域，具体涉及一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法。
背景技术
茶刺蛾核型多角体病毒(Iragoidae fasciata nuclear polyhedrosis virus，IrfaNPV)属杆状病毒科，核型多角体病毒属。IrfaNPV是茶刺蛾的病原性天敌，通过幼虫取食后在虫体内迅速增殖，致使其感染发病而死亡。目前这种病毒已可以通过室内大量增殖，经配制形成产品，进行商业化生产，近年来，IrfaNPV作为一种高效病毒杀虫剂在各省茶区广泛推广使用，对茶刺蛾进行有效的生物防治，产生了良好的社会、经济和生态效益。因为这种病毒产品不同于一般的农药，它是一个活体，目前只有通过生物测定的方法进行检测。即用病毒产品喂饲茶刺蛾幼虫，观察其是否发病来确定，因为病毒是专一的，茶刺蛾病毒只能感染茶刺蛾幼虫。这种传统的生物测定的方法使得目前在IrfaNPV病毒制剂的生产、使用过程中存在毒力指标检测粗放、评价周期过长、制剂质量难以有效监控等问题。为了快速有效检测出生物杀虫剂中IrfaNPV的含量，建立灵敏、特异而又简易的病毒检测方法至关重要。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法的技术方案。
所述的一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1）根据茶刺蛾核型多角体病毒的Lef 11基因设计引物IrfaNPV Lef 11 F和引物IrfaNPV Lef 11 R，所述的引物IrfaNPV Lef 11 F核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的引物IrfaNPV Lef 11 R核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
2）从感染茶刺蛾核型多角体病毒的虫尸中提取茶刺蛾核型多角体病毒基因组DNA，获取目的片段，以目的片段为模板，用步骤1)中设计的一对引物进行PCR扩增得到Lef 11基因片段；
3）将步骤2）扩增获得的Lef 11基因片段与载体pGEM-T连接，转化入大肠杆菌DH5a中，挑单克隆菌株，摇菌，再采用PCR鉴定单菌落质粒DNA，将鉴定为阳性的重组质粒测序并测定质粒标准品浓度，保存于-20℃冰箱中，备用，所述的重组质粒核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示；
4）将质粒标准品按梯度稀释成不同浓度的模板，进行荧光定量PCR，以其模板数的对数值为X轴，CT值为Y轴做回归曲线，建立检测茶刺蛾核型多角体病毒的标准曲线；
5）提取待测样品基因组，进行荧光定量PCR反应，根据步骤4）中建立的标准曲线求出待测样品的拷贝数，确定待测样品的浓度。
所述的一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于所述的步骤2）中PCR扩增的程序：先94℃预变性3min；然后94℃变性30s， 60℃变性45s；循环35次，最后延伸72℃延伸7min。
所述的一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于所述的步骤4）中荧光定量PCR采用20ul体系：质粒模板2µL，SYBR Premix Ex TaqTM (2×) 10µL，ROXReference DyeⅡ 0.4µL，正反引物各0.8µL，加灭菌双蒸水6ul至20µL；反应程序为：95℃30s；95℃ 5s，60℃ 34s；共40个循环，阴性对照使用灭菌双蒸水。
所述的一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于所述的步骤4）中梯度为1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103和1.0×102拷贝/µL。
上述的一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，设计合理，突破了传统的生物测定技术，解决了茶刺蛾核型多角体病毒的准确定性问题。与传统生物测定方法相比，本发明毒力指标检测更为精细，毒力评价周期大大缩短，可广泛用于病毒制剂质量的评定，规范茶刺蛾核型多角体病毒的生产应用。
附图说明
图1为Lef 11基因的PCR扩增产物电泳图；
图1中：M-DL 2000 Marker； 2- Lef 11基因PCR扩增产物；
图2为重组质粒pGEMTeasy- Lef 11PCR扩增产物电泳图；
图2中：M-DL 2000 Marker； 2-重组质粒pGEMTeasy-Lef 11PCR扩增产物；
图3为IrfaNPV Lef 11基因扩增的熔解曲线图；
图4为IrfaNPV PCR扩增产物的扩增曲线图；
图5为IrfaNPV Lef 11基因不同稀释梯度的荧光定量PCR标准曲线图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例1：IrfaNPV病毒样品的获得及其基因组DNA的提取
以茶刺蛾核型多角体病毒感染茶刺蛾幼虫，收集虫尸，以PBS溶液作缓冲液反复匀浆，缓冲液体积与虫尸体积比为10:1，10000g 离心10min，重复3次，上清液即为病毒粗提液；病毒粗提液经35000g离心2小时，沉淀即为经纯化的病毒粒子；用1×PBS反复洗涤纯化的病毒粒子，至乳白色为止；用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer.5.0试剂盒进行茶刺蛾核型多角体病毒基因组的提取。步骤如下：1）病毒的裂解①取200μl的病毒原液。②加入200μl的Buffer VGB、20μl 的Proteinase K和 1.0μl的CarrierRNA，充分混匀于56℃水浴温浴10分钟。 ③离心，取上清；向上清中加入200μl无水乙醇，充分吸打混匀。2）将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至 Spin Column中，12,000 rpm 离心2分钟，弃滤液。 3）将500μl的Buffer RWA加入至 Spin Column中，12,000rpm 离心1分钟，弃滤液。4）将700μl的Buffer RWB 加入至 Spin Column 中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。注）请确认Buffer RWB中已经加入了指定体积的 100%乙醇。请沿 SpinColumn 管壁四周加入 Buffer RWB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。5）重复操作步骤 4）。 6）将 Spin Column 安置于Collection Tube上，12,000 rpm 离心2分钟。 7）将Spin Column安置于新的1.5ml RNase free collection tube上，在 Spin Column 膜的中央处加入30～50μl的RNase free dH2O，室温静置 5 分钟。 8）12, 000 rpm离心2分钟洗脱 DNA/RNA。 如需获得更大收量，可将离下液重新加入到Spin Column膜的中央或再加入30～50μl的RNase free dH2O，室温静置5分钟后，12,000 rpm 离心2分钟洗脱 DNA。4℃保存备用。
实施例2：目的片段PCR扩增
根据IrfaNPV基因组序列（FJ362523）的Lef 11基因，采用DNAStar软件，设计了一对特异性引物IrfaNPV Lef 11F和引物IrfaNPV Lef 11R，由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列分别为：5'- ACAATGAGAGTGGACCTTACGA-3'（如SEQ ID NO：1所示）和5'-ACGCGCTAAAACACGATATGA -3'（如SEQ ID NO：2所示），扩增Lef 11，PCR反应采用25µL体系（模板2µL，10×buffer 2.5µL，dNTP 2µL，正反引物各0.5µL，Tag酶0.25µL，加灭菌双蒸水至25µL），PCR扩增使用两步法，程序如下：先94℃预变性3min；然后94℃ 30s，60℃45s；循环35次，最后72℃延伸7min。取PCR产物10ul于1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图1，与预计大小相一致。最后，用琼脂糖凝胶DNA试剂盒纯化回收扩增片段，按说明书操作进行。
实施例3：质粒标准的制备及其浓度测定
将实施例2中扩增的Lef 11基因片段与载体pGEM-T连接，转化入大肠杆菌DH5a中，挑单克隆菌株，摇菌。使用试剂盒抽提单菌落质粒DNA，进行PCR鉴定。将鉴定为阳性的重组质粒送至上海生工生物技术有限公司测序。与参考序列进行比较，确认构建结果，构建完毕后用紫外分光光度计测定其浓度，将1µL阳性质粒稀释100倍测定其OD260和OD280值，计算重组质粒浓度及OD260/OD280比例，将重组质粒稀释至10-10拷贝/µL，保存于-20℃冰箱中。
重组质粒PCR鉴定结果见图2，片段大小为155bp，与预期结果相符。重组质粒的测序结果如下：
5'-acaatgagagtggaccttacgattgaaacatttatcagtaattactgtaaaacgactcaaattttcgcttatataatcctttaaaattttaaattgttcagtttcaaacatatgtgcagtaacattatgagttttcatatcgtgttttagcgcgt -3’（如SEQ ID NO：3所示）。
实施例4：荧光定量PCR反应
采用20µL体系：模板2µL，SYBR Premix Ex TaqTM (2×) 10µL，ROX Reference DyeⅡ 0.4µL，正反引物各0.8µL，加灭菌双蒸水至20µL。反应程序为：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃34s；共40个循环，阴性对照使用灭菌双蒸水。荧光定量实验中的SYBR Premix Ex Taq (2×)和ROX Reference DyeⅡ均为Takara公司产品，荧光定量PCR仪型号为ABI PRISM 7500。
实施例5：标准曲线的建立及其灵敏性
将含有目的片段的质粒标准品按10倍系列稀释成1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102拷贝/µL的模板，将各浓度标准重组质粒的扩增产物进行定量PCR熔解曲线分析，结果见图3，与预期完全相符，均为单峰，无非特异性扩增，说明反应特异，表明该方法有良好的特异性。
将以上各浓度的质粒标准品进行荧光定量PCR，扩增的荧光曲线见图4，表明该方法检测灵敏度可达到1.0×102拷贝/µL。反应结束后取PCR反应液，用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
实验结束后，使用excel进行数据分析，以模板拷贝数的对数为X轴，CT值为Y轴做回归曲线，建立检测IrfaNPV的标准曲线，标准曲线见图5，斜率为-3.1085，截距为37.871，R2=0.9982，从而可以得出标准曲线为：y = -3.1085x + 37.817。通过标准曲线，可以求出待测样品的拷贝数。
实施例6：FQ-PCR重复性
将质粒标准品稀释成3个浓度，模板DNA含量为1.0×107、1.0×106、1.0×105拷贝/µL，对每个浓度的样品经荧光定量PCR进行定量分析，分别重复3次检测，批内和批间重复性通过计算CT值的标准差（SD）和变异系数（CV）进行评价。
实施例7：病毒制剂样本检测
以实施例5中建立的标准曲线为检测依据，对实验室保存的经血清学方法检测的IrfaNPV水制剂进行检测，首先将其稀释成1.0×106、1.0×105、1.0×104 PIB/ml，分别提取基因组，以该基因组为模板按实施例4中的荧光定量PCR方法进行扩增。对3种不同浓度的IrfaNPV水制剂样品进行荧光定量PCR检测，结果所测的CT值呈明显的梯度分布，分别为：18.12、20.97、23.56，按所建标准曲线计算得到病毒浓度分别为：106.34、105.42、104.58 PIB/ml。血清学方法所测病毒浓度为1.0×106、1.0×105、1.0×104。表明病毒的拷贝数和多角体之间显示出一定的线性关系，可用于检测茶刺蛾核型多角体病毒制剂的IrfaNPV含量。
表2 IrfaNPV病毒样品检测结果
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院茶叶研究所
<120> 一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
acaatgagag tggaccttac ga 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tcatatcgtg ttttagcgcg t 21
<210> 3
<211> 155
<212> DNA
<213> 重组质粒
<400> 3
acaatgagag tggaccttac gattgaaaca tttatcagta attactgtaa aacgactcaa 60
attttcgctt atataatcct ttaaaatttt aaattgttca gtttcaaaca tatgtgcagt 120
aacattatga gttttcatat cgtgttttag cgcgt 155

Claims (4)

1.一种非以疾病诊断为目的的茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1）根据茶刺蛾核型多角体病毒的Lef 11基因设计引物IrfaNPV Lef 11 F和引物IrfaNPV Lef 11 R，所述的引物IrfaNPV Lef 11 F核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的引物IrfaNPV Lef 11 R核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
2）从感染茶刺蛾核型多角体病毒的虫尸中提取茶刺蛾核型多角体病毒基因组DNA，获取目的片段，以目的片段为模板，用步骤1)中设计的一对引物进行PCR扩增得到Lef 11基因片段；
3）将步骤2）扩增获得的Lef11基因片段与载体pGEM-T连接，转化入大肠杆菌DH5a中，挑单克隆菌株，摇菌，再采用PCR鉴定单菌落质粒DNA，将鉴定为阳性的重组质粒测序并测定质粒标准品浓度，保存于-20℃冰箱中，备用，所述的重组质粒核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
4）将质粒标准品按梯度稀释成不同浓度的模板，进行荧光定量PCR，以其模板数的对数值为X轴，CT值为Y轴做回归曲线，建立检测茶刺蛾核型多角体病毒的标准曲线；
5）提取待测样品基因组，进行荧光定量PCR反应，根据步骤4）中建立的标准曲线求出待测样品的拷贝数，确定待测样品中茶刺蛾核型多角体病毒的浓度。
2.如权利要求1所述的一种非以疾病诊断为目的的茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于所述的步骤2）中PCR扩增的程序：先94℃预变性3min；然后94℃变性30s，60℃变性45s；循环35次，最后延伸72℃延伸7min。
3.如权利要求1所述的一种非以疾病诊断为目的的茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于所述的步骤4）中荧光定量PCR采用20µl体系：质粒模板2µL，2×SYBRPremix Ex TaqTM 10µL，ROX Reference DyeⅡ 0.4µL，IrfaNPV Lef 11 F 和引物IrfaNPVLef 11 R各0.8µL，加灭菌双蒸水6µl至20µL；反应程序为：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s；共40个循环，阴性对照使用灭菌双蒸水。
4.如权利要求1所述的一种非以疾病诊断为目的的茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于所述的步骤4）中梯度为1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103和1.0×102拷贝/µL。
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