CN112410343B - 基于crispr的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了crRNA 1,其能识别clfA的SEQ ID NO.1所示靶点，还提供了crRNA2，其能识别mecA的SEQ ID NO.2所示靶点。本发明还提供了crRNA1和2组成的组合物，及基于CRISPR的试剂盒及其进一步的检测应用。本发明经反复筛选得出clfA、mecA基因的识别靶点，进而成功实现灵敏、特异检测MRSA。

Description

基于CRISPR的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种基于CRISPR的试剂盒及其应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌（金葡菌）是一种重要的人类机会致病菌，可以引起多种疾病，如：心内膜炎，肺炎，中毒性休克综合征等。青霉素的发现使感染金葡菌的患者得到了有效治疗，但随着抗生素的大面积使用，很快出现了对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA）。因此构建操作简便的MRSA快速筛查测试非常有必要。CRISPR-Cas（Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR-associated (Cas) proteins）系统为基因组编辑提供了革命性的工具，具有替代活性的Cas蛋白成为一种检测核酸敏感性的强有力的工具。最近的研究显示利用这些新的CRISPR-Cas技术为病原体和疾病检测提供低成本和实用诊断工具的潜力。Cas12a使用单一的多结构域效应蛋白发挥作用，由一个CRISPR RNA(crRNA)和一个Cas蛋白组装成一个核糖核酸复合物，该crRNA包含针对特定DNA序列的信息。这些多结构域效应蛋白通过识别与目标DNA相邻的PAM序列，使crRNA与目标序列互补，进而发生核酸酶剪切作用。
发明内容
一方面，本发明提供了一种crRNA 1,其能识别金葡菌特异性识别基因clfA的SEQID NO.1所示靶点，或者序列如SEQ ID NO.3所示。
一方面，本发明提供了一种crRNA 2，其能识别甲氧西林耐药基因mecA的SEQ IDNO.2所示靶点，或者序列如SEQ ID NO.4所示。
对应地，本发明提供了上述crRNA 1与crRNA 2的组合形式- crRNA组合物，其可用于检测MRSA金葡菌。
进一方面，本发明提供了一种含上述crRNA组合物的试剂盒，其可含有cas12a蛋白，可称为基于CRISPR-Cas12a的试剂盒。试剂盒中可含有单链DNA荧光探针，结构可为5’6-FAM-TTTTTTTTTTTT-3’BHQ1。
对应地，本发明提供了使用上述基因或其组合应用形式，用于检测MRSA的方法，该方法可用于非诊断目的，可判定样品中是否含有甲氧西林耐药基因或耐药金葡菌，样品可为临床分离的金葡菌标本。检测可包括预先对样品进行clfA、mecA基因扩增，扩增方法可为恒温扩增，如为RAA重组酶介导等温核酸扩增，扩增金葡菌clfA基因用的引物A，其可包含上游引物ATGAATATGAAGAAAAAAGAAAAACACGCAATTC和下游引物ACGCTACTTGAATCATTACTTTTGCTTTCGTTAC；扩增甲氧西林耐药基因mecA用的引物B，其可包含上游引物CCCAATTTTGATCCATTTGTTGTTTGATATAGTCTTCAGA和下游引物GAATGCAGAAAGACCAAAGCATACATATTGAAAA。
本发明的有益效果为：经反复筛选得出clfA、mecA基因的识别靶点，进而成功实现灵敏、特异检测MRSA。
附图说明
图1为clfA基因特异性检测结果
图2为mecA基因特异性检测结果
图3为实施例2样品鉴定结果。
具体实施方式
下面各实施例均主要涉及如下基因：
1. 金葡菌特异性识别基因clfA，识别靶点SEQ ID NO.1:TTTTGGACTACTCAGCAGTAAAGA
crRNA SEQ ID NO.3: UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGACUACUCAGCAGUAAAGA
RAA恒温扩增引物：
上游引物：ATGAATATGAAGAAAAAAGAAAAACACGCAATTC
下游引物：ACGCTACTTGAATCATTACTTTTGCTTTCGTTAC
2. 耐甲氧西林耐药基因mecA，识别靶点SEQ ID NO.2:TTTCGGTCTAAAATTTTACCACGT
crRNA SEQ ID NO.4: UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGUCUAAAAUUUUACCACGU
RAA恒温扩增引物：
上游引物：CCCAATTTTGATCCATTTGTTGTTTGATATAGTCTTCAGA
下游引物：GAATGCAGAAAGACCAAAGCATACATATTGAAAA
3. 荧光探针：5’6-FAM-TTTTTTTTTTTT-3’BHQ1
实施例1：
用CRISPR-Cas12a结合RAA恒温扩增技术检测MRSA中clfA基因和mecA基因，为了便于计算基因拷贝数，分别使用包含clfA基因和mecA基因的合成质粒进行灵敏度检测，进一步使用实验室保存的细菌进行特异度检测。具体包括以下步骤：
（1）以样本基因组DNA（灵敏度检测时使用合成质粒的DNA，细菌实验时使用实验室保存的细菌的DNA）为模板，使用RAA核酸扩增试剂对clfA基因和mecA基因分别进行核酸扩增。反应体系共50ul，包括：41.5ul A Buffer，2.5ul B Buffer，2ul 样本DNA，2ul上游引物，2ul下游引物。
（引物序列：clfA基因上游引物：ATGAATATGAAGAAAAAAGAAAAACACGCAATTC，下游引物：ACGCTACTTGAATCATTACTTTTGCTTTCGTTAC；
mecA基因上游引物：CCCAATTTTGATCCATTTGTTGTTTGATATAGTCTTCAGA，下游引物：GAATGCAGAAAGACCAAAGCATACATATTGAAAA）
具体操作步骤：
a．向装有检测干粉酶制剂的检测单元管中加入41.5ul A Buffer、2.0ul上游引物（10uM）、2.0ul下游引物（10uM）。
b．向检测单元管中加入2.0ul样本DNA（质粒DNA或细菌DNA）。
c．再向检测单元管中加入2.5ul的B Buffer，混合均匀，低速离心10秒钟。
d．将检测单元管置于37℃恒温培养箱或恒温水浴锅中孵育30分钟后得到扩增产物。
e. 反应结束后，取5-10ul反应体系进行电泳检测，使用酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提反应溶液1:1（体积比）进行纯化，12000rpm/min离心3-5分钟，取上清进行点用检测。将纯化后的产物进行测序，测序结果如下：
clfA扩增序列为：
CGTGTAAATCGATTGGCGTGGCTTCAGTGCTTGTAGGTACGTTAATCGGTTTTGGACTACTCAGCAGTAAAGAAGCAGATGCAAGTGAAAATAGTGTTACGCAATCTGATAGCGCAAGTAACGAAAGCAAAAGTAATGATTCAAGTAGCGTAATA
mecA扩增序列为：
TCATACTTAGTTCTTTAGCGATTGCTTTATAATCTTTTTTAGATACATTCTTTGGAACGATGCCTATCTCATATGCTGTTCCTGTATTGGCCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAAAATTTTACCACGTTCTGATTTTAAATTTTCAATATGTATGCTTTGGTCTTTCTGCATTCA
将测序得到的基因序列与Gene bank上基因序列进行BLAST比对，结果显示：clfA与Staphylococcus aureus strain pt217 chromosome, complete genome 100%相同；mecA与Staphylococcus aureus strain pt217 chromosome, complete genome 100%相同。
（2）分别检测clfA基因和mecA基因。检测体系共50ul包括：扩增产物5ul（上步扩增产物），Cas12a（1 pM）蛋白5ul，Buffer 5ul，单链DNA荧光探针（10uM）5ul，crRNA 2.5ul（上述crRNA），无酶水27.5ul。将检测体系置于96孔培养皿，将培养皿放置于酶标仪中，以激发光494nm、发射光520nm进行荧光强度检测，每隔2min检测一次，37℃下连续检测60min，得到连续的荧光值报告。
（crRNA序列：clfA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGACUACUCAGCAGUAAAGA，
mecA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGUCUAAAAUUUUACCACGU）
检测结果：
（1）灵敏度
评价该方法灵敏度时，为了便于计算基因拷贝数选择合成质粒进行实验。将合成质粒按浓度梯度稀释，浓度依次为10-5,10-4,10-3,10-2,10-1,10-0 拷贝，按上述方法依次扩增检测，结果如下：该方法可以检测到10-3 拷贝待测基因；只有同时加入相对应的crRNA，cas12a蛋白，荧光探针，阳性基因，才可以检测到荧光值。
2）特异度
我们用实验室保存的表皮葡萄球菌同时进行检测，如图1，样本1，样本2为实验室保存金葡菌，与表皮葡萄球菌明显区分开。如图2，样本1，样本2，样本3为实验室保存耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，样本4，样本5为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌，两者可明显区分。
实施例2：
一、样品采集
实验中使用的细菌样品为临床分离的金黄色葡萄球菌。
二、实验方法
（1）DNA模板的制备
采用DNA试剂盒从细菌样品中提取全基因组DNA。从-80℃冰箱内取出细菌样品冻存管，放于4℃冰箱复温5小时，在超净台中采用无菌接种环快速蘸取菌液，以分段划线法接种于哥伦比亚血琼脂培养板上，37℃恒温箱孵育20小时，挑取血平板上单个菌落，接种于脑心浸液液体培养基中，37℃振荡培养16小时。取2ml菌液按照说明书操作。
（2）RAA恒温核酸扩增
使用RAA核酸扩增试剂对clfA基因和mecA基因分别进行核酸扩增。反应体系共50ul，包括：41.5ul A Buffer，2.5ul B Buffer，2ul 样本DNA，2ul上游引物，2ul下游引物。
a．向装有检测干粉酶制剂的检测单元管中加入41.5ul A Buffer、2.0ul上游引物（10uM）、2.0ul下游引物（10uM）。
b．向检测单元管中加入2.0ul样本DNA。
c．再向检测单元管中加入2.5ul的B Buffer，混合均匀，低速离心10秒钟。
d．将检测单元管置于37℃恒温培养箱或恒温水浴锅中孵育30分钟后得到扩增产物。
（3）CRISPR-Cas12a检测
分别检测clfA基因和mecA基因：
检测体系共50ul包括：扩增产物5ul，Cas12a（1 pM）蛋白5ul，Buffer 5ul，单链DNA荧光探针（10uM）5ul，crRNA 2.5ul，无酶水27.5ul。将检测体系置于96孔培养皿，将培养皿放置于酶标仪中，以激发光494nm、发射光520nm进行荧光强度检测，每隔2min检测一次，37℃下连续检测60min，得到连续的荧光值报告。
三、检测结果
检测结果如图3所示，clfA基因和mecA基因同时检测阳性，判定为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
序列表
<110> 郑州大学
<120> 基于CRISPR的试剂盒及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttttggacta ctcagcagta aaga 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttcggtcta aaattttacc acgt 24
<210> 3
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uaauuucuac uaaguguaga uggacuacuc agcaguaaag a 41
<210> 4
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uaauuucuac uaaguguaga uggucuaaaa uuuuaccacg u 41

Claims (4)

1.检测MRSA金葡菌用crRNA组合物，包含SEQ ID NO.3所示的crRNA 1和SEQ ID NO.4所示的crRNA 2。
2.基于CRISPR检测MRSA金葡菌用的试剂盒，其包含权利要求1所述crRNA组合物。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包含有cas12a蛋白。
4.一种非诊断目的检测MRSA金葡菌的方法，包括使用任一在先权利要求所述试剂盒。
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