CN111378722A - 一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法 - Google Patents

一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111378722A
CN111378722A CN201911063921.1A CN201911063921A CN111378722A CN 111378722 A CN111378722 A CN 111378722A CN 201911063921 A CN201911063921 A CN 201911063921A CN 111378722 A CN111378722 A CN 111378722A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
cas12g
nano
fluorescence
crispr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911063921.1A
Other languages
English (en)
Inventor
陈全胜
刘蕊
吕鹏
李欢欢
黄栋
贺培欢
张运莲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu University
Original Assignee
Jiangsu University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu University filed Critical Jiangsu University
Priority to CN201911063921.1A priority Critical patent/CN111378722A/zh
Priority to PCT/CN2019/124463 priority patent/WO2021088199A1/zh
Publication of CN111378722A publication Critical patent/CN111378722A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法：以生物样品中特异性核酸片段为研究对象，制备生物样品的核酸靶标、猝灭荧光探针、Cas12g三元复合体；将Cas12g三元复合体、核酸靶标、猝灭荧光探针、背景RNA和RNA酶抑制剂混合在核酸酶缓冲液中孵育，当Cas12g三元复合体与核酸靶标识别匹配后，不仅剪切核酸靶标，且附带非特异性反式剪切猝灭荧光探针，进而获取可被检测的荧光；通过采集荧光光谱数据，构建上转换纳米荧光强度变化值与不同浓度的核酸靶标的定量检测模型，实现生物样品中核酸靶标的纳米荧光痕量快速检测。本发明能够适用于生物样品中特异性核酸片段快速、特异、灵敏的检测方法。

Description

一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快 速检测方法
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，尤其是一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法。
背景技术
伴随着核酸检测技术的快速发展，各种生物样品的快速检测方法相继出现。如致使食源性疾病的食源性致病菌，已成为世界食品安全的热点问题。近年来，国内外的生物恐怖主义威胁以及食源性疾病事件引发人们对食源性致病菌的高度关注。对生物样品中食源性致病菌特异性核酸片段的快速检测是预防食源性疾病的重要手段。
目前，核酸检测技术包括基于PCR的检测技术(普通PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR和实时定量反转录PCR等)和非PCR核酸检测技术(环介导等温扩增、核酸依赖性扩增检测技术、基因芯片和微流体芯片等)。这些检测方法虽各有优势，但存在检测周期长或检测费用高或易出现假阳性和假阴性结果等缺陷。因此，迫切需要一种快速、特异、灵敏的适用于生物样品中特异性核酸片段的检测方法。国内外尚未有采用CRISPR-Cas12g系统实现生物样品中特异性核酸片段的纳米荧光定量检测方面的报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提出了一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，能够适用于生物样品中特异性核酸片段快速、特异、灵敏的检测方法。
本发明所采用的技术方案如下：
一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法：
以生物样品中特异性核酸片段为研究对象，制备生物样品的核酸靶标、猝灭荧光探针、Cas12g三元复合体；将Cas12g三元复合体、核酸靶标、猝灭荧光探针、背景RNA和RNA酶抑制剂混合在核酸酶缓冲液中孵育，当Cas12g三元复合体与核酸靶标识别匹配后，不仅剪切核酸靶标，且附带非特异性反式剪切猝灭荧光探针，进而获取可被检测的荧光；通过采集荧光光谱数据，构建上转换纳米荧光强度变化值与不同浓度的核酸靶标(生物样品特异性核酸片段)的定量检测模型，实现生物样品中核酸靶标(特异性核酸片段)的纳米荧光痕量快速检测。
进一步，所述核酸靶标的制备方法为：若生物样品为DNA则提取方法为：经过RPA扩增和体外转录可获得靶标；若生物样品为RNA则提取方法为：经过RT-RPA扩增和体外转录进而得到靶标；
进一步，所述猝灭荧光探针的荧光基团采用上转换纳米颗粒(UCNPS)，猝灭基团使用水溶性非荧光猝灭剂
Figure BDA0002258723820000021
QC-1，该淬灭剂能够将一定距离内荧光基团发出的光吸收，拥有较宽的吸收光谱范围(～500nm到～900nm),猝灭效率高(>97％)；所述荧光基团和猝灭基团之间用单链DNA或RNA连接，最终得到猝灭荧光探针
Figure BDA0002258723820000022
QC-1-RNA/DNA-UCNPS。所述猝灭荧光探针拥有信号报告功能，当猝灭荧光探针中的单链RNA或单链DNA被激活的Cas12g蛋白附带切割时，其中的UCNPS发出可被检测的荧光。且上转换纳米颗粒(UCNPS)的光化学性质稳定、基本不受外界环境影响、检测背景低、装置简单以及成本低。
进一步，所述上转换纳米颗粒采用高温热分解法合成，过程为：以稀土结晶水合物氯化盐等为原料，油酸和1-十八烯为溶剂，搭建基于稀土元素掺杂的高温热分解法UCNPs合成平台，制备出粒径大小约为50nm的油相OA-UCNPs，在其表面修饰氨基转为水溶性的NH2-UCNPs。
进一步，所述Cas12g三元复合体包括Cas12g、crRNA和tracrRNA，所述crRNA和tracrRNA可进行共折叠，crRNA的N区域为可变间隔序列区，且可变间隔序列区与核酸靶标序列互补；
进一步，所述Cas12g的制备方法：
S1，构建Cas12g蛋白表达质粒。合成Cas12g基因，在Cas12g基因序列两端分别加上BamH I和Xho I酶切位点；用BamH I和Xho I双酶切处理pET28a质粒；将加上BamH I和Xho I酶切位点的Cas12g连接到酶切后的pET28a质粒上，得到Cas12g蛋白表达质粒，即pET28a-Cas12g；
S2，将Cas12g蛋白表达质粒转化至感受态细胞，涂平板培养过夜，挑选单菌落扩大培养，待菌液OD600为1～1.5时，用0.2mM IPTG诱导蛋白表达，培养过夜后离心收集培养物，裂解缓冲液+蛋白酶抑制剂进行重悬；超声破碎细胞，4℃条件下28000xg离心20min，将上清液加到HisTrap FF柱上，通过FPLC经咪唑梯度(50mM～500mM)纯化；SDS-PAGE凝胶电泳后再浓缩，透析获得Cas12g蛋白。新型核糖核酸酶Cas12g尺寸小(720-830aa)，且与目标RNA序列识别匹配后不仅能剪切目标RNA，还附带非特异性反式剪切单链DNA或RNA的能力。
本发明的有益效果：
1、本发明所提出的一种基于CRISPR-Cas12g的适用于生物样品中特异性核酸片段的纳米荧光痕量快速检测方法，将CRISPR-Cas12g系统、等温扩增技术以及纳米荧光粒子和高效猝灭剂相结合，采用上转换发光纳米技术检测新思路，实现生物样品中特异性核酸片段的定量检测。该方法具有操作简单、成本低、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优势。
2、本发明通过引入RPA/RT-RPA核酸扩增技术，不仅提高了生物样品中特异性核酸片段检测的灵敏度，而且将应用范围拓展到DNA和RNA均可检测的程度，还具备检测速度快，特异性强，可低温运行，宽松的样本容，多重，低成本，灵活的试剂形态等优势。
3、本发明涉及的新型猝灭荧光探针，其荧光基团使用光化学性质稳定、基本不受外界环境影响、检测背景低、装置简单以及成本低的上转换纳米粒子(UCNPS)。该荧光基团采用高温热分解法合成，并具备粒径小、单分散、荧光强、稳定性好等特点。猝灭基团使用拥有宽的猝灭范围(～500nm到～900nm),猝灭效率>97％的新型水溶性非荧光猝灭剂
Figure BDA0002258723820000031
QC-1。由于荧光基团的荧光光谱与淬灭基团的吸收光谱相重叠，故猝灭基团可将荧光基团淬灭。荧光基团和猝灭基团之间用DNA或RNA短链连接。该探针具有合成简单、用时短、成本低等优势。
4、本发明设计的crRNA和tracrRNA通过化学合成法合成，制备简单。crRNA：5’-UUUACCGGCUCUGACACC-间隔序列-3’,间隔序列依据目标RNA设计，其与目标RNA序列互补。tracrRNA序列已知，可直接快速合成。
附图说明
图1为基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测原理图；
图2中，2A为质粒pET28a-Cas12g1图谱；2B为纯化Cas12g1蛋白的SDS-PAGE图；
图3为成熟crRNA和tracrRNA共折叠示意图(crRNA的N区域为可变间隔序列区，设计的间隔序列应与目标RNA序列互补)；
图4为0.01mg/mL上转换纳米颗粒的荧光光谱图和透射电镜图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明适用于生物样品中特异性核酸片段的纳米荧光痕量快速检测，本发明实例中仅以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的mecA基因检测为例，具体操作步骤如下：
(1)构建Cas12g1蛋白表达质粒：在本实施例中，选用Cas12g(720-830aa)中的Cas12g1(767aa)。用BamH I和Xho I两个酶处理pET28a质粒。合成Cas12g1基因，在Cas12g1基因序列两端分别加上BamH I和Xho I酶切位点，将加上BamH I和Xho I酶切位点的Cas12g1基因序列与酶切后的pET28a质粒连接，得到pET28a-Cas12g1(如图2A)。
(2)Cas12g1蛋白的表达纯化：将Cas12g1蛋白表达质粒转化至感受态细胞，涂平板培养过夜，挑选单菌落扩大培养，待菌液OD600为1～1.5时，用0.2mM IPTG诱导蛋白表达，培养过夜后离心收集培养物，裂解缓冲液+蛋白酶抑制剂进行重悬。超声破碎细胞，4℃条件下28000xg离心20min，将上清液加到HisTrap FF柱上，通过FPLC经咪唑梯度(50mM～500mM)纯化。SDS-PAGE凝胶电泳后再浓缩，透析Cas12g1蛋白，测定Cas12g1浓度(如图2B)。
(3)如图3，crRNA和tracrRNA的制备：crRNA和tracrRNA的单链DNA寡核苷酸模板由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用Next High-Fidelity 2X PCR Master Mix对pre-crRNA模板进行PCR扩增以产生双链体外转录模板DNA。T7引物与模板退火，DNA聚合酶I进行延伸得到成熟crRNA和tracrRNA的双链DNA模板。95℃退火5min，再以-5℃/min降温至4℃。使用HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis试剂盒将dsDNA模板与T7 RNA聚合酶在37℃下孵育3h进行体外转录，DNase I处理体外转录产物，再用柱式RNA快速浓缩纯化试剂盒纯化。测定制备的crRNA和tracrRNA浓度。制备的crRNA序列为5’-UUUACCGGCUCUGACACCGUCCGUAACCUGAAUCAGCUA-3’(黑色粗体序列与目标RNA序列互补)，tracrRNA序列为5’-GAUGCUUACUUAGUCAUCUGGUUGGCAAACCUCCGCGGACCUUCGGGACCAAUGGAGAGGAACCCAGCCGAGAAGCAUCGAGCCGGUAAAUGCCGGAAA-3’。
(4)核酸靶标(目标RNA)的制备：使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取MRSA的DNA。运用RPA技术对提取的DNA进行扩增反应，所使用的RPA上游引物为mecA-F:5'-TAATACGACTCACTATAGGGTGAAGATATACCAAGTGATT-3'(TAATACGACTCACTATAGG为T7启动子序列),下游引物为mecA-R:5'-ATGCGCTATAGATTGAAAGGAT-3'。接着带T7启动子序列的扩增产物在T7RNA聚合酶作用下进行体外转录获得目标RNA(序列为GUGAAGAUAUACCAAGUGAUUAUCCAUUUUAUAAUGCUCAAAUUUCAAACAAAAAUUUAGAUAAUGAAAUAUUAUUAGCUGAUUCAGGUUACGGACAAGGUGAAAUACUGAUUAACCCAGUACAGAUCCUUUCAAUCUAUAGCGCAU，黑色粗体序列为crRNA间隔序列的互补序列)，柱式RNA快速浓缩纯化试剂盒纯化目标RNA。测定目标RNA浓度。
(5)猝灭荧光探针的制备：荧光基团采用高温热分解法合成。称取0.8mM YCl3·6H2O,0.17mM YbCl3·6H2O和0.03mM ErCl3·6H2O溶于5mL甲醇中，加入3mL OA和7mL 1-ODE于烧瓶中，加热至160℃搅拌30min，冷却到室温。将溶有4mM NH4F和2.5mM NaOH的10mL甲醇溶液加入烧瓶搅拌40min，70℃挥发甲醇30min。100℃通氩气排除空气10min，迅速加热到300℃维持1h，冷却至室温，乙醇与环己烷混合清洗多次，置于真空干燥箱60℃干燥得到OA-UCNPs。接着在OA-UCNPs表面进行氨基化修饰得到水溶性的NH2-UCNPS。猝灭基团使用
Figure BDA0002258723820000051
QC-1黑暗淬火剂，合成的
Figure BDA0002258723820000052
QC-1-RNA/DNA-SH与NH2-UCNPS用Sulfo-SMCC交联剂进行连接，最终得到猝灭荧光探针
Figure BDA0002258723820000053
QC-1-RNA/DNA-UCNPS(如
Figure BDA0002258723820000054
QC-1-rArCrGrUrUrUrGrGrUrG-UCNPS或
Figure BDA0002258723820000055
QC-1-TAACACGCCAC-UCNPS)。该探针具有信号报告功能，当激活Cas12g1非特异性剪切探针中的RNA/DNA链时，能够释放可供检测的荧光信号。
(6)荧光光谱数据的采集分析(如图1)：将Cas12g1三元复合体、猝灭荧光探针、RNA酶抑制剂、背景RNA和不同浓度的目标RNA混合在核酸酶缓冲液中孵育；当Cas12g1三元复合体与核酸靶标识别匹配后，不仅剪切核酸靶标，且附带非特异性反式剪切猝灭荧光探针，进而获取可被检测的荧光；使用上转换荧光光谱仪记录不同浓度目标RNA对应的荧光强度。MRSA中mecA基因的纳米荧光痕量快速检测：构建荧光强度变化值与不同浓度目标RNA的定量分析模型如图4，实现MRSA中mecA基因的纳米荧光痕量快速检测。
以上实施例仅用于说明本发明的设计思想和特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，本发明的保护范围不限于上述实施例。所以，凡依据本发明所揭示的原理、设计思路所作的等同变化或修饰，均在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法
<140> 2019110639211
<141> 2019-11-04
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uuuaccggcu cugacaccgu ccguaaccug aaucagcua 39
<210> 2
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaugcuuacu uagucaucug guuggcaaac cuccgcggac cuucgggacc aauggagagg 60
aacccagccg agaagcaucg agccgguaaa ugccggaaa 99
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 3
taatacgact cactataggg tgaagatata ccaagtgatt 40
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 4
atgcgctata gattgaaagg at 22
<210> 5
<211> 147
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gugaagauau accaagugau uauccauuuu auaaugcuca aauuucaaac aaaaauuuag 60
auaaugaaau auuauuagcu gauucagguu acggacaagg ugaaauacug auuaacccag 120
uacagauccu uucaaucuau agcgcau 147

Claims (6)

1.一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，以生物样品中特异性核酸片段为研究对象，制备生物样品的核酸靶标、猝灭荧光探针、Cas12g三元复合体；将Cas12g三元复合体、核酸靶标、猝灭荧光探针、背景RNA和RNA酶抑制剂混合在核酸酶缓冲液中孵育，当Cas12g三元复合体与核酸靶标识别匹配后，不仅剪切核酸靶标，且附带非特异性反式剪切猝灭荧光探针，进而获取可被检测的荧光；通过采集荧光光谱数据，构建上转换纳米荧光强度变化值与不同浓度的核酸靶标的定量检测模型，实现生物样品中核酸靶标的纳米荧光痕量快速检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，所述核酸靶标的制备方法为：若生物样品为DNA则提取方法为：经过RPA扩增和体外转录可获得靶标；若生物样品为RNA则提取方法为：经过RT-RPA扩增和体外转录进而得到靶标。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，所述猝灭荧光探针的荧光基团采用上转换纳米颗粒UCNPS，猝灭基团使用非荧光猝灭剂
Figure FDA0002258723810000011
QC-1，所述荧光基团和猝灭基团之间用单链DNA或RNA连接，最终得到猝灭荧光探针
Figure FDA0002258723810000012
QC-1-RNA/DNA-UCNPS。
4.根据权利要求3所述的一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，所述上转换纳米颗粒采用高温热分解法合成，过程为：以稀土结晶水合物氯化盐等为原料，油酸和1-十八烯为溶剂，搭建基于稀土元素掺杂的高温热分解法UCNPs合成平台，制备出粒径大小约为50nm的油相OA-UCNPs，在其表面修饰氨基转为水溶性的NH2-UCNPs。
5.根据权利要求4所述的一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，所述Cas12g三元复合体包括Cas12g、crRNA和tracrRNA，所述crRNA和tracrRNA可进行共折叠，crRNA的N区域为可变间隔序列区，且可变间隔序列区与核酸靶标序列互补。
6.根据权利要求5所述的一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，所述Cas12g的制备方法：
S1，构建Cas12g蛋白表达质粒。合成Cas12g基因，在Cas12g基因序列两端分别加上BamHI和Xho I酶切位点；用BamH I和Xho I双酶切处理pET28a质粒；将加上BamH I和Xho I酶切位点的Cas12g与酶切后的pET28a质粒连接，得到Cas12g蛋白表达质粒，即pET28a-Cas12g；
S2，将Cas12g蛋白表达质粒转化至感受态细胞，涂平板培养过夜，挑选单菌落扩大培养，待菌液OD600为1～1.5时，用0.2mM IPTG诱导蛋白表达，培养过夜后离心收集培养物，裂解缓冲液+蛋白酶抑制剂进行重悬；超声破碎细胞，4℃条件下28000xg离心20min，将上清液加到HisTrap FF柱上，通过FPLC经50mM～500mM的咪唑梯度纯化；SDS-PAGE凝胶电泳后再浓缩，透析获得Cas12g蛋白。
CN201911063921.1A 2019-11-04 2019-11-04 一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法 Pending CN111378722A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911063921.1A CN111378722A (zh) 2019-11-04 2019-11-04 一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法
PCT/CN2019/124463 WO2021088199A1 (zh) 2019-11-04 2019-12-11 一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911063921.1A CN111378722A (zh) 2019-11-04 2019-11-04 一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111378722A true CN111378722A (zh) 2020-07-07

Family

ID=71222579

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911063921.1A Pending CN111378722A (zh) 2019-11-04 2019-11-04 一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN111378722A (zh)
WO (1) WO2021088199A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112410343A (zh) * 2020-12-19 2021-02-26 郑州大学 基于crispr的试剂盒及其应用
CN113324956A (zh) * 2021-04-22 2021-08-31 上海市肿瘤研究所 一种基于crispr技术与框架核酸耦合的模块化检测平台、构建方法及其应用
CN114058721A (zh) * 2021-11-18 2022-02-18 江苏大学 一种上转换荧光识别探针的制备方法及其产品和应用
CN114807316A (zh) * 2022-03-11 2022-07-29 北京科技大学 一种无核酸扩增可视化的rna定量检测方法
RU2782314C1 (ru) * 2021-12-27 2022-10-25 Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) Система CRISPR-Cas12 для выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus в ультранизких концентрациях

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676172A (zh) * 2012-04-24 2012-09-19 中国科学院福建物质结构研究所 稀土掺杂氟镧化钾纳米荧光标记材料及其制备方法
CN110129485A (zh) * 2019-06-10 2019-08-16 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种快速鉴别非洲猪瘟病毒的检测试剂盒及其检测方法
CN110205360A (zh) * 2019-05-07 2019-09-06 江苏大学 一种基于CRISPR/Cas13a的食源性致病菌核酸纳米荧光痕量检测方法
CN110241182A (zh) * 2019-05-07 2019-09-17 江苏大学 猝灭荧光rna标志物合成方法及应用于食源性致病菌检测的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104371727B (zh) * 2014-11-28 2016-06-22 赵兵 一种水溶性上转换纳米颗粒及其制备方法
CN109331171B (zh) * 2018-11-14 2020-11-06 江南大学 一种疟原虫蛋白的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676172A (zh) * 2012-04-24 2012-09-19 中国科学院福建物质结构研究所 稀土掺杂氟镧化钾纳米荧光标记材料及其制备方法
CN110205360A (zh) * 2019-05-07 2019-09-06 江苏大学 一种基于CRISPR/Cas13a的食源性致病菌核酸纳米荧光痕量检测方法
CN110241182A (zh) * 2019-05-07 2019-09-17 江苏大学 猝灭荧光rna标志物合成方法及应用于食源性致病菌检测的方法
CN110129485A (zh) * 2019-06-10 2019-08-16 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种快速鉴别非洲猪瘟病毒的检测试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAAN C.SWARTS: "Stirring Up the Type V Alphabet Soup", 《THE CRISPR JOURNAL》 *
NICOLE RUSK: "Spotlight on Cas12", 《NATURE METHODS》 *
WINSTON X.YAN ET AL: "Functionally diverse type V CRISPR-Cas systems", 《SCIENCE》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112410343A (zh) * 2020-12-19 2021-02-26 郑州大学 基于crispr的试剂盒及其应用
CN112410343B (zh) * 2020-12-19 2023-02-21 郑州大学 基于crispr的试剂盒及其应用
CN116144660A (zh) * 2020-12-19 2023-05-23 郑州大学 基于新crispr靶点的mrsa菌检测
CN113324956A (zh) * 2021-04-22 2021-08-31 上海市肿瘤研究所 一种基于crispr技术与框架核酸耦合的模块化检测平台、构建方法及其应用
CN114058721A (zh) * 2021-11-18 2022-02-18 江苏大学 一种上转换荧光识别探针的制备方法及其产品和应用
CN114058721B (zh) * 2021-11-18 2024-04-16 江苏大学 一种上转换荧光识别探针的制备方法及其产品和应用
RU2782314C1 (ru) * 2021-12-27 2022-10-25 Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) Система CRISPR-Cas12 для выявления гена антибиотикоустойчивости mecA Staphylococcus aureus в ультранизких концентрациях
CN114807316A (zh) * 2022-03-11 2022-07-29 北京科技大学 一种无核酸扩增可视化的rna定量检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021088199A1 (zh) 2021-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111378722A (zh) 一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法
Yin et al. CRISPR-Cas based virus detection: Recent advances and perspectives
Khan et al. CRISPR-Cas13a mediated nanosystem for attomolar detection of canine parvovirus type 2
US20210269866A1 (en) Crispr effector system based amplification methods, systems, and diagnostics
CN114058679B (zh) 一种crispr级联核酸检测系统及其检测方法与应用
WO2020224164A1 (zh) 一种基于CRISPR/Cas13a的食源性致病菌核酸纳米荧光痕量检测方法
CN102099488B (zh) 利用聚合酶-内切酶链式反应扩增寡核苷酸和小rna的方法
Cao et al. Biosensors based on functional nucleic acids and isothermal amplification techniques
Fu et al. Gold nanomaterials‐implemented CRISPR‐Cas systems for biosensing
WO2020186231A2 (en) Crispr effector system based multiplex diagnostics
CN102827929A (zh) 一种核酸检测方法
CN112609010B (zh) 一种基于点亮型RNA适体的CRISPR-Cas13核酸检测试剂盒
WO2021046257A1 (en) Crispr effector system based multiplex cancer diagnostics
Hu et al. Electrochemical aptasensor for simultaneous detection of foodborne pathogens based on a double stirring bars-assisted signal amplification strategy
CN110241182B (zh) 猝灭荧光rna标志物合成方法及应用于食源性致病菌检测的方法
CN110438204B (zh) 一种利用碳纳米管优化环介导等温扩增反应的方法
CN109444098A (zh) 一种基于循环扩增技术和羧基碳量子点的荧光生物传感器及其制法和应用
Shuofeng et al. Sensitive detection of microRNA based on high-fidelity CRISPR/Cas13a trans cleavage activity coupled with template-free DNA extension-induced strongly emitting copper nanoparticles
Zeng et al. Strand displacement amplification for multiplex detection of nucleic acids
CN115029345A (zh) 基于crispr的核酸检测试剂盒及其应用
Hu et al. M− CDC: Magnetic pull-down-assisted colorimetric method based on the CRISPR/Cas12a system
Chen et al. FRET with MoS2 nanosheets integrated CRISPR/Cas12a sensors for robust and visual food-borne parasites detection
CN109439730B (zh) 一种单链式核酸多重检测方法
CN113151400A (zh) 基于DNA四面体纳米结构介导HCR信号放大的Pb2+荧光传感方法
ZHANG et al. A method for detection of Micropterus salmoides rhabdovirus based on CRISPR/CAS13a system

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200707

RJ01 Rejection of invention patent application after publication