CN109439730B - 一种单链式核酸多重检测方法 - Google Patents

一种单链式核酸多重检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种单链式核酸多重检测方法，包括利用双链特异性核酸酶以降解杂交产物以释放微球的过程。本发明特异性强，灵敏度高，且无需通过PCR技术来扩增核酸分子，避免了PCR扩增过程中存在的外界条件干扰大的问题。

Description

一种单链式核酸多重检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种非治疗诊断目的的单链式核酸多重检测方法。
背景技术
近年来，分子生物学领域不断发展，聚合酶链反应(poLymerase chain reaction，PCR)技术越来越受到人们的重视，进而使得专家、学者对核酸检测技术研究热度不断上升。核酸检测技术是直接针对标志物进行检测的技术，主要原理是使用一些物理、化学和生物学方法，让肉眼看不见的极微量的核酸变成直观的光电或可视信号，从而判断标本中是否存在相应的抗原的过程。
核酸检测技术是以DNA及RNA作为标志物进行检测和分析的技术，其检测的灵敏度明显优于蛋白标志物。目前大部分的核酸检测技术都是以PCR技术为基础的，即利用特异性核酸序列的体外酶促合成方法，实现靶核酸的指数性扩增后再进行检测。虽然将靶核酸扩增后检测的方法，能将靶分子浓度提高，增加检测的准确性，且在荧光定量PCR中，根据荧光的强度可以确定PCR产物的量，进而确定样品中原始模板的量。但在相对定量中，PCR操作过程中内源控制物(已知浓度的核酸分子)易受实验条件的影响，使得PCR过程受到污染几率大，且核酸分子受实验条件影响后，其浓度会出现偏差，进而使核酸分子在PCR不断循环过程中导致最终结果的偏差。选择合适的不受实验条件影响的内源控制物也是实验成败的关键，使得核酸检测技术的定量范围有一定的限制性，从而限制了其应用。因此，不依赖于PCR技术的核酸检测技术越来越引起广大研究者的重视。
发明内容
本发明意在提供一种单链式核酸多重检测方法，以解决现有的核酸检测技术中PCR过程易受到污染而影响接测结果的问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种单链式核酸多重检测方法，包括如下步骤，
步骤1：将不同类型的DNA探针与不同种类的聚苯烯微球进行偶联反应，形成DNA探针-聚苯烯微球复合物；
步骤2：将超顺磁纳米微球与上述DNA探针-聚苯烯微球复合物进行羧基化偶联，形成磁微球-DNA探针-聚苯烯微球三联复合物；
步骤3：将待检标本的单链核酸分子与上述磁微球-DNA探针-聚苯烯微球三联复合物置于带有缓冲液的反应管中进行反应，得杂交产物；
步骤4：将杂交后的反应管至于磁场中，除去上清液后重悬沉淀；
步骤5：在步骤4的反应管中加入双链特异性核酸酶以降解杂交产物，释放聚苯烯微球；
步骤6：根据聚苯烯微球的数量，确定待检测核酸分子的量和类型。
本技术方案的原理及有益效果在于：本技术方案中聚苯烯微球用于对DNA探针标记荧光信号，便于后期检测过程中装置的识别；超顺磁纳米微球用于对待检测分子进行分离，使得结合成功的待检测分子在外加磁场和超顺磁纳米微球的吸附作用下沉在反应管底部，而结合失败的非待检分子则浮于上清液中，在去除上清液后，则反应管中均为结合成功的待检分子，在后期检测过程中去除了干扰因素，缩短了检测时间；双链特异性核酸酶用于降解杂交双链中的核酸分子，进而释放带有荧光标记的聚苯烯微球，在检测时，通过检测聚苯烯微球的荧光类型和数量，确定待检测核酸分子的量和类型。本技术方案无需通过PCR技术来扩增核酸分子的量，而是通过双链特异性核酸酶来降解DNA分子来释放检测信号。通常利用双链特异性核酸酶进行降解时，核酸分子的序列容易出现错误消减的问题，因而限制了此方式的应用，但是本技术方案通过排除干扰分子来提高反应管中的待检分子的浓度，解决了由于核酸分子序列错误消减问题带来的干扰，达到检测的目的，操作方便，避免了PCR扩增过程中存在的外界条件干扰大而影响检测结果的问题。
进一步，步骤1中的聚苯烯微球为经过活化且标记有不同比例的荧光染料的聚苯烯微球。
在聚苯烯微球上标记不同配比的荧光染料，使得不同聚苯烯微球上集成有不同的标记信号，在检测时，可通过不同荧光标记信号的数量确定不同种类抗原的含量，增大了检测范围。
进一步，所述聚苯烯微球的直径为5～10μm。
此直径下的聚苯烯微球可保证在结合后检测时，可单个通过检测装置的检测通道，增强检测的灵敏度和准确性。
进一步，聚苯烯微球的活化采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)溶液和活化缓冲液进行活化。
利用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)溶液对聚苯烯微球活化效果好。
进一步，步骤3中的杂交时的缓冲液为pH 6.3的PBS溶液。
pH 6.3的PBS溶液可保证杂交过程的稳定进行，保证待检标本的核酸分子与磁微球-DNA探针-聚苯烯微球三联复合物杂交的效率。
进一步，步骤3中反应的条件为52℃下杂交1h。
52℃为杂交过程的最适杂交温度，杂交1h可保证待检标本的核酸分子与磁微球-DNA探针-聚苯烯微球三联复合物杂交完全。
进一步，双链特异性核酸酶降解杂交产物时的反应条件为37℃下反应1h。
在此条件下反应，可保证双链特异性核酸酶对杂交产物的降解效果，最大程度的释放聚苯烯微球的荧光标记。
进一步，磁微球-DNA探针-聚苯烯微球三联复合物使用前于4℃下存储。
磁微球-DNA探针-聚苯烯微球三联复合物的最适存储温度为4℃，避免磁微球-DNA探针-聚苯烯微球三联复合物在使用前失效。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实验材料：
本实施例中所用的DNA探针由上海生物工程公司提供；超顺磁纳米微球来源于NEB公司；聚苯烯微球购置于上海透景科技公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)均购置于上海生工生物有限公司。
缓冲液配制：
活化缓冲液(Activation buffer)：100mM NaH2PO4，pH 6.3；
偶联缓冲液(CoupLing buffer)：50mM HEPES,pH 7.4；
磷酸缓冲液(PBS)：10mM NaH2PO4，150mM NaCL，pH 7.4；
2-吗啉乙磺酸缓冲液(MES):0.01M，pH 6.0；
2-吗啉乙磺酸吐温溶液(MEST)：0.01M，0.05％Tween-20，pH 6.0；
实施例1：HCV和HIV病毒联合检测方法
具体的检测方法包括如下步骤：
选择编号为11、23号的2种商品化的标准微球
DNA探针1：
Figure GDA0003610183430000041
DNA探针2：
Figure GDA0003610183430000042
步骤一：所需聚苯烯微球的活化
1.1全速涡旋聚苯烯微球储存液，形成均一的聚苯烯微球悬液；
1.2用去离子水分别配制5mg/mL的EDC和NHS；
1.3取1mL的聚苯烯微球悬液10000g离心3min，移除上清；
1.4加入80μL的活化缓冲液将聚苯烯微球重悬；
1.5分别加入5mg/mL EDC溶液100μL，5mg/mL NHS溶液100μL，混合均匀，于室温(20℃)避光，振荡孵育30min；
步骤二：相应的DNA探针与活化的聚苯烯微球偶联
2.1用TE缓冲液将DNA探针配成浓度为4μM的溶液；
2.2将聚苯烯微球在10000g离心3min，除去上清；
2.3加入步骤2.1中DNA探针；
2.4将活化的聚苯烯微球与DNA探针，于室温(20℃)避光，振荡孵育2h；
2.5将聚苯烯微球在10000g离心3min，除去上清；
2.6加入100μL PBS将聚苯烯微球重悬，10000g离心3min，除去上清；
2.7加入100μL PBS将聚苯烯微球重悬；
2.8通过血小板计数器对聚苯烯微球计数；
步骤三：超顺磁纳米微球偶联DNA探针-微球复合物
3.1取10μg羧基化超顺磁纳米微球，置于洁净离心管中；
3.2用PBS溶液1000μL洗涤2次，磁分离后弃上清；
3.3分别取20μL 5mg/mL EDC和NHS溶液与超顺磁纳米微球充分混匀，置于恒温振摇箱中(37℃，150rpm)活化30min；
3.4用PBS溶液将活化的超顺磁纳米微球洗涤3次，磁分离，弃上清，重悬20μL；
3.5取10μg超顺磁纳米微球，与10μL DNA探针-聚苯烯微球复合物混匀，室温震荡偶联过夜。
3.6用PBS溶液洗涤4次，至于磁场中分离，弃上清，用PBS重悬，保存于4℃；
步骤四：偶联DNA探针的微球混合液的配制
分别取偶联了2种DNA探针的聚苯烯微球，等比例混合，使每种微球的终浓度分别为400个/μL，4℃避光保存；
步骤五：HCV和HIV病毒核酸多重检测
5.1 HCV病毒携带者全血样本10份，HIV病毒携带者全血样本10份；
5.2采用TRIZOL法提取全血样本中的RNA；
5.3分别加入偶联DNA探针的聚苯烯微球混合液的微球溶液于96孔酶标板中，20μL/孔；
5.4加入5.2中RNA标本，10μL/孔；
5.5用排枪轻微的上、下混匀混合物，盖上盖子，52℃，杂交1h；
5.6将96孔酶标板放置于磁力板上，静置3min，洗涤3次；
5.7加入PBS缓冲液重悬，加入3uL双链特异性核酸酶，37℃下反应1h；
5.8将96孔酶标板放置于磁力板上，静置3min；
5.9用液相芯片仪检测反应管中不同微球的标记信号，通过不同种类微球通过的数量，来确定标本中各核酸分子的存在及含量。
步骤六：标准曲线的制作
将HCV和HIV病毒RNA分别配成0.001nM，0.01nM，0.1nM，1nM，10nM，100nM。按照上述步骤五，进行检测，并制作标准曲线，每组试验重复三次，结果以三次试验的平均值表示。
7检测结果及分析
7.1 HIV和HCV标准曲线
HCV的回归方程：y＝715.51x+2241.8(R2＝0.9947)
HIV的回归方程：y＝717.78x+2572.9(R2＝0.9970)
7.2临床标本检测结果
表1检测结果及分析(平均值)
样本编号 HCV(pg/mL) HIV(pg/mL)
1 500 960
2 420 540
3 540 780
4 510 280
5 840 640
6 560 780
7 250 340
8 240 580
9 860 870
10 870 390
平均值 559 616
7.3常规PCR检测标准曲线
HCV的回归方程：y＝-0.2755x+10.759(R2＝0.9821)
HIV的回归方程：y＝-0.2631x+10.08(R2＝0.9810)
表2检测结果和分析(平均值)
样本编号 HCV(pg/mL) HIV(pg/mL)
1 620 460
2 480 620
3 590 510
4 320 750
5 570 390
6 740 480
7 685 570
8 290 620
9 380 970
10 670 850
平均值 534 622
上述结果表明，用本发明方法可以进行HIV和HCV的联合检测，结果中采用回归方程中的相关系数(R2)表示检测结果的准确性的大小，相关系数R2(≤1)越大则表示接测结果越准确。从上表中的数据可以看出，HCV定量检测的相关系数可达99.47％，HIV的定量检测的相关系数可达99.70％，而常规PCR检测方法，HCV定量检测的相关系数为98.21％，HIV的定量检测的相关系数为98.10％，均为达到99％以上相关系数的标准，因此，本技术方案的方法比常规的PCR法检测所产生的误差要更小，检测结果更为可靠，可作为临床检测数据提供基础，以及RNA的分类及鉴定，为核酸检测方法的研究提供理论依据。
核苷酸序列表
<110>中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
<120>一种单链式核酸多重检测方法
<160>2
<210>1
<211>510
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>prim_bind
<400>1
gtaagaaaaa caaggcacag ccagcagctg ctaacacagg anatagcagc ccggtcagcc 60
aaaattaccc catagtgcaa aatgcacagg ggcaatgggt acaccaggcc ttgtcaccta 120
ggaccttgaa tgcatgggtc aaagtagtag aagaaaaagc tttcagccca gaagtgatac 180
ccatgtttac agcattatca gaaggagcca ccccacagga tttaaacacc atgctaaaca 240
cagtgggggg tcatcaagca gctatgcaaa tactaaaaga agccatcaat gatgaagctg 300
cagaatggga tagattacat ccagtgcatg cagggcctat tgcaccaggc cagatgaggg 360
aaccaagggg aagtgacata gcaggaacta ctagtaccct tcaggaacaa atagcatgga 420
tgacgagcaa cccacctatc ccagtaggag aaatttacaa aagatggata atcttgggat 480
taaataagat agtaagaatg tatagccct 510
<210>2
<211>162
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>prim_bind
<400>2
gtggcctact accgcggtct tgacgtgtct gtcatcccgg ccagtggcga tgttgtcgta 60
gtggcaactg atgctctcat gaccggcttt accggcgatt tcgactcggt gatagactgc 120
aacacgtgtg tcacccagac ggtcgacttc agccttgatc ct 162。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
<110>中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
<120>一种单链式核酸多重检测方法
<160>2
<210>1
<211>510
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>prim_bind
<400>1
gtaagaaaaa caaggcacag ccagcagctg ctaacacagg anatagcagc ccggtcagcc 60
aaaattaccc catagtgcaa aatgcacagg ggcaatgggt acaccaggcc ttgtcaccta 120
ggaccttgaa tgcatgggtc aaagtagtag aagaaaaagc tttcagccca gaagtgatac 180
ccatgtttac agcattatca gaaggagcca ccccacagga tttaaacacc atgctaaaca 240
cagtgggggg tcatcaagca gctatgcaaa tactaaaaga agccatcaat gatgaagctg 300
cagaatggga tagattacat ccagtgcatg cagggcctat tgcaccaggc cagatgaggg 360
aaccaagggg aagtgacata gcaggaacta ctagtaccct tcaggaacaa atagcatgga 420
tgacgagcaa cccacctatc ccagtaggag aaatttacaa aagatggata atcttgggat 480
taaataagat agtaagaatg tatagccct 510
<210>2
<211>162
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>prim_bind
<400>2
gtggcctact accgcggtct tgacgtgtct gtcatcccgg ccagtggcga tgttgtcgta 60
gtggcaactg atgctctcat gaccggcttt accggcgatt tcgactcggt gatagactgc 120
aacacgtgtg tcacccagac ggtcgacttc agccttgatc ct 162

Claims (1)

1.一种非疾病诊断的单链式核酸多重检测方法，其特征在于：包括如下步骤，
步骤1：将不同类型的DNA探针与不同种类的聚苯烯微球进行偶联反应，形成DNA探针-聚苯烯微球复合物；聚苯烯微球为经过活化且标记有不同比例的荧光染料的聚苯烯微球，聚苯烯微球的直径为5~10 µm；聚苯烯微球的活化采用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液，N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）溶液和活化缓冲液进行活化或者聚苯烯微球的活化采用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液，N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）溶液和活化缓冲液进行活化；
步骤2：将超顺磁纳米微球与上述DNA探针-聚苯烯微球复合物进行羧基化偶联，形成磁微球-DNA探针-聚苯烯微球三联复合物；磁微球-DNA探针-聚苯烯微球三联复合物使用前于4℃下存储；
步骤3：将待检标本的单链核酸分子与上述磁微球-DNA探针-聚苯烯微球三联复合物置于带有缓冲液的反应管中进行反应，反应的条件为52 ℃下杂交1 h，得杂交产物；杂交时的缓冲液为pH 6.3的PBS溶液；
步骤4：将杂交后的反应管至于磁场中，除去上清液后重悬沉淀；
步骤5：在步骤4的反应管中加入双链特异性核酸酶以降解杂交产物，释放聚苯烯微球；双链特异性核酸酶降解杂交产物时的反应条件为37 ℃下反应1h；
步骤6：根据聚苯烯微球的数量，确定待检测核酸分子的量和类型；
其中，DNA探针1的序列为：5’-gtaagaaaaa caaggcacag ccagcagctg ctaacacagganatagcagc ccggtcagcc aaaattaccc catagtgcaa aatgcacagg ggcaatgggt acaccaggccttgtcaccta ggaccttgaa tgcatgggtc aaagtagtag aagaaaaagc tttcagccca gaagtgatacccatgtttac agcattatca gaaggagcca ccccacagga tttaaacacc atgctaaaca cagtggggggtcatcaagca gctatgcaaa tactaaaaga agccatcaat gatgaagctg cagaatggga tagattacatccagtgcatg cagggcctat tgcaccaggc cagatgaggg aaccaagggg aagtgacata gcaggaactactagtaccct tcaggaacaa atagcatgga tgacgagcaa cccacctatc ccagtaggag aaatttacaaaagatggata atcttgggat taaataagat agtaagaatg tatagccct-3’；
DNA探针2的序列为：5’-gtggcctact accgcggtct tgacgtgtct gtcatcccggccagtggcga tgttgtcgta
gtggcaactg atgctctcat gaccggcttt accggcgatt tcgactcggtgatagactgcaacacgtgtgtcacccagac ggtcgacttc agccttgatc ct-3’。
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