CN104120191A

CN104120191A - 虫媒病毒液相芯片三重检测方法

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Publication number: CN104120191A
Application number: CN201410247111.2A
Authority: CN
Inventors: 李云峰; 蔡鹏�; 龙川凤; 赵亮; 葛藤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-06-06
Filing date: 2014-06-06
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2034-06-06
Also published as: CN104120191B

Abstract

本发明公开了一种虫媒病毒液相芯片三重检测方法，即针对基孔肯雅病毒、克里米亚-刚果出血热和裂谷热病毒三种虫媒病毒分别设计特异性引物和探针，通过单重PCR和克隆测序，确定了引物和探针的特异性后，进行多重PCR扩增，在扩增反应体系中，上下游引物的浓度比为1:1-1:8；然后将探针与荧光编码微球偶联制得微球混合液并通过偶联探针进行偶联质量控制；最后将多重PCR产物与微球混合液进行杂交反应，同时加入用核酸检测缓冲液稀释的链霉素-藻红蛋白，并通过液相芯片检测仪对反应产物进行分析。本发明检测特异性好，可以同时检测三种虫媒病毒；由于在多重PCR扩增过程中，采用不对称PCR的扩增方法，本发明检测灵敏度高。

Description

虫媒病毒液相芯片三重检测方法

技术领域

本发明涉及一种可以同时检测基孔肯亚热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、裂谷热病毒三种虫媒病毒的液相芯片三重检测方法以及所涉及的液相芯片的制备方法和应用。

背景技术

虫媒病毒是指一类以吸血昆虫为媒介，在脊椎动物和人、畜间传播多种严重疾病的病毒。目前已发现的虫媒病毒约537 种，分布遍及世界五大洲，已证实其中130 余种对人畜有致病性^[1]。在病毒分类中，虫媒病毒隶属14个病毒科。根据所包括病毒的种类及其与人、畜疾病的关系，虫媒病毒主要集中在披膜病毒科甲病毒属(29种)、黄病毒科黄病毒属(69种)、呼肠孤病毒科(77种)和布尼安病毒科(350种)，其中许多病毒对人类健康和生命安全危害较大^[2]。

基孔肯雅热的病原体为基孔肯雅病毒(Chikungunya virus, CHIKV)，主要传播媒介为埃及伊蚊(Aedes aegypti)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)和非洲伊蚊(Aedes africanus)，以“人-蚊-人”的方式循环。该病毒最早在非洲，随后在印度和东南亚流行。近几年，基孔肯雅热在非洲和亚洲再次暴发，导致数百万人发病^[3]，且传播范围具有超出现有分布范围的趋势，即向中美洲、南美洲以及美国南部和中国等地区扩散。2008年，我国首次从2例斯里兰卡回国的输入性病例血清标本中检出CHIKV。2010年我国广东省东莞市发生基孔肯雅热流行，共确定诊断173例患者。该病传播媒介在我国广泛分布，尤其在南方地区具有引发基孔肯雅热流行的条件^[2]。基孔肯雅热的典型表现为突起高热，关节疼痛以及皮疹。在亚洲，CHIKV与出血热综合征有密切关系，类似登革出血热或登革休克综合征。

克里米亚-刚果出血热(Crimean Congo hemorrhagic fever, CCHF)(在中国称新疆出血热) 因感染CCHF 病毒引起，是中国目前已经发现的4 种虫媒病毒性传染病之一^[4]。CCHF病毒属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，内罗毕病毒属(Nairovirus genus)，CCHF病毒广（CCHFV）泛分布于非洲、中东、欧洲东南部和亚洲的干燥地区，我国新疆从1964至1994年共报告260例病人^[5]。各种野生哺乳动物为该病毒储存宿主，流行季节为3-6月，呈散发流行。该病毒引起以发热、全身性出血为典型特征的烈性传染疾病，病死率高达67%^[6]。

裂谷热病毒(Rift Valley fever virus, RVFV)属于布尼安病毒科白蛉热病毒属，蚊虫为主要传播媒介。该病毒可引起具有高发病率和高病死率的急性出血性人畜共患传染病。人类感染裂谷热后，主要表现为发热，乏力，头痛，肌肉痛，关节痛，有时会有恶心，呕吐，部分会出现眼部疾病、脑膜炎或出血热。近10多年，该病在非洲流行较为严重，2006-2007年肯尼亚共报道684例(155例死亡)，索马里报道114例(51例死亡)；2007年坦桑尼亚报道290例(117例死亡)，苏丹报道228例；2008年马达加斯加岛报道418例(7例死亡)(WHO，2007，2008)。该病曾被认为仅在非洲流行，直到2000年9月沙特阿拉伯和也门有确诊病例，该病具有向亚洲其他地区以及欧洲传播的趋势，我国应引起高度关注^[7]。

多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，是根植于普通PCR技术的一种特殊方法，可在同一PCR反应管中同时扩增出一个或多个核酸片段，一次操作即可完成多个靶基因的扩增，具有高效性、经济性、简便性等显著的优点。液相芯片技术是20世纪90年代后期发展起来的被喻为后基因组时代的芯片技术，是融流式技术、荧光微球、激光、数字信号处理和传统化学技术为一体的一种新型生物分子高通量检测技术^[8-9]。液相芯片技术的出现，大大拓宽了科学研究者和医学工作者的研究空间，目前该技术已广泛应用于临床诊断如肿瘤标志物、内分泌激素、遗传性疾病的基因诊断、组织配型的基因检测、病原菌感染等的检测^[10-14]。

我国国土面积广大，地理条件复杂多样，地跨寒、温、热三带，存在多种媒介昆虫，适宜多种虫媒病毒生存。基孔肯雅热和克里米亚-刚果出血热均在我国发生过较大规模的暴发，同时我国具备裂谷热病毒滋生、传播的天然条件和疫情暴发的诱发条件^[15]。随着人类活动范围的日益扩大和人员流动的日益广泛，境外虫媒病毒病传入我国的可能性显著增加。但上述三种病毒病的临床表现相似，且主要流行于非洲、亚洲等地区，通过简单的体温监测及流行病学个案调查难以区分与鉴别。本研究采用多重PCR结合液相芯片技术（如图1所示），能一次同时检测这3种病毒，对这些病毒的监测、检测和控制研究具有重要的现实意义。虫媒病毒的早发现、早鉴定可以提高我国防控该类传染病的能力，对保护人民的健康和生命安全具有重要意义^[16]。

发明内容

本发明将多重PCR技术和液相芯片技术有机结合，对CHIKV的E1基因、RVFV的Polymerase L基因、CCHFV的Nucleoprotein基因联合起来检测，提供了一种相比单重PCR技术检测而言操作步骤简化，而且成本低的检测方法，同时还充分发挥了液相芯片技术高通量的技术优势，大大减少了工作量。

本发明采用的技术方案是：针对CHIKV、RVFV、CCHFV三种虫媒病毒分别设计特异性引物和探针，通过单重PCR和克隆测序，确定引物和探针的特异性；然后设计三种病毒的特异性探针，偶联不同编号的编码微球，并通过优化多重PCR反应体系和液相芯片杂交体系，建立了针对CHIKV、RVFV、CCHFV三种虫媒病毒液相芯片检测最佳反应条件，最后通过液相芯片检测系统实现对三种虫媒病毒的同时检测。

具体而言，本发明提供的一种虫媒病毒液相芯片三重检测方法，包括如下步骤：

1）设计引物并对下游引物进行生物素标记，在引物特异性验证成功后，进行虫媒病毒多重PCR扩增，其中所述虫媒病毒为基孔肯雅病毒(Chikungunya virus, CHIKV)、克里米亚- 刚果出血热病毒(Crimean Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV)和裂谷热病毒(Rift Valley fever virus, RVFV)三种；其中所述PCR扩增的反应体系为：

成分	体积
		Dream Taq^TM Green	10μL
混合引物	0.4μL
		模板1	1μL
模板2	1μL
		模板3	1μL
ddH₂O	6.6μL
		总体积	20μL

反应条件为：95 ℃，10 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，30 s，35 cycles；72 ℃，10 min；4℃，hold；所述混合引物为上下游引物的混合物，上、下游引物的浓度比为1:1-1:8；反应体系中所述模板可以为模板1、2、3种的任意一种或任意两种组合或三种；

2）设计核酸探针并进行氨基化修饰，与荧光编码微球偶联制得微球混合液；

3）设计偶联质控探针并加入到步骤2）得到的微球混合液进行偶联质量控制，所述偶联质控探针序列与步骤2）所述核酸探针序列互补；

4）将PCR产物与微球混合液进行杂交反应，同时加入用核酸检测缓冲液稀释的链霉素-藻红蛋白，并通过液相芯片检测仪对反应产物进行分析。

进一步地，所述基孔肯雅病毒CHIKV、裂谷热病毒RVFV和克里米亚-刚果出血热CCHF的上（F）、下（R）游引物序列为：

并对下游引物的5’端进行了生物素标记。

优选地，在多重PCR扩增反应体系中所述上下游引物的浓度比为1:8。

进一步地，上述步骤2）和3）中所述核酸探针（P）和偶联质控探针（CC）的序列为：

进一步地，上述序列中每个核酸探针的5^’端加10个poly(T)，再加氨基修饰，并对偶联质控探针（CC）的5^‘端进行了生物素标记。

进一步地，上述虫媒病毒液相芯片三重检测方法步骤2）中所述偶联微球混合液通过如下步骤制得：

1）随机选取带有不同编号的羧基化微球并活化；

2）向活化微球中各加入100 pmol/μL的氨基化修饰的核酸探针3-5 µL，瞬时震荡；

3）再各加3 µL核酸偶联活化剂(10mg/mL EDC)到上述微球中，瞬时震荡；

4）室温避光孵育30-45min；

5）向上述微球中各加200µL核酸偶联洗涤液A (0.02% 吐温-20)，全速震荡5min；

6） 12，000×g 离心微球10min；

7）弃上清，向上述微球中加入200µL核酸偶联洗涤液B (0.1% SDS)，全速震荡5min；

8） 12，000×g 离心微球10min；

9）弃上清，不要触动沉淀；

10）各加入100µL 核酸偶联微球贮存液(TE)，全速震荡或超声波悬浮微球5min制得偶联微球混合液。

进一步地，上述虫媒病毒液相芯片三重检测方法步骤3）中所述偶联质量控制包括如下步骤：

1）取偶联混合微球5µL，加入到1.5 mL离心管中，并用核酸检测缓冲液1 (1.5×TMAC)稀释至33µL，

2）将偶联质控探针(CC)稀释至0.01µM的混合液，取7µL偶联质控探针混合液，加入到含上述33µL微球混合液的1.5mL离心管中，

3）然后用核酸检测缓冲液2 (1.0×TMAC)补足体积至50µL，52℃避光孵育15min，

4）加入25µL 的10µg/mL SAPE，混匀，52℃避光孵育5min，加入反应终止液50µL；

5）液相芯片系统中进行测试，判断标准：空白质控荧光信号中值(Median Fluorescence Intensity, MFI)均小于100，偶联质控MFI均远大于1000。

进一步地，上述虫媒病毒液相芯片三重检测方法步骤4）中所述杂交反应步骤为：

1）在杂交反应中，设置PCR产物上样量，共四个梯度，分别为1µL/反应、3µL/反应、5µL/反应、7µL/反应；

2）全速震荡重悬微球混合液约3min；

3）对每个样品孔和背景孔，加入微球混合液10µL，然后加入33µL核酸检测缓冲液1 (1.5×TMAC)；

4）对每个背景孔，加入1µL /3µL /5µL /7µL PCR blank产物；

5）对每个样品孔，加入1µL /3µL /5µL /7µL PCR产物；

6）用核酸检测缓冲液2 (1.0×TMAC)补足体积至50µL；

7）充分混匀反应孔中的各成份；

8）盖上盖子，防止液体蒸发，于金属加热器中进行如下反应： 95℃ 10min，变性；52℃ 15min，杂交；

9）在样品进行杂交反应时，用核酸检测缓冲液2 (1.0×TMAC)将链霉素-澡红蛋白(SA-PE，1mg/mL)稀释至10µg/mL，制备新鲜的报告液；

10）向每个反应孔中加入25µL的报告混合液，充分混匀；

11）于金属加热器中52℃孵育5min；

12）加入50µL终止液(52℃预热)，混匀；

13）依照液相芯片检测仪的操作说明进行检测，判断标准为：待测样本的荧光中值≥250时，判断为阳性样本。

优选地，所述PCR产物上样量为7uL。

本发明的优点：

1）本研究将多重PCR技术和液相芯片技术有机结合，相比单重PCR技术检测一种病毒而言，不仅简化了操作步骤，节省了成本，还充分发挥了液相芯片技术高通量的技术优势，大大减少了工作量；

2）将多重PCR技术和液相芯片技术进行有效的结合，对CHIKV、RVFV和CCHFV同时进行检测；

3）将多重PCR技术与液相芯片技术相结合，可以单独检测样品中的CHIKV、RVFV、CCHFV，也可以同时检测样品中的CHIKV、RVFV、CCHFV；

4）检测方法灵敏度提高：将多重PCR技术与液相芯片技术相结合，由于在多重PCR扩增过程中，采用不对称PCR的扩增方法，即将生物素标记引物的量提高，使得PCR富集较多的生物素标记的产物，进一步采用液相芯片技术平台进行检测，最终建立的检测方法灵敏度与传统多重RT-PCR琼脂糖凝胶电泳法灵敏度2.38×10⁴copies/反应相比^[17]，灵敏度提高了10倍；

5）该检测方法的成功建立，有效避免了样本提取和纯化等操作的繁琐和弊端，大大节省了成本，易于进行标准化和推广示范。

附图说明

图1 多重PCR结合液相芯片检测反应原理图。

图2 探针多重比对。

图3 羧基化荧光编码微球与氨基化核酸探针偶联示意图。

图4 RT-PCR扩增CHIKV、RVFV、CCHFV，M:Maker; 1:CHIKV-E1(104bp); 2:RVFV- Polymerase L (130bp); 3:CCHFV- Nucleoprotein (179bp)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不以任何方式受下述实施例的限制。

实验材料：

1．供试病毒株

克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV) cDNA，汉坦病毒(Hanta virus, HTV) cDNA，埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)质粒，包含病毒检测靶标基因的基孔肯雅热病毒质粒、克里米亚-刚果出血热病毒质粒、裂谷热病毒质粒，由辽宁出入境检验检疫局提供，黄热病毒(Yellow fever virus, YFV)质粒、西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)质粒、马尔堡病毒(Marburg virus, MBV)质粒由深圳博睿祥晖生物技术有限公司提供；

2．主要供试试剂

核酸液相芯片偶联试剂盒(深圳博睿祥晖生物技术有限公司，50次)；核酸液相芯片检测试剂盒(深圳博睿祥晖生物技术有限公司，100次)；Dream Taq^TM Green (Fermentas，1000次)；琼脂糖(西班牙Biowest公司，100g)；pUC19 vector(美国Promega公司，25次)；藻红蛋白(SAPE，美国Invitrogen公司，1mg/mL，1mL)；36号、46号、62号羧基化荧光编码微球(美国Luminex 公司，1.25×10⁷个/mL)。

实施例 1 ： PCR 多重扩增

1）引物和探针的设计

采用Primer 5.0软件进行引物和探针的设计，引物和探针均送宝生物工程(大连)有限公司合成，序列和引物相关信息如表1所示；

表1 液相芯片检测基因及相关引物和探针序列

此外，我们还利用在线序列比对工具http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html对3种探针进行了多重序列比对，结果表明3种探针序列一致性较差，表明3种探针形成交叉反应的几率很小，结果如图2所示；

由于在多重PCR扩增体系中涉及到多条引物同时扩增，因此，多重PCR技术对引物的性能要求较单重PCR技术要高；另外，在液相芯片检测过程中，为了提高偶联探针对靶基因的捕获，扩增的靶基因片段优选在100-300bp之间，片段过长，可能会造成荧光信号值的降低；

2）引物与探针修饰

为了使PCR扩增产物容易生物素化，所有下游引物的5’端进行了生物素标记；为了便于探针固定及保证探针杂交效率，所有探针的5’端添加了10个poly(T)，poly(T)作为间隔臂可有效减少空间位阻，有利于探针的杂交反应；为了便于探针和羧基化微球进行偶联反应，所有探针均进行了氨基化修饰；为了有效的对核酸探针与荧光编码微球偶联的结果进行质控，我们合成了偶联质控(Coupling Control，CC)，偶联质控的序列与核酸探针的序列完全互补，如表1所示，并对5’端进行了生物素标记；

3）引物特异性验证

具体的扩增反应体系如表2所示，扩增条件如下：50℃，30 min；95 ℃，10 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，65 ℃，30 s，35 cycles；65 ℃，10 min；4℃，hold。取扩增产物5μL进行琼脂糖凝胶(2%)电泳检测，单一模板扩增如果有单一条带，即将上述条带分别割胶回收，连接Puc19载体后转入大肠杆菌感受态细胞中，通过0.1%AmP LB培养基筛选后，挑取白色克隆子进行菌落PCR鉴定。将菌落PCR鉴定为阳性的克隆子送至北京诺赛基因进行测序。将测序得到序列与Genbank中相应序列比对，测序结果与目标基因一致的克隆子大量提取质粒保存于-20˚C；

表2 RT-PCR反应体系

4）多重PCR扩增

在引物特异性验证成功的基础上，进行多重PCR扩增。采用构建的阳性质粒为模板，将每种质粒DNA拷贝数稀释至1×10⁷ copies/µL，进行多重PCR扩增反应体系优化。在反应体系优化中，上下游引物设置四种比例浓度，浓度设置如表3所示，将三种引物按照表3的四种浓度梯度稀释成混合引物；

表3 多重PCR反应引物浓度优化

表4是采用的多重PCR反应体系，其中反应体系为20μL。根据模板组合的不同，可进行任意一种基因的检测、任意两种基因的检测、三种基因的同时检测等不同的检测方式。多重PCR扩增程序为：95 ℃，10 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，30 s，35 cycles；72 ℃，10 min；4℃，hold；

表4 多重PCR反应体系

。

实施例 2 ：制备微球混合液

1）核酸探针与荧光编码微球偶联

羧基化荧光编码微球与氨基化探针的偶联反应原理如图3所示。本研究所设计的三种核酸探针分别与不同编号的荧光编码微球偶联，核酸探针与对应荧光编码微球的编号如下表所示；

表5 核酸探针及微球编号

核酸探针与荧光编码微球偶联方法根据深圳博睿祥晖生物技术有限公司提供的核酸液相芯片偶联试剂盒使用说明书进行操作，具体方法如下：

2）实验准备：

将所有试剂平衡至室温(至少30min)；

用核酸偶联缓冲液(0.1 mol/L MES pH4.5)或无菌去离子水悬浮氨基化修饰的核酸探针至100 pmol/μL；

3）微球的活化：

随机取36号、46号、62号羧基化微球用于实验；

先用超声波仪打散沉淀的微球3min，并将微球全速震荡至少5min；

上下颠倒震荡微球，立即从贮存管中取50μL微球到1.5mL的聚丙烯微量离心管中；

，000×g 离心5min；

弃上清，不要触动沉淀；

加入50µL 微球偶联缓冲液，全速震荡并用超声波分散约5min；

4）氨基化探针与微球的偶联：

在上述活化的微球中，按照表5所示，在对应的活化微球中各加入100pmol/μL的氨基化修饰的核酸探针4 µL，瞬时震荡；

各加3 µL核酸偶联活化剂(10mg/mL EDC)到上述微球中，瞬时震荡；

室温避光孵育30-45min；

各加200µL核酸偶联洗涤液A (0.02% 吐温-20)，全速震荡约5min；

，000×g 离心微球10min；

弃上清，不要触动沉淀，向上述微球中加入200µL核酸偶联洗涤液B (0.1% SDS)，全速震荡5min；

，000×g 离心微球10min；

弃上清，不要触动沉淀；

各加入100µL 核酸偶联微球贮存液(TE)，全速震荡或超声波悬浮微球约5min；

5）偶联微球的得率的检测：

取上述悬浮微球，4µL /管，用核酸偶联微球贮存液稀释至125µL，采用血球计数板在光学显微镜下进行微球计数；

每个离心管取5份样品分别对4个中方格中的微球数进行计数，并取其平均值，用该平均值根据计算公式(1)和(2)计算偶联微球得率；

偶联微球数量(个)=(平均值×4)×10⁴×(125/4)×0.1… (1)

偶联微球得率=[偶联微球数量/(6.25×10⁵)]×100%…….. (2)

制备混合微球贮存液：根据微球计数结果，用核酸偶联微球贮存液(TE)将微球稀释至合适的浓度(10µL约含300个/种微球)，2-8℃ 避光保存；

6）偶联质量控制：

空白质控：取原始36号、46号、62号羧基化微球各1µL，加入到1.5 mL离心管中，并用核酸检测缓冲液1 (1.5×TMAC)稀释至33µL，加入核酸检测缓冲液2 (1.0×TMAC)补足体积至50µL，52℃避光孵育15min，加入25µL 的10µg/mL SAPE，混匀，52℃避光孵育5min，加入反应终止液50µL；

阴性质控：取偶联混合微球5µL，加入到1.5 mL离心管中，并用核酸检测缓冲液1 (1.5×TMAC)稀释至33µL，加入核酸检测缓冲液2 (1.0×TMAC)补足体积至50µL，52℃避光孵育15min，加入25µL 的10µg/mL SAPE，混匀，52℃避光孵育5min，加入反应终止液50µL；

偶联质控：取偶联混合微球5µL，加入到1.5 mL离心管中，并用核酸检测缓冲液1 (1.5×TMAC)稀释至33µL，将偶联质控探针(CC)稀释至0.01µM的混合液，取7µL偶联质控探针混合液，加入到含上述33µL微球混合液的1.5mL离心管中，然后用核酸检测缓冲液2 (1.0×TMAC)补足体积至50µL，52℃避光孵育15min，加入25µL 的10µg/mL SAPE，混匀，52℃避光孵育5min，加入反应终止液50µL；

分别取125µL上述孵育产物，加入液相芯片系统中进行测试。

实施例 3 ：虫媒病毒液相芯片三重检测方法的建立， PCR 产物与微球混合液杂交、液相芯片检测

在杂交反应中，PCR产物上样量设置四个梯度，分别为1µL/反应、3µL/反应、5µL/反应、7µL/反应，根据试验结果确定最佳上样量；

1）实验步骤

全速震荡重悬微球混合液约3min；

对每个样品孔和背景孔，加入微球混合液10µL，然后加入33µL核酸检测缓冲液1 (1.5×TMAC)；

对每个背景孔，加入1µL /3µL /5µL /7µL PCR blank产物；

对每个样品孔，加入1µL /3µL /5µL /7µL PCR产物；

用核酸检测缓冲液2 (1.0×TMAC)补足体积至50µL；

充分混匀反应孔中的各成份；

盖上盖子，防止液体蒸发，于金属加热器中进行如下反应：

℃ 10min，变性；52℃ 15min，杂交；

在样品进行杂交反应时，用核酸检测缓冲液2 (1.0×TMAC)将链霉素-澡红蛋白(SA-PE，1mg/mL)稀释至10µg/mL，制备新鲜的报告液；

向每个反应孔中加入25µL的报告混合液，充分混匀；

于金属加热器中52℃孵育5min；

加入50µL终止液(52℃预热)，混匀；

依照液相芯片检测仪的操作说明进行检测(设置检测体积为50µL)。

本研究建立的实验结果判断标准如下：

A、数据有效性分析：

a)空白质控荧光中值≤100；

b)阴性质控荧光中值≤200；

c)偶联质控荧光中值≥1000；

B、待测样本分析判断：

a)待测样本的荧光中值≤200时，判断为阴性样本；

b)Cutoff值设置为250，待测样本的荧光中值≥250时，判断为阳性样本；

c)当200≤荧光中值﹤250时，设置为灰度区间，判断为可疑样品，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证。

实施例 4 ：虫媒病毒液相芯片三重检测方法的优化

1）三重检测体系检测方法优化PCR阴性质控检测结果

本实验严格设置了实验质控，PCR阴性质控即在PCR扩增体系中将阳性模板用H₂O代替。阴性质控的作用主要是判断PCR扩增实验中是否出现污染。从本实验结果来看，不同引物浓度比例，不同PCR产物上样量对MFI均没有实质性的影响，阴性质控的MFI较为稳定，表明优化实验未出现实验污染；

表6 液相芯片三重检测方法优化实验PCR阴性质控检测结果

2）三重检测体系检测CHIKV方法优化

根据实验方法中所述的多重PCR扩增体系优化方案和液相芯片检测方法中的PCR产物上样量优化方案对CHIKV的E1基因进行检测，检测结果如表7所示。根据检测结果，随着上下游引物浓度比例的降低，MFI呈现逐渐升高的趋势，当PCR产物上样量逐渐升高时，MFI呈现逐渐升高并平稳的趋势。当多重PCR反应体系中，上下游引物浓度比例为1：8时，PCR产物上样量为7µL/反应时，针对CHIKV得到最高的MFI；

表7 液相芯片检测CHIKV-E1实验优化结果

3）三重检测体系检测RVFV方法优化

根据实验方法中所述的多重PCR扩增体系优化方案和液相芯片检测方法中的PCR产物上样量优化方案对RVFV的Polymerase L基因进行检测，检测结果如表8所示。根据检测结果，随着上下游引物浓度比例的降低，MFI呈现逐渐升高的趋势，当PCR产物上样量逐渐升高时，MFI呈现逐渐升高并平稳的趋势。当多重PCR反应体系中，采用上下游引物浓度比例为1:4或者1:8时，PCR产物上样量为3-7µL/反应时，针对RVFV得到较高的MFI；

表8 液相芯片检测RVFV-Polymerase L 实验优化结果

4）三重检测体系检测CCHFV方法优化

根据实验方法中所述的多重PCR扩增体系优化方案和液相芯片检测方法中的PCR产物上样量优化方案对CCHFV的Nucleoprotein基因进行检测，检测结果如表9所示。根据检测结果，随着上下游引物浓度比例的降低，MFI呈现逐渐升高的趋势，当PCR产物上样量逐渐升高时，MFI呈现逐渐升高并平稳的趋势。当多重PCR反应体系中，采用上下游引物浓度比例为1:4或者1:8时，PCR产物上样量为5-7µL/反应时，针对CCHFV得到较高的MFI；

表9 液相芯片检测CCHFV-Nucleoprotein实验优化结果

5）三重检测体系检测CHIKV、RVFV方法优化

根据实验方法中所述的多重PCR扩增体系优化方案和液相芯片检测方法中的PCR产物上样量优化方案分别对CHIKV的E1基因和RVFV 的Polymerase L基因进行检测，检测结果如表10所示。根据检测结果，随着上下游引物浓度比例的降低，MFI呈现逐渐升高的趋势，当PCR产物上样量逐渐升高时，MFI呈现逐渐升高并平稳的趋势。当多重PCR反应体系中，采用上下游引物浓度比例为1：4或者1：8时，PCR产物上样量为5-7µL/反应时，针对CHIKV和RVFV得到较高的MFI；

表10 液相芯片检测CHIKV-E1和RVFV-Polymerase L实验优化结果

6）三重检测体系检测CHIKV、CCHFV方法优化

根据实验方法中所述的多重PCR扩增体系优化方案和液相芯片检测方法中的PCR产物上样量优化方案分别对CHIKV的E1基因和CCHFV的Nucleoprotein基因进行检测，检测结果如表11所示。根据检测结果，随着上下游引物浓度比例的降低，MFI呈现逐渐升高的趋势，当PCR产物上样量逐渐升高时，MFI呈现逐渐升高并平稳的趋势。当多重PCR反应体系中，采用上下游引物浓度比例为1:8时，PCR产物上样量为7µL/反应时，针对CHIKV和CCHFV得到较高的MFI；

表11 液相芯片检测CHIKV-E1和CCHFV-Nucleoprotein实验优化结果

7）三重检测体系检测RVFV、CCHFV方法优化

根据实验方法中所述的多重PCR扩增体系优化方案和液相芯片检测方法中的PCR产物上样量优化方案分别对RVFV的Polymerase L基因和CCHFV的Nucleoprotein基因基因进行检测，检测结果如表12所示。根据检测结果，随着上下游引物浓度比例的降低，MFI呈现逐渐升高的趋势，当PCR产物上样量逐渐升高时，MFI呈现逐渐升高并平稳的趋势。当多重PCR反应体系中，采用上下游引物浓度比例为1:4或者1:8时，PCR产物上样量为5-7µL/反应时，针对RVFV和CCHFV得到较高的MFI；

表12 液相芯片检测RVFV-Polymerase L和CCHFV-Nucleoprotein实验优化结果

8）三重检测体系检测CHIKV 、RVFV、CCHFV方法优化

根据实验方法中所述的多重PCR扩增体系优化方案和液相芯片检测方法中的PCR产物上样量优化方案分别对CHIKV的E1基因、RVFV的Polymerase L基因和CCHFV的Nucleoprotein基因基因进行检测，检测结果如表13所示。根据检测结果，随着上下游引物浓度比例的降低，MFI呈现逐渐升高的趋势，当PCR产物上样量逐渐升高时，MFI呈现逐渐升高并平稳的趋势。当多重PCR反应体系中，采用上下游引物浓度比例为1:8时，PCR产物上样量为7µL/反应时，针对CHIKV、RVFV和CCHFV得到较高的MFI；

表13 液相芯片检测CHIKV-E1、RVFV-Polymerase L和CCHFV-Nucleoprotein实验优化结果

。

虫媒病毒液相芯片三重检测方法的评价

根据建立的多重PCR反应体系采用阳性质粒模板进行灵敏性的检测。同时采用该方法对实际样本进行检测。以验证建立的多重PCR和液相芯片检测方法的特异性；

1 检测方法特异性实验：采用建立的多重PCR扩增体系及液相芯片检测方法分别对汉坦病毒、埃博拉病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、马尔堡病毒、基孔肯雅热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、裂谷热病毒进行检测。每PCR反应加入模板量为1μL；

2 检测方法灵敏度实验：根据提取的质粒DNA浓度，将每种质粒DNA稀释至1×10⁷copies/μL，进一步采用10倍稀释法稀释至1×10⁰copies/μL。每PCR反应加入模板量为1μL。采用建立的多重PCR扩增体系及液相芯片检测方法进行扩增和检测。

实施例 5 ：实验结果

1）引物和探针特异性验证

引物特异性实验结果如图4所示。由实验结果可知，基因E1、Polymerase L、Nucleoprotein均得到靶片段，将上述目的片段进行割胶回收，并进行克隆构建和测序，以验证扩增产物的特异性；

将上述目的基因阳性克隆子进行测序鉴定，以验证PCR扩增产物的特异性。测序结果如下表14所示。测序结果与Genbank中已知基因序列对比后发现，E1基因片段与CHIKV病毒E1基因的序列同源性达100%，Polymerase L基因片段与RVFV病毒的Polymerase L序列同源性达100%，Nucleoprotein基因片段与CCHFV病毒的Nucleoprotein基因的序列同源性达98%-100%。显然，针对目的片段检测的引物设计是成功的；

表14 测序结果

将含上述基因片段的阳性克隆子进行扩大培养，采用碱裂解法提取质粒，并对质粒DNA的浓度和纯度进行测定。结果见表15。由测定结果可知，提取的质粒浓度介于1597.18-3470.74ng/µL之间，纯度比值在1.8左右；

表15 质粒DNA浓度、纯度、拷贝数测定结果

2）核酸探针与微球的偶联

A 微球偶联得率

由表16的实验结果可以看出：三种偶联微球得率均大于80%，平均微球偶联得率为85.75%，本次偶联操作符合Luminex操作要求；

表16 偶联微球得率

B 微球偶联质量控制

表17偶联质控检测结果表明：空白质控荧光信号中值(Median Fluorescence Intensity, MFI)均小于100，阴性质控MFI均小于200，偶联质控MFI均远大于1000，说明本次实验中，微球有较高的偶联效率；

表17 偶联质偶联量控制检测结果

3）虫媒病毒液相芯片三重检测方法的评价和应用

对基孔肯雅热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、裂谷热病毒的检测结果显示，探针与相应的PCR产物之间有特异性的杂交，MFI值大于250，表明均为阳性。而对汉坦病毒、埃博拉病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、马尔堡病毒的检测结果均为阴性，说明建立的液相芯片多重检测方法特异性较好，方法成立；

表18 液相芯片特异性检测实验结果

4）虫媒病毒液相芯片三重检测方法灵敏度实验

提取的质粒DNA通过分光光度计进行定量，将DNA稀释至1×10⁷copies/μL ；采用10倍稀释法进行稀释，稀释至1×10⁰copies/μL；每PCR反应加入模板量为1μL；

A）CHIKV液相芯片检测灵敏度实验

梯度稀释CHIKV质粒模板经PCR扩增后，与偶联特异探针的微球混合物进行杂交反应，然后用液相芯片仪器进行检测。结果如表19所示，结果表明CHIKV质粒DNA的灵敏度为1×10⁴copies /PCR；

表19 CHIKV液相芯片灵敏性检测实验结果

B）RVFV液相芯片检测灵敏度实验

梯度稀释RVFV质粒模板经PCR扩增后，与偶联特异探针的微球混合物进行杂交反应，然后用液相芯片仪器进行检测。结果如表20所示，结果表明RVFV质粒DNA的灵敏度为1×10³copies /PCR，同时，对于1×10²copies和1×10¹copies 质粒样品检测结果位于灰度区间内，可利用其它检测方法进一步确认；

表20 RVFV液相芯片灵敏性检测实验结果

C）CHFV液相芯片检测灵敏度实验

梯度稀释CCHFV质粒模板经PCR扩增后，与偶联特异探针的微球混合物进行杂交反应，然后用液相芯片仪器进行检测。结果如表21所示，结果表明CCHFV质粒DNA的灵敏度为1×10⁵copies /PCR；

表21 CCHFV液相芯片灵敏性检测实验结果

。

结论

1) 本研究针对CHIKV、RVFV、CCHFV三种虫媒病毒分别设计特异性引物和探针。通过单重PCR和克隆测序，确定了引物和探针的特异性；

2) 通过优化多重PCR反应体系和液相芯片杂交体系，建立了针对CHIKV、RVFV、CCHFV三种虫媒病毒液相芯片检测最佳反应条件。即多重PCR扩增反应体系中上下游引物浓度采用1：8的比例，杂交反应中，PCR产物上样量确定为7µL/反应；

3) 通过对三种模板的任意一种、任意两种、任意三种模板的组合检测，证实了本研究建立的多重检测方法的可行性；

4) 液相芯片特异性试验结果表明：本研究建立的多重检测方法具有良好的特异性，与其他非目的虫媒病毒没有交叉反应；

5) 液相芯片灵敏度试验结果表明：针对CHIKV检测的灵敏度为1×10⁴copies /PCR、针对RVFV检测的灵敏度为1×10³copies /PCR、针对CCHFV检测的灵敏度为1×10⁵copies /PCR；

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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SEQUENCE LISTING

<110> 李云峰

<120> 虫媒病毒液相芯片三重检测方法

<130> 2014

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> CHIKV-F

<400> 1

attggcaaac ggaagagatg ta 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> CHIKV-R

<400> 2

gttcggagaa tcgtggaaga gt 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> RVFV-F

<400> 3

cagggctcgg aagcaatgta 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> RVFV-R

<400> 4

ccatttggga gaggtgaact ca 22

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> CCHFV-F

<400> 5

gctctcaagt ggaggaaaga catag 25

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> CCHFV-R

<400> 6

gggttttcat caccacctct gtt 23

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> CHIKV-P

<400> 7

tttttttttt gcttcctaaa agcagccga 29

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> CHIKV-CC

<400> 8

tcggctgctt ttaggaagc 19

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> RVFV-P

<400> 9

tttttttttt caaggaagtg gaaccaaggc 30

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> RVFV-CC

<400> 10

gccttggttc cacttccttg 20

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> CCHFV-P

<400> 11

tttttttttt caaagttcct ggcgaaattg tg 32

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> CCHFV-CC

<400> 12

cacaatttcg ccaggaactt tg 22

Claims

1.虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1) 设计引物并对下游引物进行生物素标记，在引物特异性验证成功后，进行虫媒病毒多重PCR扩增，其中所述虫媒病毒为基孔肯雅病毒CHIKV、克里米亚- 刚果出血病毒CCHFV和裂谷热病毒RVFV三种，其中多重PCR扩增反应体系为：

反应条件为：95 ℃，10 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，30 s，35 cycles；72 ℃，10 min；4℃，hold；所述混合引物为上下游引物的混合物，上下游引物的浓度比为1:1-1:8；反应体系中所述模板可以为模板1、2、3种的任意一种或任意两种组合或三种；

2) 设计核酸探针并进行氨基化修饰，与荧光编码微球偶联制得微球混合液；

3) 设计偶联质控探针并加入到步骤2）得到的微球混合液进行偶联质量控制，所述偶联质控探针序列与步骤2）所述核酸探针序列互补；

4) 将PCR产物与微球混合液进行杂交反应，同时加入用核酸检测缓冲液稀释的链霉素-藻红蛋白，并通过液相芯片检测仪对反应产物进行分析。

2.根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，所述基孔肯雅病毒CHIKV、裂谷热病毒RVFV和克里米亚-刚果出血热CCHF的引物序列为：

。

3.根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，所述上下游引物的浓度比为1:8。

4.根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，所述核酸探针和偶联质控探针的序列为：

。

5.根据权利要求4所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，所述序列中每个核酸探针的5^’端加10个poly(T)，再加氨基修饰，并对偶联质控探针的5^‘端进行了生物素标记。

6.根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，步骤2）所述偶联微球混合液通过如下步骤制得：

1) 随机选取带有不同编号的羧基化微球并活化；

2) 向活化微球中各加入100 pmol/μL的氨基化修饰的核酸探针3-5 µL，瞬时震荡；

3) 再各加3 µL核酸偶联活化剂，即10 mg/mL 的EDC到上述微球中，瞬时震荡；

4) 室温避光孵育30-45min；

5) 向上述微球中各加200 µL核酸偶联洗涤液A ，即0.02% 吐温-20，全速震荡5min；

6) 12，000×g 离心微球10min；

7) 弃上清，向上述微球中加入200µL核酸偶联洗涤液B，即0.1% SDS，全速震荡5min；

8) 12，000×g 离心微球10min；

9) 弃上清，不要触动沉淀；

10) 各加入100µL 核酸偶联微球贮存液，全速震荡或超声波悬浮微球5min制得偶联微球混合液。

7.根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，步骤3）偶联质量控制包括如下步骤：

1) 取偶联混合微球5µL，加入到1.5 mL离心管中，并用核酸检测缓冲液1，即1.5×TMAC，稀释至33µL；

2) 将偶联质控探针稀释至0.01µM的混合液，取7µL偶联质控探针混合液，加入到含上述33µL微球混合液的1.5mL离心管中；

3) 然后用核酸检测缓冲液2 ，即1.0×TMAC，补足体积至50µL，52℃避光孵育15min；

4) 加入25µL 的10µg/mL SAPE，混匀，52℃避光孵育5min，加入反应终止液50µL；

5）液相芯片系统中进行测试，判断标准：空白质控荧光信号中值小于100，偶联质控荧光信号中值大于1000。

8.根据权利要求1所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，步骤4）所述杂交反应步骤为：

1) 设置PCR产物上样量，分别为1µL/反应、3µL/反应、5µL/反应、7µL/反应；

2) 全速震荡重悬微球混合液约3min；

3) 对每个样品孔和背景孔，加入微球混合液10µL，然后加入33µL核酸检测缓冲液1 ，即1.5×TMAC；

4) 对每个背景孔，加入1µL /3µL /5µL /7µL PCR blank产物；

5) 对每个样品孔，加入1µL /3µL /5µL /7µL PCR产物；

6) 用核酸检测缓冲液2，即1.0×TMAC补足体积至50µL；

7) 充分混匀反应孔中的各成份；

8) 盖上盖子，防止液体蒸发，于金属加热器中进行如下反应： 95℃ 10min，变性；52℃ 15min，杂交；

9) 在样品进行杂交反应时，用核酸检测缓冲液2将链霉素-澡红蛋白稀释至10µg/mL，制备新鲜的报告液；

10) 向每个反应孔中加入25µL的报告混合液，充分混匀；

11) 于金属加热器中52℃孵育5min；

12) 52℃预热，加入50µL终止液，混匀；

13) 依照液相芯片检测仪的操作说明进行检测，判断标准为：待测样本的荧光中值≥250时，判断为阳性样本。

9.根据权利要求8所述的虫媒病毒液相芯片三重检测方法，其特征在于，所述PCR产物上样量为7uL。