CN113249521A - 一种同时检测五种动物病毒的多重液相芯片检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时检测ASFV、PPRV、WNV、RVFV和FMDV五种病毒的多重液相芯片检测试剂盒。根据ASFV的p72基因、PPRV的N基因、WNV的E基因、RVFV的S基因和FMDV南非型5’UTR基因，筛选每个基因的高度保守区，设计特异性探针以及验证探针，并在探针上、下游分别设计特异性引物。在探针5’端进行C12臂氨基化修饰并与微球偶联，在PCR引物的下游引物5’端进行生物素（Biotin）标记。利用PCR引物获得目标扩增片段，将扩增产物与偶联微球的探针进行杂交，读取MFI值，分辨不同类型的病毒。该方法提高了检测的特异性和敏感性，简化了试验步骤，实现了对同一样品中的多种不同病原核酸的同时检测，检测通量高，样品用量少，可大大降低检测成本，提高检测效率。
Description
技术领域：
本发明属于动物病毒检测领域，具体涉及一种同时检测非洲猪瘟病毒(ASFV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、西尼罗病毒(WNV)、裂谷热病毒(RVFV)和南非型口蹄疫病毒(SATFMDV)的多重液相芯片检测方法及试剂。
背景技术：
非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)、小反刍兽疫(Peste Des PetitsRuminants,PPR)、西尼罗热(West Nile Fever,WNF)、裂谷热(Rift Valley Fever,RVF)和南非型口蹄疫(Southen African Territories Foot-and-Mouth Disease,SAT FMD)是我国明确指出要重点防范的外来动物疫病，病原分别为ASFV、PPRV、WNV、RVFV和SAT FMDV。目前对这些疾病病原的检测主要釆用血清学方法与分子生物学方法。传统血清学检测方法常涉及活病毒试验，因此对操作人员易感，稍有不慎就会导致病毒的扩散，限制了其在非疫区国家的使用。常规分子生物学检测方法目前主要以普通PCR和实时荧光定量PCR为主，且多为同时检测3种以下病原，如赵文华等[1]建立了PPRV、RVFV、SBV的三重普通和实时荧光定量RT-PCR检测方法，王涛等[2]建立了ASFV的TaqMan荧光定量PCR方法，霍晓丽等[3]建立了PPRV和MO的双重RT-PCR检测方法等，这些方法具有较好的敏感性和特异性，但难以满足对大规模临床样品大量、高通量的检测需求。液相芯片技术是近几年发展的一种新型生物芯片技术，凭借其高通量、快速、准确等优势很快就得到广泛应用，满足了本研究快速高通量检测的目的。
液相芯片技术是一种可同时针对多个目标分子进行定量、定性分析的新型芯片技术，它不同于传统的固相芯片技术，无需在芯片上进行点样，而是将探针结合于微球载体上，悬浮于液态环境中对样品进行检测。该方法具有操作简便、耗时短、高通量以及准确性高的优点，适合大量样品的高通量快速检测。近年来，国内外已建立了多种重要病原微生物的液相芯片检测方法，可从动物组织及血液中同时检测多种病原并分型，显示了良好的应用前景。本发明建立了可同时检测非洲猪瘟、小反刍兽疫、西尼罗、裂谷热和南非型口蹄疫的多重液相芯片检测方法，旨在为这五种外来动物疫病的病原检测建立快速准确的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：现有技术检测在检测非洲猪瘟、小反刍兽疫、西尼罗、裂谷热和南非型口蹄疫五种病原时，难以满足对大规模临床样品大量、高通量的检测需求，针对该不足本发明可以提供一种可同时检测ASFV、PPRV、WNV、RVFV和FMDV五种病毒的敏感性高、特异性好的多重液相芯片检测方法，为临床样品的大规模筛查提供了有效方法。
为解决上述技术问题，本发明提供一种同时检测ASFV、PPRV、WNV、RVFV和FMDV五种病毒的多重液相芯片检测试剂盒，所述试剂盒由多重不对称PCR扩增引物以及分别包被有特异性检测探针的荧光微球组成，其中包被有特异性检测探针的荧光微球由以下序列特异的探针在5’端经过C12臂氨基化(NH2(CH2)12)修饰并与磁性微球偶联得到，探针序列如下所示：
ASFV Probe：NH2(CH2)12-CAAACCCTACTGGAACATAAGGCT；
PPRV Probe：NH2(CH2)12-TCAAAGATCGGCCGAGGCACTCTTC；
WNV Probe：NH2(CH2)12-TGAAGGGAACAACCTATGGCGTCTG；
RVFV Probe：NH2(CH2)12-ATGCTGTAGTTCCAAACTCAGCC；
FMDV Probe：NH2(CH2)12-TAACGACCGTCCCCGGTTGAAAC；
所述多重不对称PCR扩增引物为分别针对各探针上、下游序列设计的特异性引物，并且在下游引物5’端进行生物素(Biotin)标记，引物序列如下所示：
ASFV-F：GABGAATGACAYGCACCCA；
ASFV-R：Biotin-GGCCCAAGACTTGCTKAATAGC；
PPRV-F：GAGCTATGCGRTGGGTGTC；
PPRV-R：Biotin-TGCAGKCTRAAGAGTGCC
WNV-F：ACTCAGGCAGGGAGATTC；
WNV-R：Biotin-TGAACARACGCCATAGGT；
RVFV-F：CTTCGACCTRAGCTCTACYAGA；
RVFV-R：Biotin-ATGCTRGGRAGTGATGAG；
FMDV-F：GGTCTAGCCCTRGTGTYGC；
FMDV-R：Biotin-CAGTTGTCAGYCTRRWGGAGG。
优选的，所述多重不对称PCR扩增引物中，WNV最佳上、下游引物比例为1:10，其他病毒最佳上、下游引物比例为1:20。
所述同时检测ASFV、PPRV、WNV、RVFV和FMDV五种病毒的多重液相芯片检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)设计出了针对ASFV p72基因、PPRV N蛋白基因、WNV E蛋白基因、RVFV S片段基因和SAT FMDV5’UTR基因保守区域的特异性探针，并在探针上、下游分别设计特异性引物；
(2)为提高检测的准确性，降低检测结果的假阴性，对上、下游引物部分碱基位点使用兼并碱基；
(3)在探针的5’端进行C12臂氨基化(NH2(CH2)12)修饰，在下游引物5’端进行生物素(Biotin)标记；
(4)选取不同编号的磁性微球分别与经过C12臂氨基化(NH2(CH2)12)修饰的PPRV、ASFV、WNV、RVFV以及FMDV探针进行偶联。
所述一种同时检测ASFV、PPRV、WNV、RVFV和FMDV五种病毒的多重液相芯片检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)获得含有DNA和cDNA的检测样品，采用多重不对称PCR扩增引物对检测样品进行多重不对称PCR扩增；
(2)扩增产物与包被有特异性检测探针的荧光微球进行杂交检测；
(3)在已经预热的Bio-Plex悬浮芯片检测仪上读取样品的中位荧光值(MFI)，根据样品的中位荧光值(MFI)读数来进行结果判定。
所述步骤(2)中扩增产物与包被有特异性检测探针的荧光微球进行杂交检测，杂交时间为30分钟，杂交温度为54℃。
所述一种同时检测ASFV、PPRV、WNV、RVFV和FMDV五种病毒的多重液相芯片检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(3)中Bio-Plex悬浮芯片检测仪的预热温度为54℃。
本发明的有益效果在于：与现有技术相比，提高了检测的特异性和敏感性，简化了试验步骤，实现了对同一样品中的多种不同病原核酸的同时检测，检测通量高,样品用量少，可大大降低检测成本，提高检测效率。
附图说明
图1为ASFV p72基因序列一致性比对结果；
图2为PPRV N蛋白基因序列一致性比对结果；
图3为WNV E蛋白基因序列一致性比对结果；
图4为RVFV S片段基因序列一致性比对结果；
图5为FMDV 5’UTR区基因序列一致性比对结果；
图6为各病毒探针与微球偶联效率验证；A.ASFV探针与063#微球偶联效率验证；B.RVFV探针与043#微球偶联效率验证；C.FMDV探针与027#微球偶联效率验证；D.WNV探针与055#微球偶联效率验证；E.PPRV探针与036#微球偶联效率验证；
图7为最佳上下游引物比例筛选结果；
图8为最佳杂交温度筛选结果；
图9最佳杂交时间筛选结果
图10 ASFV、RVFV、FMDV、WNV和PPRV液相芯片特异性试验检测结果；
图11普通PCR扩增特异性检测结果；A:ASFV特异性引物扩增；B:RVFV特异性引物扩增；C:FMDV特异性引物扩增；D:WNV特异性引物扩增；E:PPRV特异性引物扩增；M:DL2000 DNAMaker；1:ASFV；2:RVFV；3:FMDV；4:WNV；5:PPRV；6:阴性对照
图12普通PCR扩增敏感性检测结果；A:ASFV；B:RVFV；C:FMDV；D:WNV；E:PPRV M:DL2000 DNA Maker；1:10-1稀释；2:10-2稀释；3:10-3稀释；4:10-4稀释；5:10-5稀释；6:10-6稀释；7:10-7稀释；8:10-8稀释
具体实施方式
实施例1引物及探针序列的设计合成
通过GenBank上公布的21条ASFV的p72基因序列、28条PPRV的N蛋白基因序列、21条WNV的E蛋白基因序列、22条RVFV的S片段基因序列和15条FMDV南非型SAT1 5’UTR区基因序列，发现序列同源性较高，ASFVp72基因序列一致性为95.1％-100％(图1)、PPRV的N蛋白基因序列一致性为90.7％-100％(图2)、WNV E蛋白基因序列一致性为98.9％-100％(图3)、RVFVS片段基因序列一致性95.9％-100％(图4)、SATFMDV 5’UTR基因序列一致性为91.1％-100％(图5)。
利用DNAStar、Primer 5等软件筛选分析，设计出了针对ASFV p72基因、PPRV N蛋白基因、WNV E蛋白基因、RVFV S片段基因和SAT FMDV5’UTR基因保守区域的特异性探针以及反向互补的验证探针，并在探针上、下游分别设计特异性引物。为提高检测的准确性，降低检测结果的假阴性，对上、下游引物部分碱基位点使用兼并碱基。在探针的5’端进行C12臂氨基化(NH2(CH2)12)修饰，在验证探针及下游引物5’端进行生物素(Biotin)标记，引物及探针序列见表1，2。
表1五种外来病原引物序列
表2五种外来病原探针及验证探针序列
实施例2微球与探针的偶联及验证
微球与探针的偶联
选取了Bio-Rad公司编码为36#、63#、55#、43#和27#的磁性微球分别与经过C12臂氨基化(NH2(CH2)12)修饰的PPRV、ASFV、WNV、RVFV以及FMDV探针进行偶联，偶联步骤如下：
(1)将两支新鲜EDC粉末从4℃冰箱中取出于室温静置30min。
(2)以最高转速涡旋悬浮微球，并超声30s，使其完全分散开。
(3)取200μL微球加入到1.5mL离心管中。
(4)以最高转速离心2min。
(5)弃去上清，以22μL 0.1M pH 4.5的MES重悬微球，彻底涡旋，使微球分散。
(6)在重悬的微球中加入2μL对应的探针。
(7)取恢复至室温的EDC粉末，加入1mL ddH2O溶解。取1.25μL EDC溶液加入微球中，迅速涡旋混匀。
(8)黑暗中室温孵育30min。
(9)再次制备新鲜EDC溶液，取1.25μL EDC溶液加入微球中，迅速涡旋混匀。
(10)黑暗中室温孵育30min。
(11)加入1mL 0.02％Tween 20，轻微涡旋混匀。
(12)以最高转速离心2min。
(13)弃去上清，加入0.1％SDS，重悬沉淀40s。
(14)以最高转速离心2min。
(15)弃去上清，用40μL pH 8.0 TE Buffer重悬沉淀。
(16)涡旋仪上以最高转速涡旋30s。
(17)用锡纸包裹Ep管，置于4℃黑暗条件下保存。
偶联探针的验证
使用生物素标记的验证探针对微球的偶联效率进行检测。
(1)通过血球计数器来计算偶联微球的数量：涡旋仪上重悬微球40s，1:100稀释微球，彻底混匀后，取10μL转移至血球计数器上，进行计数。微球浓度(个/μL)＝4个角落微球数量之和×2.5×100。
(2)准备工作微球混合液：在涡旋仪上重悬每种微球40s，在660μL1.5×TMAC杂交缓冲液中加入约150,000个偶联好的微球，加入双蒸水至终体积为990μL，放置在冰上。
(3)将验证探针浓度稀释至10fmol/μL，彻底混匀后置于冰上。
(4)在涡旋仪上以最高转速重悬工作微球混合液30s。
(5)在PCR管中加入33μL工作微球混合液。
(6)各个管中分别加入不同体积的验证探针和TE Buffer，形成不同浓度梯度，加入验证探针和TE Buffer的体积见表3，并设置3组重复。
表3各管中验证探针和TE Buffer的体积
(7)置于水平振荡器上震荡混匀1min。
(8)在PCR仪中进行孵育杂交，95℃加热5min，54℃孵育15min。
(9)配置新鲜的SA-PE工作液，用1×TMAC 100倍稀释SA-PE至工作浓度。
(10)将杂交孵育后的样品转移到预热的滤板中，磁力洗板机中清洗2次。
(11)在每孔中加入100μL 1×TMAC，水平震荡器上重悬磁珠1min。
(12)加入25μL稀释好的SA-PE工作液。
(13)室温振荡孵育5min。
(14)在已经预热到54℃的Bio-Plex悬浮芯片检测仪上分析样品。根据中位荧光值(Median florescence intensity,MFI)来判断探针与微球的偶联效率。
偶联效率验证结果如图6所示。结果显示，随着验证探针的量逐渐增加，中卫荧光值(MFI)呈梯度上升，且当验证探针为0fmol时，MFI小于300，表明偶联成功，可用于后续杂交检测。
实施例3各病毒多重不对称PCR扩增
合成ASFV的p72基因序列(登录号：AY578708)、PPRV N蛋白基因序列(登录号：KX938427)、WNV E蛋白基因序列(登录号：GQ502441)、RVFVS片段基因序列(登录号：DQ380153)、FMDV SAT1 5’UTR区基因序列(登录号：AY593840)，并分别连接于PUC57质粒，获得五种重组质粒，并以这五种重组质粒混合物为模板进行病毒的多重不对称PCR扩增。
PCR扩增体系(50μL体系)：
PCR扩增程序：98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃延伸5min，结束反应，放置于4℃保存。取2μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。
实施例4杂交与检测
将经多重不对称PCR扩增后的产物与偶联了微球的探针进行杂交检测(027#-FMDV，036#-PPRV，043#-RVFV，055#-WNV，063#-ASFV)。杂交步骤如下：
(1)在涡旋仪上重悬每种微球40s。
(2)配制工作微球混合液：在660μL1.5×TMAC杂交缓冲液中加入偶联好的微球，每种微球约150,000个，加入双蒸水至终体积为990μL，放置在冰上。
(3)在反应管中加入33μL混合好的工作微球混合液。
(4)加入2μL以五种重组质粒为模板进行多重不对称PCR扩增的阳性产物，用TEBuffer将总量补齐至50μL，并以PCR阴性产物作为阴性对照，TE Buffer作为空白对照。
(5)将加完样的反应管置于PCR仪中孵育杂交，95℃加热5min，54℃孵育30min。
(6)配置新鲜的SA-PE工作液，用1×TMAC 100倍稀释SA-PE至工作浓度。
(7)将杂交孵育后的样品转移到预热的滤板中，磁力洗板机中清洗2次。
(8)在每孔中加入100μL 1×TMAC，水平震荡器上重悬磁珠1min。
(9)加入25μL稀释好的SA-PE工作液。
(10)54℃振荡孵育5min。
(11)在已经预热到54℃的Bio-Plex悬浮芯片检测仪上分析样品。根据结果判定标准分析每孔中中位荧光值(Median florescence intensity，MFI)读数来进行结果判定。
液相芯片检测结果判定标准：当检测时每种微球的检出数≧50且空白对照背景中位荧光值小于300，则表示结果可信。当样品中中位荧光值(Median florescenceintensity，MFI)≧300且与阴性对照的比值(qualitative criteria，QC)≧3时，可判定结果为阳性，否则为阴性。
实施例5不对称PCR上下游引物比例的优化
在液相悬浮体系杂交过程中，捕获探针与目的基因单链的结合会受到其反义链的竞争作用，而影响杂交的效率。为了减少双链对杂交的干扰，我们通过对不对称PCR体系中上、下游引物的比例进行优化，以获得最佳杂交效率。本研究中，分别选择上、下游引物比例为1:1、1:2、1:5、1:10、1:20五个比例分别进行不对称PCR，通过液相芯片检测的中位荧光值(MFI)确定最佳前后引物比例。
在保持其他条件不变的情况下，选择上、下游引物比例为1:1、1:2、1:5、1:10、1:20五个比例分别进行不对称PCR，以确定最佳上、下游引物比例。检测时空白对照的MFI值符合杂交检测判定结果的要求，检测结果可信。杂交信号值结果如图7所示，在所检测的上、下游引物比例范围内，WNV在上、下游引物比例为1:10时，MFI值最高，其他病毒上、下游引物比例为1:20时，MFI值最高，因此WNV最佳上、下游引物比例为1:10，其他病毒最佳上、下游引物比例为1:20。
实施例6杂交温度的优化
根据所设计五条探针的Tm值，我们选择了48℃-58℃的温度范围，并且每隔2℃设置温度梯度，其他条件保持不变，根据液相芯片检测读取的中位荧光值(MFI)确定最佳杂交温度。
在其它条件完全相同的情况下，分别在杂交温度为48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃下进行杂交，以确定最佳杂交温度。检测时空白对照的MFI值符合杂交检测判定结果的要求，检测结果可信。杂交信号值结果如图8所示，FMDV的最佳杂交温度为56℃，其余均为54℃。综合考虑，我们筛选54℃作为最佳杂交温度。
实施例7杂交时间的优化
分别将杂交温度设定为5min、10min、15min、20min、30min、对各病毒进行杂交检测，根据液相芯片检测读取的中位荧光值(MFI)确定最佳杂交时间。在保证其他条件不变的情况下，将杂交时间设定为5min、10min、15min、20min和30min，以确定最佳杂交时间。检测时空白对照的MFI值符合杂交检测判定结果的要求，检测结果可信。杂交信号值结果如图9所示，各病毒最佳杂交时间均为30min，因此最终将最佳杂交时间确定为30min。
实施例8特异性试验
利用所建立的五重液相芯片检测方法，对经多重不对称PCR扩增后的各病毒重组质粒扩增产物与偶联了微球的探针进行杂交检测，检验该检测方法的特异性。结果显示，所建立的五重液相芯片检测方法可以特异性的检测出对应的5种病毒重组质粒，相互之间没有交叉反应，具有良好的特异性(图10)。使用普通PCR单独对每个病毒对应的引物扩增的产物进行电泳鉴定，发现各病毒引物所检测出对应的病毒质粒条带单一，无杂带，且对其他几种病毒重组质粒的扩增无条带，显示特异性良好(图11)。
实施例9敏感性试验
将各病毒重组质粒，用无菌水进行10倍倍比稀释后，ASFV、RVFV、FMDV、WNV以及PPRV 5种病毒重组质粒起始模板浓度分别为1.20ng/μL，1.08ng/μL，1.12ng/μL，1.17ng/μL，2.15ng/μL。以各稀释度作为模板进行多重不对称PCR扩增，分别按两种不同的多重不对称PCR体系进行，(1)一种为用实施例3中各病毒的上、下游引物的体系进行，(2)另一种为用引物比例WNV上、下游引物比例为1:4，其他病毒为1:5的体系进行，然后对各组PCR产物进行杂交检测，比较两者检测的灵敏度。根据液相芯片检测结果判定标准，按(1)进行多重不对称PCR的检测结果，ASFV、RVFV、FMDV、WNV以及PPRV 5种病毒最低检出量分别为1.20×10- 6ng/μL，1.08×10-6ng/μL，1.12×10-6ng/μL，1.17×10-7ng/μL，2.15×10-6ng/μL，结果如表4所示；按(2)进行多重不对称PCR的检测结果，ASFV、RVFV、FMDV、WNV以及PPRV 5种病毒最低检出量分别为1.20×10-5ng/μL，1.08×10-4ng/μL，1.12×10-5ng/μL，1.17×10-6ng/μL，2.15×10-6ng/μL，结果如表4’所示。(1)方法比(2)方法敏感性提高了1-100倍。(1)方法与使用普通PCR单独对每个病毒对应的引物扩增的敏感性比较(图12)，提高了约100倍。
表4 ASFV、RVFV、FMDV、WNV和PPRV液相芯片敏感性试验检测结果
表4’ASFV、RVFV、FMDV、WNV和PPRV液相芯片敏感性试验检测结果
实施例10样品的检测
利用建立的五重液相芯片检测方法对来自养殖场及边境地区的265份样品进行了检测。首先，使用Axygen病毒DNA/RNA提取试剂盒对采集的样品同时进行DNA和RNA的提取。利用TaKaRa反转录试剂盒对提取的病毒核酸样品进行反转录，获得含有DNA和cDNA的检测样品。对检测样品进行多重不对称PCR扩增，扩增产物与偶联了微球的探针进行杂交检测(027#-FMDV，036#-PPRV，043#-RVFV，055#-WNV，063#-ASFV)。然后在已经预热到54℃的Bio-Plex悬浮芯片检测仪上读取样品的中位荧光值(MFI)。根据样品的中位荧光值(MFI)读数来进行结果判定。结果检出PPRV阳性样品19份，其余病毒检测结果均呈阴性，见表5。以普通PCR对265份样品进行重复检测，结果检出PPRV阳性样品17份，其余病毒检测结果为阴性，见表6。经比较，液相芯片检测方法比普通PCR检测方法多检出的2份阳性样品，经测序鉴定，这2份样品为PPRV样品，表明液相芯片检测方法优于普通PCR方法，可以检出普通PCR难以检出的样品类型。
表5多重液相芯片样品检测结果
表6普通PCR检测结果
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (6)
1.一种同时检测ASFV、PPRV、WNV、RVFV和FMDV五种病毒的多重液相芯片检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由多重不对称PCR扩增引物以及分别包被有特异性检测探针的荧光微球组成，其中包被有特异性检测探针的荧光微球由以下序列特异的探针在5’端经过C12臂氨基化（NH2（CH2）12）修饰并与磁性微球偶联得到，探针序列如下所示：
ASFV Probe：NH2(CH2)12-CAAACCCTACTGGAACATAAGGCT；
PPRV Probe：NH2(CH2)12- TCAAAGATCGGCCGAGGCACTCTTC；
WNV Probe：NH2(CH2)12-TGAAGGGAACAACCTATGGCGTCTG；
RVFV Probe：NH2(CH2)12-ATGCTGTAGTTCCAAACTCAGCC；
FMDV Probe：NH2(CH2)12- TAACGACCGTCCCCGGTTGAAAC；
所述多重不对称PCR扩增引物为分别针对各探针上、下游序列设计的特异性引物，并且在下游引物5’端进行生物素（Biotin）标记，引物序列如下所示：
ASFV-F：GABGAATGACAYGCACCCA；
ASFV-R：Biotin- GGCCCAAGACTTGCTKAATAGC；
PPRV-F：GAGCTATGCGRTGGGTGTC；
PPRV-R：Biotin-TGCAGKCTRAAGAGTGCC
WNV-F：ACTCAGGCAGGGAGATTC；
WNV-R：Biotin-TGAACARACGCCATAGGT；
RVFV-F：CTTCGACCTRAGCTCTACYAGA；
RVFV-R：Biotin-ATGCTRGGRAGTGATGAG；
FMDV-F：GGTCTAGCCCTRGTGTYGC；
FMDV-R：Biotin-CAGTTGTCAGYCTRRWGGAGG。
2.根据权利要求1所述一种同时检测ASFV、PPRV、WNV、RVFV和FMDV五种病毒的多重液相芯片检测试剂盒，其特征在于，所述多重不对称PCR扩增引物中，WNV最佳上、下游引物比例为1:10，其他病毒最佳上、下游引物比例为1:20。
3.权利要求1所述同时检测ASFV、PPRV、WNV、RVFV和FMDV五种病毒的多重液相芯片检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
设计出了针对ASFV p72基因、PPRV N蛋白基因、WNV E蛋白基因、RVFV S片段基因和SATFMDV5’UTR基因保守区域的特异性探针，并在探针上、下游分别设计特异性引物；
为提高检测的准确性，降低检测结果的假阴性，对上、下游引物部分碱基位点使用兼并碱基；
在探针的5’端进行C12臂氨基化（NH2(CH2)12）修饰，在下游引物5’端进行生物素（Biotin）标记；
选取不同编号的磁性微球分别与经过C12臂氨基化（NH2（CH2）12）修饰的PPRV、ASFV、WNV、RVFV以及FMDV探针进行偶联。
4.权利要求1所述一种同时检测ASFV、PPRV、WNV、RVFV和FMDV五种病毒的多重液相芯片检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
获得含有DNA和cDNA的检测样品，采用多重不对称PCR扩增引物对检测样品进行多重不对称PCR扩增；
扩增产物与包被有特异性检测探针的荧光微球进行杂交检测；
在已经预热的Bio-Plex悬浮芯片检测仪上读取样品的中位荧光值（MFI），根据样品的中位荧光值（MFI）读数来进行结果判定。
5.根据权利要求4所述一种同时检测ASFV、PPRV、WNV、RVFV和FMDV五种病毒的多重液相芯片检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤（2）中扩增产物与包被有特异性检测探针的荧光微球进行杂交检测，杂交时间为30分钟，杂交温度为54℃。
6.根据权利要求4所述一种同时检测ASFV、PPRV、WNV、RVFV和FMDV五种病毒的多重液相芯片检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤（3）中Bio-Plex悬浮芯片检测仪的预热温度为54℃。
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