CN114182027B - 一种基于熔解曲线技术的动物源性成分通用筛检试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于熔解曲线技术的动物源性成分通用筛检试剂盒及检测方法，涉及分子生物学检测技术领域。本发明针对9种畜禽动物基因组中具有特定结构特征的基因片段，设计了通用型引物及分子信标荧光探针组合物。以待测样品的基因组DNA为模板，应用本发明所公布的试剂盒及方法进行实时荧光PCR检测及熔解曲线分析，通过比对受检样品熔解峰形状及对应的特征熔解温度(Tm值)，实现单管条件下对9种畜禽动物源性成分的快速鉴定。本发明体系构成简单、应用成本低、灵敏度高、特异性强、适用性好，可用于食品、饲料等样品中动物源性成分的快速筛检和掺杂制假鉴定。

Description

一种基于熔解曲线技术的动物源性成分通用筛检试剂盒及检 测方法

技术领域

本发明涉及一种基于熔解曲线技术的动物源性成分通用筛检试剂盒及检测方法，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

畜禽肉及其制品因风味鲜美、营养丰富，一直以来都是居民日常膳食构成中重要的品类之一，而其食品安全对保障消费者权益具有重要意义。由于畜禽肉及其制品的生产成本高且市场消费需求大，掺杂制假成为当前肉类食品存在的主要食品安全问题之一，与之相关的重大食品安全事件近年来在国内外屡有报道。这类违法欺诈制销行为在给消费者造成经济损失的同时，其掺杂肉类原料的不明来源也难以避免的造成一定的健康危害。肉类食品尤其是深加工产品在色、香、味、形及口感等性状方面极为相近，难以用感官鉴定方法对其成分来源进行直接区分，这也成为食品质量安全检验检测技术领域的一项难题。探索和研发高效便捷、灵敏特异、成本合理的肉类食品源性成分快速鉴定方法，对于筑牢抵御食品欺诈行为的技术防线，有效防范行业性食品安全风险，提高肉类食品安全监管和消费保障能力具有重要的应用价值和现实意义。

当前，关于食品、饲料等样品中动物源性成分实验室鉴定方法的研究已有一定报道，在技术层面主要通过检测具有种属特异性的生物标志物(蛋白质或基因)，从而达到鉴定和区分样品种属来源的目的。相对于蛋白质检测技术而言，基因鉴定因其靶分子具有更好的稳定性、多样性，在同一个体中不存在组织间表达差异性，同时，依靠PCR技术指数级扩增效应可对微量样品进行准确检测，灵敏度和特异性大幅度提升，成为当前动物源性成分鉴定方法中最常用的检测技术，目前我国已颁布实施的食品安全标准中也建立了以动物特异性基因为检测对象、基于探针杂交技术或测序技术的标准检测方法。但值得关注的是，目前常用的基因鉴别方法多采用“一对一”检测模式，即针对一种动物种属，设计和使用一组特异性引物和探针。为达到多重鉴定目的，往往需进行多次实验或采用多重引物及探针组合物的检测方法，工作量大、体系组成复杂，竞争干扰大，鉴定成本高。基因芯片技术虽具有快速高效的多重检测能力，但由于需要专业设备和专用商品化试剂，应用成本高，在食品检验检测领域尚未广泛普及。亦有已公开的检测技术采用通用型引物联合高分辨熔解曲线方法实现多重鉴定目标，但该类技术对检测设备具有特殊要求，适用性较为局限。

分子信标是基于荧光共振能量转移原理设计的双标签寡核苷酸链探针，通过独特的茎-环结构设计，与靶基因杂交后，可通过荧光检测实现对模板的定性鉴定及定量分析，具有灵敏度高、特异性好等优点。同时，由于其独特的构象设计，可通过熔解曲线分析区分杂交分子中基因错配情况，因此，也常被应用于基因突变的检测。本发明以动物基因组极为广泛的异质性为应用基础，基于分子信标熔解曲线技术路线，通过对9种常见畜禽动物线粒体基因组多重比对和特征筛选，设计和应用一对通用引物及一根具有广泛错配分辨能力的分子信标探针，建立一种基于实时荧光PCR和熔解曲线分析技术、适用于食品及饲料中常见畜禽动物源性成分快速鉴定的基因检测方法。该方法简便经济、灵敏高效、易于推广，对拓展动物源性鉴定技术可用范畴、提高肉类食品真伪筛查效能具有重要的实用价值。

发明内容

本发明的目的为克服现有鉴定技术存在的不足和局限，提供一种可用于快速鉴别食品中猪、黄牛、山羊、驴、马、骆驼、狗、鸡和鸭等9种畜禽动物源性成分的检测组合物，该检测试剂组合物灵敏度高、特异性好。

在一种实施方式中，所述检测组合物包括以下通用引物和分子信标探针：

所述通用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的通用上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的通用下游引物；

分子信标探针：

5’-ccgCCCACTTGTTCTCCAAATAAGGACTTGTATGAATGGCCACACGAGGGcgg-3’(SEQ IDNO.3)。

在一种实施方式中，所述分子信标探针的5’端修饰有荧光报告基团，探针的3’端修饰有淬灭基团。

在一种实施方式中，所述报告基团选自但不限于FAM、HEX、JOE、CY3、CY5，所述淬灭基团选自但不限于DABCYL、TAMRA、BHQ。

本发明的另一目的是提供含有上述检测组合物的实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒简便经济、不易污染、准确稳定。

在一种实施方式中，所述试剂盒中还含有猪、黄牛、山羊、驴、马、骆驼、狗、鸡和鸭的标准品。

在一种实施方式中，所述标准品是以猪、黄牛、山羊、驴、马、骆驼、狗、鸡或鸭的基因组DNA为模板，利用上述通用引物扩增得到基因片段，并将基因片段构建至载体上形成重组质粒。

在一种实施方式中，所述载体包括但不限于pEASY-T1。

在一种实施方式中，所述试剂盒的反应体系为1μL DNA提取液作为模板，加入通用上、下游引物、分子信标探针、qPCR反应试剂和ROX参比染料(根据qPCR机型选用)，超纯水补足至20μL。

在一种实施方式中，所述qPCR反应试剂包括PCR缓冲液(含[Mg²⁺])、dNTPs和Taq酶，或超纯水构成的2×qPCR预混液。

在一种实施方式中，所述试剂盒的反应体系为2×qPCR预混液10μL，通用上、下游引物各0.4μL，分子信标探针0.4μL，50×ROX参比染料0.2μL，超纯水补足至20μL。

在一种实施方式中，所述通用上、下游引物的在反应体系中的终浓度为0.1μM-1.0μM，分子信标在反应体系中的终浓度为0.05μM-1.0μM。

在一种实施方式中，所述试剂盒在实时荧光PCR的扩增程序为95℃预变性30s，95℃变性5s、50℃复性20s并采集荧光信号、72℃延伸10s，共45个循环。

在一种实施方式中，所述试剂盒的熔解曲线分析程序为待PCR扩增反应结束后，将反应体系升温至95℃持续1min，降温至40℃持续5min，随后以每步0.2℃升温速率缓慢递增至85℃，同步采集荧光。

本发明应用通用型引物及分子信标探针组合物，建立了一种基于实时荧光PCR检测及熔解曲线分析技术，可同时鉴别食品及饲料中9种畜禽动物源性成分的快速基因筛检方法。实现该技术目标的关键在于通用引物及具有错配分辨能力的通用分子信标探针组合物的设计和优化。线粒体基因组具有高拷贝数、高异质性、稳定易检测等特点，是物种鉴定常选用的靶基因之一。本发明应用通用型引物及探针组合物对动物DNA样品进行扩增和荧光检测，各种属来源的杂交分子因熔解温度(Tm值)存在显著差异，通过熔解曲线图谱中相应的特征熔解峰可进行区分和鉴别。

本发明提供的包含上述通用引物及分子信标探针组合物、阳性对照标准基因的动物源性成分通用筛检试剂盒，还包括实时荧光PCR检测所需试剂：qPCR反应试剂、ROX参比料、超纯水。

在一种实施方式中，所述qPCR反应试剂包括PCR缓冲液(含[Mg²⁺])、dNTPs和Taq酶，或超纯水构成的2×qPCR预混液。

本发明的另一目的是提供一种基于分子信标熔解曲线分析技术的动物源性成分快速筛检方法，该方法简便高效、适用性好。所述方法包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)利用上述检测组合物进行实时荧光PCR扩增；

(3)熔解曲线分析。

在一种实施方式中，本领域技术人员可以按照现有已公开技术方法或商品化试剂盒提取待测样品的基因组DNA，该操作易于实现。

在一种实施方式中，所述样品可为生鲜肉及肉类加工品。

在一种实施方式中，所述实时荧光PCR的反应体系为1μL DNA提取液作为模板，加入通用上、下游引物、分子信标探针、qPCR反应试剂和ROX参比染料(根据qPCR机型选用)，超纯水补足至20μL。

在一种实施方式中，所述qPCR反应试剂包括PCR缓冲液(含[Mg²⁺])、dNTPs和Taq酶，或超纯水构成的2×qPCR预混液。

在一种实施方式中，所述通用上、下游引物的在反应体系中的终浓度为0.1μM-1.0μM，分子信标在反应体系中的终浓度为0.05μM-1.0μM。

在一种实施方式中，所述实时荧光PCR的扩增程序为95℃预变性30s，95℃变性5s、50℃复性20s并采集荧光信号、72℃延伸10s，共45个循环。

在一种实施方式中，所述步骤(3)的熔解曲线分析程序为待PCR扩增反应结束后，将反应体系升温至95℃持续1min，降温至40℃持续5min，随后以每步0.2℃升温速率缓慢递增至85℃，同步采集荧光；以荧光信号强度对温度的一阶负导数为纵坐标(-Rn’)、以温度为横坐标，绘制熔解曲线。

在一种实施方式中，所述检测方法的结果判定方法为：9种畜禽动物基因扩增产物与分子信标形成的杂交分子均具有特异的熔解温度(Tm值)，在熔解曲线图上反映为具有该Tm值的特征性熔解峰，当受检样品熔解峰对应的Tm值与上述9种畜禽动物种属的特征Tm值一致，可直接获知受检样品对应的动物种属；当受检样品熔解峰对应的Tm值与9种动物种属特征Tm值均不匹配，表明受检样品可能含有2种及以上动物源性成分或样品来源为9种畜禽动物种属之外。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明提供一种基于熔解曲线分析技术的动物源性成分通用筛检组合物、试剂盒及检测方法。充分利用丰富的生物基因组多样性资源，以猪、黄牛、山羊、驴、马、骆驼、狗、鸡鸭为对象，以其线粒体基因组16s rDNA中具有特定结构特征的基因序列为标靶，设计和优选通用引物和分子信标探针组合物。基于各种属来源的目标片段与分子信标所形成杂交分子在热动力学属性方面的显著差异，采用实时荧光PCR和熔解曲线分析方法，根据熔解峰形状及特征Tm值比对，实现对样品动物源性的快速鉴定。

2、本发明提供的试剂盒及检测方法充分发挥了分子信标技术灵敏度高、特异性好的优势，采用单管封闭操作，避免了外源基因污染。应用优化筛选的通用引物和探针组合，检测体系构成简单，成本经济，稳定性好，可以检测不同加工类型的肉制品，灵敏便捷，DNA浓度在10¹-10⁸copies/μL范围内都能有效检出，并且有效避免了常规多重检测方法中多组引物及探针间竞争干扰大、灵敏度低、检测条件优化难等技术难题。

3、基于分子信标对靶序列的错配兼容能力，形成Tm值分布广泛且易于辨识的特征熔解峰，结果判定不依赖于高分辨熔解曲线分析，检测设备普及率高，方法适用性好，易于在各级食品安全检验检测实验室推广和应用。

附图说明

图1为本发明设计的3对引物PCR产物电泳检测图，其中，图(a)、图(b)、图(c)分别为引物对FP和RP、FP-2和RP-2、FP-3和RP-3的PCR产物电泳检测图。

图2为本发明设计的2根分子信标探针样品检测结果图，其中，图(a)和图(b)为分子信标探针MB-P检测9种畜禽动物DNA样品实时荧光PCR和熔解曲线检测图；图(c)和图(d)为分子信标探针MB-P2检测9种畜禽动物DNA样品实时荧光PCR和熔解曲线检测图。

图3为检测梯度稀释猪DNA模板实时荧光PCR扩增图(图a)和熔解曲线分析图(图b)。

图4为检测不同猪肉制品熔解曲线分析图。

图5为检测混合样品熔解曲线分析图，其中，图(a)为猪源性与鸡源性不同比例混合样品检测结果图，图(b)为猪源性、牛源性及羊源性等比例混合样品检测结果图。

具体实施方式

以下参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述，以便于本领域技术人员更好的理解本发明。

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。

实施例1：通用引物及分子信标组合物的设计和优选

1.从美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因组数据库下载本发明所述试剂盒可鉴定的9种畜禽动物线粒体基因组序列，作为通用引物、分子信标探针设计及样品种属鉴定的参考依据，包括：猪(Sus scrofa)NC012095、黄牛(Bos taurus)NC006853、山羊(Caprahircus)NC005044、驴(Equus asinus)NC001788、马(Equus caballus)NC001640、骆驼(Camelus bactrianus)NC009628、狗(Canis lupus familiaris)NC002008、鸡(Gallusgallus)NC001323、鸭(Anas platyrhynchos)EU755252。

2.设计和优选具有多重鉴别能力的通用引物及分子信标探针组合物，靶基因序列筛选原则及方法为：(1)序列大小在200bp左右，满足实时荧光PCR检测效率需求。(2)应用多序列比对等生物信息学技术在猪、黄牛、山羊、驴、马、骆驼、狗、鸡、鸭等9种畜禽动物源性参考序列中筛选具有“保守区-高变区-保守区”特定结构特征的目标序列。在此结构中，靶序列两端“保守区”序列为引物结合区，要求序列在种属间保守；靶序列中段的“高变区”作为分子信标结合区，具有种间特异、种内保守的特质。(3)以靶序列为模板，应用Primer等软件及在线分析工具设计和优选通用引物和探针组合物。通用引物经NCBI BLAST在线比对，进行特异性评估，分子信标应用Mfold和UNAFold应用程序进行构象及杂交特性分析，通过预测Tm值分布情况及实样检测，优选可有效分辨各种属源性基因的通用分子信标探针。基于上述原则及方法，设计通用引物及分子信标探针如下：

(1)通用引物：设计的通用引物主要包括：

引物对一：以nt2863-nt3089片段(参考序列NC012095)为目标序列，

上游引物(FP)：5’-AACCCCGCCTGTTTACCAA-3’；

下游引物(RP)：5’-TTTTATTCCCGCCTCTTCA-3’；

引物对二：以nt2841-nt3117片段(参考序列NC012095)为目标序列，

上游引物(FP-2)：5’-TAAAAGGAACTCGGCAAACA-3’；

下游引物(RP-2)：5’-TAAAAGGAACTCGGCAAACA-3’；

引物对三：以nt1786-nt2003片段(参考序列NC012095)为目标序列，

上游引物(FP-3)：5’-GGATTAGATACCCCACTATGCT-3’；

下游引物(RP-3)：5’-AGGGTTTGCTGAAGATGGC-3’；

在生物信息学分析评价基础上，应用PCR及测序分析，检验通用引物特异性及扩增效率。

(2)分子信标探针设计

以引物对一扩增序列设计的两根探针，其杂交片段序列分别为：

探针一：5’-CACTTGTTCTCCAAATAAGGACTTGTATGAATGGCCACACGAGGG-3’

探针二：5’-GGCACTGCCTGCCCAGTGACACCAGTTTAACGGCCGCGG-3’

应用Mfold及UNAFold在线程序对探针的检测效能进行评价。

(3)通用引物及分子信标探针组合物优选

以9种畜禽动物基因组DNA为模板，应用3对引物分别进行PCR扩增，图1展示了三对引物扩增产物电泳结果，其中，引物对一扩增产物条带单一、片段大小与预期相符、经测序鉴定后与各参考序列完全一致(图1a)，扩增效率为99.7％(R²＝0.99，荧光染料qPCR法检测)；引物对二虽扩增产物条带单一、片段大小与预期相符(图1b)，但在相同反应条件下，扩增效率仅有90.5％(R²＝0.96，荧光染料qPCR法检测)，显著低于引物对一；引物对三扩增产物条带复杂，特异性弱(图1c)。由此，将引物对一作为通用引物优选对象。

根据引物对一靶序列设计的两根分子信标，经生物信息学技术评价，预测Tm值如下表：

表1预测的Tm值

为实现对9种畜禽动物种属的有效鉴别，分子信标探针与各类源性基因形成的杂交分子需具有显著差异的Tm值分布，且差值满足常规荧光PCR仪分辨率要求。由表1可见，探针二所形成的多种杂交分子存在黄牛、驴和马的Tm值重合现象，无法有效区分；与之相比，探针一与各种属源性靶基因杂交后，各类产物Tm值间差异显著，具有更好的辨识度，可用作通用型分子信标。

基于以上分析及评价，确定引物对一FP和RP(核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示)和探针一MB-P(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)作为通用型引物-探针组合的优选方案。

实施例2：畜禽肉样品检测

应用本发明所提供的包含通用引物和探针组合物的检测试剂盒，采用实时荧光PCR及熔解曲线分析，检测9种畜禽生鲜肉样品。

1.实验材料：生鲜猪肉、黄牛肉、山羊肉、驴肉、马肉、骆驼肉、狗肉、鸡肉、鸭肉，样品采购于超市或网络平台，均经过《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》(GB/T38164-2019)等标准方法鉴定及序列比对分析，种属来源明确。

2.试剂和设备：食品基因组提取试剂盒及探针法qPCR检测试剂均采用商品化通用型试剂盒；荧光定量PCR仪为Thermo Fisher公司AB ViiA^TM7型。本发明试剂盒提供的通用引物和分子信标探针组合委托生物公司合成。根据分子信标探针常规设计原则，为考察探针长度对检测能力的影响，在探针MB-P(核苷酸序列如SEQ ID NO3所示)基础上，以覆盖9种源性基因“高变区”错配位点为前提，设计并合成了常规类型的分子信标探针(MB-P2)。两根分子信标探针分别为：

MB-P：

5’-FAM-ccgCCCACTTGTTCTCCAAATAAGGACTTGTATGAATGGCCACACGAGGGcgg-DABCYL-3’；

MB-P2：

5’-FAM-ccgCCGCCAAATAAGGACTTGTATGAATGGcgg-DABCYL-3’。

上述探针序列中大写字符区域为探针与靶序列杂交区。

3.检测方法：

(1)样品DNA提取：样品肌肉组织经磁珠研磨均质后，取100mg均质样品，使用商品化的通用型食品基因组提取试剂盒提取DNA，使用微量紫外分光光度计检测DNA样品的浓度和纯度。

(2)实时荧光PCR：取1μL样品DNA(10ng/μL)，加入检测试剂构成20μL反应体系，包括：2×qPCR预混液10μL，上、下游通用引物FP和RP各0.4μL(终浓度为0.1μM-1.0μM)，分子信标探针0.4μL(终浓度为0.05μM-1.0μM)，50×ROX参比染料0.2μL(终浓度为0.5×)，超纯水7.6μL。

实时荧光PCR检测反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s、50℃复性20s并采集荧光信号、72℃延伸10s，共45个循环。

(3)熔解曲线分析：待PCR扩增反应结束后，将反应体系升温至95℃持续1min，降温至40℃持续5min，随后以每步0.2℃升温速率缓慢递增至85℃，同步采集荧光。以荧光信号强度对温度的一阶负导数为纵坐标(-Rn’)、以温度为横坐标，绘制熔解曲线。熔解峰中最高点对应温度即为该样品Tm值。

(4)阳性对照实验：为提高检测结果判定的准确性，本发明提供了基于分子克隆技术构建的9种畜禽动物标准基因阳性对照。以所需标准基因作为模板，采用上述相同的反应体系和检测条件进行实时荧光PCR扩增和熔解曲线分析。通过比对标准基因Tm值与待测样品Tm值的符合程度，准确判定样品种属来源。

4.结果分析：图2展示应用两根探针的检测结果。应用探针MB-P对9种畜禽动物DNA进行实时荧光PCR检测，扩增曲线良好(见图2a)，表明扩增反应有效；熔解曲线分析可见各样品熔解峰单一且独立(见图2b)。经检测，本试剂盒可鉴定的9种畜禽动物源性特征Tm值(实测值)分别为：猪(68.0℃)、黄牛(64.3℃)、山羊(65.1℃)、驴(65.8℃)、马(63.4℃)、驼(60.6℃)、狗(61.8℃)、鸡(52.6℃)、鸭(56.7℃)。实测值虽与预测值间存在一定差异，但满足荧光PCR仪分辨率需求，可以实现对各源性成分的有效鉴别。

应用常规型分子信标MB-P2检测9种畜禽动物DNA，部分种属来源模板未见有效的扩增曲线(图c)，这可能是由于常规型分子信标MB-P2对模板中多位点错配的兼容能力相对较弱所致；熔解曲线图可见各种属样品熔解峰杂乱、Tm值聚集，不易辨识和区分(图2d)。

实施例3：灵敏度及特异性实验

1.检测样品及方法：以猪源性标准品为待检测样品，10倍梯度稀释至模板终浓度为10¹-10⁸copies/μL，采用本发明所建立20μL反应体系及检测条件，进行实时荧光PCR检测及熔解曲线分析，检验灵敏度和特异性。

2.结果分析：根据图3所展示的梯度稀释猪标准DNA模板检测结果可见，在10¹-10⁸copies/μL模板浓度下，实时荧光PCR反应扩增曲线良好，Ct值在15～35区间(图3a)，与模板起始浓度呈良好的线性关系(R²＝0.99)，表明本发明提供的通用引物-分子信标探针组合具有良好的检测灵敏度。

当扩增曲线Ct值>35时，提示样品中可能不含9种畜禽动物源性成分，或因样品DNA提取质量不佳等原因导致实验失败，需重新进行实验。熔解曲线分析可见，随着模板浓度的降低，熔解峰高逐步下降，但各浓度样品Tm值聚集在68.0±0.1℃(图3b)，表明在不同模板浓度下，杂交分子熔解温度的检测结果能够保持良好的稳定性。在此检测精度下，根据9种畜禽动物特征Tm值间的差异水平，能够实现对单一来源样品的特异性鉴别。

实施例4：肉制品检测

1.检测样品及方法：以生鲜猪肉及不同加工处理的猪肉制品为检测样品，应用本发明所提供试剂盒及检测方法进行实时荧光PCR检测及熔解曲线分析，检验本发明试剂盒对不同肉制品的鉴定效果。

2.结果分析：食品深度加工工艺可造成食材中DNA的断裂和降解，影响基因检测效能。由图4可见，采用本发明所提供检测方法，生鲜猪肉及6种不同加工处理的猪肉制品熔解峰单一独立，Tm值稳定集中，表明本发明试剂盒适用于各类肉制品的检测和鉴定。

实施例5：混合样品检测

1.检测样品及方法：在猪源性DNA样品中按比例掺入其他畜禽动物源性DNA样品，制成混合基因模板，采用本发明试剂盒所提供反应体系及检测条件，进行实时荧光PCR检测及熔解曲线分析，检验本发明试剂盒对混合样品的鉴定效果。

2.结果分析：由图5a可见，猪源性与鸡源性混合样品经熔解曲线检测，两种源性基因均形成独立的熔解峰，对应的Tm值与其特征Tm值一致，熔解峰高随着样品所占比例的增加而相应增高。由图5b可见，等比例混合的猪、牛、羊三种源性基因混合样品经熔解曲线分析，未见形成相应的独立特征熔解峰，而在各源性基因特征Tm间的温度区域内形成新的融合峰，该融合峰较单一源性熔解峰相比温度跨度更宽，且可形成非特异性峰脊，此现象可能与混合样品中各源性基因特征Tm值相近以及常规荧光PCR仪分辨率相关。以上结果表明，应用所建立检测体系可对肉类食品动物源性成分进行筛查，当熔解曲线图谱中形成2处以上种属特征熔解峰或新生融合峰(熔解峰偏移现象)，指示样品中可能存在异源性基因。在食品安全抽检监测工作中，应用本发明进行样品高通量快速筛选，可为进一步采用国标方法进行确证鉴定提供指征。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁波市产品食品质量检验研究院（宁波市纤维检验所）

<120> 一种基于熔解曲线技术的动物源性成分通用筛检试剂盒及检测方法

<130> BAA211898A

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaccccgcct gtttaccaa 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttttattccc gcctcttca 19

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccgcccactt gttctccaaa taaggacttg tatgaatggc cacacgaggg cgg 53

Claims (7)

1.一种快速鉴别动物源性成分的检测组合物，其特征在于，包括通用引物和分子信标探针；所述通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，分子信标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述分子信标探针的5’端修饰有荧光报告基团，探针的3’端修饰有淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的检测组合物，其特征在于，所述报告基团选自但不限于FAM、HEX、JOE、CY3、CY5，所述淬灭基团选自但不限于DABCYL、TAMRA、BHQ。

3.一种基于熔解曲线技术的动物源性成分通用筛检试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的检测组合物。

4.根据权利要求3所述的动物源性成分通用筛检试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有猪、黄牛、山羊、驴、马、骆驼、狗、鸡和鸭的标准品。

5.根据权利要求4所述的动物源性成分通用筛检试剂盒，其特征在于，所述标准品是以猪、黄牛、山羊、驴、马、骆驼、狗、鸡或鸭的基因组DNA为模板，利用权利要求1或2所述的通用引物扩增得到基因片段，并将基因片段构建至载体上形成重组质粒。

6.根据权利要求3~5任一项所述的动物源性成分通用筛检试剂盒，其特征在于，包括反应体系，所述反应体系为以1 μL 待测样品的基因组DNA提取液作为模板，加入权利要求1或2所述的检测组合物、qPCR反应试剂、ROX参比染料和超纯水。

7.一种基于分子信标熔解曲线分析技术的动物源性成分快速筛检方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（2）利用权利要求1或2所述检测组合物进行实时荧光PCR扩增；

（3）熔解曲线分析；

所述方法用于非疾病诊断的目的；

所述检测方法的结果判定方法为：9种畜禽动物基因扩增产物与分子信标形成的杂交分子均具有特异的熔解温度，在熔解曲线图上反映为具有该Tm值的特征性熔解峰，当受检样品熔解峰对应的Tm值与所述9种畜禽动物种属的特征Tm值一致，可直接获知受检样品对应的动物种属；当受检样品熔解峰对应的Tm值与9种动物种属特征Tm值均不匹配，表明受检样品可能含有2种及以上动物源性成分或样品来源为9种畜禽动物种属之外；

所述9种畜禽动物种属为猪、黄牛、山羊、驴、马、骆驼、狗、鸡和鸭。

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