CN104928387A - 同时检测多种动物源性成分的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测多种动物源性成分的试剂盒及其应用，采用荧光引物复扩和毛细管电泳方法结合，能同时检测12种动物源性成分，选择犬、牛、羊、鱼、猪、鸭、鸡、兔、猫、马、鼠的STR序列和大肠杆菌设计多组特异性引物。所述特异性引物由犬PEZ1、牛BM2113、羊MAF33、鱼HLJ392、猪SW742、鸭CAUD056、鸡MCW248、兔Sat7、猫FCA955、马HMS3、鼠cds和大肠杆菌CFS073组成。具有特异性好，灵敏度好，可以较快速的鉴定肉类的源性，且由于复扩系统中包含大肠杆菌的引物，可以同时鉴定肉类食品和制品是否存在大肠杆菌污染。
Description
技术领域
本发明涉及动物分子生物学领域,具体涉及同时检测多种动物源性成分的试剂盒及其应用。
技术背景
随着市场经济的不断发展，一些不法商贩为了谋取不正当的利益，在血制品、肉制品中掺杂一些价格便宜的肉种甚至有挂羊头卖狗肉的行为存在。有调查研究表明，这种掺假的现象在市场上已经普遍存在，大部分肉制品中都掺有相对比较便宜的肉种，甚至全部是价格便宜的肉种，这极大的损害了消费者的利益，扰乱了市场秩序，危害市民的健康。
并且口蹄疫、疯牛病、禽流感、羊瘙痒病等动物源传染病频发，疫情区域内的动物源性成分鉴别显得尤为重要；为了防止疫情扩散，维护广大消费者的切身利益，也需要一种快速有效的动物源性监测方法。
但是，因血制品和肉类的同源性因此难以直接分辨，目前已有的动物源性成分鉴别方法都存在一定的缺陷（显微检测方法：难以区分动物源性、免疫学检测方法：工艺繁琐及灵敏特异性低、近红外光谱检测方法：需要大量有权威性的标准样品、实时荧光定量检测方法通量低且容易出现假阳性）。目前检测监测机构没有一种快速有效的检测方法，对肉制品中的动物源性成分做出鉴定，致使此类现象难以判断和裁决。为了规范市场秩序，维护消费者的正当权力和利益，保证市场竞争的公正性，急需一种快速全面准确的检测方法来判断此类现象。
大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌。其食品卫生学意义是作为食品是否被粪便污染的指示菌，广泛被我国和国外许多国家应用于食品卫生质量检验。虽然肠道致病菌是引起食物中毒的主要来源，但由于大肠杆菌与致病菌的来源相同，只要食品检出大肠杆菌，说明有粪便污染，被认为不卫生。本发明，包含11对不同动物来源的特异性引物，并包含一对大肠杆菌引物作为血液、血制品及肉类，肉制品是否有粪便污染的现象存在。
专利201310082539.1和201310368498.2提供的检测系统仅可检测1种和4种肉类源性，适用范围有很大的限制。
微卫星（Microsatellite），又称简单序列重复（Simple sequencerepeats,SSR），是指少数几个核苷酸（一般为1-6个）为重复单位组成的简单多次串联重复序列，其长度大多在100bp以内。由于微卫星具有高度的多态性,在基因组中含量丰富且分布均匀等优点，而且微卫星DNA所在区域在生物的基因组中是比较保守的，某一物种的微卫星引物可在相关密切的物种中使用，因此微卫星标记技术的应用非常广泛。STR位点相对线粒体细胞色素氧化酶b（Cytb）物种间的特异性更加好，扩增特异性较好，在样本浓度高时，依然可以做到特异性较高，避免了Cytb序列物种间序列高度相似，无法复合扩增及高浓度样本易出现假阳性结果的缺陷。
毛细管电泳检测具很高的灵敏度，最低可检测31-62.85pg的基因组DNA，相当于10-20个拷贝的人类基因组。并且可同时检测的位点数量比实时荧光定量检测多，通量更高。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时检测多种动物源性成分的试剂盒及其应用，采用荧光引物复扩和毛细管电泳方法结合，快速有效的对动物源性成分检测，可以同时检测犬、牛、羊、鱼、猪、鸭、鸡、兔、猫、马、鼠和大肠杆菌的动物源性成分。
本发明采用的技术方案：
在12种种属的序列STR保守区域设计12对特异性引物分别扩增犬（PEZ1）、牛（BM2113）、羊（MAF33）、鱼（HLJ392）、猪（SW742）、鸭（CAUD056）、鸡（MCW248）、兔（Sat7）、猫（FCA955）、马（HMS3）、鼠（cds）和大肠杆菌（CFS073），检测样本DNA中是否含有这12种种属的DNA，实现同时鉴别样本多种动物源性成分的目的。
同时检测多种动物源性成分的试剂盒，该试剂盒包括12对用于检测动物源性成分的引物，所述特异性引物由犬（PEZ1）、牛（BM2113）、羊（MAF33）、鱼（HLJ392）、猪（SW742）、鸭（CAUD056）、鸡（MCW248）、兔（Sat7）、猫（FCA955）、马（HMS3）、鼠（cds）和大肠杆菌（CFS073）的特异性引物组成，所述引物序列及其浓度见表1。
表1 引物序列及浓度
| 编号 | 基因座 | 引物序列 | 引物浓度/μM |
| SQ1 | MCW248 | 5’- TTAGGTTGTTGTTCAAAAGAAGATGC -3’ | 0.1 |
| SQ2 | MCW248 | 5’- AGCTTATGCAGACAGCCCTACT-3’ | 0.1 |
| SQ3 | FCA955 | 5’- GACAGTTGGGTTTGGCACTT -3’ | 0.08 |
| SQ4 | FCA955 | 5’- TCATCTTTAAGGCCAAGATTCCAT -3’ | 0.08 |
| SQ5 | PEZ1 | 5’- GAATATCCTCCCCATGAAAGTCCT -3’ | 0.15 |
| SQ6 | PEZ1 | 5’- CCAGAAAAAGATCACAGAGATGGAG -3’ | 0.15 |
| SQ7 | MAF33 | 5’- TCATCTGAGTGTGAGTATATACAGAGAA -3’ | 0.2 |
| SQ8 | MAF33 | 5’- TTGTTTCAATCTATTCCAATTTCTCACT -3’ | 0.2 |
| SQ9 | cds | 5’- CATGGATCTGCTTAGGACTTCT -3’ | 0.15 |
| SQ10 | cds | 5’- GGAAGACATGATCCAAGTATGGTT -3’ | 0.15 |
| SQ11 | HLJ392 | 5’- CACCAGGCTACAAGGCAACA -3’ | 0.11 |
| SQ12 | HLJ392 | 5’- CACCAGGCTACAAGGCAACA -3’ | 0.11 |
| SQ13 | SW742 | 5’- TTCTACTTCTGGGGAGAGGG -3’ | 0.2 |
| SQ14 | SW742 | 5’- TTGGGAACATTTCTGCCTTAGT -3’ | 0.2 |
| SQ15 | Sat7 | 5’- GTAACCACCCATGCACACTC -3’ | 0.25 |
| SQ16 | Sat7 | 5’- CCAGCACAATACCTGGGATGTAG -3’ | 0.25 |
| SQ17 | CAUD056 | 5’- TCCATCTTAGGGAAATCAGGTCC -3’ | 0.18 |
| SQ18 | CAUD056 | 5’- TAGCATAAACTATTCAGAGCCAGC -3’ | 0.18 |
| SQ19 | HMS3 | 5’- TCAGTCAGAAGCTGCGAAC -3’ | 0.2 |
| SQ20 | HMS3 | 5’- AGCCCCAACTCTTTGTCACATAAC -3’ | 0.2 |
| SQ21 | BM2113 | 5’- GCTGCCTTCTACCAAATACCC -3’ | 0.1 |
| SQ22 | BM2113 | 5’- TCCTGAGAGAAGCAACACCT -3’ | 0.1 |
| SQ23 | CFT073 | 5’- GTTGTATATCGCCACCACGC-3’ | 0.1 |
| SQ24 | CFT073 | 5’-GTAAAGCCGAAGGTATATGTCAC-3’ | 0.1 |
所述的引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
优选的，所述的每个基因座对应的引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
优选的，将所述12个物种分组，具体为：第一组羊（MAF33）、鱼（HLJ392）、猪（SW742）、鸡（MCW248）、大肠杆菌（CFT073）、犬（PEZ1）
；第二组鸭（CAUD056）、鼠（cds）、兔（Sat7）、牛（BM2113）、马（HMS3）、猫（FCA955）；
每组引物采用蓝色荧光染料6-FAM、绿色荧光染料HEX、黄色荧光染料TAMRA或红色荧光染料ROX中任一种进行标记，且各组之间的标记色均不相同；内标选用橙色荧光标记，标记物为SIZ。
所述试剂盒的扩增体系如表2：
表2 PCR加样体系
| 组分 | 体积 |
| Reaction Mix | 10.0 μL |
| DNA模版 | 0.1～10ul含量为0.5ng～1ng |
| 引物混合物 | 5 μL |
| 热启动Taq酶（5U/ μL） | 0.5 μL |
| sdH2O | 补足至25.0μL |
其中所述的Reaction Mix为MgCl2 7.5mM，Tris-HCl buffer 125mM，KCl 125mM，dNTPs 7.5mM ，BSA 2mg/ml。其中DNA模版为待检测样品中提取的DNA，样品来源可为肉、肉制品、血、血制品。
复合扩增引物之间存在相互干扰，比如不同基因座引物形成二级结构、产生非特异扩增。复合扩增引物测试的加样体系如表2，扩增体系如表2。经过引物筛选之后最终确定了引物序列及引物浓度，如表1，引物扩增效率高，相互之间无非特异扩增。
所述的试剂盒在检测动物源性成分中的应用，包括如下步骤：
1）、取待检测样品，进行DNA的提取，提取的DNA作为DNA模版，样品来源可为肉、肉制品、血、血制品，
2）按表1中的引物及浓度配置引物混合物，PCR加样体系如表2；
3）将PCR扩增管置于热循环仪上，选择表3所示的扩增程序进行扩增；扩增后的样品应避光保存；
表3 热循环仪的扩增程序
4）扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔（0.5μl AGCU Marker SIZ-500（无锡中德美联生物技术有限公司））×（进样数）＋（12μl去离子甲酰胺）×（进样数）〕。将12.5μl上样混合物与PCR产物，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析；
用片段分析软件GeneMapper分析步骤4）中遗传分析仪检测收集的数据。
电泳采用多道或单道毛细管电泳。软件分析峰高高于50rfu，认为相应的基因有扩增。反之，分析结果峰高低于50rfu，认为无扩增，即不含相应的基因。
有益效果：
1、本发明提供的同时检测多种动物源性成分的试剂盒，可以同时检测犬（PEZ1）、牛（BM2113）、羊（MAF33）、鱼（HLJ392）、猪（SW742）、鸭（CAUD056）、鸡（MCW248）、兔（Sat7）、猫（FCA955）、马（HMS3）、鼠（cds）动物源性成分，在一次扩增、可以检测出是否血液，血制品，肉类和肉类品来源。
2、复扩体系中添加的大肠杆菌（CFS073）引物可以作为制品是否存在粪便污染的指示。
3、选用11种物种的STR位点，避免了各物种间线粒体基因由于序列相似，实时荧光定量PCR高浓度样本检测带来的假阳性结果。本发明20ng模版DNA扩增除目的峰以外无非特异扩增。同时灵敏度较好，50pg模版DNA能够检出。
附图说明
图1为鸭提取DNA扩增结果，只有CAUD056基因座有扩增，其余无扩增。
图2 为羊提取DNA扩增结果，只有MAF33基因座有扩增，其余无扩增。
图3为鱼提取DNA扩增结果，只有HLJ392基因座有扩增，其余无扩增。
图4为猪提取DNA扩增结果，只有SW742基因座有扩增，其余无扩增。
图5为鸡提取DNA扩增结果，只有MCW248基因座有扩增，其余无扩增。
图6为大肠杆菌菌液扩增结果，只有CFS073基因座有扩增，其余无扩增。
图7为马提取DNA扩增结果，只有HMS3基因座有扩增，其余无扩增。
图8为猫提取DNA扩增结果，只有FCA955基因座有扩增，其余无扩增。
图9为牛提取DNA扩增结果，只有BM2113基因座有扩增，其余无扩增。
图10为犬提取DNA扩增结果，只有PEZ1基因座有扩增，其余无扩增。
图11为鼠提取DNA扩增结果，只有cds基因座有扩增，其余无扩增。
图12为兔提取DNA扩增结果，只有Sat7基因座有扩增，其余无扩增。
图1~12中第三行峰为分子量marker AGCU
SIZ-500的峰，由无锡中德美联生物技术有限公司生产及销售，以siz荧光标记，从75bp到500bp，分别是75，100，139，150，160，200，250，300，340，350，400，450，490，500，共14个片段。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明，但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 引物的筛选
从NCBI genebank中下载引物设计模板序列，如表4。
表4 模板序列表
| 基因座 | 序列Genebank 号 |
| MCW248 | G32016.1 |
| FCA955 | AY434939.1 |
| PEZ1 | AY672136.1 |
| MAF33 | M77200.1 |
| cds | BC081853.1 |
| HLJ392 | JN687127.1 |
| SW742 | AF235351.1 |
| Sat7 | X99888.1 |
| CAUD056 | AY493301.1 |
| HMS3 | X74632.1 |
| BM2113 | M97162.1 |
| CFT073 | AE014075.1 |
每个基因座序列在genebank中比对，在STR序列两端设计引物，选择特异性较好经blast比对唯一的引物，经大量反复测试在复扩体系中各物种DNA模版扩增出唯一扩增峰，设计引物时，需要在引物设计软件中反复调试，确保所有引物具有适中的长度、具有相似的物理学特性和反应动力学特点、Tm值相近、GC含量适中、并保证引物之间不形成二聚体。此外，某些转基因位点之间同源性较高，因此需要保证每对引物的特异性；同时应考虑在复合扩增体系中，引物对不同扩增模板的适用性，保证不同模板扩增时，都满足试剂盒均衡性要求。引物见表1。
引物由上海生工合成，共分为两组：第一组羊（MAF33）、鱼（HLJ392）、猪（SW742）、鸡（MCW248）、大肠杆菌（CFT073）、犬（PEZ1）引物采用蓝色荧光染料6-FAM进行标记；第二组鸭（CAUD056）、鼠（cds）、兔（Sat7）、牛（BM2113）、马（HMS3）、猫（FCA955）采用绿色荧光染料HEX进行标记。内标选用橙色荧光标记，标记物为SIZ。单对引物做退火温度梯度扩增，扩增体系如表2。
其中所述的Reaction Mix为MgCl2
7.5mM，Tris-HCl
buffer 125mM，KCl
125mM，dNTPs
7.5mM ，BSA 2mg/ml。
B扩增热循环：
（l）将PCR扩增管置于热循环仪上；
（2）选择表5的扩增程序进行扩增；
（3）扩增后的样品应避光保存；
表5、温度梯度扩增程序
其中延伸温度分别为54℃，56℃，58℃，60℃，62℃，64℃。其余步骤温度相同。做梯度测试。选择从54℃-64℃扩增特异性、扩增效率都好的12对引物用于复合扩增测试。
复合扩增引物之间存在相互干扰，比如不同基因座引物形成二级结构、产生非特异扩增。复合扩增引物测试的加样体系如表2，扩增体系如表2。经过引物筛选之后最终确定了引物序列及引物浓度，如表1，引物扩增效率高，相互之间无非特异扩增。
C、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AGCU Marker SIZ-500组成上样混合物〔（0.5μl AGCU Marker SIZ-500（无锡中德美联生物技术有限公司））×（进样
数）＋（12μl去离子甲酰胺）×（进样数）〕。将12.5μl上样混合物与PCR产物混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析；
D、分型分析
用片段分析软件GeneMapper分析步骤C中遗传分析仪检测收集的数据。
电泳采用多道或单道毛细管电泳。
实施例2、实际样本测试
自行购买市场上的12种肉类，使用QIAamp® DNA
Blood Mini Kit试剂盒提取12种肉类DNA。
用分光光度计检测12个提取DNA的浓度，并稀释至0.5ng/μL作为模板。
按表6的加样体系加样，按表3的扩增程序进行扩增。
表6 PCR加样体系
| 组分 | 体积 |
| Reaction Mix | 10.0 μL |
| DNA模版 | 2μl |
| 引物混合物 | 5 μL |
| 热启动Taq酶（5U/ μL） | 0.5 μL |
| sdH2O | 补足至25.0μL |
其中所述的Reaction Mix为MgCl2 7.5mM，Tris-HCl buffer 125mM，KCl 125mM，dNTPs 7.5mM ，BSA 2mg/ml。
扩增结果按实施例1中的电泳检测、数据分析方法进行分析，每个模板重复3管扩增。
附图1~12是电泳结果经美国AB公司genemapper IDX软件分析之后的12种动物源性成分扩增图谱。
附图1-12依次为鸭（CAUD056）、羊（MAF33）、鱼（HLJ392）、猪（SW742）、鸡（MCW248）、大肠杆菌（CFT073）、马（HMS3）、猫（FCA955）、牛（BM2113）、犬（PEZ1）、鼠（cds）、兔（Sat7）；各物种提取DNA模板均能扩增出单一目的峰。
序列表
<110> 无锡中德美联生物技术有限公司
<120> 同时检测多种动物源性成分的试剂盒及其应用
<130>
<160> 24
<170> PatentIn
version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttaggttgtt gttcaaaaga agatgc 26
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcttatgca gacagcccta ct
22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gacagttggg tttggcactt 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcatctttaa ggccaagatt ccat 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaatatcctc cccatgaaag tcct 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccagaaaaag atcacagaga tggag 25
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tcatctgagt gtgagtatat acagagaa 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttgtttcaat ctattccaat ttctcact 28
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
catggatctg cttaggactt ct 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggaagacatg atccaagtat ggtt 24
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
caccaggcta caaggcaaca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
caccaggcta caaggcaaca
20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ttctacttct ggggagaggg 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ttgggaacat ttctgcctta gt
22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gtaaccaccc atgcacactc 20
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccagcacaat acctgggatg tag 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tccatcttag ggaaatcagg tcc 23
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tagcataaac tattcagagc cagc 24
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tcagtcagaa gctgcgaac 19
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
agccccaact ctttgtcaca taac 24
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gctgccttct accaaatacc c 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tcctgagaga agcaacacct
20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gttgtatatc gccaccacgc 20
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gtaaagccga aggtatatgt cac 23
Claims (10)
1.同时检测多种动物源性成分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增如下12种动物基因位点的引物：犬PEZ1、牛BM2113、羊MAF33、鱼HLJ392、猪SW742、鸭CAUD056、鸡MCW248、兔Sat7、猫FCA955、马HMS3、鼠cds和大肠杆菌CFS073。
2.根据权利要求1所述同时检测多种动物源性成分的试剂盒，其特征在于，所述12对引物核苷酸序列为：犬PEZ1 SEQ ID NO.5~6，牛 BM2113 SEQ ID
NO.21~22，羊MAF33 SEQ ID NO.7~8，鱼HLJ392 SEQ ID NO.11~12，猪SW742SEQ
ID NO.13~14，鸭CAUD056SEQ ID NO.17~18，鸡MCW248SEQ ID NO.1~2，兔Sat7SEQ ID NO.15~16，猫FCA955SEQ ID NO.3~4，马HMS3SEQ ID NO.19~20，鼠 cds SEQ ID NO.9~10和大肠杆菌 CFS073 SEQ ID NO.23~24。
3.根据权利要求1所述同时检测多种动物源性成分的试剂盒，其特征在于，所述引物在扩增体系中的终浓度为：SEQ
ID NO.1~2：0.1µM；SEQ ID NO.3~4：0.08µM； SEQ ID NO.5~6：0.15µM；SEQ ID NO.7~8：0.2µM；SEQ ID NO.9~10：0.15µM；SEQ ID NO.11~12：0.11µM；SEQ ID NO.13~14：0.2µM；SEQ ID NO.15~16：0.25µM；SEQ ID NO.17~18：0.18µM；SEQ ID NO.19~20：0.2µM；SEQ ID NO.21~22：0.1µM；SEQ ID NO.23~24：0.1µM。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括反应混合物、热启动Taq酶和sdH2O；所述的反应混合物中包括有：MgCl2
7.5mM，Tris-HCl
buffer 125mM，KCl
125mM，dNTPs
7.5mM，BSA
2mg/ml。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增体系为：反应混合物 10.0μL， DNA 模板0.1～10μL，引物混合物 5μL，热启动Taq酶0.5μL，sdH2O补足至25.0μL。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述12个动物基因位点的引物分组进行荧光染料标记，第一组：羊MAF33、鱼HLJ392、猪SW742、鸡MCW248、大肠杆菌CFT073、犬PEZ1；第二组：鸭CAUD056、鼠cds、兔Sat7、牛BM2113、马HMS3、猫FCA955。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，每组引物采用蓝色荧光染料6-FAM、绿色荧光染料HEX、黄色荧光染料TAMRA或红色荧光染料ROX中任一种进行标记，且各组之间的标记色均不相同；内标选用橙色荧光标记，标记物为SIZ。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序为：
变性 95℃
2min，
循环94℃ 30s，59℃ 1min，72℃ 1min 30个循环，
终止延伸 72℃
20min，
4℃保温维持。
10.权利要求1~9中任意一项所述的试剂盒在检测动物源性成分中的应用。
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