CN113308555A - 一种特异性扩增野生动物源成分的引物组、检测体系及试剂盒 - Google Patents
一种特异性扩增野生动物源成分的引物组、检测体系及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种特异性扩增野生动物源成分的引物组、检测体系及试剂盒。所述引物组包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.40所示的20对引物对。所述检测体系即试剂盒均采用所述引物组特异性扩增待测样品中的白狐、孔雀、猪獾、猴、鹿、貉、龟、蛇、大鲵、虎、穿山甲、鳄鱼、象、竹鼠、犀牛、金雕、熊、巨蜥、河马和鹦鹉的野生动物源成分。具有精确度好、灵敏度高、稳定易操作等优点。多重荧光PCR反应是在同一管内进行的，不易污染，且具有特异性强、通量大等优势，此外，整个检测过程可在2‑3小时内完成，能够满足样品快速检验要求。
Description
技术领域
本发明涉及生物样品检测技术领域，特别涉及一种特异性扩增野生动物源成分的引物组及检测体系。
背景技术
目前，根据《濒危野生动植物种国际公约》的最新统计资料显示，野生动物已经成为世界上仅次于毒品和武器的第三大走私对象，一年的非法贸易交易金额高达50亿美元。交易对象主要有野生动物活体及其皮毛、药材以及加工成装饰品、奢侈品等，由于其利润之高，导致几千种野生动物被推到了濒临灭绝的边缘，每一种物种的绝迹，都预示着很多物种即将面临死亡，保护生物链才能更好地维系生态平衡。
由于野生动物物种鉴定、价值鉴定等是刑事案件立案侦查和准确定性量刑的依据，为加强打击野生动物违法犯罪力度，对涉案的野生动物鉴定需求随之增加。但案件中的野生动物往往经过加工处理成皮张、龟壳、角制品和玳瑁制品等，无法通过宏观形态学鉴定，因此需要利用以DNA为研究对象的遗传学方法，从分子水平进行分析，能够实现快速、准确和自动化的物种鉴定。
基于DNA的种属鉴别方法主要有聚合酶链式反应(PCR)、多重PCR、荧光定量PCR、LAMP等。传统的PCR方法一次只能用一对引物鉴定一个物种，对于两种及以上的物种，则需要分别进行PCR检测达到鉴定目的，耗时长且操作繁琐；荧光定量PCR具有灵敏度高，操作简便，能进行定量分析等优点，但检测通量小，实验操作所需的荧光定量PCR仪及试剂价格昂贵，而且多数情况下，种属鉴定只要求定性检测。
发明内容
本发明目的在于提供一种特异性扩增野生动物源成分的引物组、检测体系及试剂盒，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。
本发明第一方面提供一种特异性扩增野生动物源成分的引物组，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.40所示的20对引物对，能同管分别特异性扩增20种不同的野生动物源成份。所述野生动物源成份包括白狐、孔雀、猪獾、猴、鹿、貉、龟、蛇、大鲵、虎、穿山甲、鳄鱼、象、竹鼠、犀牛、金雕、熊、巨蜥、河马和鹦鹉。
本发明第二方面提供一种包含上述特异性扩增野生动物源成分引物组的检测体系。检测体系中进一步还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示的通用引物对，该通用引物根据所有脊柱动物线粒体DNA12S rRNA的公共保守序列设计，产物片段范围为400-500bp，用于判定待测DNA模板的有效性。因此检测体系中包含的引物序列如表1所示：
表1检测体系所含引物序列
由于细胞中线粒体DNA随线粒体独立复制，进化速度快，不受核基因影响，并且为严格的母系遗传，几乎不发生倒位、易位等畸变与重组，忠实地保存了进化过程中的突变，因此从上述20种野生动物的线粒体筛选合适的标靶基因序列[如12SrRNA、16SrRNA、细胞色素b(cytb)、细胞色素C氧化酶亚基I(COI)等]，挑选各基因序列的保守区域。通过基因序列对比分析，分别确定cytb基因作为孔雀、猪獾、貉、大鲵、虎、穿山甲、鳄鱼、象、犀牛、竹鼠、熊、鹦鹉鉴别的靶基因；确定COI基因作为白狐、龟、金雕、蛇、鹿、猴鉴别的靶基因；确定16SrRNA基因作为巨蜥、河马鉴别的靶基因。
在一些实施例中，所述引物组中每对特异性扩增所述目标野生动物的所述引物对中至少一条引物的5’端标记有荧光染料标记。进一步，所述荧光染料标记选自FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIC、PET、NED、TAZ或SIZ。
在一些实施例中，检测体系包括下述试剂中的一种或多种：引物组的混合物、Reaction Mix(反应混合液)、热启动Taq酶、阳性对照品、sdH2O。具体试剂的体积可以是：引物组的混合物2.0μL，反应混合液4.0μL，热启动Taq酶0.4μL，sdH2O 2.6μL，加上1ng/μL的待测DNA模板1.0μL组成10μL的多重扩增体系。所述阳性对照品是含有孔雀、猪獾、貉、大鲵、虎、穿山甲、鳄鱼、象、犀牛、竹鼠、熊、鹦鹉的cytb基因片段，白狐、龟、金雕、蛇、鹿、猴的COI基因片段，以及巨蜥、河马的16SrRNA基因片段的重组质粒。
具体检测方法包括以下步骤：
1)提取样品基因组DNA；按照常规的DNA提取方法或试剂盒进行DNA提取均可。样本类型为冷冻或新鲜动物组织、器官、熟肉或者血液时，可使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒；选取动物组织、器官或熟肉25-50mg，剪碎或者切成小块放入离心管中，或者取动物血液200μL加入离心管中；具体步骤按照基因组DNA提取试剂盒进行操作；使用分光光度计对DNA进行定量，采用超纯水调节DNA浓度为0.1ng/uL，4℃冰箱保存待扩增。
2)PCR扩增：用上述的特异性扩增野生动物源成分的检测体系对步骤1)保存的DNA进行PCR复合扩增，并以上述20种野生动物种属特异性DNA片段的重组质粒DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；PCR扩增反应体系为10μL，包括4.0μL Reaction Mix，2.0μL引物混合物，0.4μL热启动Taq酶，1.0μL待测DNA模板，以及2.6μL sdH2O。
3)反应程序：95℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸50s，共30个循环，最后72℃延伸10min；
4)对PCR扩增产物进行检测和结果判定：取1μL PCR的扩增产物与0.3μL的内标SIZ加入到10μL的甲酰胺中，95℃变性3min后，冰浴3min，然后使用ABI 3500遗传分析仪进行毛细管电泳检测，检测结果使用分析软件GeneMapper进行分析。在目标种属对应的扩增片段长度±1bp的范围内，峰高大于500RFU可认为初始模板中含有该种属的肉类源性成分。
与现有的检测技术相比，本发明具有以下优势：本发明以待测动物的线粒体基因为检测靶标，使用荧光标记引物进行复合扩增。PCR扩增产物经ABI3130XL全自动基因分析仪检测，根据不同种属目标扩增序列的长度差异进行种属鉴定。
1、本发明基于线粒体基因组DNA设计了适合常见20种野生动物的引物，具有精确度好、灵敏度高、稳定易操作等优点。
2、分辨率高：本发明采用毛细管电泳检测方法，检测分辨率可达到2bp，对于目的片段长度差距在2bp以上的产物均能进行分别。
3、本发明通过设计合成一对脊椎动物通用引物，能有效指示DNA提取步骤是否成功。
4、本发明检测20种野生动物源成分的多重荧光PCR反应是在同一管内进行的，不易污染，且具有特异性强、通量大等优势，此外，整个检测过程可在2-3小时内完成，能够满足样品快速检验要求。
附图说明
图1为20种野生动物PCR扩增产物长度排布图；
图2为阳性对照品扩增检测图谱；
图3～图22为多重荧光PCR体系分别针对白狐、孔雀、猪獾、猴、鹿、貉、龟、蛇、大鲵、虎、穿山甲、鳄鱼、象、竹鼠、犀牛、金雕、熊、巨蜥、河马、鹦鹉20种野生动物的检测结果；
图23～图34为多重荧光PCR体系分别针对常见普通动物鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、鱼、鼠、兔、猫、犬及人基因组DNA的特异性检测结果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1，野生动物多重荧光PCR引物设计
根据非法野生动物交易和禁止食用的常见野生动物种类，挑选了白狐、孔雀、猪獾、猴、鹿、貉、龟、蛇、大鲵、虎、穿山甲、鳄鱼、象、竹鼠、犀牛、金雕、熊、巨蜥、河马、鹦鹉20种野生动物作为研究对象。由于细胞中线粒体DNA随线粒体独立复制，进化速度快，不受核基因影响，并且为严格的母系遗传，几乎不发生倒位、易位等畸变与重组，忠实地保存了进化过程中的突变。线粒体基因序列上常用的分子标记有12SrRNA、16SrRNA、细胞色素b(cytb)、细胞色素C氧化酶亚基I(COI)等；经过目标序列的比对分析之后，分别确定cytb基因作为孔雀、猪獾、貉、大鲵、虎、穿山甲、鳄鱼、象、犀牛、竹鼠、熊、鹦鹉鉴别的靶基因；确定COI基因作为白狐、龟、金雕、蛇、鹿、猴鉴别的靶基因；确定16SrRNA基因作为巨蜥、河马鉴别的靶基因。设计的PCR扩增的DNA片段大小依次为85(白狐)、199(孔雀)、287(猪獾)、266(猴)、219(鹿)、109(貉)、101(龟)、133(蛇)、304(大鲵)、194(虎)、128(穿山甲)、297(鳄鱼)、259(象)、168(竹鼠)、253(犀牛)、110(金雕)、177(熊)、103(巨蜥)、211(河马)、141(鹦鹉)bp。所得的PCR扩增产物排布图如图1所示。
此外，根据所有脊柱动物线粒体DNA 12S rRNA的公共保守序列设计一对通用引物，用于判定待测DNA模板的有效性，该通用引物的产物片段范围为400-500bp。
实施例2，阳性对照品的制备
分别以20种野生动物的标靶线粒体基因为模板进行常规PCR扩增，将扩增产物克隆连接到pMD18T载体上，转化感受态DH-5α，提取质粒，经过DNA测序验证与目标片段一致，最后获得20种含有特异性靶标序列的重组质粒，将其混合均匀即可得到阳性对照品。图2为阳性对照品扩增检测图谱。
实施例3，建立一步法同时检测20种野生动物成分的检测方法
1)提取样品基因组DNA；按照常规的DNA提取方法或试剂盒进行DNA提取均可。样本类型为冷冻或新鲜动物组织、器官、熟肉或者血液时，可使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒；选取动物组织、器官或熟肉25-50mg，剪碎或者切成小块放入离心管中，或者取动物血液200μL加入离心管中；具体步骤按照基因组DNA提取试剂盒进行操作；使用分光光度计对DNA进行定量，采用超纯水调节DNA浓度为0.1ng/uL，4℃冰箱保存待扩增。
2)PCR扩增：用上述的特异性扩增野生动物源成分的检测体系对步骤1)保存的DNA进行PCR复合扩增，并以上述20种野生动物种属特异性DNA片段的重组质粒DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；PCR扩增反应体系为10μL，包括4.0μL Reaction Mix，2.0μL引物混合物，0.4μL热启动Taq酶，1.0μL待测DNA模板，以及2.6μL sdH2O。
3)反应程序：95℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸50s，共30个循环，最后72℃延伸10min；
4)对PCR扩增产物进行检测和结果判定：取1μL PCR的扩增产物与0.3μL的内标SIZ加入到10μL的甲酰胺中，95℃变性3min后，冰浴3min，然后使用ABI 3500遗传分析仪进行毛细管电泳检测，检测结果使用分析软件GeneMapper进行分析。在目标种属对应的扩增片段长度±1bp的范围内，峰高大于500RFU可认为初始模板中含有该种属的肉类源性成分。
实施例4，3多重荧光PCR反应特异性鉴定
采用实施例3建立的检测方法分别对白狐、孔雀、猪獾、猴、鹿、貉、龟、蛇、大鲵、虎、穿山甲、鳄鱼、象、竹鼠、犀牛、金雕、熊、巨蜥、河马和鹦鹉样品以及11种普通动物物种样本(鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、鱼、鼠、兔、猫、犬、)及人基因组样品分别进行特异性检测，结果如图3～图22所示，每种模板均只在对应的目标位置出现单一检测峰，而在其他位置均不出峰，说明本发明建立的一步法同时检测20种野生动物成分的检测方法具有良好的特异性；如图23～图34所示，结果均未扩增出条带，表明本发明提供的20种野生动物成分的引物组合物具有优良的特异性。
实施例5多重荧光PCR检测灵敏度鉴定
采用实施例3建立的检测方法对白狐、孔雀、猪獾、猴、鹿、貉、龟、蛇、大鲵、虎、穿山甲、鳄鱼、象、竹鼠、犀牛、金雕、熊、巨蜥、河马和鹦鹉20种动物源性成分样品的基因组核酸分别进行了灵敏度检测；将阳性DNA模板分别稀释成0.1、0.05、0.02、0.01、0.005和0.002ng/uL，再利用本发明建立的多重PCR体系检测可以扩增出的最低模板浓度，设置阳性组、阴性组、空白组作对照。检测结果详见下表2。
表2灵敏度检测结果
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东华美众源生物科技有限公司；佛山市公安局
<120> 一种特异性扩增野生动物源成分的引物组、检测体系及试剂盒
<130> 2021
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Claims (10)
1.特异性扩增野生动物源成分的引物组，其特征在于，包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.40所示的20对引物对。
2.特异性扩增野生动物源成分的检测体系，其特征在于，包括如权利要求1所述引物组。
3.根据权利要求2所述检测体系，其特征在于，还包括通用引物对，所述通用引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示。
4.根据权利要求2所述检测体系，其特征在于，所述引物组的终浓度为0.12μM～0.18μM；优选地，各引物的终浓度按SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.40依次为0.13μM、0.13μM、0.18μM、0.18μM、0.13μM、0.13μM、0.15μM、0.15μM、0.13μM、0.13μM、0.15μM、0.15μM、0.18μM、0.18μM、0.16μM、0.16μM、0.12μM、0.12μM、0.18μM、0.18μM、0.16μM、0.16μM、0.15μM、0.15μM、0.18μM、0.18μM、0.12μM、0.12μM、0.14μM、0.14μM、0.15μM、0.15μM、0.15μM、0.15μM、0.18μM、0.18μM、0.16μM、0.16μM、0.15μM、0.15μM。
5.根据权利要求2至4任一项所述检测体系，其特征在于，所述引物组中每对特异性扩增所述目标野生动物的所述引物对中至少一条引物的5’端标记有荧光染料标记；优选地，所述荧光染料标记选自FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIC、PET、NED、TAZ或SIZ。
6.根据权利要求5所述检测体系，其特征在于，包括引物组的混合物2.0μL，反应混合液4.0μL，热启动Taq酶0.4μL和适量sdH2O。
7.根据权利要求6所述检测体系，其特征在于，扩增程序为：95℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸10min。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述引物组或权利要求2至9任一项所述检测体系。
9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和阴性对照品。
10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品含有孔雀、猪獾、貉、大鲵、虎、穿山甲、鳄鱼、象、犀牛、竹鼠、熊、鹦鹉的cytb基因片段，白狐、龟、金雕、蛇、鹿、猴的COI基因片段，以及巨蜥、河马的16SrRNA基因片段。
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