CN110331218A - 一种用于鉴别象牙的引物探针组及其应用、鉴别方法、试剂盒 - Google Patents

一种用于鉴别象牙的引物探针组及其应用、鉴别方法、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于鉴别象牙的引物探针组及其应用、鉴别方法、试剂盒，属于分子检测技术领域。本发明提供的引物探针组，包括引物和探针；所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明提供的引物探针组，既能灵敏、快捷、高效的鉴别象牙，也具备检测微量、痕量样品的能力。

Description

一种用于鉴别象牙的引物探针组及其应用、鉴别方法、试剂盒
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，尤其涉及一种用于鉴别象牙的引物探针组及其应用、鉴别方法、试剂盒。
背景技术
大象是陆地上体积最大的野生哺乳动物，属于长鼻目，共有一科二属三种，即象科(Elephantidae)，非洲象属的非洲草原象(Loxodonta africana)、非洲森林象(Loxodontacyclotis)，亚洲象属的亚洲象(Elephas maximus Linnaeus)。大象广泛分布于非洲撒哈拉沙漠以南和亚洲东南部的热带、亚热带地区。大象家族曾是地球上最占优势的动物类群之一，目前已发现的化石多达400余种。但由于气候变化、人为猎杀等因素，其族群的种类越来越少；某些地区的物种近乎全部“进化”为无牙象；非洲象也以每年8％的比率持续减少，至2020年将濒临灭绝。
照传统方法，通过完整的形态学特征可轻易对象牙进行鉴别，但经过加工的象牙艺术品多数无法观察其横断面夹角，使用焙烤、热针试验等对于艺术品的破坏性较大，给鉴定人员带来很大挑战。分子生物学作为一门新兴技术，在使用遗传标记进行物种鉴定方面的优势便得以体现。目前，国内对象牙鉴定的研究集中在物理特征鉴定、显微CT鉴定和荧光光谱鉴定三个方面。早在2009年Lee等(参见“Lee C I,Hsieh H M,Huang L H,et al.Ivoryidentification by DNA profiling of cytochrome b gene[J].International Journalof Legal Medicine,2009,123(2):117-121.”)便基于大象的细胞色素b基因建立了套式PCR鉴定象牙的方法，从453个象牙样品中扩增出382个样品的DNA；2012年，Wozney等(参见“Wozney K M,Wilson P J.Real-time PCR detection and quantification ofelephantid DNA:species identification for highly processed samples associatedwith the ivory trade[J].Forensic Science International,2012,219(1-3):106-112.”)首次开发出荧光PCR鉴定象牙的方法，通过对100份象牙样品的检测，得出其最低检测限为102拷贝，但检测灵敏度低。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于鉴别象牙的引物探针组及其应用、鉴别方法、试剂盒，本发明提供的用于鉴别象牙的引物探针组具有特异性，能够灵敏、快捷、高效地鉴别出象牙。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种用于鉴别象牙的引物探针组，包括引物和探针；
所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了一种用于鉴别象牙成分的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物组和2×Taq PCR Master mix。
本发明还提供了上述技术方案所述的引物探针组在鉴别象牙中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的试剂盒在鉴别象牙中的应用。
本发明还提供了一种利用上述技术方案所述的引物探针组鉴别象牙的方法，包括：提取样品DNA，以所述样品DNA为模板，利用上述技术方案所述的引物探针组进行荧光PCR扩增，使用实时荧光PCR仪分析软件分析扩增结果，当被检测样品出现显著荧光扩增曲线时，判断为样品含有象牙源性成分，当被检测样品未出现荧光扩增曲线时，判断为样品不含有象牙源性成分。
优选地，所述荧光PCR扩增使用的体系每25μL包括：2×Taq PCR Master mix 12.5μL，上游引物和下游引物各1μL，探针0.5μL，样品DNA模板2.0μL，补充双蒸水至25μL；
所述上下游引物的浓度独立的为10μmol/L；所述探针的浓度为10μmol/L。
优选地，所述荧光PCR扩增的程序包括：95℃5min；95℃10s，56℃40s，收集荧光信号，40个循环。
本发明提供了一种用于鉴别象牙的引物探针组，包括引物和探针；所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明以象科动物的线粒体DNA(mtDNA)序列为模型，设计具有特异性分的引物探针组，既能够灵敏、快捷、高效的鉴别出象牙，也具备检测微量、痕量样品的能力。实施例结果表明，本发明提供的引物组能够将象牙与犀牛角、水牛角等多种形态相似的物品进行区分，最低可以检测到10个拷贝数量级(46个)的重组质粒DNA，两次重复试验的批内变异系数分别为2.34％和2.51％，批间变异系数为2.82％。
进一步地，本发明通过采用精确的检测参数值，有效地提高了检测方法的灵敏度。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为象牙样品荧光PCR检测结果；
图2为特异性试验结果；
图3为灵敏度试验结果；
图4为第一次稳定性试验结果；
图5为第二次稳定性试验结果。
具体实施方式
本发明提供了一种用于鉴别象牙的引物探针组，包括引物和探针；所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明优选根据GenBank中公布的象科物种线粒体DNA(mtDNA)序列，使用生物学软件DNAMAN8.0进行比对，并通过生物学软件Oligo7.0在高度保守区域设计所述引物和探针，由上海辉睿生物科技有限公司合成。
在本发明中，所述荧光PCR引物和探针序列参见表1。
表1荧光PCR引物和探针序列
在本发明中，所述探针在使用时还优选在5’端添加FAM，在3’端添加BHQ1。
本发明还提供了一种用于鉴别象牙的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物组和2×Taq PCR Master mix。在本发明中，所述引物组中上游引物的含量优选为1μL，浓度优选为10μmol/L；所述引物组中下游引物的含量优选为1μL，浓度优选为10μmol/L；所述引物组中探针的含量优选为0.5μL，浓度优选为10μmol/L；所述2×Taq PCR Master mix的含量优选为12.5μL。
本发明还提供了上述技术方案所述的引物探针组在鉴别象牙中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的试剂盒在鉴别象牙中的应用。
本发明还提供了一种利用上述技术方案所述的引物探针组鉴别象牙的方法，包括：提取样品DNA，以所述样品DNA为模板，利用上述技术方案所述的引物探针组进行荧光PCR扩增，使用实时荧光PCR仪分析软件分析扩增结果，判断样品中是否含有象牙。
本发明提取样品DNA，以所述样品DNA为模板，利用上述技术方案所述的引物探针组进行荧光PCR扩增，使用实时荧光PCR仪分析软件分析扩增结果，当被检测样品出现显著荧光扩增曲线时，判断为样品含有象牙源性成分，当被检测样品未出现荧光扩增曲线时，判断为样品不含有象牙源性成分。
本发明优选按照DNA提取试剂盒的说明书提取样品DNA，并确保所提取的DNA模板260/280比值介于1.8至2.0。在本发明中，所述DNA提取试剂盒优选购买自美国OMEGA公司产品E.Z.N.A.TM Tissue DNAKit。
本发明优选在PCR反应管中加入2×Taq PCR Master mix 12.5μL，上游引物和下游引物各1μL，探针0.5μL，样品DNA模板2.0μL，补充双蒸水至25μL，混合均匀后，将所述PCR反应管放入荧光定量PCR仪中进行荧光PCR扩增。在本发明中，所述上下游引物的浓度优选独立的为10μmol/L；所述探针的浓度优选为10μmol/L。
在本发明中，所述荧光PCR扩增的程序优选包括：95℃5min；95℃10s，56℃40s，收集荧光信号，40个循环。
下面结合实施例对本发明提供的用于鉴别象牙成分的引物探针组及其应用、鉴别方法、试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例中所采用的仪器包括：ViiA 7 Real Time PCR System为美国AppliedBiosystems公司产品；Sigma 3-18 K小型高速冰冻台式离心机为德国Sartorius公司产品；NanoDrop-1000 Spectrophotometer紫外分光光度计为美国NanoDrop Technologies公司产品。
实施例1
荧光PCR方法检测象牙样品
1)动物样品
大象牙样品4份。
2)引物和探针的设计与合成
根据GenBank中公布的象科物种线粒体DNA(mtDNA)序列，使用生物学软件DNAMAN8.0进行比对，并通过生物学软件Oligo7.0在高度保守区域设计特异性引物、探针，由上海辉睿生物科技有限公司合成。荧光PCR引物和探针的序列见表1。
3)样品DNA提取
按照DNA提取试剂盒说明书提取样品DNA，并确保所提取的DNA模板260/280比值介于1.8至2.0。
DNA提取试剂盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit为美国OMEGA公司产品，2×Superstart Premix plus荧光PCR试剂购自珠海宝锐生物科技有限公司。
4)荧光PCR方法检测象牙样品
采用重组质粒作为阳性对照，双蒸水作为空白对照，检测4份象牙DNA样品。
以提取的4个已知象牙样品DNA为模板进行荧光PCR扩增。反应体系：2×Taq PCRMaster mix 12.5μL，上下游引物各1μL，引物浓度分别为10μmol/L，探针0.5μL，探针浓度为10μmol/L，DNA模板2.0μL，补充双蒸水至25μL。扩增程序：95℃5min；95℃10s，56℃40s(收集荧光信号)，40个循环。荧光PCR方法检测结果参见图1。
从图1可以看出，4份象牙DNA都出现扩增曲线，其中两份样品的Ct值小于30，说明样品DNA浓度较高，另外两份样品的Ct值在34左右，说明样品DNA浓度较低。
实施例2
荧光PCR方法特异性试验
1)动物样品
犀牛角1份、野牛角1份、黄牛角2份、水牛角3份、山羊角2份、绵羊角2份、鹿角2份。
2)样品DNA提取
以犀牛角、野牛角、黄牛角、水牛角、山羊角、绵羊角、鹿角的共13份样品提取的DNA为模板，使用与实施例1相同的反应体系和反应程序进行荧光PCR扩增，验证所建立荧光PCR方法的特异性，实验结果参见图2。
从图2中可以看出，犀牛角、野牛角、黄牛角、水牛角、山羊角、绵羊角、鹿角的共13份样品均没有出现荧光值的升高，说明本发明提供的检测方法的特异性好，不会对其它物种产生扩增。
实施例3
灵敏度试验
将含有荧光PCR扩增区域的线粒体基因片段送上海旭冠生物科技有限公司合成，并克隆至PES质粒载体(约2692bp)中。将重组质粒用紫外分光光度计测定OD260数值换算为质粒质量浓度、摩尔浓度，然后根据阿伏伽德罗常数(6.02×1023)换算为目的基因的拷贝数，将该质粒以10倍浓度梯度依次稀释，稀释后的质粒作为灵敏度试验的阳性标准品。阳性标准品初始浓度为2.3×1010拷贝/μL，使用2.3×106拷贝/μL到2.3×100拷贝/μL进行灵敏度试验，每个反应加2μL，荧光PCR反应中的拷贝数依次为4.6×106、4.6×105、4.6×104、4.6×103、4.6×102、4.6×10和4.6，实验结果参见图3。
从图3中可以看出，该检测方法最低可以检测到4.6×10拷贝的重组质粒，说明本发明提供的检测方法的灵敏度高。
实施例4
稳定性试验
取实施例3中105拷贝的阳性标准品为模板，使用与实施例1相同的反应体系和反应程序进行两次试验，试验时间间隔为30天，单次试验重复数为20个。
图4～5分别为第一次和第二次稳定性试验结果，从图中可以看出，间隔30天的两次试验结果的Ct值进行统计分析，批内变异系数分别为2.34％和2.51％，批间变异系数为2.82％。说明本发明提供的检测方法重复性较好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 拱北海关技术中心
<120> 一种用于鉴别象牙的引物探针组及其应用、鉴别方法、试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcctgtctc rtaaccgatg a 21
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgaagatggt ggtatatgga ctga 24
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccgatacac cttaccgtca cttgcta 27

Claims (7)

1.一种用于鉴别象牙的引物探针组，其特征在于，包括引物和探针；
所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.一种用于鉴别象牙的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组和2×Taq PCR Mastermix。
3.权利要求1所述的引物探针组在鉴别象牙中的应用。
4.权利要求2所述的试剂盒在鉴别象牙中的应用。
5.一种利用权利要求1所述的引物探针组鉴别象牙的方法，其特征在于，包括：提取样品DNA，以所述样品DNA为模板，利用权利要求1所述的引物探针组进行荧光PCR扩增，使用实时荧光PCR仪分析软件分析扩增结果，当被检测样品出现显著荧光扩增曲线时，判断为样品含有象牙源性成分，当被检测样品未出现荧光扩增曲线时，判断为样品不含有象牙源性成分。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光PCR扩增使用的体系每25μL包括：2×Taq PCR Master mix 12.5μL，上游引物和下游引物各1μL，探针0.5μL，样品DNA2.0μL，补充双蒸水至25μL；
所述上下游引物的浓度独立的为10μmol/L；所述探针的浓度为10μmol/L。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光PCR扩增的程序包括：95℃5min；95℃10s，56℃40s，收集荧光信号，40个循环。
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