CN110066879A - 一种co i基因序列的dna条形码及其鉴定拟水龟属物种的方法 - Google Patents

一种co i基因序列的dna条形码及其鉴定拟水龟属物种的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CO I基因序列的DNA条形码及其鉴定拟水龟属物种的方法，涉及分子生物学技术，通过oligo7软件对拟水龟属物种CO I基因部分序列设计一对PCR通用引物，利用PCR扩增的方法，对待测样品通过一次一般的PCR扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳图中的条带显示、生工测序和MrBayes软件构建贝叶斯树分析，来证明该引物是否能够扩增出拟水龟属物种相应的CO I基因部分序列，且所用的模板可直接从尾部肌肉组织中提取，大大降低了取样的难度，而且该方法可以快速，准确地区分拟水龟类物种，解决了拟水龟属物种识别困难和不易区分的问题，为后续不同龟类的研究提供了科学依据。

Description

一种CO I基因序列的DNA条形码及其鉴定拟水龟属物种的 方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是指一种CO I基因序列的DNA条形码及其鉴定拟水龟属物种的方法。
背景技术
龟鳖类的演化历史可以追溯到2亿年前，是迄今仍然存在的和恐龙同一时期的动物。世界现存龟鳖动物共计14科94属356种，其中拟水龟属(Mauremys)共有13种，中国常见的有乌龟(Mauremys reevesii)、黄喉拟水龟(Mauremys mutica)、中华花龟(Mauremyssinensis)等，尤以乌龟分布最广，我国各地几乎均有乌龟分布，但以长江中下游各省的产量较高，国外主要分布于日本、巴西和朝鲜。中国能见到的拟水龟属物种形态较相似，这给外形分辨带来困难。近年来，随着分子技术的发展，基于DNA条形码的分子分类系统弥补了传统形态学分类存在的不足，已成为生物分类学研究中受人关注的新方向和研究热点。DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、容易扩增且相对较短的DNA片段；DNA条形码技术的应用极大地增强了人类监测、了解和利用生物多样性资源的能力，其在生命科学、法医学、流行病学以及医药、食品质量控制等领域均有广泛的应用前景。
申请人在研究现有技术中对拟水龟属物种鉴别的方法发现，目前现有鉴定龟类物种的方法主要是以形态学分类为主，但形态学鉴定有其局限性，如形态学鉴定受生物性别和发育阶段以及相似性的限制，因此很多物种很难鉴定，即使能鉴定，鉴定的准确性较差。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种CO I基因序列的DNA条形码及其鉴定拟水龟属物种的方法，以解决现有技术中鉴定方法的全部或者部分不足。
基于上述目的本发明提供的一种CO I基因序列的DNA条形码，通过对CO I部分基因序列进行PCR扩增得到，其中，PCR扩增的通用引物序列如下：
CO I-F1:5`-CCTGAGCAGGTATAGTAGGCA-3`；
CO I-R1:5`-TAGTAATACCTGCGGCGAGT-3`。
可选的，所述DNA条形码的长度约为550bp。
一种鉴定拟水龟属物种的方法，采用所述的CO I基因序列的DNA条形码，通过基因组提取、PCR引物扩增、生工测序和构建贝叶斯树(BI)的方法进行鉴定。
可选的，具体步骤如下：
基因组提取：剪取拟水龟属物种尾部肌肉组织，提取肌肉的总DNA；
PCR引物扩增：用oligo7软件对拟水龟属物种CO I基因部分序列设计一对通用引物，用所述通用引物对提取的DNA基因组进行PCR扩增；
生工测序：将PCR扩增产物送上海生工进行测序；
构建贝叶斯树：从GenBank数据库下载拟水龟属物种相应的CO I基因序列，结合生工测序所测数据，运用MrBayes软件构建BI树，在BI树上，不同种类龟分别进行聚类并具有较高的节点支持率。
可选的，所述PCR引物扩增的扩增体系如下：
可选的，所述PCR引物扩增的PCR引物的浓度为5μmol。
可选的，所述PCR引物扩增的反应条件如下：
可选的，所述PCR引物扩增还包括退火步骤，其中，退火温度为55℃，退火时间为45s。
可选的，所述生工测序采用ABI-3730DNA测序仪器进行测序。
从上面所述可以看出，本发明提供的一种CO I基因序列的DNA条形码及其鉴定拟水龟属物种的方法，通过oligo7软件对乌龟CO I基因部分序列设计一对PCR通用引物，利用PCR扩增的方法，对待测样品通过一次PCR扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳图中的条带显示、测序和MrBayes软件构建贝叶斯树(BI)分析，来证明该引物是否能够扩增出乌龟、黄喉拟水龟、中华花龟个体相应的CO I基因部分序列，且所用的模板可直接从尾部肌肉组织中提取，大大降低了取样的难度，而且该方法可以快速，准确地区分拟水龟类物种，解决了龟属识别困难、不易区分的问题，为后续不同龟类的研究提供了科学依据。
本发明提供了一种可以准确、有效的方法鉴别拟水龟属物种，解决了拟水龟属物种外形相似，仅从外形有时难以区分的难题，从而为更准确的识别拟水龟属物种提供了科学依据和方法。
附图说明
图1为本发明实施例利用1％的琼脂糖凝胶电泳分辨乌龟样本基因组DNA示意图；
泳道1、2、3分别指乌龟1号、2号、3号；泳道4、5、6分别指黄喉拟水龟1号、2号、3号；泳道7、8、9分别指中华花龟1号、2号、3号；泳道M为分子量标记；
图2为本发明实施例CO I基因引物扩增结果示意图；
泳道1、2、3分别指乌龟1号、2号、3号；泳道4、5、6分别指黄喉拟水龟1号、2号、3号；泳道7、8、9分别指中华花龟1号、2号、3号，泳道M为分子量标记；
图3为本发明实施例利用CO I基因序列构建的BI树示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
术语解释：
BI：贝叶斯树；
dNTPMix：PCR底物；
CO I：线粒体细胞色素C氧化酶I亚基基因；
用于PCR扩增的聚合酶以及缓冲液可以为本领域常规聚合酶和缓冲液。本发明实施例所用品均购于天根生物公司，其用量具体的可以参照产品说明书中的详细说明。
本发明实施例中使用的dNTPMix为Takara公司的市售品，使用DNA提取的试剂盒为天根生物公司的市售品，其余所使用的化学试剂均为常规市售分析纯试剂。
本发明实施例提供的一种CO I基因序列的DNA条形码，通过对CO I基因部分序列进行PCR扩增得到，其中，PCR扩增的通用引物序列如下：
CO I-F1:5`-CCTGAGCAGGTATAGTAGGCA-3`；
CO I-R1:5`-TAGTAATACCTGCGGCGAGT-3`。
本发明实施例提供的一种鉴定拟水龟属物种的方法，采用CO I基因序列的DNA条形码，通过基因组提取、PCR引物扩增、生工测序和构建贝叶斯树(BI)的方法进行鉴定，具体步骤如下：
基因组提取：剪取拟水龟属物种尾部肌肉组织，提取肌肉的总DNA；
PCR引物扩增：用oligo7软件对拟水龟属物种CO I基因部分序列设计一对通用引物，用所述通用引物对提取的DNA基因组进行PCR扩增；
生工测序：将PCR扩增产物送上海生工进行测序；
构建贝叶斯树：从GenBank数据库下载拟水龟属物种相应的CO I基因序列，结合生工测序所测数据，运用MrBayes软件构建BI树，在BI树上，不同种类龟分别进行聚类并具有较高的节点支持率。
通过oligo7软件对乌龟CO I基因部分序列设计一对PCR通用引物，利用PCR扩增的方法，对待测样品通过一次PCR扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳图中的条带显示、测序和MrBayes软件构建贝叶斯树(BI)分析，来证明该引物是否能够扩增出乌龟、黄喉拟水龟、中华花龟个体相应的CO I基因部分序列，且所用的模板可直接从尾部肌肉组织中提取，大大降低了取样的难度，而且该方法可以快速，准确地区分拟水龟类物种，解决了拟水龟属识别困难、不易区分的问题，为后续不同龟类的研究提供了科学依据。
本发明实施例提供了一种鉴定拟水龟属物种的方法，具体步骤如下：
1、样品采集
本发明实施例选取拟水龟属7种20个个体，其中乌龟、日本拟水龟、黑颈乌龟、中华花龟、黄喉拟水龟、希腊拟水龟、各三个和两个地中海拟水龟，其中乌龟、黄喉拟水龟和中华花龟9个个体的CO I基因是由实验测序获得，其余个体均从GenBank下载CO I基因(表1)。
表1不同龟类物种GenBank序列号
物种 GenBank序列号
黑颈乌龟1 KT951839.1
黑颈乌龟2 AF348264.2
黑颈乌龟3 NC-029369.1
日本拟水龟1 GU938833.1
日本拟水龟2 AY337349.1
日本拟水龟3 NC-016951.1
希腊拟水龟1 AY337352.1
希腊拟水龟2 KP100054.1
希腊拟水龟3 NC-029183.1
地中海拟水龟1 KP100055.1
地中海拟水龟2 NC-031432.1
2、主要试剂和引物合成
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)，Taq DNAPolymerase、10×Taq plus Buffer、dNTPS、DNA Marker II(TIANGEN)。特异性引物由上海生工(Sangon)合成，扩增乌龟、黄喉拟水龟和中华花龟CO I基因片段PCR扩增的通用引物序列如下：
3、基因组DNA提取、PCR引物扩增、生工测序
本发明实施了使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNAKit)分别提取乌龟、黄喉拟水龟和中华花龟各三只的基因组，取尾部肌肉组织50mg，用剪刀剪碎，提取基因组DNA，提取过程按照试剂盒操作说明书进行(-20℃保存备用)。将提取的乌龟、黄喉拟水龟、中华花龟基因组DNA用琼脂糖凝胶电泳进行检测，测试结果见图1，可以看出扩增条带只有一条且非常明亮，点样孔处没有蛋白质沉淀，无拖带，基因组提取效果很好，可以进行下一步实验操作。
同时用设计的通用引物CO I-F1:5`-CCTGAGCAGGTATAGTAGGCA-3`；
CO I-R1:5`-TAGTAATACCTGCGGCGAGT-3`，对提取的DNA基因组进行PCR扩增，PCR引物扩增的扩增体系如下：
PCR反应条件如下：
将1％琼脂糖凝胶提前半小时制好，PCR产物混合显色剂加入点样孔后电泳检测(如图2)。将扩增到目的条带的PCR产物委托生工生物(上海)股份有限公司，采用ABI-3730DNA测序仪器进行测序。利用设计的通用引物扩增出的DNA条形码约550bp的片段，与目标片段的长度相符。经过基因片段测序进一步确认。乌龟、黄喉拟水龟和中华花龟共9只个体均扩出的CO I基因。
PCR扩增过程中的退火过程可以为本领域所常规使用的退火方式，在本发明实施例中，为了得到更好的扩增效果，所述PCR扩增退火温度为55℃，退火时间为45s。
4、序列处理及系统发生关系分析
运用BioEdit软件查看序列结果并辅助测序峰图进行人工校正，排除可能引入的错误信息，序列比对使用的是Clustalw2(Gap Open Penalty缺省值设置为10，并构建长度为539bp的联合数据。
在本发明实施例中，分子系统树的构建采用贝叶斯推断法(Bayesian inference,BI)，贝叶斯树(BI)的构建基于MrBayes软件，并进行1000次自展分支检验，以检验分支树的可靠性。
在应用MrBayes软件建立系统发生树(BI)。发现不同物种龟类都能明显的聚类在一起，并且各个节点都具有非常高的支持率，甚至有些节点支持率达到了100，如图3所示20个样本的分子系统树。结果表明通过BI树发现不同种类的龟存在明显的差异；在BI树上，不同龟类物种分别进行聚类并具有较高的节点支持率。因此，CO I基因可以作为DNA条形码对不同拟水龟类物种进行有效鉴定。
CO I基因序列DNA条形码技术在弥补传统分类不足上的潜力巨大，它提供了一个更加敏感、精确、客观的分子差别模式，其优势表现在：①鉴别过程快速简便，鉴别结果更精确，客观；②能在生物不同生长阶段取样鉴别；③不需要专门的物种鉴定专家，只需要设计好鉴别的实验流程，鉴别过程是可以机械重复的；④CO I基因作为线粒体基因具有进化快、呈母系遗传、较为容易进行有效扩增等特点。
本发明实施例采用CO I基因作为DNA条形码设计一对通用引物来探讨其在拟水龟类物种鉴定中的有效性，以便于更精准的鉴别拟水龟属物种。本发明提供了一种可以准确、有效的方法鉴别拟水龟属物种，解决了拟水龟属物种外形相似，仅从外形有时难以区分的难题，从而为更准确的识别拟水龟属物种提供了科学依据和方法。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种CO I基因序列的DNA条形码，其特征在于，通过对CO I部分基因序列进行PCR扩增得到，其中，PCR扩增的通用引物序列如下：
CO I-F1:5`-CCTGAGCAGGTATAGTAGGCA-3`；
CO I-R1:5`-TAGTAATACCTGCGGCGAGT-3`。
2.根据权利要求1所述的COⅠ基因序列的DNA条形码，其特征在于，所述DNA条形码的长度约为550bp。
3.一种鉴定拟水龟属物种的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的COⅠ基因序列的DNA条形码，通过基因组提取、PCR引物扩增、生工测序和构建贝叶斯树(BI)的方法进行鉴定。
4.根据权利要求3所述的鉴定拟水龟属物种的方法，其特征在于，具体步骤如下：
基因组提取：剪取拟水龟属物种尾部肌肉组织，提取肌肉的总DNA；
PCR引物扩增：用oligo7软件对拟水龟属物种CO I基因部分序列设计一对通用引物，用所述通用引物对提取的DNA基因组进行PCR扩增；
生工测序：将PCR扩增产物送上海生工进行测序；
构建贝叶斯树：从GenBank数据库下载拟水龟属物种相应的CO I基因序列，结合生工测序所测数据，运用MrBayes软件构建BI树，在BI树上，不同种龟类物种分别进行聚类并具有较高的节点支持率。
5.根据权利要求3或4所述的鉴定拟水龟属物种的方法，其特征在于，所述PCR引物扩增的扩增体系如下：
6.根据权利要求3或4所述的鉴定拟水龟属物种的方法，其特征在于，所述PCR引物扩增的PCR引物的浓度为5μmol。
7.根据权利要求3或4所述的鉴定拟水龟属物种的方法，其特征在于，所述PCR引物扩增的反应条件如下：
8.根据权利要求3或4所述的鉴定拟水龟属物种的方法，其特征在于，所述PCR引物扩增还包括退火步骤，其中，退火温度为55℃，退火时间为45s。
9.根据权利要求3或4所述的鉴定拟水龟属物种的方法，其特征在于，所述生工测序采用ABI-3730DNA测序仪器进行测序。
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