CN110616271B - 一种定量检测环境中红耳龟生物量的特异性引物及其检测方法和应用 - Google Patents

一种定量检测环境中红耳龟生物量的特异性引物及其检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种定量检测环境中红耳龟生物量的特异性引物及其检测方法和应用，本发明选择红耳龟线粒体基因作为目的基因，开发获得了一种特异性扩增引物KM216748F2和KM216748R2，并利用该特异性引物与ddPCR技术相结合，实现对环境中红耳龟生物量的定量检测。与现有技术相比，该引物能够与ddPCR技术相结合，实现对红耳龟线粒体基因的特异性扩增，具有针对性强的特点，此外，本发明在检测过程中不依赖标准曲线，且能够避免背景DNA中抑制剂的干扰和不同样品和试验过程中PCR扩增效率变化的影响，具有更高的灵敏度和准确度。

Description

一种定量检测环境中红耳龟生物量的特异性引物及其检测方 法和应用
技术领域
本发明属于环境分子检测技术领域，尤其涉及一种定量检测环境中红耳龟生物量的特异性引物及其检测方法和应用。
背景技术
红耳龟（Trachemys scripta elegans ）原产于美国中部，现已被引入欧洲、非洲、亚洲及美洲等地区的许多国家，严重威胁入侵地区的生态安全，被世界自然保护联盟（IUCN）列为世界上100个最具威胁性的入侵物种之一。 红耳龟自 20 世纪 80 年代经中国香港引入我国内陆，21世纪初该种人工养殖已形成较大规模，同时因人工放生等原因进入野外自然环境，呈蔓延态势，已严重威胁栖息环境的本土龟类及生物多样性。快速掌握红耳龟野外分布状况，开展早期的预警监测，是对其进行有效防控的关键。目前，对于红耳龟的野外识别和监测，通常采用野外调查、标本采集或拍照取证，这些方法耗时费力效率低，不利于大规模快速掌握红耳龟的野外分布状况。
近些年，已有研究采用环境DNA（Environmental DNA）技术开展外来入侵物种的调查监测。环境DNA技术是在确定调查物种的特异性基因识别片段的基础上，利用各种分子手段检测环境DNA中所包含识别片段的情况，进而确定取样环境中生物的分布状况，并可以根据环境DNA浓度来推测物种生物量。环境DNA技术可以在不采集动物标本或发现动物实体的条件下监测物种分布情况，相对于传统的生物调查方法，具有标准化、灵敏度高、对生态系统干扰少、调查成本低等优势，是外来入侵物种野外调查监测研究中的有力工具。
目前，利用环境DNA开展入侵物种的调查监测时，大多采用的是荧光定量PCR(qPCR)技术。但由于提取的环境DNA通常存在一定量的PCR抑制剂，qPCR过程很容易受到抑制剂的干扰，影响其扩增效率。而且，在野外调查中，外来入侵物种的环境DNA浓度通常很低，qPCR的定量检测完全依赖于标准曲线和Ct值，当qPCR检测样本的Ct值大于30的情况下，其数据精确度和重复性都急剧下降。因此，急需开发一种更加灵敏、准确、对抑制剂更加耐受的环境DNA检测技术。
微滴式数字PCR(digital droplet PCR, ddPCR)是一种新的绝对定量技术，采用数字化终点荧光检测方式和分子计数的定量手段，不依赖于标准曲线和参照、对影响PCR扩增效率的抑制物不敏感，相对于qPCR技术，ddPCR在检测复杂背景样品中低丰度核酸序列方面更加灵敏可靠，但是目前，ddPCR技术在外来入侵物种环境DNA检测中的应用还很少。在采用环境DNA方法调查红耳龟的野外分布情况时，由于其环境DNA浓度通常很低，传统的qPCR技术在检测的灵敏性、准确性和稳定性都受到一定限制。因此，本发明提供了一种定量检测环境中红耳龟生物量的特异性引物及其检测方法。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种定量检测环境中红耳龟生物量的特异性引物及其检测方法和应用，以提供一种特异性扩增引物序列，该引物序列配合ddPCR技术，解决了现有检测技术灵敏度、准确度和重复性都低的技术问题。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供了一种定量检测环境中红耳龟生物量的特异性引物，其特征在于，所述引物包括KM216748F和KM216748R，所述KM216748F和KM216748R的序列为：
正向引物KM216748F：5’-TCTTCTAGGGTAAATCCTATTG-3’
反向引物KM216748R：5’-AACAGTAGCCATCATTGAACTAGG-3’。
该引物为红耳龟线粒体DNA中的基因序列片段的特异性扩增引物，所述基因序列的NCBI序列号为KM216748.1。
本发明还提供了一种利用上述引物定量检测环境中红耳龟的方法，具体为使用上述的引物对待检测环境样本的DNA进行ddPCR扩增。
作为本发明进一步的优化方案，所述利用上述引物定量检测环境中红耳龟的方法，包括以下步骤：
步骤S1、提取待检测环境样本的DNA；
步骤S2、以提取的环境DNA为模板，以KM216748F2和KM216748R2为特异性扩增引物，进行ddPCR扩增反应；
步骤S3、利用微滴分析仪对扩增产物进行荧光检测和分析，并通过QuantSoft软件计算目标基因的拷贝数浓度。
作为本发明进一步的优化方案，所述步骤S1中待检测环境样本的DNA为待检测水体环境或土壤环境样本的DNA。
作为本发明进一步的优化方案，所述步骤S2中ddPCR的扩增反应体系包括：10μl的2X ddPCR EvaGreen Supermix、5μl的无菌去离子水、浓度为10μM的正反向引物各1.5μl，以及2μl DNA模板。
作为本发明进一步的优化方案，所述步骤S2中ddPCR的扩增反应程序为：50℃热激活120s；95℃预变性120s；95℃变性3s，55℃退火及延伸30s，共40个循环。
作为本发明进一步的优化方案，所述步骤S3的步骤包括：将扩增产物置于微滴分析仪内，利用QuantSoft软件的ABS检测模式，检测微滴的荧光信号，根据检测到的阳性微滴和阴性微滴的比例，由QuantSoft软件计算获得样品中目标基因的拷贝数。
本发明还提供了一种上述引物在定量检测环境中红耳龟生物量中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明选择红耳龟线粒体基因作为目的基因，开发获得了一种特异性扩增引物，该引物与ddPCR技术相结合，能够完全适用于本发明的定量检测，实现对红耳龟线粒体基因的特异性扩增，具有针对性强的特点。并且，ddPCR在检测过程中不依赖标准曲线，且能够避免背景DNA中抑制剂的干扰和不同样品和试验过程中PCR扩增效率变化的影响，具有更高的灵敏度和准确度，能够精准定量检测红耳龟线粒体基因的拷贝数浓度。
附图说明
图1是红耳龟和其它6种龟类线粒体基因的ddPCR扩增图；
图2是红耳龟环境DNA的ddPCR扩增图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1 引物设计
从NCBI网站上获取红耳龟线粒体DNA中的基因序列（NCBI序列号：KM216748.1），以基因序列为模板设计用于检测红耳龟的特异性PCR引物，本实施例共获得了三对引物，分别为KM216748-F1/KM216748-R1、KM216748-F2/KM216748-R2和KM216748-F3/KM216748-R3，引物序列如下表1所示：
表1：引物序列表
引物名称 序列
KM216748-F1 5’-TCAATTTTCTTCTAGGGTAAATCC-3’
KM216748-R1 5’-CAGTAGCCATCATTGAACTAGGAC-3’
KM216748-F2 5’-TCTTCTAGGGTAAATCCTATTG-3’
KM216748-R2 5’-AACAGTAGCCATCATTGAACTAGG-3’
KM216748-F3 5’-CTAGGGTAAATCCTATTGAT-3’
KM216748-F3 5’-ACAGTAGCCATCATTGAAC-3’
2.2 引物有效性验证
为了验证上述引物的有效性，本实施例中，选择红耳龟及其它6种中国野外常见龟类（中华鳖Pelodiscus sinensis、中华花龟Mauremys sinensis、黄喉拟水龟Mauremysmutica、大鳄龟Macroclemys temminckii、佛罗里达鳖Apalone ferox和乌龟Mauremysreevesii）作为样品，进行ddPCR检测，具体步骤如下：
2.2.1 红耳龟、中华鳖、中华花龟、黄喉拟水龟、大鳄龟、佛罗里达鳖、和乌龟的基因组DNA，采用超微量核酸定量分析仪（Implen-NP80，德国）对基因组DNA浓度和纯度进行检测，结果表明，提取DNA的OD260nm/OD280nm比值均在1.7至1.9之间，浓度均约为100ng/µL，对以上提取的基因组DNA进行10倍稀释后，作为ddPCR的模板备用；
2.2.2 将步骤2.1的三对引物用TE进行溶解稀释，引物稀释后的浓度为10µmol/L；
2.2.3 ddPCR扩增反应
ddPCR反应体系：10μl的2X ddPCR EvaGreen Supermix、5μl的无菌去离子水、浓度为10μM的正反向引物各1.5μl，以及2μl DNA模板；
将配置好的样品反应体系加入微滴发生卡的样品孔中，注意加样过程中避免产生气泡，再将70µL的微滴发生油加入到微滴发生卡的反应油孔内，将密封垫盖在发生卡底座上，置于微滴发生器中生成油包水的微滴；
微滴生成是ddPCR的关键步骤，只有微滴数大于11000时，DNA分子的分布才能符合泊松分布的统计学原理，系统才可以对阳性和阴性微滴进行计数。本实验中，ddPCR反应中形成的微滴数均大于11000，满足ddPCR微滴的分析要求；
从微滴发生卡上层反应孔内吸取40 µL微滴，转移至96孔PCR反应板的一个反应孔内，注意避免微滴的破坏和聚集，封膜仪180℃热封，使用热封铝膜封口后置于PCR仪上进行PCR扩增；
ddPCR反应程序为：50℃热激活120s；95℃预变性120s；95℃变性3s，55℃退火及延伸30s，共40个循环。
2.2.4 ddPCR结果读取与分析
ddPCR反应结束后，将扩增后的PCR反应板置于微滴分析仪内，打开QuantSoft软件，点击Flush System键冲洗系统，然后点击Setup键输入样品信息，检测模式设定为ABS，选择染料法试剂盒，输入完成后点击Run，微滴分析仪会自动对每个微滴进行荧光检测和分析，判断各微滴是否发生了PCR扩增反应，若发生了扩增，则为阳性微滴，若未发生扩增，则为阴性微滴。最后利用QuantSoft软件，根据检测到的阳性微滴和阴性微滴的比例，按照泊松分布原理计算获得样品中目标基因的拷贝数浓度。
根据QuantSoft软件读取红耳龟、中华鳖、中华花龟、黄喉拟水龟、大鳄龟、佛罗里达鳖和乌龟线粒体基因的拷贝数浓度。结果只有引物KM216748-F2/KM216748-R2能够对红耳龟线粒体基因进行特异性定量检测，而引物KM216748-F1/KM216748-R1和KM216748-F3/KM216748-R3都无法实现特异性定量检测。
采用引物KM216748-F2/KM216748-R2对红耳龟、中华鳖、中华花龟、黄喉拟水龟、大鳄龟、佛罗里达鳖和乌龟线粒体基因进行ddPCR扩增的结果如下表2和图1所示：
表2：龟类线粒体基因的拷贝数浓度
Figure DEST_PATH_IMAGE001
图1中，以横线为基线，上半部分的黑色信号点代表发生PCR扩增的微滴，系统判读为阳性信号，下半部分的黑色信号点代表未发生PCR扩增的微滴，系统判读为阴性信号。其中，C01为红耳龟、D01为中华鳖、H01为中华花龟、B02为黄喉拟水龟、E02为大鳄龟、G02为佛罗里达鳖、F03为乌龟。
从表2和图1中可以看出，采用引物KM216748-F2/KM216748-R2进行的ddPCR扩增，检测到的阳性微滴与阴性微滴能够很好的区分开，红耳龟线粒体基因的浓度为3307±1079copies/ul，而中华鳖、中华花龟、黄喉拟水龟、大鳄龟、佛罗里达鳖和乌龟线粒体基因的拷贝数浓度在0.02±0.04～0.18±0.03copies/ul之间，均可判定为阴性。以上说明ddPCR的结果与预期相符，引物KM216748-F2/KM216748-R2能够对红耳龟线粒体基因进行特异性定量检测。
2.3 环境中红耳龟生物量的检测
2.3.1 建立龟类混合种群
首先将乌龟、中华花龟、黄喉拟水龟、中华鳖和佛罗里达鳖五种龟类混合养殖于10L的鱼缸中，加入2L水，养殖1天后，再将红耳龟加入到混合种群中养殖2天。实验开始前，所有龟在实验室驯养两周。养殖实验前48h及实验期间禁食。
2.3.2 水样环境DNA的采集及提取
在将红耳龟加入混合种群之前，先对本底水样进行取样，作为空白对照。实验结束后用100ml烧杯收集水样，一共收集3份。先将收集的水样静置1小时，在靠近烧杯底部的位置取样，取15mL水样装入50mL无菌离心管中，每个烧杯取2次样。使用注射器将水样经0.45μm孔径针头式过滤器过滤，过滤完后，用灭菌镊子从边缘夹起滤膜，放入无菌离心管中，按照QIAamp DNA Blood Mini Kit (50T)（QIAGEN, cat No 51104，德国）试剂盒说明书操作，提取水样环境DNA。采用核酸微量分析仪（Implen-NP80，德国）测定环境DNA浓度。
2.3.3 ddPCR定量检测环境DNA
ddPCR反应体系：10μl的2X ddPCR EvaGreen Supermix、5μl的无菌去离子水、浓度为10μM的正反向引物各1.5μl，以及2μl DNA模板；其中，所述的正反向引物为KM216748-F2/KM216748-R2
按照上述步骤2.2.3的操作方法进行ddPCR，获得反应微滴。
2.3.4 ddPCR结果读取与分析
读取与分析的步骤同上述步骤2.2.4，结果如下表3、图2所示：
表3：ddPCR扩增的总微滴数及红耳龟环境DNA的拷贝数浓度
Figure DEST_PATH_IMAGE002
图2中，以横线为基线，上半部分的黑色信号点代表发生PCR扩增的微滴，系统判读为阳性信号，下半部分的黑色信号点代表未发生PCR扩增的微滴，系统判读为阴性信号。其中，E01、G02和H02分别为水样1，水样2和水样3；F03、G03和H03为空白对照水样。
由表3和图2可以看出，采用引物KM216748-F2/KM216748-R2进行的ddPCR反应中形成的微滴数处于13102-18645之间，均大于11000，满足ddPCR微滴的分析要求。本实验中检测到红耳龟环境DNA的拷贝数浓度平均为4.87～9.73copies/µL，在空白对照的水样中没有检测到红耳龟的环境DNA。本结果表明ddPCR能够灵敏、准确地的从环境样本中检测到红耳龟的环境DNA，所设计的引物具有较好的特异性和稳定性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种利用特异性引物定量检测环境中红耳龟的方法，其特征在于，使用所述特异性引物对待检测环境样本的DNA进行ddPCR扩增，所述特异性引物的序列为：
正向引物KM216748F2：5’-TCTTCTAGGGTAAATCCTATTG-3’
反向引物KM216748R2：5’-AACAGTAGCCATCATTGAACTAGG-3’；
方法包括以下步骤：
步骤S1、提取待检测环境样本的DNA；
步骤S2、以提取的环境DNA为模板，以KM216748F2和KM216748R2为特异性扩增引物，进行ddPCR扩增；
步骤S3、利用微滴分析仪对扩增产物进行荧光检测和分析，并通过QuantSoft软件计算目标基因的拷贝数浓度。
2.根据权利要求1所述的定量检测环境中红耳龟的方法，其特征在于，所述步骤S1中待检测环境样本的DNA为待检测水体环境或土壤环境样本的DNA。
3.根据权利要求1所述的定量检测环境中红耳龟的方法，其特征在于，所述步骤S2中ddPCR的扩增反应体系包括：10μl的2X ddPCR EvaGreen Supermix、5μl的无菌去离子水、浓度为10μM的正反向引物各1.5μl，以及2μl DNA模板。
4.根据权利要求3所述的定量检测环境中红耳龟的方法，其特征在于，所述步骤S2中ddPCR的扩增反应程序为：50℃热激活120s；95℃预变性120s；95℃变性3s，55℃退火及延伸30s，共40个循环。
5.一种如权利要求1所述的利用特异性引物定量检测环境中红耳龟的方法在定量检测环境中红耳龟生物量中的应用。
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