CN116064848B - 一种定量监测红耳龟环境dna时空分布的引物探针组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量监测红耳龟环境DNA时空分布的引物探针组合及其应用，属于环境DNA检测技术领域，包括引物组和探针，其中，所述的引物组的核苷酸序列如下所示：F：5’‑AACCCACGATCTACCTCACCATC‑3’；R：5’‑GCTGGACTAGTTTCATGGTTCC‑3’；探针的核苷酸序列如下所示：5’‑FAM‑TACCACCGTCGCCAGCTTACC‑MGB‑3’。本发明选择红耳龟线粒体12S rRNA基因作为目的基因，开发获得了一种特异性检测引物和探针，该引物和探针与微滴式数字PCR(ddPCR)技术相结合，能够完全适用于本发明的定量检测，实现对红耳龟线粒体12S rRNA基因的特异性扩增，具有针对性强的特点。

Description

一种定量监测红耳龟环境DNA时空分布的引物探针组合及其 应用

技术领域

本发明属于环境DNA检测技术领域，具体涉及一种定量监测红耳龟环境DNA时空分布的引物探针组合及其应用。

背景技术

红耳龟(Trachemys scripta elegans)作为全球100种恶性外来入侵物种之一，具有繁殖力强、食性广泛、栖息环境多样等特点，严重威胁本土龟类多样性及入侵地区的生态安全。早期监测预警是外来入侵物种有效防控和清除的关键，但在入侵的早期阶段，外来物种的种群密度较低，采用传统野外调查方法耗时、效率低、经济成本高，且难以及时发现。基于环境DNA(environmental DNA,eDNA)的技术以其高灵敏度和高效性极大地增加了外来物种入侵早期阶段发现的可能性，为入侵物种监测预警提供了新途径。

环境DNA在环境介质中的浓度和分布是由eDNA的产生、降解、迁移和散布等一系列动态变化过程共同决定的，eDNA的时空分布特征直接影响了基于eDNA的物种监测结果以及eDNA采样策略的制定。目前，对于eDNA时空分布的定量监测，大多是在不同时间尺度上检测eDNA的脱落降解速率，或者在不同空间尺度上检测eDNA在水体中的浓度和分布变化，尚未对其进行时间和空间分布的同步监测。而且，生物因素是影响eDNA时空分布变化的关键因素，已开展的相关监测研究主要针对鱼类、着生和底栖等生物类群，龟类eDNA在水体中的时空分布特征尚不清楚。

现阶段eDNA的定量检测多采用基于标准样品的荧光定量PCR(Quantitative PCR，qPCR)技术，需要根据标准品的拷贝数浓度和建立的标准曲线推断待测样品的浓度，难以实现真正意义上的绝对定量。而且，qPCR扩增过程容易受到DNA样本中抑制剂的干扰，影响扩增效率。由于生物释放到环境介质中的DNA分子大多以痕量形式存在，当环境DNA样本的Ct值大于30时，qPCR检测数据的准确度和重复性都急剧下降。微滴式数字PCR(digitaldroplet PCR,ddPCR)采用数字化终点荧光检测方式和分子计数的定量手段，不依赖于标准样品和扩增效率，能够克服PCR抑制剂的影响，可以对目标DNA直接进行绝对定量，尤其适用于痕量样品的定量检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种定量监测红耳龟环境DNA时空分布的引物探针组合及其应用。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供了一种定量监测红耳龟环境DNA时空分布的引物探针组合，包括引物组和探针，其中，所述的引物组的核苷酸序列如下所示：

F：5’-AACCCACGATCTACCTCACCATC-3’；

R：5’-GCTGGACTAGTTTCATGGTTCC-3’；

探针的核苷酸序列如下所示：

5’-FAM-TACCACCGTCGCCAGCTTACC-MGB-3’。

进一步改进在于，所述引物探针组合是以红耳龟线粒体12S rRNA基因核苷酸序列为目的基因设计的，所述红耳龟线粒体12S rRNA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种上述引物探针组合在定量监测红耳龟环境DNA时空分布中的应用。

本发明提供了一种上述引物探针组合定量监测红耳龟环境DNA时空分布的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在不同时间和空间尺度上采集待检测的环境样本，并进行环境DNA富集和提取；

(2)以提取的环境DNA为模板，采用所述引物探针组合，基于ddPCR技术对提取的环境DNA进行定量检测，获得ddPCR的定量检测结果；

(3)提取红耳龟组织样品基因组DNA进行等比稀释，以稀释后的红耳龟基因组DNA为模板，利用所述引物探针组合，采用ddPCR技术定量检测目的基因片段的拷贝数浓度，以建立ddPCR定量检测限；

(4)基于所述ddPCR的定量检测结果和所述ddPCR定量检测限，计算每个采样点红耳龟环境DNA的检出率及拷贝数浓度，以分析获得红耳龟环境DNA的时空分布。

所述步骤(1)中待检测环境样本的DNA为待检测水体环境或土壤环境样本的DNA。

进一步改进在于，所述ddPCR技术中的扩增反应体系包括：10μL的2X ddPCRSupermix for Probes、8μL的无菌去离子水、浓度为10μM的所述引物组中两引物各0.4μL、浓度为10μM的所述探针0.2μL、以及1μL的DNA模板。

进一步改进在于，所述ddPCR技术中的扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，共40个循环。

进一步改进在于，所述等比稀释具体为将浓度为100ng/μL的DNA按照等比级数为10的等比稀释，稀释后浓度分别为：1.0×10¹ng/μL、1.0×10⁰ng/μL、1.0×10^-1ng/μL、1.0×10^-2ng/μL、1.0×10^-3ng/μL和1.0×10^-4ng/μL。

线粒体DNA(mtDNA)具有分子量小、结构简单、拷贝数多、编码效率高、无组织特异性、进化速度较快等特点，而且，基因组数据库mtDNA序列信息覆盖度相对较高，便于对获取的eDNA进行序列比对、搜索和快速识别，已广泛应用于eDNA研究领域中。通过对红耳龟及其它6种中国野外常见龟类(中华鳖Pelodiscus sinensis、中华花龟Mauremys sinensis、黄喉拟水龟Mauremys mutica、大鳄Macroclemys temminckii、佛罗里达鳖Apalone ferox和乌龟Mauremys reevesii)线粒体全基因组序列信息(中华鳖线粒体基因组NCBI序列号：AY687385.1；中华花龟线粒体基因组NCBI序列号：FJ871126.1；黄喉拟水龟线粒体基因组NCBI序列号：DQ453753.1；大鳄线粒体基因组NCBI序列号：EF071948.1；佛罗里达鳖线粒体基因组NCBI序列号：FJ890514.1；乌龟线粒体基因组NCBI序列号：AY676201.1)的比对，发现线粒体12S rRNA基因在不同种龟类间的序列差异大，具有高度的多态性，有利于设计针对红耳龟的高特异性引物，且扩增该基因的稳定性和可重复性好。而已有研究采用的COI和Cyt b基因为线粒体上的蛋白质编码基因，具有一定的保守性，且通过序列比对发现其种间变异性没有12S rRNA高。

本发明具有如下有益效果：

本发明选择红耳龟线粒体12S rRNA基因作为目的基因，开发获得了一种特异性检测引物和探针，该引物和探针与ddPCR技术相结合，能够完全适用于本发明的定量检测，实现对红耳龟线粒体12S rRNA基因的特异性扩增，具有针对性强的特点。并且，ddPCR能够精准定量检测红耳龟12S rRNA基因片段的拷贝数浓度，定量检测限为1.47±0.23copies/μL，可以稳定检测出红耳龟12S rRNA基因片段的最低DNA浓度为1×10^-3ng/μL，与荧光定量PCR(qPCR)相比定量限降低了10倍，提高了检测的灵敏度和准确性。本发明提供了一种定量监测红耳龟环境DNA时空分布的方法，该方法可以精确获得红耳龟eDNA在静水生态系统中的时空分布特征，即eDNA有很强的空间聚集效应，主要集中于距红耳龟10m以内；受沉降作用影响，eDNA在40cm水层的检出率和浓度均高于20cm水层；eDNA扩散距离和浓度随红耳龟出现时间的增加而增加，在红耳龟从水体中取出7天后，eDNA急剧衰减到定量限以下。本发明为eDNA有效应用于红耳龟监测预警提供新的技术方法和数据支撑。

附图说明

图1为不同浓度红耳龟组织样品基因组DNA的ddPCR扩增图；

图2为红耳龟环境DNA检出率时空变化图；

图3为红耳龟环境DNA浓度时空变化图；

图4为qPCR扩增的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。

1、材料

本发明所用方法如无特别说明均为本领域技术人员所知晓的常规方法，所用试剂等，如无特别说明，均为市售购买产品。

2、方法

2.1引物和探针的设计

本发明以红耳龟线粒体12S rRNA基因序列(基因长度为969bp，NCBI序列号为NC_011573.1：71-1039)为模版，设计了5对用于检测红耳龟的引物12S-QF1/12S-QR1、12S-QF2/12S-QR2、12S-QF3/12S-QR3、12S-QF4/12S-QR4和12S-QF5/12S-QR5及一条探针12S-probe1，引物和探针序列如表1：

表1引物和探针序列

2.2引物和探针特异性的验证

为了筛选并验证上述引物和探针的特异性，本发明试验中，选择红耳龟及其它6种中国野外常见龟类(中华鳖Pelodiscus sinensis、中华花龟Mauremys sinensis、黄喉拟水龟Mauremys mutica、大鳄龟Macroclemys temminckii、佛罗里达鳖Apalone ferox和乌龟Mauremys reevesii)的组织样品进行ddPCR检测，具体步骤如下：

(1)采用DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒(QIAGEN，德国)提取红耳龟、中华鳖、中华花龟、黄喉拟水龟、大鳄龟、佛罗里达鳖和乌龟的组织样品基因组DNA，对基因组DNA进行10倍稀释后，作为ddPCR的模板备用；

(2)ddPCR特异性检测的反应体系为：10μL的2X ddPCR Supermix for Probes、8μL的无菌去离子水、浓度为10μM的正反向引物各0.4μL、浓度为10μM的探针0.2μL、以及1μL的DNA模板；

(3)将配置好的样品反应体系加入微滴发生卡的样品孔中，注意加样过程中避免产生气泡，再将70μL的微滴发生油加入到微滴发生卡的反应油孔内，将密封垫盖在发生卡底座上，置于微滴发生器中生成油包水的微滴；

(4)从微滴发生卡上层反应孔内吸取40μL微滴，转移至96孔PCR反应板的一个反应孔内，注意避免微滴的破坏和聚集，封膜仪180℃热封，使用热封铝膜封口后置于PCR仪上进行PCR扩增；

(5)ddPCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，共40个循环；

(6)ddPCR结果读取与分析：将扩增后的PCR反应板置于微滴分析仪(QX200，BIO-RAD,USA)内，打开QuantSoft软件，点击Flush System键冲洗系统，然后点击Setup键输入样品信息，检测模式设定为ABS，检测FAM荧光信号，输入完成后点击Run，微滴分析仪会自动对每个微滴进行荧光检测和分析，判断各微滴是否发生了PCR扩增反应，若发生了扩增，则为阳性微滴，若未发生扩增，则为阴性微滴。最后利用QuantSoft软件，根据检测到的阳性微滴和阴性微滴的比例，按照泊松分布原理计算获得样品中目标基因的拷贝数浓度。

根据QuantSoft软件读取红耳龟、中华鳖、中华花龟、黄喉拟水龟、大鳄龟、佛罗里达鳖和乌龟线粒体12S rRNA基因的拷贝数浓度。结果显示，引物12S-QF2/12S-QR2相较于其他四对引物的特异性更好，引物12S-QF2/12S-QR2和探针12S-probe1与红耳龟基因组DNA模板的匹配度更高，对红耳龟、中华鳖、中华花龟等7种龟类线粒体12S rRNA基因进行ddPCR定量检测的拷贝数浓度如表2：

表2不同种龟类线粒体12S rRNA基因拷贝数浓度

从表2可以看出，采用引物12S-QF2/12S-QR2和探针12S-probe1进行ddPCR扩增，红耳龟12S rRNA基因片段的拷贝数浓度为2900±286.48copies/μL，而乌龟、中华花龟、黄喉拟水龟、中华鳖、大鳄龟和佛罗里达鳖的拷贝数浓度在0.02±0.03～0.10±0.04copies/μL之间。基于ddPCR检出限判定标准，除红耳龟外其他龟类均为阴性。以上说明ddPCR的检测结果与预期相符，引物12S-QF2/12S-QR2和探针12S-probe1能够实现对红耳龟线粒体12SrRNA基因的特异性定量检测。

2.3建立ddPCR定量检测限

2.3.1红耳龟组织样品基因组DNA稀释

提取红耳龟组织样品基因组DNA，将基因组DNA(浓度为100ng/μL)按照等比级数为10的等比稀释，稀释后浓度分别为：1.0×10¹ng/μL、1.0×10⁰ng/μL、1.0×10^-1ng/μL、1.0×10^-2ng/μL、1.0×10^-3ng/μL和1.0×10^-4ng/μL。

2.3.2ddPCR扩增反应

将引物12S-QF2/12S-QR2和探针12S-probe1用超纯水进行溶解稀释，引物和探针稀释后的浓度均为10μM；以梯度稀释的红耳龟基因组DNA为模板，利用上述引物和探针进行ddPCR扩增反应，每个DNA模板设置3个技术平行。

(1)反应体系：10μL的2X ddPCR Supermix for Probes、8μL的无菌去离子水、浓度为10μM的正反向引物各0.4μL、浓度为10μM的探针0.2μL、以及1μL的DNA模板。

(2)反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，共40个循环。

2.3.3ddPCR结果读取与分析

ddPCR扩增结束后，将PCR反应板置于微滴分析仪内，对每个微滴逐个进行荧光检测和分析，使用QuantSoft软件分析不同浓度红耳龟基因组DNA中线粒体12S rRNA基因片段的拷贝数浓度。

结果显示，利用引物12S-QF2/12S-QR2和探针12S-probe1对红耳龟基因组DNA进行ddPCR检测，检测到的阳性微滴与阴性微滴能够很好的区分开(图1)。如表3所示，红耳龟基因组DNA浓度为1.0×10¹ng/μL时，由于检测到的12S rRNA基因片段浓度过高，ddPCR仪未读取出来；基因组DNA浓度为1.0×10⁰ng/μL时，12S rRNA基因片段拷贝数浓度为2070±62.82copies/μL；基因组DNA浓度为1.0×10^-1ng/μL时，检测到的拷贝数浓度为182.67±11.59copies/μL；基因组DNA浓度为1.0×10^-2ng/μL时，拷贝数浓度为16.43±0.72copies/μL；基因组DNA浓度为1.0×10^-3ng/μL时，12S rRNA基因片段的拷贝数浓度为1.47±0.23copies/μL；基因组DNA浓度为1.0×10^-4ng/μL时，有两个平行未检出。计算红耳龟每个浓度基因组DNA中检测到的12S rRNA基因拷贝数平均值及其标准差，根据每个浓度梯度的相对标准偏差值(RSD)确定ddPCR的定量限(limit of quantity,LOQ)，RSD值≤25％的DNA样品最低浓度或测得的最低拷贝数浓度即为定量限。基于此，ddPCR对红耳龟的定量检测限为1.47±0.23copies/μL，对应的基因组DNA最低浓度为1.0×10^-3ng/μL。

表3不同浓度红耳龟基因组DNA中12S rRNA基因拷贝数浓度

2.4qPCR定量限与ddPCR定量限的差异分析

以上述梯度稀释的红耳龟基因组DNA为模板，利用引物12S-QF2/12S-QR2和探针12S-probe1对不同浓度梯度的DNA模板进行qPCR定量检测，比对分析qPCR定量限与ddPCR定量限的差异。

2.4.1建立qPCR标准曲线

(1)制备质粒标准品

将浓度为10^-1ng/μL(3.03×10⁷copies/μL)的质粒标准品按照等比级数为10的等比稀释，稀释后的质粒浓度分别为：10^-2ng/μL、10^-3ng/μL、10^-4ng/μL、10^-5ng/μL、10^-6ng/μL和10^-7ng/μL，对应的拷贝数浓度分别为：3.03×10⁶copies/μL、3.03×10⁵copies/μL、3.03×10⁴copies/μL、3.03×10³copies/μL、3.03×10²copies/μL和3.03×10¹copies/μL。以梯度稀释的质粒标准品为模板，进行qPCR扩增反应，建立标准曲线(表4)。

(2)qPCR反应体系：10μL的2×Mastermix、7.6μL的无菌去离子水、浓度为10μM的正反向引物各0.4μL、浓度为10μM的探针0.2μL、0.4μL的50×ROX以及1μL的DNA模板。

(3)qPCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，共40个循环，16℃保存。

表4不同浓度质粒标准品qPCR检测循环数(Ct值)

由于拷贝数浓度为3.03×10²copies/μL和3.03×10¹copies/μL的两个标准品扩增Ct值与水的Ct值接近，在绘制标准曲线时不采用这两个点(图4)。

2.4.2不同浓度红耳龟基因组DNA的qPCR检测结果

利用引物12S-QF2/12S-QR2和探针12S-probe1对不同浓度红耳龟基因组DNA模板进行qPCR定量检测，通过与标准曲线比较，当基因组DNA为1.0×10^-3ng/μL时，目标基因扩增的Ct值已不在标准曲线范围内(表5)。因此，qPCR能够稳定检出红耳龟线粒体12S rRNA基因片段的最低基因组DNA浓度为1.0×10^-2ng/μL，对应的目标基因拷贝数为958copies/μL(表5)。与ddPCR的定量检测限比对可知，ddPCR能够有效稳定检出的最低基因组DNA浓度比qPCR低了10倍，而且其检测的精确度也远高于qPCR。

表5不同浓度红耳龟基因组DNA中12S rRNA基因拷贝数浓度

2.5红耳龟环境DNA时空分布的定量检测

通过人工控制实验，定量监测红耳龟环境DNA在静水生态系统中的时空分布特征。

2.5.1环境DNA样品的采集

将红耳龟放置于网箱中，每个网箱放置1只，共8个网箱，均匀固定于水塘靠近岸边的水体中，使网箱的一半浮于水面。放置红耳龟前，在水塘的不同位置至少采集3份水环境样品作为空白对照，并称量红耳龟体重和体长，保证所有个体大小一致。为监测红耳龟环境DNA在不同时间和空间上的分布变化，分别于红耳龟放置于水塘中的第7天、14天、21天、28天以及从水塘取出后的第7天和14天，在距网箱0m、1.5m、3m、6m、9m、18m和27m处平行设置7条采样线，在每条采样线水面下20cm和40cm深度分别采集水环境样品。每个采样点设置3个样品重复，每个样品体积为4L，共采集水环境样品252个。为避免潜在的DNA交叉污染，在环境样品采集过程中实验人员需戴无菌手套，所有重复使用的实验材料均用95％以上的酒精消毒。

2.5.2环境DNA的富集和提取

采用双通道水环境DNA过滤仪(WD-2,南京易基诺环保科技有限公司)和一体化eDNA富集试剂盒(WF0201012,南京易基诺环保科技有限公司)进行水环境DNA的富集和保存。

采用一体化环境DNA提取试剂盒(MT061,南京易基诺环保科技有限公司)提取水环境DNA。

通过核酸微量分析仪(Implen-NP80，德国)定量分析水环境样品DNA的浓度和纯度，结果表明，提取DNA的OD260nm/OD280nm比值均在1.7至1.9之间，浓度均为50ng/μL以上。

2.5.3利用ddPCR定量检测环境DNA

采用引物12S-QF2/12S-QR2(F:5’-AACCCACGATCTACCTCACCATC-3’/R：5’-GCTGGACTAGTTTCATGGTTCC-3’)和探针12S-probe1(5’-FAM-TACCACCGTCGCC AGCTTACC-MGB-3’)基于ddPCR技术对提取的环境DNA进行定量检测，每个环境DNA样品设置3个技术平行。

ddPCR的扩增反应体系包括：10μL的2X ddPCR Supermix for Probes、8μL的无菌去离子水、浓度为10μM的正反向引物各0.4μL、浓度为10μM的探针0.2μL、以及1μL的DNA模板。

将配制好的样品反应体系加入微滴发生卡的样品孔中，注意加样过程中避免产生气泡，再将70μL的微滴发生油加入到反应油孔内，将密封垫盖在发生卡底座上，置于微滴发生器中生成油包水的微滴。从微滴发生卡上层反应孔内吸取40μL微滴，转移至96孔PCR反应板的一个反应孔内，注意避免微滴的破坏和聚集，封膜仪180℃热封，使用热封铝膜封口后置于PCR仪上进行PCR扩增。

ddPCR的扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，共40个循环。

2.5.4环境DNA检测结果与分析

依据阴性对照和空白对照的扩增结果划定ddPCR检出阈值线，阈值线以上的微滴为阳性微滴，含有2个及以上阳性微滴的认定为阳性样本，每个eDNA样本的3个技术重复中，有2个及以上阳性的即为阳性eDNA样本。依据ddPCR对阳性eDNA样本检测的拷贝数浓度，计算其平均值。

2.5.4.1红耳龟环境DNA检出率的时空分布特征

监测结果显示，水平方向上，红耳龟eDNA有很强的空间聚集效应，主要集中于距生物放置点10m以内。在垂直方向上，受沉降作用影响，红耳龟eDNA在40cm水层的检出率高于20cm水层。随着红耳龟放置时间的延长，eDNA在水体中的扩散距离和沉降深度逐渐增加。在时间尺度上，红耳龟eDNA检出率随着其在水体中放置时间的增加而逐渐增加，在第28d时达到峰值，在第35d(即红耳龟从水体中取出后的第7d)，eDNA仅在距生物放置点9m以内的范围内能够检测到，取出后的14d所有检测点均未检出红耳龟eDNA(图2)。

2.5.4.2红耳龟环境DNA浓度的时空分布特征

监测结果显示，水平方向上，随着距红耳龟放置点距离的增加，红耳龟eDNA浓度急剧下降，6m以后eDNA浓度低于ddPCR定量检测限。垂直方向上，随生物放置时间的延长，40cm水层红耳龟eDNA浓度显著高于20cm水层(图3)。在时间尺度上，不同距离处的红耳龟eDNA浓度随生物放置时间的增加逐渐增加，在放置第28d时，各距离处eDNA浓度达到峰值，但18m和27m的eDNA浓度仍低于ddPCR定量限。红耳龟从水体中取出7d后，其eDNA浓度急剧衰减，各距离处的eDNA浓度均低于定量限(图3)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种引物探针组合定量监测红耳龟环境DNA时空分布的方法，其特征在于，所述引物探针组合包括引物组和探针，其中，所述的引物组的核苷酸序列如下所示：

F：5’-AACCCACGATCTACCTCACCATC-3’；

R：5’-GCTGGACTAGTTTCATGGTTCC-3’；

探针的核苷酸序列如下所示：

5’-FAM-TACCACCGTCGCCAGCTTACC-MGB-3’；

所述引物探针组合是以红耳龟线粒体12S rRNA基因核苷酸序列为目的基因设计的，所述红耳龟线粒体12S rRNA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述方法包括以下步骤：

（1）在不同时间和空间尺度上采集待检测环境样本，并进行环境DNA富集和提取；

（2）以提取的环境DNA为模板，采用所述引物探针组合，基于ddPCR技术对提取的环境DNA进行定量检测，获得ddPCR的定量检测结果；其中，所述ddPCR技术中的扩增反应体系包括：10μL的2X ddPCR Supermix for Probes、8μL的无菌去离子水、浓度为10μM的所述引物组中两引物各0.4μL、浓度为10μM的所述探针0.2μL、以及1μL的DNA模板；所述ddPCR技术中的扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，共40个循环；

（3）提取红耳龟组织样品基因组DNA并进行等比稀释，以稀释后的红耳龟基因组DNA为模板，利用所述引物探针组合，采用ddPCR技术定量检测目的基因片段的拷贝数浓度，以建立ddPCR定量检测限；

（4）基于所述ddPCR的定量检测结果和所述ddPCR定量检测限，计算每个采样点红耳龟环境DNA的检出率及拷贝数浓度，以分析获得红耳龟环境DNA的时空分布。

2.根据权利要求1所述的定量监测红耳龟环境DNA时空分布的方法，其特征在于，所述步骤（1）中待检测环境样本的DNA为待检测水体环境或土壤环境样本的DNA。

3.根据权利要求1所述的定量监测红耳龟环境DNA时空分布的方法，其特征在于，所述等比稀释具体为将浓度为100ng/μL的DNA按照等比级数为10的等比稀释，稀释后浓度分别为：1.0×10¹ng/μL、1.0×10⁰ng/μL、1.0×10^-1ng/μL、1.0×10^-2ng/μL、1.0×10^-3ng/μL和1.0×10^-4ng/μL。