CN108486227A - 基于环境dna技术对红耳龟生物量评估的引物及其方法 - Google Patents

基于环境dna技术对红耳龟生物量评估的引物及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的引物及其方法。本发明所述的方法包括以下步骤：1)通过qPCR技术制作红耳龟DNA浓度与Ct值的标准曲线；2)根据标准曲线测定不同红耳龟放养密度环境下的水体中的红耳龟eDNA浓度；3)将测得的红耳龟eDNA浓度与对应的红耳龟生物量制成相应曲线。结果表明，红耳龟eDNA浓度与其生物量成线性关系，R2为0.9429。本发明提供的方法在实验室环境下可通过检测水体对红耳龟进行快速识别，并且能够根据eDNA浓度评估红耳龟的生物量，为红耳龟的野外分布调查、数量评估及入侵程度等级评估等提供技术支撑。

Description

基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的引物及其方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的引物及其方法。
背景技术：
环境DNA(environmental DNA，eDNA)是指从环境样品(如水、粪便、土壤、排泄物等)中直接提取到的所有DNA片段集合。从环境样品中直接提取DNA片段后利用各种分子生物学手段对环境中的生物进行定性或定量分析的方法被称为eDNA技术。在水生动物调查研究中，eDNA技术与传统的调查方法相比，具有高效、快速、高灵敏度及对生物体无损伤的特点。近年来，eDNA技术已经在水生生物入侵、珍稀物种监测、生物多样性评估以及生物量估测等方面得到广泛应用。
生物入侵是威胁生态安全的主要因素之一。红耳龟Trachemys scripta elegans是世界上最危险的100个入侵物种之一，该种20世纪80年代被引入中国，目前已在中国野外广泛分布，严重威胁入侵地区的生态安全，并传播高致病性沙门氏菌，对人类健康构成巨大的威胁。快速准确地掌握红耳龟野外分布状况和种群数量是开展入侵防控工作的重要基础。传统龟类分布及种群数量调查以野外动物实体调查为主，耗时费力，效率较低，不利于大规模快速掌握红耳龟的野外入侵状况。因此，本发明专利提供了一种基于eDNA技术来评估水体中红耳龟生物量的方法。
发明内容：
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的引物及其方法。利用该引物通过荧光定量PCR技术检测不同生物量水体中的红耳龟eDNA浓度，构建水体中红耳龟eDNA浓度与其生物量之间关系的数学模型，为红耳龟野外调查及入侵监测提供新的思路及方法，也为红耳龟野外生物量的评估及入侵程度的估测提供研究基础及技术支撑。
本发明的目的是通过以下的技术方案实现的：
本发明提供的基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的引物是根据红耳龟线粒体DNA基因COI序列而设计的，所述的红耳龟COI碱基数为1542bp，上游引物F：
5'-GGGATGACCAAATCTACAATG-3'，如SEQ ID NO.1所示。
下游引物R：5'-TAATGGCACGAGTCAGTTCC-3'，如SEQ ID NO.2所示。
具体地，所述的基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的方法，包括以下步骤：
(1)提取红耳龟基因组DNA，获得DNA原液，然后将DNA原液进行梯度稀释，以稀释后的DNA作为反应模板，并利用权利要求1所述的引物进行qPCR扩增，制作红耳龟DNA浓度与qPCR反应Ct值的标准曲线；
(2)采集不同红耳龟群体密度环境下的水体样品，采用过滤法提取水体样品中的eDNA，以水体样品eDNA作为模板进行qPCR检测，记录Ct值；
(3)根据步骤(1)得到的红耳龟DNA浓度与qPCR反应Ct值的标准曲线，以及步骤(2)得到的Ct值，计算出红耳龟eDNA浓度；并将红耳龟eDNA浓度与对应的红耳龟生物量制成相应曲线，据此曲线判断水体中红耳龟eDNA浓度与红耳龟生物量之间的关系。
进一步地，所述步骤(1)中DNA原液进行梯度稀释的倍数分别为8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、512倍、1024倍和2048倍。所述DNA原液的浓度为0.248μg/μl。
进一步地，所述步骤(1)qPCR的反应体系为：红耳龟DNA模板DNA 2μL，2×SYBRqPCR Master Mix 10μL，100nmol/L的上游引物和100nmol/L的下游引物各0.5μL，ddH2O 7μL；反应条件为：95℃3min；95℃10s，57℃30s，72℃60s，40个循环；95℃15s，57℃60s，95℃15s；4℃保存。
进一步地，所述步骤(2)过滤法滤膜的孔径为0.45μm。
进一步地，所述步骤(2)qPCR的反应体系为：水体eDNA 2μL，2×SYBR qPCR MasterMix 10μL，100nmol/L的上游引物和100nmol/L的下游引物各0.5μL，ddH2O 7μL；反应条件为：95℃3min；95℃10s，57℃30s，72℃60s，40个循环；95℃15s，57℃60s，95℃15s；4℃保存。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明成功地利用荧光定量PCR法绘制了红耳龟DNA浓度与Ct值的标准曲线，据此测定了不同红耳龟群体密度环境下的水体样品中的eDNA，且首次构建红耳龟eDNA浓度与其生物量之间关系的数学模型，为开展野外红耳龟生物量、种群密度的评估及其分布现状的调查提供了技术支撑和理论依据，有利于对红耳龟的野外入侵程度进行等级划分，对红耳龟的入侵危害程度评价及防控具有重要意义。
附图说明：
图1为红耳龟DNA浓度与Ct值的标准曲线图。该图中的曲线方程为：y＝-3.164*log(x)+20.69，横坐标x代表红耳龟DNA稀释后的浓度，纵坐标y代表对应浓度qPCR反应的Ct值，对数底数为10。
图2为红耳龟eDNA浓度与红耳龟密度的关系图。
图3为红耳龟eDNA浓度与红耳龟生物量的关系图。
图4为红耳龟生物量与红耳龟密度的关系图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下列实施例使用的相关仪器、试剂和材料的厂家为：梯度PCR仪(Bio-Rad，美国)、荧光定量PCR仪(Mx3000P，美国)、NanoDrop 3000荧光分光光度计(Thermo)、凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)，动物组织基因组DNA提取试剂盒、20mL注射器、针头式过滤器(0.45μm)购自生工生物工程(上海)股份有限公司，SYBR qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
实施例1
(1)引物设计
根据红耳龟线粒体DNA基因COI序列设计qPCR引物，具体为：
上游引物F为：5'-GGGATGACCAAATCTACAATG-3'；
下游引物R为：5'-TAATGGCACGAGTCAGTTCC-3'。
(2)红耳龟DNA浓度与Ct值的标准曲线制作
取红耳龟腿部肌肉组织，根据动物组织基因组DNA提取试剂盒说明书操作，提取红耳龟DNA，NanoDrop 3000荧光分光光度计测定DNA浓度，测得DNA原液的浓度为0.248μg/μl。将红耳龟DNA原液依次稀释8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、512倍、1024倍、2048倍，包括原液共10个DNA浓度。采用依次稀释好的DNA作为qPCR的反应模板，每种浓度均设置三个重复，绘制红耳龟DNA浓度与qPCR反应Ct值的标准曲线。qPCR反应体系为20μL：红耳龟DNA模板DNA 2μL，2×SYBR qPCR Master Mix 10μL，红耳龟COI上下游引物(100nmol/L)各0.5μL，ddH2O 7μL。反应条件为：95℃3min；95℃10s，57℃30s，72℃60s，40个循环；95℃15s，57℃60s，95℃15s；4℃保存。
结果表明，红耳龟DNA浓度与Ct值成相应曲线关系，该曲线方程为：y＝-3.164*log(x)+20.69，其中，x为红耳龟DNA稀释后的浓度，y为对应浓度qPCR反应的Ct值，对数底数为10。具体见图1所示。
(3)水体eDNA提取
选用大小均一、体重相近的250只红耳龟(平均体重约30g)，设置10、30、50、70及90只五个梯度，分别放入五个养殖箱中，每盒养殖箱加入的水量均为5L。试验期间禁食，3天后用100ml烧杯分别收集水样，先将收集的全部水样静置1小时，在靠近烧杯底部的相同位置取样，取15mL水样装入50mL无菌离心管中，每组6个重复。使用注射器将水样经0.45μm孔径针头式过滤器过滤，过滤完后，用灭菌镊子从边缘夹起滤膜，放入无菌离心管中，按照动物组织基因组DNA提取试剂盒说明书操作，提取水体eDNA。NanoDrop 3000荧光分光光度计测定eDNA浓度。
(4)红耳龟eDNA浓度与龟密度/生物量的关系
以各试验组水体eDNA为模板进行qPCR检测，记录其Ct数值。按照红耳龟DNA浓度与Ct值的标准曲线计算各组红耳龟eDNA的浓度，并将红耳龟eDNA浓度与其对应的红耳龟生物量制成相应曲线。qPCR反应体系为20μL：水体eDNA 2μL，2×SYBR qPCR Master Mix 10μL，红耳龟COI qPCR上游引物F(100nmol/L)(5'-GGGATGACCAAATCTACAATG-3')和下游引物R(100nmol/L)(5'-TAATGGCACGAGTCAGTTCC-3')各0.5μL，ddH2O 7μL。反应条件为：95℃3min；95℃10s，57℃30s，72℃60s，40个循环；95℃15s，57℃60s，95℃15s；4℃保存。
结果表明，红耳龟eDNA浓度与龟密度间成正相关(图2)，红耳龟的密度增加水体中红耳龟eDNA浓度也随之升高；红耳龟eDNA浓度与红耳龟生物量成线性关系，y＝0.0506x+2.3795，R2为0.9429(图3)；另外，红耳龟生物量与水体中龟密度成线性关系，y＝7.64x-23.2，R2为0.9973(图4)。
eDNA技术中水样的采集方法采用过滤法，是指取一定量的水样经过滤膜过滤，使eDNA保留在滤膜上，通过收集滤膜上eDNA达到DNA采集量。本实验采用过滤法采集水样eDNA，发现过滤法收集的水体eDNA量与红耳龟密度成正相关，表明这一方法的可行性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省生物资源应用研究所
<120> 基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的引物及其方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 上游引物(Forward primer)
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 下游引物(Reverse primer)
<400> 2

Claims (6)

1.一种基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的引物，其特征在于，所述的引物为：
上游引物F：5'-GGGATGACCAAATCTACAATG-3'；
下游引物R：5'-TAATGGCACGAGTCAGTTCC-3'。
2.一种基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取红耳龟的基因组DNA，获得DNA原液，然后将DNA原液进行梯度稀释，以稀释后的DNA作为反应模板，并利用权利要求1所述的引物进行qPCR扩增，制作红耳龟DNA浓度与qPCR反应Ct值的标准曲线；
(2)采集不同红耳龟群体密度环境下的水体，采用过滤法提取水体中的eDNA，以水体eDNA作为模板进行qPCR检测，记录Ct值；
(3)根据步骤(1)得到的红耳龟DNA浓度与qPCR反应Ct值的标准曲线，以及步骤(2)得到的Ct值，计算出红耳龟eDNA；并将红耳龟eDNA以及对应的红耳龟生物量制成相应曲线，据此判断红耳龟eDNA与红耳龟生物量的关系。
3.根据权利要求2所述的基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的方法，其特征在于，所述步骤(1)中DNA原液进行梯度稀释的倍数分别为8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、512倍、1024倍和2048倍。
4.根据权利要求2所述的基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的方法，其特征在于，所述步骤(1)qPCR的反应体系为：红耳龟DNA模板DNA 2μL，2×SYBR qPCR Master Mix 10μL，100nmol/L的上游引物和100nmol/L的下游引物各0.5μL，ddH2O 7μL；反应条件为：95℃3min；95℃10s，57℃30s，72℃60s，40个循环；95℃15s，57℃60s，95℃15s；4℃保存。
5.根据权利要求2所述的基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的方法，其特征在于，所述步骤(2)过滤法滤膜的孔径为0.45μm。
6.根据权利要求2所述的基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的方法，其特征在于，所述步骤(2)qPCR的反应体系为：水体eDNA 2.0μL，2×SYBR qPCR Master Mix 10μL，100nmol/L的上游引物和100nmol/L的下游引物各0.5μL，ddH2O 7μL；反应条件为：95℃3min；95℃10s，57℃30s，72℃60s，40个循环；95℃15s，57℃60s，95℃15s；4℃保存。
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