JP2006141394A - アルゴリズムを使用する試料の定量分析 - Google Patents

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Abstract

【課題】病原体を検出するための、ＰＣＲに基づく診断試験を数学的に解析する方法の開発。
【解決手段】試料中の特異的核酸配列の存在を決定するために、決定すべき核酸に結合できる標識化された物質、または標識化性物質を添加し、前記標識化性物質は核酸を標識化する能力を有するか、あるいは核酸を代表する。その存在を決定すべき核酸を増幅し、標識化された物質の増加および/またはこの特異的核酸の増加により生ずる標識化された物質により開始された効果を測定する。線形曲線からの偏差を決定するモデルを使用して、時間に対するシグナル増加および効果を時間に対して解析する。
【選択図】なし

Description

本発明は、請求項1に記載の序論に従う特異的核酸の存在を決定する方法、試料中の特異的核酸を検出する数学的モデル、および特異的核酸が試料中に存在するか否かを決定するための数学的モデルの使用に関する。
前記核酸中に含有される配列に基づいて核酸を検出し、定量する多数の異なる分析法の中で、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) は最も強力な広く使用されている技術であり、その原理は米国特許第4,683,195号および米国特許第4,683,102号に記載されている。
PCR技術の複数の可能な用途の中で、1つの重要な分野は、重大な医学的欠陥の原因となるDNA配列の検出、または重大な疾患、例えば、肝炎、エイズ、ヒト乳頭腫ウイルス (これは子宮頸癌を引き起こすことがある) 、トラコーマクラミジア (これは女性における不妊症に導くことがある) 、およびその他の診断である。PCR技術は、ヒトの健康および生命・生活の質を改良するために必須な研究および診断ツールとなった。PCR技術に従い、科学者は、まさに1つの細胞から、遺伝物質の検体を採り、その遺伝物質を何回もコピーし、特異的DNAウイルスまたは細菌、または遺伝物質の任意の特定の配列の存在または非存在を検出するために十分な被験試料を発生させることができる。
1つの非常に重要な特定の分野は、献血センターにおける血液検査であり、ここで短期間中に数千の血液試料を検査して、特定の系列の血液を使用できるか、あるいは廃棄すべきかどうかを決定しなくてはならない。特に血液検査について、汚染された血液を選別し、かつ重大な疾患、例えば、前述の疾患の原因となる特異的DNA配列を検出するために、急速な、容易な、絶対的に信頼性ある検査を考案することが重要である。
したがって、DNA増幅前にPCR混合物に添加し、増幅間にPCR生成物の分析に使用できる、標識化された物質を使用することが提案された。増幅を生成物の分析と組み合わせるという、この概念は、例えば、下記の文献に記載されている実時間PCRとして知られようになった: WO/97 46707、WO/97 46712、およびWO/97 46714。さらに、この技術は下記の文献に開示されている:EP 0 543 942ならびにEP 1 041 158およびEP 1 059 523。
詳しくは、蛍光実在物が使用され、これらは特異的核酸の存在を示すことができ、そして反応混合物中に存在する特異的核酸の量に関係する蛍光シグナルを提供することができる。換言すると、PCR進行間に核酸鎖のそれ以上の形成は、蛍光実在物のために事実上追跡可能である。
それに関する特定の方法は、いわゆるTaqManプローブの使用を含む。これらのプローブは、鋳型DNAのプライマー結合部位間に位置する領域にアニールした、短いDNAフラグメントである。これらのプローブは異なる位置にリポーター実在物とクエンチャー実在物とを有する。PCR溶液中のポリメラーゼは、DNA鋳型の倍加間にTaqManプローブを破壊することができる。そのようにすることにおいて、TaqManプローブはクエンチャー実在物を遊離させ、次いでクエンチャー実在物はリポーターの影響から離れる方向に移動する。それゆえ、ポリメラーゼが事実必要なDNAストランドをコピーした場合にのみ、リポーター実在物の蛍光を測定できる。リポーター実在物の各蛍光発生分子は、形成されたDNAストランドを表す。したがって、TaqManプローブを使用して、任意の所定の時間に形成した特異的DNAの量を測定し、決定できる。
現時点において、いわゆるTaqManプローブを使用することによって、試料中に特異的核酸が存在するかどうかを決定するために、蛍光の変化、好ましくは増加を測定し、時間、好ましくはPCR間のサイクル数に対してプロットする。測定点のプロットが多少線形基線を表す場合、特異的核酸が溶液中に存在しないという診断が通常なされる。例えば、血液検査は陰性であり、これは、例えば、肝炎、エイズ、およびその他を表す、重大な核酸、すなわち、DNAまたはRNAが存在しないことを意味する。線形基線に対する蛍光増加の偏差が観測される場合、これは曲線がいわゆる肘の偏差を含むことを意味し、診断は陽性であり、検査した血液が汚染されていることを意味する。
しかしPCR反応の反応速度論は非常に複雑であるので、蛍光シグナルのレベルは核酸の入力量に対して簡単な関係をもたないので、反応結果は特別のデータ解析を必要とする。診断、特に血液試料の診断のために実際に使用される方法において、診断結果のあるものは陰性と判定され、これは実際には陽性であることがある。
したがって、本発明の1つの主題は、実行が容易であり、比較的短い期間中に完結され、いっそう信頼性があり、比較的経済的である、試料中の特異的核酸を検出する方法を創作することである。
本発明によれば、請求項1に記載の方法が提案される。
提案された方法によれば、統計的に比較される線形/組み合わせた線形曲線およびS字形曲線の2つの線形モデルを組み合わせる、新規な定量的アルゴリズムが提案される。したがって、PCR技術を使用することによって、決定すべき核酸のある領域に対して相補的である配列を含有する試験すべき試料に、標識化された物質を添加して、前記配列が前述の試料中に存在するか否かを検出する。この混合物を、例えば、PCRにより、増幅条件下に維持し、そして特異的核酸の可能な増加のために、標識化された物質により開始されたシグナル増加および/または標識化された物質により開始された効果を測定または決定する。測定されたシグナルまたは効果の増加を時間、例えば、PCRのサイクルに対してプロットし、そして記載した回帰モデルの組み合わせを使用してプロットした結果を解析する。
それに関して、実時間反応速度論を使用してDNA試料の存在を決定する方法は下記の論文に開示されている: Liu Weihong 他、”Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics” Biochemical and Biophysical Research Communications、Vol. 294、No. 2、7 June 2002、pp. 347-353。提案された検出は、加法的線形ドリフトを含まない簡単なS字形モデルを使用し、定量的であるが、定性的ではない。この論文における目標は増幅効率を決定することであるが、プリセット増幅効率を決定することではない。
さらに、抗HIV 1活性を測定する実時間PCRは下記の論文に開示されている: Stuyver L. 他、”Using Real Time PCR to Determine Anti-HIV-1 Activity and Mitochondrial Toxicity of Nucleoside Analogs” Antiviral ResearchElseviere Science BV.、Amsterdam、NL、Vol. 51、No. 1、July 2001、pp. 53-54。提案された検出は定量的であるが、定性的ではなく、そしてCt (閾値サイクル) を使用し、本発明に含まれるように成長しない。最後に、この論文はHIVのみに関する。
再び、定量的決定であるが、定性的検出ではない方法が下記の論文に開示されている: Yang Ji-Hong 他、”Real Time RT-PCR for quantitation of hepatitis C virus RNA” Journal of Virological Methods、Vol. 102、No. 1-2、April 2002、pp. 119-128。Ct (閾値サイクル) を使用し、本発明に含まれるように成長しない。最後に、この論文はHIVのみに関する。
急速なサイクルのPCR間のTaq DNAポリメラーゼの反応速度論的パラメーターの推定は下記の論文に提示されている: Waterfall Christy M. 他、”Kinetic Characterisation of primer mismatches in allele-specific PCR: A quantitative assessment” Biochemical and Biophysical Research Communications、Vol. 299、No. 5、20 December 2002、pp. 715-722。加法的線形ドリフトを含まない簡単なS字形モデルが提案されている。さらに、S字形モデルは各単一工程における基質濃度についてのものであるが、全体の反応についてのものではない。この論文における目標は反応速度論的パラメーターの推定であり、定性的検出ではない。
US 20003/0236633 A1 (Mei Rui 他) には、遺伝子発現をモニターするためのオリゴヌクレオチドプローブが記載されている。再び、加法的線形ドリフトを含まない簡単なS字形モデルが提案されている。このS字形モデルはオリゴヌクレオチドの結合のためのものであるが、増幅反応についてのものではない。この特許出願の目標は反応速度論的パラメーターの推定であり、定性的検出ではない。
技術水準と比較して、本発明による提案された回帰モデルは偏向を考慮するか、あるいは
技術水準と比較して、提案された回帰モデルは回帰モデルに関する測定結果の偏向または偏差を考慮し、これは各サイクルにおける特定の蛍光シグナルの偏向または偏差をPCRの反応速度論のために考慮することを意味する。
第1に、完全なデータ組を使用して数学的回帰解析を行う。3つの回帰係数を使用して下記式に従い準線形回帰を多数回行う:
f(x) = β1 + β2 ・ x + β3 ・ s(x)
式中β1は定数であり、β2は線形傾きであり、そしてβ3はS字形、例えば、関数s(x) の大きさである。試行関数は、S字形曲線と比較して、定数 (プリセット) 傾きdをもつ線形曲線である。
これはプリセットサイクル数範囲 (入力パラメーター) にわたって変化する変曲点eを使用して作られる。計算した回帰係数β3の系列をそれ以上の解析のために使用する。添付された第1図において、サイクルに関してPCR間に測定した蛍光を代表する、線形および組み合わせたS字形曲線の回帰が示されている。
線形および組み合わせた曲線の回帰のために、例えば、下記の特定の数学的モデルが提案される:
項β3 = 0である場合、古典的線形回帰を使用し、直線を使用することを意味する。このような場合において、加速された蛍光増加が存在せず、したがって直線は混合物中の基本的蛍光を表しているので、診断は非常に簡単である。傾きの増加は、例えば、増幅に使用する試薬、例えば、「マスターミックス」の変化、pH値の変化、混合物の温度変化、およびその他により引き起こされることがある。
このような場合において、結果は陰性であるので、診断は簡単である。帰無仮説β3 = 0は、「陰性」として報告されるであろう成長が存在しないことに対応する。蛍光基線より上に存在する増幅サイクルのいずれかにおいて開始する蛍光増加により、陽性結果は示される。例えば、第7図を考慮すると、線形または組み合わせた線形およびS字形曲線の回帰が可能であるかどうかを判定することは時には非常に困難であり、これはβ3がゼロであるか否か決定することを意味する。
本発明によれば、統計的方法、例えば、回帰係数β3のt検定をさらに考慮することをここで提案する。統計的仮説の検定をS字形係数β3について行う。例えば、β3とβ3の標準誤差との間の比についてのt検定を使用して、前述の帰無仮説を研究する。この場合において、t値tは回帰係数およびその標準誤差の商として計算した正規化偏差である。
逆ステューデントのｔ分布関数から、統計的偽陽性 (統計的I型誤差) 確率pを計算することができる。統計的I型誤差pは、仮説が実際には真実であってさえ、この方法により拒絶されることを意味する。他の普通の統計的有意性の基準 (調節されたR2、SIC) は同様な結果に導く。第1図に示す最終結果について変曲点が変化する各回帰の最小t値に基づいて、変曲点が変化する最も有意な回帰が選択される。
第2図において、t検定ダイヤグラムが示されており、ここで線1はステューデントのｔ分布の密度関数を示す。この曲線は、陰性曲線の場合におけるtの関数としてｔ分布を示す (平均 (t) = 0) 。その曲線より下の面積は、特別のt値以下を示す陰性の確率を表す。線2はあるt値より大きいtの確率pを表す (対数目盛り) 。それはｔ分布関数の100%の累積確率として計算される。例えば、1.5のt値が非線形回帰により決定される場合、正しい陰性診断の高い確率が存在し、そして最終結果は多分陰性である。しかしt値が、例えば、6または7である場合、誤った陽性の結果の確率は非常に低い。これは最終結果が多分陽性であることを意味する。逆ステューデントのｔ分布関数は、グラフ中の5のt値を、可能な識別値として確率p 10^-7に関係づける。
ここで診断が陽性または陰性であるかどうかを判定するために、統計的に偽陽性の確率についてのカットオフ値は陽性/陰性の識別に役立つ。このパラメーターを使用して、アルゴリズムの感受性/特異性を調節することができる。
陰性と陽性との間のボーダーラインは、もちろん、各特定の適用について実験的値であり、これは前もって複数の検定を実行することによって表示しなくてはならない。
さらに、第3図は識別ヒストグラムであり、これは種々の実験的検定の結果を示す。換言すると、例えば、5のt値が1E-03以下のp値を有する場合、結果は陽性であろう。偽結果は非常に低い。しかし他方において、t値が例えば2であり、例えば1E-01のp値を有する場合、β3値が0に等しくない場合さえ、結果は陰性である可能性が非常に高いであろう。
第2図に戻ると、カットオフp値のこれらのボーダーラインおよび決定は参照数字5’および5”で示されている。再び、これらのボーダーラインの値は実験的に決定しなくてはならない。
アルゴリズムの主な結果は陽性と陰性との間の識別である。本発明による主な結果は、試料中の決定すべき特異的DNA配列または核酸が存在するか否かを判定することである。新しい試料を試験する場合において、血液試料がHIVウイルスで汚染されているか否かについての診断を容易に、急速にかつ絶対的に安全に実施できる。もちろん、他の欠陥、例えば、B型肝炎および前述した他の疾患を表す核酸に関して、同一の診断を行うことができる。また、計算した偽陽性 (I型誤差) の確率それ自体も結果の安全性の推定に役立つ。さらに、曲線の特性数値のいくつかの任意の推定がこの計算から抽出される。それらはR & Dの目的および可能な追加のコンシステンシーの基準のために使用できるであろう。
「S字形回帰」アルゴリズムを多少わずかに調節して、性能を改良した。当然、陰性のS字形パラメーターβ3は低下する。陽性のS字形パラメーターがまったく存在しない場合、陰性が報告される。非線形ドリフトを使用する陰性の偽検出を減少させる回帰のために、変曲後の20サイクルより大きいシグナルを使用しない。アルゴリズムはすべてのデータ点を使用するので、それは頑丈でありスパイクできない。したがって、スパイクの検出を必要としない。
本発明による「S字形回帰」アルゴリズムの視的印象を獲得するために、第4図および第5図に示す添付したグラフは2つのシグナル曲線を示す。第4図において、明らかに陰性の曲線が示されている。
第5図において、報告された陽性曲線が示されている。
交差値に相対的増加値を掛けることによって、第4図中の曲線のβ3値を評価する。換言すると、β3は6.22 × 10-2 = 0.062である。さらに示すように、p値は3.9E-2であり、偽陽性検出の値は非常に高いであろうことを意味する。
第5図において、β3は4.92 × 376% = 18.49である。偽陽性検出の確率は非常に低く、この値は1.1E-46である。したがって、試験し、第5図に示す試料の検出は陽性であり、そして誤った診断の確率はむしろ無視できる。
第6図および第7図に示す2つの曲線を比較しても、曲線中のどの結果が陰性結果を表すかは明らかではない。第6図および第7図はの回帰曲線を表すアルゴリズムのβ3値が平均偏差の範囲内にあることを示すことができ、これは結果が両方の場合においてちょうど陰性であろうことを意味する。第6図におけるβ3値は0.08であり、そしてp値は2.7E-05である。ダイヤグラムを見ると、これらの値はむしろ異常であるように思われるが、測定した試験点の巨大な広がりのために説明可能である。
第7図において、β3は0.12であるが、p値は4.6E-05である。不明確さが非常に高いか、あるいはβ3が非常に低いために、t-検定値がむしろ低い場合でさえ、診断は間欠的として考えられるであろう。先行する研究は、報告された結果を決定するカットオフ値に導く。
本発明による「S字形回帰」アルゴリズムは、ことに定性的検出のために開発された最初のものである。計算のためにすべてのデータ点を使用するとき、それは統計的に十分に基づく。しかしながら、それはなお実行が比較的簡単である。
初期のアルゴリズム比較解析は、5回のアッセイの低い陽性試料について平均感度の2倍〜5倍の増加を示した。特異性に影響を与えないで、これに到達した。
図１は、サイクル数に対する成長曲線の回帰を示す。 図２は、ｔ検定の分布を示すグラフである。 図３は、識別ヒストグラムを示すグラフである。 図４は、陰性の結果を示すシグナル曲線を示す。 図５は、陽性の結果を示すシグナル曲線を示す。 図６は、陰性の結果を示すグラフである。 図７は、陰性の結果を示すグラフである。

Claims (7)

  1. 決定すべき核酸に結合できる標識化された物質または標識化性物質を添加し、前記標識化性物質は核酸を標識化する能力を有するか、あるいは核酸を代表し、その存在を決定すべき核酸を増幅し、特異的核酸の増加のために標識化された物質または標識化性物質により開始されたシグナルの変化を測定し、そして下記式に従い線形曲線からの偏差を決定するモデルを使用して、標識化された物質または標識化性物質により開始されたシグナル変化を時間に対して解析することを含んでなる、試料中の特異的核酸の存在を決定する方法:
    f(x) = β1 + β2 ・ x + β3 ・ s(x)
    式中β1およびβ2は線形曲線の係数であり、そしてβ3はプリセット非線形の形状s(x) の係数である。
  2. 非線形係数β3および回帰からのデータの個々の偏差について解析学を実施することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
  3. 統計的検定、例えば、いわゆるt検定として、標準平均偏差検定、R^2検定、平均二次偏差を考慮する検定、または確率検定を使用することを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
  4. I型誤差 (仮説β3 = 0の) についてのt検定の統計的確率pを測度として使用してプリセットカットオフ値に対して比較し、ここでカットオフよりも小さいp値は陽性結果に関し、そしてより大きいp値は陰性結果に関係することを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
  5. プリセット曲線s(x) について、下記のS字形を使用することを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の方法:
    式中、
    dはプリセット傾きパラメーターであり、そして
    eは測定した範囲にわたって変化し、そして統計的に最良の回帰 (t検定の最小I型誤差p) を結果の生成に選択する。
  6. 標識化された物質が蛍光実在物を含んでなる、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
  7. HIV、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、またはヒト乳頭腫ウイルスを包含する病原体を検出するPCRに基づく診断試験における請求項1〜6のいずれかに記載の方法の使用。
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