CN112342279B

CN112342279B - 一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的试剂盒及其方法

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Publication number: CN112342279B
Application number: CN202011232085.8A
Authority: CN
Inventors: 杨军; 谭凤娇; 肖鹏
Original assignee: Institute of Urban Environment of CAS
Current assignee: Institute of Urban Environment of CAS
Priority date: 2020-11-06
Filing date: 2020-11-06
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2040-11-06
Also published as: CN112342279A

Abstract

本发明建立了一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的试剂盒及其方法。所述试剂盒含有SEQ ID No:1‑4所示序列；其中SEQ ID No:1‑2为检测拉氏尖头藻特异基因rpoC1的上下游引物，SEQ ID No:3‑4为检测产拟柱胞藻毒素特异基因cyrJ的上下游引物。还含有rpoC1基因荧光标记TaqMan探针和cyrJ基因荧光标记TaqMan探针。应用所述试剂盒进行数字PCR检测的方法灵敏度高、准确性高、特异性高，能方便精准地对水环境样本中拉氏尖头藻丰度和产拟柱胞藻毒素潜力进行测定和评估，实现拉氏尖头藻低丰度时期成功检出，达到早期检测和早期预警的效果。

Description

一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的试剂盒及其方法

技术领域

本发明涉及分子生物检测领域，尤其涉及一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的试剂盒及其方法。

背景技术

由于气候变暖、水体富营养化等原因，导致内陆水体蓝藻水华发生频率和强度增加，特别是湖库型饮用水源地容易发生蓝藻水华、甚至产生藻类毒素，不仅增加水处理成本、而且对人类健康造成巨大威胁。内陆水体中水华蓝藻种类很多，其中拉氏尖头藻(Raphidiopsis raciborskii)，之前称为拉氏拟柱胞藻(Cylindrospermopsisraciborskii)，是近年来在我国东南地区发现的一种新型的水华蓝藻，由于其具有较强的入侵性和高度适应性，其全球分布从最初的热带地区逐渐扩散到亚热带和温带地区。近几十年来，在温带和亚热带地区拉氏尖头藻水华事件的发生频率逐渐增加，其水华发生规律显著不同于微囊藻。值得注意的是，全球范围来看澳大利亚、东南亚地区的拉氏尖头藻存在产毒株系，其毒素是由产毒基因表达产生的拟柱胞藻毒素(cylindrospermopsins，CYNs)。拟柱胞藻毒素为肝毒素生物碱，具有水溶性和高稳定性，半衰期较长。在摄入到体内之后，通过不可逆抑制磷酸蛋白酶导致细胞死亡，进而对肝脏造成损害。除此之外，拟柱胞藻毒素还可以促进肿瘤发生、诱发染色体变异和胎儿畸变等。近十多年来，在我国东南地区许多水库型水源地发现拉氏尖头藻水华现象，水华形成之前的早期检测与早期诊断对蓝藻水华防控十分关键。然而，经典的显微镜方法费时费力、而且难于区分产毒株系和非产毒株系，普通的荧光定量PCR方法难于对低丰度蓝藻进行有效监测。因此，亟需研发快速、灵敏、准确和高效的技术方法对水体中拉氏尖头藻丰度及其产毒潜力进行监测和评估。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用数字PCR(dPCR)方法同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻与产拟柱胞藻毒素特异基因的方法，应用dPCR方法的灵敏度高、准确性高的优势，利用特异性引物精确地对拉氏尖头藻丰度及其产毒能力进行测定和评估，实现拉氏尖头藻低丰度时期成功检出，以达到早期检测和早期预警的效果。

为了实现上述目的，本发明提供一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的试剂盒，其特征在于，含有SEQ ID No:1-4所示序列；其中SEQ ID No:1-2为检测拉氏尖头藻特异基因rpoC1的上下游引物，SEQ ID No:3-4为检测产拟柱胞藻毒素特异基因cyrJ的上下游引物。

进一步，还含有rpoC1基因荧光标记TaqMan探针(VIC)和cyrJ基因荧光标记TaqMan探针(FAM)，其中rpoC1基因荧光标记TaqMan探针的序列为SEQ ID No:5，cyrJ基因荧光标记TaqMan探针的序列为SEQ ID No:6。

本发明还提供一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的检测方法，其特征在于，使用了所述试剂盒。

进一步，步骤为，将待测样本的DNA于暗光条件下加入到反应体系中，进行双模块dPCR扩增，读取数据结果，根据数据结果的平均值分别计算拉氏尖头藻特异基因rpoC1和产拟柱胞藻毒素特异基因cyrJ的拷贝数。

进一步，待测样本的DNA浓度为每个反应1-10⁴个拷贝。

进一步，所述反应体系为，14.5μL的反应体积，包括1×dPCR缓冲液7.25μL、SEQ IDNo:1-4所示序列各900nM、VIC探针和FAM探针各200nM、待测DNA样本和ddH₂O。

进一步，所述dPCR扩增的条件为，预变性94-96℃、5-10min；再按照以下设定条件PCR扩增循环36-39次：94-96℃、30s，56-58℃、2min；96-98℃、2min，最后10℃保温。

进一步，所述待测样本包括产毒拉氏尖头藻，也适用于其他水华蓝藻物种。

与现有水华蓝藻密度测定方法相比，本方法有以下优点：

(1)本发明所述的dPCR检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的方法结果计算不依赖于标准曲线，可同时实现蓝藻丰度及其产毒基因的绝对定量。

(2)本发明所述的dPCR检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的方法灵敏度较高，比显微镜方法和荧光定量PCR的检测限低3个数量级，最低可检测到每升水单拷贝，能够达到产毒蓝藻早期检测和早期预警的效果。

(3)本发明所述的dPCR检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的方法相比于传统的显微镜方法和荧光定量PCR操作简单，受环境抑制影响较小，结果重复性更好，应用价值较高。

(4)本发明所述的dPCR检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的方法所用样本量较少，可节省环境样本量。

附图说明

图1为dPCR方法测定拉氏尖头藻特异性基因rpoC1和产拟柱胞藻毒素基因cyrJ时，DNA浓度较为合适时的荧光分布图；

图2为dPCR方法测定拉氏尖头藻rpoC1和cyrJ两种基因时，DNA浓度过高时的荧光分布图；

图3为dPCR方法测定拉氏尖头藻rpoC1和cyrJ两种基因时，dPCR结果出现单拷贝时的荧光分布图；

图4为dPCR检测范围内预期拉氏尖头藻rpoC1和cyrJ基因预期拷贝值与实际测定拷贝数值关系曲线；

图5为建立本发明最优检测浓度范围的技术路线图；

图6为本发明用于水华蓝藻监测的路线图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

实施例1：dPCR技术对拉氏尖头藻rpoC1和cyrJ基因的最优检测浓度范围确定

1.获得已知拷贝数的rpoC1和cyrJ基因模板质粒DNA样本：

1)使用cyl2/cyl4和cyrJF/cyrJR两对引物对含有rpoC1和cyrJ的水环境DNA样本进行dPCR扩增，获得扩增产物；

cyl2：5’-GGCATTCCTAGTTATATTGCCATACTA-3’；SEQ ID No:1；

cyl4：5’-GCCCGTTTTTGTCCCTTTGCTGC-3’；SEQ ID No:2；

cyrJF：5’-GAGAAGCATCAAGCGTATCAT-3’；SEQ ID No:3；

cyrJR：5’-AGCATTGTC TCGGTAAACTCA-3’；SEQ ID No:4。

2)将步骤1)所得扩增产物使用试剂盒进行DNA回收纯化；

3)将步骤2)的纯化产物连接到Takara pMD18-T载体内，然后转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将感受态细胞加入到800μL LB液体培养基中摇菌培养40min后，取适当菌液均匀地涂在含氨卞抗生素的LB固体培养基平板上，37℃培养8-12h，挑取单克隆接种到含氨卞抗生素的LB液体培养基中进行摇菌，菌液浑浊后提取质粒，测定质粒质量和浓度，选择质量高，且两个基因质粒浓度较为相近的两种质粒待用；

2.质粒拷贝数计算：

提取的质粒，用超微量核酸蛋白质分析仪，检测其质量浓度a ng/μL。

计算重组质粒的分子量b＝质粒的分子量+插入片段的分子量＝(质粒的碱基数+插入片段的碱基数)×324.5×2；

重组质粒的拷贝数浓度c＝重组质粒的质量浓度a(ng换算成g)×6.02×10²³/分子量＝a×10^-9×6.02×10²³/b(copies/μL)；

得到两种基因质粒DNA模板的拷贝数；

3.将步骤2得到的拉氏尖头藻rpoC1和cyrJ基因的两种模板质粒DNA分别按照1:10体积比例进行梯度稀释，得到不同梯度浓度已知拷贝数的两种基因质粒模板DNA；

4.将步骤3所得两种基因质粒模板DNA样本进行dPCR测定：

1)反应体系为：1×dPCR缓冲液7.25μL、cyl2/4引物各900nM、cyrJF/R引物各900nM、VIC探针200nM、FAM探针200nM、步骤3所得两种基因模板质粒DNA样本和ddH₂O，最终体系体积为14.5μL；其中VIC探针(rpoC1基因荧光标记TaqMan探针)的序列为5’-VIC-TCCTGGTAATGCTGACACACTCG(SEQ ID No:5)-BHQ1-3’。FAM探针(cyrJ基因荧光标记TaqMan探针)的序列为5’-FAM-AGCATTCTCCGCGGATCGTTCAGC(SEQ ID No:6)-BHQ2-3’。

2)芯片上样：样本上样过程在暗光条件下进行，芯片上样完成后应立即放入黑暗条件下等待下一步操作；

3)双模块dPCR扩增：预变性温度为94-96℃、时间为5-10min；按照以下设定条件扩增循环36-39次：变性温度94-96℃、时间30s，退火延伸温度为56-58℃、时间2min；酶失活温度96-98℃、时间2min，最后10℃保温；

5.荧光信号读取：芯片读取之前，将芯片暗处理1-2h，待荧光信号稳定后进行荧光信号读取。多次读取，确保结果稳定，并取平均值；

6.结果统计与分析：当模板浓度为dPCR较为适合的测定浓度时，荧光信号分布均匀，如图1所示。当模板DNA浓度过高时，荧光信号会出现被覆盖的情况，如图2所示。当两种基因模板浓度为每升10³和10⁴个拷贝时，dPCR结果出现10倍梯度变化，且两种荧光信号分布均匀，dPCR结果分别为每升10³和10⁴个拷贝，荧光信号稳定且读数可重复；当两种基因模板浓度为每升10个拷贝以内时，dPCR结果出现单拷贝，荧光信号稳定且读数可重复，如图3所示。dPCR检测范围内rpoC1与cyrJ基因预期拷贝数值与实际测定数值之间具有极强的线性相关，如图4所示。可得出dPCR检测拉氏尖头藻特异性基因(rpoC1)和产拟柱胞藻毒素特异基因(cyrJ)的最优检测浓度范围为每个反应1-10⁴个拷贝。

能够理解的是，图1-3中的FAM、VIC、FAM+VIC等所标数值为检测到荧光信号的芯片孔的个数，并不代表基因丰度值。

实施例2：dPCR技术检测拉氏尖头藻菌株DNA及水环境DNA中的拉氏尖头藻rpoC1和cyrJ基因

1.取不同浓度拉氏尖头藻培养液样本(即纯种菌株DNA)及含有拉氏尖头藻的环境样本(即水环境DNA)；其中纯培养样本共72份，水环境样本共111份，又分为：

尖头藻高丰度样本组：样本中拉氏尖头藻细胞数浓度大于10⁷个/L，共37个样本；

尖头藻中丰度样本组：样本中拉氏尖头藻细胞数浓度为10⁵-10⁷个/L，共32个样本；

尖头藻低丰度样本组：样本中拉氏尖头藻细胞数浓度小于10⁵个/L，共42个样本。

2.使用0.22μm滤膜进行过滤，过滤后保留滤膜样本；

3.将滤膜样本进行DNA提取，分别获得DNA样本；

4.将步骤3所述DNA样本用无菌水稀释到适宜浓度；

5.将步骤4所得DNA样本进行dPCR测定：

1)反应体系为：1×dPCR缓冲液7.25μL、cyl2/4引物各900nM、cyrJF/R引物各900nM、VIC探针200nM、FAM探针200nM、步骤4所得DNA样本和ddH₂O；

2)芯片上样：样本上样过程中应该在暗光条件下进行，上样完成后应立即放入黑暗条件下等待下一步操作；

3)双模块dPCR扩增：预变性温度为94-96℃，时间为10min；按照以下设定条件扩增循环36-39次：变性温度94-96℃、时间30s，退火延伸温度为56-58℃、时间2min；酶失活温度96-98℃、时间2min,最后10℃保温；

6.荧光信号读取：芯片读取之前，将芯片暗处理1-2h，待荧光信号稳定后进行荧光信号读取，多次读取，确保结果稳定，并取平均值；

7.结果统计与数据分析：首先观察荧光信号是否分布均匀，VIC荧光结果值(即为拉氏尖头藻特异性基因的拷贝数)代表拉氏尖头藻特异性基因丰度值，FAM荧光结果值(即为产拟柱胞藻毒素特异基因的拷贝数)代表产拟柱胞藻毒素基因丰度值，最终可得到两个基因的最终定量结果。

本实施例的分析结果如表1和表2所示。表1说明本发明建立方法检测拉氏尖头藻与荧光定量PCR方法和显微镜方法结果的一致性；表2说明本发明建立方法检测拉氏尖头藻的高灵敏度、低检测限，适合水华蓝藻低丰度时期早期检测和早期预警。

表1 dPCR与qPCR方法和显微镜方法的结果相关性表

注：纯种菌株DNA即为拉氏尖头藻培养液样本；

水环境DNA即为含有拉氏尖头藻的水环境样本。

qPCR为荧光定量PCR，利用标准曲线根据PCR循环数所对应的拷贝数可得到样本中的基因丰度。

表中数值为Spearman相关性系数，**表示P值小于0.01。

表2水环境样本中拉氏尖头藻检出率表

注：检出率＝每组检出拉氏尖头藻的样本数/每组的样本数。

从表1可以看出，dPCR测定结果与qPCR方法和显微镜计数结果均具有较强的相关性，结果一致性较高，说明dPCR方法结果可靠、准确。表2结果显示，总体而言，dPCR检出率高于qPCR及显微镜计数法，尤其是拉氏尖头藻低丰度时期。表明dPCR检测可解决qPCR和显微镜方法在有害藻类低丰度时期检测的漏检或假阴性问题，进而起到精准检测、早期诊断、早期预警的作用。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院城市环境研究所

<120> 一种同时检测拟柱胞藻特异基因rpoC1及产毒特异基因cyrJ的试剂盒及其方

法

<130> HJYJ-20047-CNI

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggcattccta gttatattgc catacta 27

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gcccgttttt gtccctttgc tgc 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gagaagcatc aagcgtatca t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

agcattgtct cggtaaactc a 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tcctggtaat gctgacacac tcg 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

agcattctcc gcggatcgtt cagc 24

Claims

1.一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的dPCR检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

(1)配置反应体系，反应体系为，14.5μL的反应体积，包括1×dPCR缓冲液7.25μL、rpoC1基因上下游引物各900nM、cyrJ基因上下游引物各900nM、rpoC1基因荧光标记TaqMan探针和cyrJ基因荧光标记TaqMan探针各200nM、待测样本的DNA和ddH₂O；所述的rpoC1基因上下游引物为SEQ ID No:1-2，所述的cyrJ基因上下游引物为SEQ ID No:3-4，所述的rpoC1基因荧光标记TaqMan探针的序列为SEQ ID No:5，所述的cyrJ基因荧光标记TaqMan探针的序列为SEQ ID No:6，所述的待测样本为拉氏尖头藻；

(2)进行dPCR扩增，dPCR扩增的条件为，预变性95℃、10min；再按照以下设定条件PCR扩增循环39次：95℃、30s，58℃、2min；96℃、2min，最后10℃保温；

(3)读取荧光信号，根据荧光信号的平均值分别计算拉氏尖头藻特异基因rpoC1和产拟柱胞藻毒素特异基因cyrJ的拷贝数。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的待测样本的DNA的浓度为每个反应1-10⁴个拷贝。