CN106834461A - 生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，包括以下步骤：步骤一、以待测样品的DNA为模板，利用通用型引物对进行PCR扩增，扩增片段约为400bp；步骤二、扩增产物建库；步骤三、利用二代测序平台测序；步骤四、数据分析比对确认物种，其中，所述通用型引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明的生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，可以快速鉴定食品、化妆品和饲料中未知动物源性成分，实现真正意义上的全覆盖、无缝生物监测，从源头杜绝动物源性制品掺杂使假等行为，也为检测机构提供技术支持。

Description

生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测 方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，是基于二代测序技术的通用型物种特异性DNA分析技术，包括通用型引物对、数据库、分析方法、试剂盒与实际应用方法。

背景技术

动物源性制品的掺假是关系到人类食品安全和畜牧业健康发展的一个重要问题。事实上，饲料和食品安全问题不仅涉及人类的健康，而且涉及相关企业的生存、经济的发展、社会的稳定、甚至是民众对政府的信心等问题。一方面由于不同物种来源的动物组织、皮革、血液等本身具有相似的物理形态以及工业化处理加工技术的影响，普通消费者自己很难准确判定物种来源特别是众多混合动物源性制品各组成部分的真实性。未知来源的动物源性成分存在巨大的经济和安全漏洞，这是关系到人类食品安全和畜牧业健康发展的一个重要问题。事实上，动物源性制品安全问题不仅涉及人类的健康，而且涉及相关企业的生存、经济的发展、社会的稳定、甚至是民众对政府的信心等多方面问题。另一方面国内外目前使用的所有检测技术均不具备对未知来源的动物源性成分进行准确鉴定的能力。因此建立全新的通用型检测方法来对食品和饲料中的动物源性成分进行鉴定的研究显得十分必要和重要。

目前在食品安全检测技术方面，基于DNA序列的检测方法如聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction，PCR)和实时荧光PCR技术(Real-time fluorescencepolymerase chain reaction，qPCR)相比于其他方法具有较高的特异性、灵敏度和稳定性等优点，是目前最重要的检测技术，在食品饲料中转基因成分检测、动物源性成分检测、病原微生物检测、过敏源检测、真假鉴别等方面均具有非常成功和广泛的应用。但这些基于PCR技术的检测方法均具有一个严重的技术瓶颈，只能针对某一物种设计具有针对性的引物，然后针对其进行有目的的检测，如果待测样品是混合样品并具有完全未知的物种，则这些方法均无法完成检测。这一技术瓶颈一直困扰着相关领域检测工作人员。因此，有必要建立一种特异性好、且在一次实验中对混合样品中各已知或未知动物源性成分进行准确定性检测的检测方法。

DNA条形码技术是使用一段两端相对保守、中间具有足够区分度的，易于扩增的较短的DNA片段，并利用其具有种间特异性和种内保守性而创建的一种新的生物身份识别系统，以实现对物种的快速鉴定。

第二代测序技术(Next-generation sequencing)利用接头技术进行高通量并行PCR以实现大规模平行测序，同时结合微流体技术，利用计算机对测序数据进行拼接和分析，而且DNA被测次数还可以间接反映某种DNA的相对丰度。

发明内容

针对现有生物监测技术无法全面甄别不确定动物源性成分的不足，本发明的目的在于提供一种生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，是基于高通量测序技术和DNA条形码分析技术的通用型动物源性成分检测方法，包括通用型引物对、数据库、分析方法、试剂盒与实际应用策略。该方法可以实现对复杂混合生物制品中不可预测或未知物种进行准确筛选和鉴定，实现真正意义上的全覆盖、无缝生物监测，从源头杜绝动物源性制品掺杂使假等行为，也为检测机构提供技术支持。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个目的在于提供一种生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，该通用型检测方法包括以下步骤：

步骤一、以待测样品的DNA为模板，利用通用型引物对进行普通PCR扩增，其扩增片段约为400bp；

步骤二、扩增产物建库；

步骤三、利用二代测序平台测序；

步骤四、数据分析比对确认物种，

其中，所述通用型引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

根据本发明，步骤一的PCR扩增的条件如下：

PCR扩增的反应体系为50μL，包括2X Taq Master mix 25μL，正向引物、反向引物各10μM，DNA模板5μL；

PCR扩增程序为：98℃变性5min；进入循环，96℃变性20s，55℃退火30s和72℃延伸30s，共35个循环；延伸2min。

根据本发明，所述通用型检测方法还包括参考线粒体数据库的序列。

进一步的，所述步骤三是利用Illumina Miseq测序平台进行测序。

进一步的，所述步骤三是采用Ion Torrent半导体测序平台进行测序。

本发明的第二个目的在于提供一种生物制品中动物源性成分的通用型引物对，所述通用型引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

本发明的第三个目的在于提供一种上述所述的生物制品中动物源性成分的通用型引物对用于高通量二代测序。

本发明的有益效果是：

1、提供了一种针对复杂动物源性成分进行快速鉴定的技术，该检测技术创造性结合二代测序技术和物种特异性线粒体DNA barcode技术，针对食品、化妆品和饲料中混合未知动物源性成分进行快速鉴定。

2、与所有传统检测技术相比，不再需要使用特异性的引物有针对性的对某单一物种进行一对一检测，而是通过一次实验将待测样本中的各种动物源性成分进行准确区分鉴定，节省大量人力物力。

3、这一技术可以解决生物制品中大量不可预见动物源性成分难以同时鉴定的技术难题，从源头杜绝动物源性制品制假掺假等行为，从根本上堵住安全漏洞。

4、该通用型检测技术在多个领域具有广泛的科技应用价值：如食品安全领域，可以应用于肉类食品质量监督，为执法部门提供技术依据；在疾病控制领域，可以严防动物性疫病疫区的动物源性制品携带病毒传入我国，为我国畜牧业安全保驾护航；在国际贸易领域，可以为进出口企业消除贸易技术壁垒、为出入境检验检疫部门提供技术保障，为国际贸易纠纷仲裁提供技术支持；还可以为其它相关学科领域如物种分类学、比较遗传学、动物生态学提供一个新颖的研究方向和可靠的研究手段。

5、该方法自动化程度高，人为操作影响弱，操作简便，对人员要求低，适用范围广。

附图说明

图1为生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的结构示意图。

图2为实施例2的待测样品等比例混合的物种分布和丰度的示意图。

图3为实施例3的待测样品等比例混合的物种分布和丰度的另一示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

以下实施例的待测样品的线粒体基因组购自于Zyagen Laborateorie(SanDiego,CA,USA)，具体如表1所示。

表1 13种待测样品的来源和序列情况

以下实施例的参考线粒体数据库的序列来源于在线NCBI数据库，如表2所示。其中表2仅列出参考线粒体数据库的部分动物线粒体DNA的序列来源。

表2参考线粒体数据库

实施例1通用型动物源性成分特异性扩增引物的设计

本申请人通过设计多组引物，发现采用本发明的通用型动物源性成分特异性扩增引物对进行生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测的效果最好。

(1)本发明的通用型动物源性成分特异性扩增引物的序列如下：

NGS-382-F TAAGACGAGAAGACCCTRTGGA(SEQ ID NO：1)

NGS-382bp-R CGGTCTGAACTCAGATCACGTA(SEQ ID NO：2)

(2)PCR的反应体系和反应程序见表3和表4

表3 PCR反应体系

成分	体积(μl)
		2X Taq Master mix	25
正向引物(10μM)	1
		方向引物(10μM)	1
DNA模板(20ng/μl)	1
		ddH2O	22
总体积	50

表4 PCR反应条件

实施例2生物制品中动物源性成分的高通量二代测序，具体操作如图1所示。

(1)将实施例1的13种动物样品的特异性DNA等比例混合(如表5所示，每种动物样品以7.69％的标准比例混合)；

(2)利用实施例1的通用型引物对和PCR的反应体系和反应程序进行普通PCR扩增，获得扩增产物，构建PCR产物文库；

(3)利用Illumina Miseq 2*300PE模式对PCR产物进行高通量测序。IlluminaMiseq的2*300PE模式拥有高通量、高质量等特点，通过连接Pair-end两端reads，可以获得长约500bp的高质量测序序列，总分涵盖了382bp的扩增片段长度；

(4)对获得的测序数据进行生物信息学分析

首先，对测序数据进行质控，去除低质量的测序序列(包括去除reads中的接头序列、修剪测序质量值小于Q20的reads末端、切除两端引物序列、去除嵌合体序列)，再利用BLAST将过滤后的测序数据与表2建立的参考线粒体数据库进行比对，将满足阈值的比对结果进行统计以显示待测样品中的物种分布和丰度。结果见表5和图2。其中，表5的实际比例为高通量二代测序的结果。

表5等比例混合的动物样品中的物种分布和丰度

试验编号	动物样品	计数	实际比例	标准比例
					A6	山羊	16616	17.58％	7.69％
A13	火鸡	14522	15.36％	7.69％
					A12	绵羊	12434	13.15％	7.69％
A11	鹌鹑	8766	9.27％	7.69％
					A9	鹅	7975	8.44％	7.69％
A1	鸭	5374	5.68％	7.69％
					A2	鸡	4327	4.58％	7.69％
A3	牛	4257	4.50％	7.69％
					A8	猫	4208	4.45％	7.69％
A10	驴	4151	4.39％	7.69％
					A5	猪	4138	4.38％	7.69％
A7	马	4091	4.33％	7.69％
					A4	骆驼	3676	3.89％	7.69％

从表5和图2可以看出，13种添加的动物样品均可以在一次测序比对中被准确的认定。

结论：采用实施例1的通用型引物对和实施例2的高通二代测序方法可以同时对多个物种进行定性检测。

实施例3验证高通量二代测序的通用型方法的适用性

为了验证通量二代测序的通用型方法的的适用性(即是否适用于其他二代测序平台)，申请人以同样的样品和分析比对方法在赛默飞公司的Ion Torrent半导体测序平台上进行的验证。具体如下：

(1)待测样品制备方法与实施例2的方法一样

采用与实施例2相同的样品，等比例混合(如表6所示，每种动物样品以7.69％的标准比例混合)；

(2)测序文库的制备

按照Ion Torrent半导体测序平台的通用方法制备。

(3)测序方法按照Ion Torrent半导体测序平台要求进行。

(4)对获得的测序数据进行生物信息学分析

首先，对测序数据进行质控，去除低质量的测序序列(包括去除reads中的接头序列、修剪测序质量值小于Q20的reads末端、切除两端引物序列、去除嵌合体序列)，再利用BLAST将过滤后的测序数据与表2建立的参考线粒体数据库进行比对，将满足阈值的比对结果进行统计以显示待测样品中的物种分布和丰度。结果见表6和图3。其中，表6的实际比例为高通量二代测序的结果。

表6不同比例混合的动物样品中的物种分布和丰度

试验编号	动物样品	计数	实际比例	标准比例
					A6	山羊	9432	12.55％	7.69％
A3	牛	9125	12.14％	7.69％
					A12	绵羊	16382	21.80％	7.69％
A13	火鸡	224	0.30％	7.69％
					A2	鸡	677	0.90％	7.69％
A5	猪	9164	12.19％	7.69％
					A9	鹅	2884	3.84％	7.69％
A1	鸭	1387	1.85％	7.69％
					A8	猫	6563	8.73％	7.69％
A10	驴	4720	6.28％	7.69％
					A4	骆驼	3491	4.64％	7.69％
A7	马	6586	8.76％	7.69％
					A11	鹌鹑	4525	6.02％	7.69％

从表6和图3可以看出，即使更换完全不同的二代测序平台，不同比例混合的动物样品还是可以在一次测序比对中被准确的认定。说明该方法具有较好的跨二代测序平台适用性。

结论：采用Ion Torrent半导体测序平台的测序方法也可以同时对多个物种进行定性检测。

综上所述，本发明设计的通用型引物对，为快速鉴定生物制品中动物源性成分提供了一种很好的定性检测方法。该检测方法创造性的结合二代测序技术和物种特异性线粒体DNA barcode技术，通过该技术较长的测序读长和较大的测序通量，再结合特异性片段中间400bp左右的高区分度区间可以精确鉴定物种。

另外，该检测方法对具有高度一致性却不能匹配参考线粒体数据库的reads与在线NCBI数据库中45596条动物线粒体序列建立的线粒体参考数据库进行再次比对，比对结果分析确认物种后可以补充至本地库中。这一良性循环的方式既可以完成对不可预知物种的准确识别还可以进一步扩充本地物种特异性序列库的内容，为之后的比对提供更多参考数据。本检测系统具有自我完善更新能力，随着使用次数的增加，在对完全陌生的物种进行鉴定后，新数据补充至对比库，不断完善比对库，当再次遇见该物种时就可以快速识别。

此外，本发明设计的通用型引物对适合多种二代测序平台，适用范围广。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心

<120> 生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法

<130> 171005

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

taagacgaga agaccctrtg ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cggtctgaac tcagatcacg ta 22

Claims (7)

1.一种生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、以待测样品的DNA为模板，利用通用型引物对进行PCR扩增，扩增片段约为400bp；

步骤二、扩增产物建库；

步骤三、利用二代测序平台测序；

步骤四、数据分析比对确认物种，

其中，所述通用型引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，其特征在于，步骤一的PCR扩增的条件如下：

PCR扩增的反应体系为50μL，包括2X Taq Master mix 25μL，正向引物、反向引物各10μM，DNA模板5μL；

PCR扩增程序为：98℃变性5min；进入循环，96℃变性20s，55℃退火30s和72℃延伸30s，共35个循环；延伸2min。

3.如权利要求1所述的生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，其特征在于，所述通用型检测方法还包括参考线粒体数据库的序列。

4.如权利要求1-3任一项所述的生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，其特征在于，所述步骤三是利用Illumina Miseq测序平台进行测序。

5.如权利要求1-3任一项所述的生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，其特征在于，所述步骤三是采用Ion Torrent半导体测序平台进行测序。

6.一种生物制品中动物源性成分的通用型引物对，其特征在于，所述通用型引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

7.一种如权利要求6所述的生物制品中动物源性成分的通用型引物对用于高通量二代测序。