CN104704127A - 体外诊断受试者的薄皮状态的方法及相关应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及诊断受试者的薄皮状态的方法,鉴定去头屑剂的筛选方法,和可用于所述方法的试剂盒和核酸阵列。
Description
发明领域
本发明涉及皮肤学的技术领域,并且涵盖皮肤学的化妆和治疗两方面。
更具体而言,本发明涉及诊断受试者的薄皮状态的体外方法及鉴定用于预防或治疗薄皮状态的活性剂的筛选方法。本发明还涉及要用于所述方法的试剂盒和核酸阵列。
头皮屑(D)是一种在多达50%的人中发生的头皮状况,并且尽管有几种可用的治疗,其一直存在了几个世纪。
头皮屑又称为单纯头皮糠疹(pityriasis simplex capilitii,p.simplex capitis)和干性糠疹(p.sicca),该词语头皮屑源于盎格鲁-撒克逊语,即意为“皮疹”的“tan”和意为“脏”的“drof”的组合。它通常以头皮的过多片状剥落为特征,并且经常引起发痒。在约5%人群中观察到的极端重度形式的头皮屑中,又称为脂溢性皮炎(seborrheic dermatitis,SD),身体的其他区域诸如面部和/或胸部也可以受到影响,并且这些区域的皮肤(包括头皮)炎症可以是可见的。虽然不是威胁生命的,但是头皮屑是相对不美观的,而且可以导致自尊丧失。
至今为止,为了阐明此种状况的起源而进行的研究已经将酵母生物马拉色菌(Malassezia)鉴定为主要的致病因素。虽然也会涉及其它因素,至今开发的去头屑组合物牵涉使用软化并溶解薄片(flake)的角质层分离剂(keratolyticagent),使用角质化调节剂,使用抗真菌剂或抗脂溢剂(antiseborrheic agent),在需要时使用消炎药,及组合使用它们。也有提议天然产物诸如茶树油、蜂蜜或肉桂酸,通常与其他合成的活性剂组合。
然而,这些药剂仅仅最多缓解头皮屑的体征,而没有导致使用停止后该状况的完全消退。通常,在受头皮屑影响的受试者停止使用抗真菌制剂后,状况的外观体征重现,并且马拉色菌群体升回到其初始水平。
因此,需要鉴定新颖的有效且更为合适的头皮屑治疗,而且还需要表征受头皮屑影响的受试者中薄皮状态的严重性程度以明显调节所述治疗。
至今为止,已知评估薄皮状态的技术主要依赖于头皮的视觉检查。
发明人令人惊讶且出乎意料地鉴定出,在头皮上定居的微生物菌群的特定失调(尤其涉及伴随丙酸杆菌物种密度降低的马拉色菌物种密度显著升高)与薄皮状态的严重程度直接相关。
因此,本发明第一次提供了诊断受试者的薄皮状态的体外方法,其是高度可预测的,灵敏的,且展现出较高的预测价值。本发明进一步提供了鉴定用于预防或治疗所述状态的活性剂的筛选方法,及用于实施所述方法的试剂盒和核酸阵列。
发明详述
关于遍及本说明书的不同术语的使用,适用以下定义。
根据本发明的“薄皮状态”意为受试者头皮的异常脱落,即死亡的皮肤细胞的丧失。薄皮状态通常以头皮的皮肤细胞的过多丧失为特征,其也可以伴随皮肤的轻度发红和刺激。一般地,丧失的细胞对于肉眼而言以带白色或带灰色的薄片(又称为头皮屑)可见,其可以从头皮脱落并落下,并且通常由角化细胞簇构成。丧失的细胞数目反映薄皮状态的严重程度,其可以通过不同方法诸如视觉评分(即,ASFS,又称为粘附头皮剥落量表(adherent scalpflaking scale);Van Abbe,1964),鳞屑计量法(squamometry)或通过使用角化细胞计数(Pierard-Franchimont等,2006;Pierard GE等,1995;Pierard GE等,1992)评估。高于10的ASFS得分通常表征薄皮状态,若ASFS得分高于24,则其也可以与皮肤的轻度炎症联系起来。在脂溢性皮炎(SD)的情况中,ASFS得分高于24,并且薄皮状态伴有皮肤炎症、发红和剧烈发痒。如本文中使用的,“脂溢性皮炎”(SD)指薄皮状态的重度形式,其不仅可以影响受试者的头皮,而且还影响面部和/或胸部,并且其与皮肤炎症有关。
根据本发明,“去头屑剂”(或活性剂)是对如上文定义的薄皮状态,包括其重度形式,诸如脂溢性皮炎(SD)有活性的成分。
术语“微生物群体”(“微菌群”,“微生物菌群”,或“微生物群落”)指占据特定环境的两个或更多个微生物细胞。在本发明的内容中,所述微生物包括细菌、古细菌、微观真核生物和真菌(诸如酵母)及病毒,优选细菌和真菌。环境指微生物存在于其中并且对微生物生长和形成具有影响的因素、条件、或影响,诸如在受试者的皮肤或毛发上,更优选在所述受试者的头皮、面部、胸部或甚至全身的皮肤或毛发上。
根据本发明的细菌的例子包括但不限于放线菌科(Actinobacteria)、厚壁菌科(Firmicutes)和变形菌科(Proteobacteria)的细菌,更具体地细菌属于丙酸杆菌属、微杆菌属(Microbacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、气球菌属(Aerococcus)、差异球菌属(Alloiococcus)、厌氧球菌(Anaerococcus)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、孪生球菌属(Gemella)、颗粒链菌属(Granulicatella)、乳球菌属(Lactococcus)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、橙单胞菌属(Aurantimonas)、短波单胞菌属(Bevundimonas)、嗜血杆菌(Haemophylus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、莫拉氏菌属(Moraxella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、副球菌属(Paracoccus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)。丙酸杆菌物种特别包括物种痤疮丙酸杆菌(P.acnes)和颗粒丙酸杆菌(P.granulosum)。葡萄球菌物种特别包括物种表皮葡萄球菌(S.epidermis)、耳葡萄球菌(S.auricularis)、山羊葡萄球菌(S.caprae)、人葡萄球菌(S.hominis)、和施氏葡萄球菌(S.schleiferi)。
根据本发明的真菌的例子包括但不限于子囊菌科(Ascomycota)和担子菌科(Basidiomycota)的真菌,更具体地属于德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、Exophylia、青霉属(Penicillium)、松萝属(Usnea)、隐球菌属(Cryptococcus)、马拉色菌属、红酵母属(Rhodotolura)、裂褶菌属(Schizophyllum)和大囊松果伞(Strobilirus)的真菌。马拉色菌属包括约14个种,其中包括限制性马拉色菌(M.restricta)、球形马拉色菌(M.globosa)、合轴马拉色菌(M.sympodialis)、斯洛菲马拉色菌(M.slooffiae)、糠秕马拉色菌(M.furfur)、厚皮马拉色菌(M.pachydermatis)和钝形马拉色菌(M.obtuse),在本发明中都称为马拉色菌物种。
术语“门”、“纲”、“目”、“科”、“属”和“种”是本领域技术人员公知的,并且应当以其在本发明领域中的常规意义解释。
术语“密度”或定量分布指每个体积(例如细胞.ml-1,细胞.L-1,等等)或表面单位(例如细胞.mm-2,细胞.cm-2)中的细胞数目。在本发明的内容中,密度优选指每个表面单位的细胞数目。
根据本文中描述的本发明的以下方面和实施方案,“受试者”指哺乳动物,优选人或动物,甚至更优选人。甚至更优选地,所述人属于高加索人群,有利地属于欧洲人群。
在本发明的内容中,在处理受试者或如下文定义的模型的头皮、面部或胸部时,优选意为处理头皮、面部或胸部皮肤表面。
因此,在第一个方面,本发明涉及一种诊断受试者的薄皮状态的体外方法,其包括下列步骤:
a.检测并量化来自受试者的微生物群体样品的马拉色菌(Malassezia sp.)的密度和丙酸杆菌(Propionibacterium sp.)的密度;
b.计算所述样品中存在的马拉色菌的密度和丙酸杆菌的密度之间的比率R;
c.比较所述比率与参照数值;
其中高于所述参照数值的比率R指示所述受试者中薄皮状态的存在。
因此,通过
如下通过微生物群体样品中存在的马拉色菌密度数值除以丙酸杆菌密度数值测定步骤b)的比率R:
参照数值指健康受试者中马拉色菌的密度对丙酸杆菌的密度的比率。此数值可以根据通常用于诊断方法(例如Altman等,1994)的统计学标准来确定。
在本发明的一个优选的实施方案中,参照数值等于0.008,优选等于0.013,甚至更优选等于0.0196。
根据本发明的一个具体的实施方案,高于0.490数值的比率R指示重度薄皮状态的存在。
因此,包含0.008-0.490的比率R指示非重度薄皮状态。
根据本发明的另一个具体的实施方案,高于2.5数值的比率R指示脂溢性皮炎的存在。更优选地,高于数值3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30的比率R指示脂溢性皮炎的存在。
因此,包含0.490-2.5的比率R指示轻度炎性的重度薄皮状态(severemild-inflammatory pellicular state)。
特别地,本发明涉及诊断受试者中的脂溢性皮炎(SD)的体外方法,其包括下列步骤:
a.检测并量化来自受试者的微生物群体样品的马拉色菌的密度和丙酸杆菌的密度;
b.计算所述样品中存在的马拉色菌的密度和丙酸杆菌的密度之间的比率R;
c.比较所述比率与至少2.5的参照数值;
其中高于所述参照数值的比率R指示所述受试者中脂溢性皮炎的存在。
在一个优选的实施方案中,所述数值等于3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25和30。应当理解,数值越高,脂溢性皮炎(SD)的严重性越高。
在一个优选的实施方案中,马拉色菌或马拉色菌物种包含或组成为(consists of)限制性马拉色菌、球形马拉色菌、合轴马拉色菌、斯洛菲马拉色菌、糠秕马拉色菌、厚皮马拉色菌和钝形马拉色菌,更优选包含或组成为限制性马拉色菌和球形马拉色菌,甚至更优选马拉色菌指限制性马拉色菌。发明人确将限制性马拉色菌鉴定为人头皮的微生物群体中存在的最主要的真菌,且更特别地鉴定为最主要的马拉色菌物种。
优选地,本发明的丙酸杆菌或丙酸杆菌物种包括或组成为痤疮丙酸杆菌(P.acnes)和颗粒丙酸杆菌(P.granulosum),且更优选丙酸杆菌指痤疮丙酸杆菌。发明人确已经将痤疮丙酸杆菌鉴定为人头皮的微生物群体中存在的最主要的细菌,且更特别地鉴定为最主要的痤疮丙酸杆菌物种。
因此,本发明的一个有利的实施方案提供了如上文定义的体外诊断方法,其中马拉色菌是限制性马拉色菌,且丙酸杆菌是痤疮丙酸杆菌。
更优选地,从受试者的头皮、面部或胸部,且甚至更优选从头皮收集来自所述受试者的微生物群体样品。
通过来自受试者头皮的微生物群体样品的马拉色菌和丙酸杆菌的核酸的扩增,接着量化来实施根据上述方法的步骤a)的检测并量化所研究微生物的密度的优选方法。
如本文中使用的,术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核苷酸序列(它们可以互换),指精确连续的天然核苷酸(例如A、T、G、C和U),对应于单链或双链DNA,诸如cDNA、基因组DNA、核糖体DNA或质粒DNA,和所述DNA的转录产物,诸如RNA。
可以分离并通过任何已知的方法制备根据本发明的核酸,所述方法包括但不限于任何合成方法、任何重组方法、任何离体(ex vivo)生成方法等,及其组合。
“扩增”和“量化”指适合于生成感兴趣核酸的多个拷贝并量化所述拷贝的任何规程。聚合酶链式反应(PCR)是至今最广泛使用的扩增核酸的方法。扩增和量化也可以作为单一规程使用,诸如通过定量PCR(q-PCR)或通过FISH(荧光原位杂交)。定量PCR工具的例子是商品化的,并且包括但不限于MGB探针(Applied Biosystems)、绿(Applied Biosystems)、分子信标、和ScorpionTM探针(Sigma-Aldrich)。在本发明的一个优选的实施方案中,体外诊断方法的步骤a)通过定量PCR实施。
应当理解,根据本发明,要扩增和量化的核酸在要分析的属间(例如马拉色菌或丙酸杆菌间)可以是保守的,或者对要分析的物种(例如马拉色菌或丙酸杆菌)可以是特异性的。“保守”意为核酸序列在要分析的属内共享较高的同源性。一般地,这意味着解释所述序列在至少60%,优选70%、80%、更优选90%,甚至更优选97%、98%、99%的属于所述属的已知微生物中是基本上相同的,且其中基本上相同意味着不超过8,更优选不超过7、6、5、4、3、2、或1个核苷酸是不同的。在任何情况中,在本发明的背景内在如下情况时认为核酸序列是保守的:其适合于被探针或引物结合,由此容许区别来自一个属与另一个的微生物,即探针或引物在它不会或基本上不结合另一个属的已知微生物的序列的实质性部分时对至少一个属是特异性的,其可以通过如上文定义的方法(例如PCR)分析。比较而言,在如下情况时认为核酸序列是特异性的:它适合于被探针或引物结合,由此容许区别来自一个物种与属内的另一个的微生物,即探针或引物在它不会或基本上不结合相同属或另一个属的已知微生物的序列的实质性部分时对至少一个物种是特异性的,其也可以通过如上文定义的方法(例如PCR)分析。根据一个优选的实施方案,要依照本发明扩增并量化的核酸序列对限制性马拉色菌和/或痤疮丙酸杆菌是特异性的。在一个具体的实施方案中,要扩增并量化的核酸序列是核糖体DNA(rDNA),诸如细菌16S rDNA和真菌ITS1-5、8S-ITS2-(D1/D2)-28S(ITS-28S)rDNA。
对于实施感兴趣核酸的扩增和/或量化需要或有用的探针和引物在本发明的内容中称为“核酸片段”。
“核酸片段”在本文中更一般意指与感兴趣的核酸杂交的核酸。例如,此类核酸片段的长度可以是至少10个核苷酸或优选长度为至少15个核苷酸。它们的长度也可以是至少25或至少50个核苷酸。
在本发明的内容中,核酸片段优选会在严格杂交条件下与感兴趣的核酸杂交。严格杂交条件的一个例子如下,其中意图的杂交使用约0.9摩尔的盐溶液于约50℃至约65℃的温度实施。然而,本领域技术人员会能够改变此类条件,以考虑诸如核酸片段长度、碱基组成、存在的离子类型等变量。
更具体而言,“引物”指充当用于扩增感兴趣的核酸的起始点的核酸片段。本发明的核酸引物的例子包括但不限于序列SEQ ID N°7,SEQ ID N°8,SEQ ID N°10,SEQ ID N°11,SEQ ID N°12,SEQ ID N°14,SEQ ID N°15,SEQ ID N°16,SEQ ID N°18,SEQ ID N°19,SEQ ID N°20,SEQ ID N°22,SEQID N°23,SEQ ID N°24,SEQ ID N°26,SEQ ID N°27,SEQ ID N°28,SEQ IDN°29和SEQ ID N°30的引物。此类引物可以在“引物组”中使用以扩增感兴趣的核酸。本发明的引物组的例子包括但不限于引物组(SEQ ID N°7,SEQ IDN°8),(SEQ ID N°1 1,SEQ ID N°12),(SEQ ID Ν5,SEQ ID N°16),(SEQ IDN°19,SEQ ID N°20),(SEQ ID N°23,SEQ ID N°24),(SEQ ID N°27,SEQ IDN°28),和(SEQ ID N°29,SEQ ID N°30)。
更具体而言,“探针”指可以用于检测感兴趣核酸的核酸片段。此术语涵盖各种衍生物形式,诸如“荧光探针”。在与如上文定义的引物组结合使用时,所述探针可以用于量化感兴趣的核酸。本发明的探针的例子包括但不限于序列SEQ ID N°7,SEQ ID N°8,SEQ ID N°9,SEQ ID N°10,SEQ ID N°11,SEQ ID Ν2,SEQ ID Ν3,SEQ ID N°14,SEQ ID N°15,SEQ ID N°16,SEQID N°17,SEQ ID N°18,SEQ ID N°19,SEQ ID N°20,SEQ ID N°21,SEQ IDN°22,SEQ ID N°23,SEQ ID N°24,SEQ ID N°25和SEQ ID N°26的探针。根据本发明的最优选的探针包括探针SEQ ID N°10,SEQ ID N°14,SEQ ID Ν8,SEQ ID N°22和SEQ ID N°26。探针可以通过放射性同位素、放射性标记物、结合模仿诸如生物素、半抗原诸如洋地黄毒苷、发光物(luminogenic)、质量标签(mass tag)、磷光或荧光部分,或通过单独的或与其他染料组合的荧光染料(例如MGB,FAM,VIC,TET,NED,TAMRA,JOE,HEX,ROX等)标记。这些标记物提供通过荧光、放射性、比色法、重量测定、X-射线衍射或吸收、磁性、酶活性、质谱术、结合亲和力等可检测的信号,并且便于感兴趣核酸的检测或量化。通过本发明的荧光染料标记的探针的例子包括但不限于序列SEQ ID N°9,SEQ ID N°13,SEQ ID N°17,SEQ ID N°21,和SEQ ID N°25的探针。
应当理解如本文中提供的核酸片段的序列以标准的IUB/IUPAC核酸密码表达。
在本发明的一个优选的实施方案中,通过使用至少选自下组的核酸片段对马拉色菌实施上文描述的方法的步骤a):序列SEQ ID N°7,SEQ ID N°8,SEQ ID N°9,SEQ ID N°10的核酸片段、其变体和其互补序列。更优选地,通过使用与序列SEQ ID N°9的探针组合的引物组(SEQ ID N°7,SEQ ID N°8)实施针对马拉色菌的步骤a)。
在本发明的一个更优选的实施方案中,通过使用至少选自下组的核酸片段对限制性马拉色菌实施上文描述的方法的步骤a):序列SEQ ID N°11,SEQID N°12,SEQ ID N°13,SEQ ID N°14的核酸片段,其变体及其互补序列。更优选地,通过使用与序列SEQ ID Ν3的探针组合的引物组(SEQ ID N°11,SEQ ID N°12)实施针对限制性马拉色菌的步骤a)。
在本发明的又一个优选的实施方案中,通过使用至少选自下组的核酸片段对丙酸杆菌实施上文描述的方法的步骤a):序列SEQ ID N°23,SEQ IDN°24,SEQ ID N°25,SEQ ID N°26的核酸片段、其变体及其互补序列。更优选地,通过使用与序列SEQ ID N°25的探针组合的引物组(SEQ ID N°23,SEQ IDN°24)实施针对丙酸杆菌的步骤a)。
在本发明的甚至更优选的实施方案中,通过使用至少选自下组的核酸片段对痤疮丙酸杆菌实施上文描述的方法的步骤a):序列SEQ ID N°27,SEQ IDN°28,SEQ ID N°25,SEQ ID N°26的核酸片段、其变体及其互补序列。更优选地,通过使用与序列SEQ ID N°25的探针组合的引物组(SEQ ID N°27,SEQ IDN°28)实施针对痤疮丙酸杆菌的步骤a)。
如本文中使用的,术语“互补”意味着例如第一核酸序列的每个核苷酸与第二核酸序列的互补碱基配对,所述第二核酸序列方向是相反的。互补核苷酸是A和T(或A和U)或C和G。
根据本发明的核酸片段的“变体”包括但不限于在与所述核酸片段比对后至少99%相同,并且保留其与上文定义的感兴趣核酸杂交的能力的核酸序列。变体的例子是简并核酸片段。
可以通过比较每个序列中的位置测定核酸序列间的同一性,所述核酸可以为了比较而对齐。在比较序列中的位置被相同核苷酸占据时,则序列在该位置处是相同的。核酸间序列同一性的程度是这些序列共享的位置处的相同核苷酸的数目的函数。为了测定两个核酸序列间的同一性百分比,为了最佳比较而对齐序列。例如,可以在第一核酸序列的序列中引入缺口以实现与第二核酸序列的最佳比对。然后,比较相应核苷酸位置处的核苷酸。在第一核酸中的位置被第二序列中相应位置处的核苷酸占据时,分子在该位置处是相同的。两个序列间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数目的函数。因此,%同一性=相同位置的数目/重叠位置的总数X 100。在此比较中,序列可以是相同长度的或可以是不同长度的。可以通过Needleman和Wunsch(1972)的全局同源性比对算法进行序列的最佳比对,其通过此算法的计算机化执行或通过视觉检查进行。选自通过各种方法生成的最佳比对(即导致比较序列间的最高同一性百分比)。换言之,如下计算序列同一性的百分比,即比较两个最佳比对序列,测定两个序列中出现相同核苷酸的位置的数目以产生匹配位置的数目,用匹配位置的数目除以位置总数,并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。
本发明的另一个方面提供了鉴定去头屑剂的方法,其包括下列步骤:
a)对受试者或头皮屑模型施用候选去头屑剂,其中所述受试者或所述模型上存在的马拉色菌的密度和丙酸杆菌的密度之间的比率R高于如上文限定的参照数值;
b)计算与所述药剂接触的所述受试者或所述模型上存在的马拉色菌的密度和丙酸杆菌的密度之间的比率R’;
其中低于或等于所述参照数值的比率R’指示所述药剂是去头屑剂。
更优选地,低于或等于所述参照数值的75%的比率R’指示所述药剂是去头屑剂。
用于计算比率R’及用于检测和量化微生物密度的方法如上文描述。如上文提及的有利的实施方案就马拉色菌和丙酸杆菌而言类似适用。
在一个优选的实施方案中,将施用所述候选剂的步骤a)实施至少2至3周,且更优选至少6周。
根据本发明,“施用”意为将感兴趣的药剂或组合物表面,口服,舌下,经鼻(例如气雾剂),或通过注射,诸如通过皮下注射,静脉内注射,肌肉内注射或腹膜内注射投递或分布。在本发明的背景之中,根据上述方法的“施用”候选去头屑剂的步骤a)优选通过表面或口服且更优选表面投递所述药剂实施。
根据一个优选的实施方案,步骤a)在于对受试者施用所述候选剂,其中马拉色菌和丙酸杆菌存在于所述受试者的头皮,面部或胸部上,且甚至更优选在头皮上。
根据本发明的另一个优选的实施方案,步骤a)在于对头皮屑模型施用所述候选剂,优选表面施用。
头皮屑模型的例子是本领域技术人员已知的,并且包括但不限于体外模型及实验室中使用的动物模型,诸如小鼠、兔、或豚鼠模型(Oble等,2005;Hewitson等,2012;Troller等,1971;Ashbee and Bond,2010)。开发或改变所述模型的方法对于本领域技术人员而言是可用的。
根据一个更优选的实施方案,在对如上文定义的头皮屑动物模型实施步骤a)时,鉴定所述去头屑剂的方法进一步包括杀死所述动物的步骤c)。
具体地,本发明涉及鉴定去头屑剂的方法,其包括下列步骤:
a)对受试者或对脂溢性皮炎模型施用候选去头屑剂,其中所述受试者或所述模型上存在的马拉色菌的密度和丙酸杆菌的密度之间的比率R高于如上文限定的参照数值;
b)计算与所述药剂接触的所述受试者或所述模型上存在的马拉色菌的密度和丙酸杆菌的密度之间的比率R’;
其中低于或等于所述参照数值的比率R’指示所述药剂是去头屑剂。
更优选地,低于或等于所述参照数值的75%的比率R’指示所述药剂是去头屑剂。
根据本发明的一个优选的实施方案,步骤a)在于对脂溢性皮炎模型施用所述候选剂,优选表面施用。
脂溢性皮炎模型的例子是本领域技术人员已知的,并且包括但不限于体外方法及实验室中使用的动物模型,诸如脂溢性皮炎的小鼠模型(例如Oble等,2005)。开发或改变所述模型的方法对于本领域技术人员而言是可用的。
根据一个更优选的实施方案,在对如上文定义的脂溢性皮炎动物模型实施步骤a)时,鉴定所述活性剂的方法进一步包括杀死所述动物的步骤c)。
例如,可以通过使用包含或组成为本发明的核酸片段的预包装试剂盒或核酸阵列实施上文描述的方法。
因此,本发明涉及试剂盒,其包含或组成为:
a)至少与马拉色菌核酸特异性杂交的核酸片段;和
b)至少与丙酸杆菌核酸特异性杂交的核酸片段。
根据一个优选的实施方案,所述与马拉色菌核酸特异性杂交的核酸片段选自下组:序列SEQ ID N°7,SEQ ID N°8,SEQ ID N°9,SEQ ID Ν0,SEQ ID Ν1,SEQ ID Ν2,SEQ ID Ν3,SEQ ID N°14的核酸片段、其变体及其互补序列,更优选序列SEQ ID N°7,SEQ ID N°8,SEQ ID N°9,SEQ ID N°10的核酸片段,甚至更优选序列SEQ ID Ν1,SEQ ID Ν2,SEQ ID Ν3,SEQ ID Ν4的核酸片段。
根据另一个优选的实施方案,至少与丙酸杆菌核酸特异性杂交的核酸片段选自下组:序列SEQ ID N°23,SEQ ID N°24,SEQ ID N°25,SEQ ID N°26,SEQ ID N°27,SEQ ID N°28的核酸片段、其变体及其互补序列,更优选序列SEQ ID N°23,SEQ ID N°24,SEQ ID N°25,SEQ ID N°26的核酸片段,甚至更优选序列SEQ ID N°25,SEQ ID N°26,SEQ ID N°27,SEQ ID N°28的核酸片段。
在一个最优选的实施方案中,所述试剂盒包含或组成为:
a)序列SEQ ID N°11,SEQ ID N°12和SEQ ID N°13的核酸片段;和
b)序列SEQ ID N°27,SEQ ID N°28和SEQ ID N°25的核酸片段。
说明书还公开了核酸阵列,其包含或组成为:
a)至少是,与马拉色菌核酸特异性杂交的核酸片段;和
b)至少是,与丙酸杆菌核酸特异性杂交的核酸片段。
根据一个优选的实施方案,所述与马拉色菌核酸特异性杂交的核酸片段选自下组:序列SEQ ID N°7,SEQ ID N°8,SEQ ID N°9,SEQ ID Ν0,SEQ ID Ν1,SEQ ID Ν2,SEQ ID Ν3,SEQ ID N°14的核酸片段、其变体及其互补序列,更优选序列SEQ ID N°7,SEQ ID N°8,SEQ ID N°9,SEQ ID N°10的核酸片段,甚至更优选序列SEQ ID N°1 1,SEQ ID N°12,SEQ ID N°13,SEQ ID Ν4的核酸片段。
根据另一个优选的实施方案,所述与丙酸杆菌核酸特异性杂交的核酸片段选自下组:序列SEQ ID N°23,SEQ ID N°24,SEQ ID N°25,SEQ ID N°26,SEQ ID N°27,SEQ ID N°28的核酸片段、其变体及其互补序列,更优选序列SEQ ID N°23,SEQ ID N°24,SEQ ID N°25,SEQ ID N°26的核酸片段,甚至更优选序列SEQ ID N°25,SEQ ID N°26,SEQ ID N°27,SEQ ID N°28的核酸片段。
在一个最优选的实施方案中,所述核酸阵列包含或组成为:
a)序列SEQ ID N°11,SEQ ID N°12和SEQ ID N°13的核酸片段;和
b)序列SEQ ID N°27,SEQ ID N°28和SEQ ID N°25的核酸片段。
根据对实验(包括实施例)的以下详细描述会更好地理解本发明。不过,本领域技术人员应当领会,此详细描述不是限制性的,并且各种修改、替换、省略和变化可以在不背离本发明的范围的前提下进行。
附图简述
图1:20个对照和29个头皮屑头皮上通过qPCR检测的细胞数/样品:A)丙酸杆菌、葡萄球菌和限制性马拉色菌。B)限制性马拉色菌/丙酸杆菌比率和葡萄球菌/丙酸杆菌比率(细胞/样品)。与无头皮屑头皮相比,这些比率在头皮屑头皮中显著增加(分别为p值=0.004和0.0055)。星号标示显著的统计学差异(p<0.01)。
图2:个体内变化。框图,其比较在每个个体(D10至D29)头皮的区域M1(头皮屑区)和M2(非头皮屑区)上取样的通过qPCR量化的微生物群落。在头皮屑头皮中,限制性马拉色菌(p=0.0006)、葡萄球菌(P=0.002)、以及限制性马拉色菌/丙酸杆菌的比率(p=0.03)都是增加的。丙酸杆菌是减少的(p=0.0024)。
图3:来自19名受试者(N1-10,无头皮屑的对照;D1-9有头皮屑的受试者)的细菌16S rDNA序列的分布。
图4:来自19名受试者(N1-10,无头皮屑的对照;D1-9有头皮屑的受试者)的真菌ITS-28S rDNA序列的分布。
图5:通过从来自组-1的19名受试者的基因组DNA克隆PCR产物并对其测序和对来自组-2的30名受试者的表征获得的4,347个序列的分布。
实施例
I.实验方案
I.1.受试者招募和样品收集
招募49名健康成人(22-63岁龄;40%男性)以提供样品并用于临床研究。在此研究中收集并分析独立的两组样品。组-1由来自10名非头皮屑受试者和9名头皮屑受试者(分别为受试者N1至N10和受试者D1至D9)的样品组成,对所述样品分析以鉴定微生物群体,接着进行qPCR量化。组-2聚集来自10名非头皮屑受试者和20名头皮屑受试者(即分别为受试者N11至N20和受试者D10至D29)的样品,所述样品在每个头皮的两个区域中收集:有头皮屑的区域(M1)和无头皮屑的区域(M2)(图5)。如下针对头皮剥落严重性在临床上对人头皮分级:将头皮的8个部分相比于参照照片归为0-5的等级(0表示没有薄片的区域;1至4.5表示少量至大量薄片;5表示剥落最多的区域,其中头皮屑覆盖整个头皮表面)。最终得分对应于这8个数值的平均值。此外,还根据取样部位划分等级。遵循赫尔辛基宣言原则实施研究,并且从每名受试者获得书面知情同意。
对于样品收集,将无菌棉拭子在5.0ml NaCl 0.15M-Tween20 0.1%缓冲液中浸泡。对16cm2面积取样,方法是,沿着8条线划线,每条线划4次。将每个拭子的头部从柄切出,放入含有缓冲液的管中。将拭子样品于4℃贮存,并在24小时内处理以进行DNA分离。作为阴性对照,将无菌棉拭子从柄切出,放入5.0ml NaCl 0.15M-Tween20 0.1%缓冲液中,并在与头皮无任何接触的相同条件下进一步处理。
I.2.研究群体和微生物测序
从头皮样品提取DNA。对于每个DNA样品,使用两组通用引物(即CIP-pA和CIP-pH;TW13和ITS1f。参见表1)对细菌16S rDNA和真菌ITS1-5,8S-ITS2-(D1/D2)-28S(ITS-28S)rDNA进行PCR扩增。使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化新鲜的PCR产物。仅对来自组1的受试者样品测序来自这两个PCR产物的克隆文库,并将其克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)中并分析,如下文的方案I.5至I.7中描述的。在排除低质量序列后,16S rDNA有2,122个序列,ITS-28S rDNA有2,225个序列(约1500bp),其代表200个序列/受试者的平均值(Clermont等,2009)。在门、属和种水平上进一步分析所有序列。通过在合适的参照数据库中进行Blastn 2.2.21程序分配分类学身份。对于细菌鉴定,使用核糖体数据库项目-II(RDP-II第10_18版,(Cole等,2009)),而对于存在于人皮肤上的真菌物种,通过选择皮肤真菌的ITS和28S真菌序列创建定制的数据库(Gemmer等,2002;Gao等,2007;Paulino等,2006;Dekio等,2005;Gupta等,2004)。用ClustalW比对序列,并用phyml(GTR模型)重建最大似然性系统发生树(maximum likelihood phylogenetic tree)。
I.3.定量PCR
通过使用靶向细菌16S rDNA序列或真菌ITS-28S rDNA序列的物种特异性区域的特异性引物和TaqMan MGB探针用定量PCR评估头皮屑环境中存在的三个主要物种:痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和限制性马拉色菌。对于马拉色菌属、限制性马拉色菌和球形马拉色菌物种,使用由Sugita等(2010)报告的引物和探针。对于表皮葡萄球菌,与一组新引物(序列SEQ ID N°19的802F,和序列SEQ ID N°20的862R;参见表1)组合使用Staph-P探针(Gao等,2006)。对于痤疮丙酸杆菌,设计新引物(序列SEQ ID N°23的591F,和序列SEQ ID N°24的654R)和探针(序列SEQ ID N°25的Prop615-P)(表1)。通过使用primer express 4(Applied Biosystem)和此研究中获得的相应细菌16S rRNA序列设计所有新引物和探针。对于限制性马拉色菌、痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌生成细胞计数的标准曲线。为了便于计数,通过超声处理分散限制性马拉色菌酵母。在提取基因组DNA前通过10倍稀释获得102-107个细胞的细胞浓度范围,并用于生成细胞标准曲线。对于实时PCR,反应混合物由20μl不含UNG的TaqMan通用主混合物II(Applied Biosystem),200nM每种引物(表1)、250nM TaqMan探针(Applied Biosystem)和DNA(0.5-5ng)组成。用iCycler iQ(BIO-RAD)以下列循环参数实施扩增和检测:55℃持续2分钟,95℃持续10分钟,再于95℃持续30秒和55℃持续30秒进行40个循环(对于马拉色菌),或者,55℃持续2分钟,95℃持续10分钟,再于95℃持续30秒和55℃持续45秒进行40个循环(对于细菌物种)。使用循环阈值(Ct)数值绘制每个生物体的标准曲线。一式三份运行每个样品。
表1:本研究中使用的引物组和用于量化限制性马拉色菌、球形马拉色菌、丙酸杆菌和葡萄球菌的引物和探针。
I.4.菌株和培养基
痤疮丙酸杆菌(菌株CIP A179:自皮脂腺分离)由巴斯德研究所CIP-Library友情提供。将痤疮丙酸杆菌在培养基20(胰蛋白胨3%,酵母提取物2%,半胱氨酸盐酸盐0.05%,葡萄糖0.5%,琼脂1.5%(w/v)和Hemin溶液2,5%(v/v)(氯化血红素0.1%(w/v),三乙醇胺4%(v/v))pH 7.2)上于37℃在厌氧气氛下培养14天。从无头皮屑的受试者分离限制性马拉色菌和表皮葡萄球菌菌株(并通过对表皮葡萄球菌的16S rDNA和限制性马拉色菌的ITS rDNA测序表征)。将限制性马拉色菌细胞在Leeming和Notman琼脂培养基(Leeming等,1987)上于32℃培养14天。将表皮葡萄球菌在2yt培养基(细菌用胰蛋白胨1.6%,细菌用酵母提取物1%,氯化钠0.5%,和葡萄糖0.2%pH 7.0)中于37℃在搅动下培养24小时。然后,将细胞收获,并用血球计数器计数。
I.5.真菌和细菌DNA提取
用于DNA分离的方案如下:通过以13500rpm离心20分钟沉淀2ml来自头皮的细菌-真菌细胞悬浮液。将收集的细胞在400μl含有5μl蛋白酶K(10mg/ml,Roche)的裂解缓冲液(Tris-HCl 20mM,NaCl 250mM,EDTA 25mM,SDS1%(w/v),Triton x1001%(w/v),pH8.0)中重悬,并于55℃中温育16小时,然后在沸水浴中温育5分钟。将细胞转移到有螺旋帽的管,添加250μl玻璃珠(0.17-0.18mm,Sartorius),并通过进行速度6.0涡旋振荡60秒的三个循环在FastPrep(MP Biomedicals)中摇动样品。给上清液进一步补充酚和氯仿(各400μl),并涡旋振荡。在以13500rpm离心20分钟后,将水相取出,并于37℃用RNA酶(2μl,10mg/ml,Roche)处理3小时。最终,通过添加乙酸铵(5mM,终浓度),纯的乙醇(1ml),并于-20℃静置最少24小时沉淀DNA。将所得的DNA通过离心(以13500rpm持续20分钟)沉淀,并用乙醇70%(700μl)清洗,最终在40μl无DNA酶-RNA酶的超纯水中悬浮。通过Qubit dsDNA HS试剂盒(Invitrogen)测量DNA含量。
I.6.PCR扩增
对于每个头皮样品,从基因组DNA制备两个不同的PCR产物。用通用引物ITS1f和TW13(表1)扩增真菌ITS1-5.8S-ITS2和28S(D1/D2)区的一部分。使用引物组:CIP-pA和CIP-pH(表1)扩增16S rDNA。然后,将这两个PCR产物(约1,500bp)单独克隆。扩增方法如下:在50μl反应混合物中包括5.0μl 10x缓冲液(Amersham Bioscience),5.0μl dNTP混合物(各25mM;Roche),1μl每种引物(10μΜ),1μl DMSO,1μl基因组DNA(20ng)和0.3μl rTaq聚合酶(Amersham),用水定容到50μl。对于热循环,于95℃最初变性5分钟,接着是于95℃变性60秒,于60℃退火60秒,和于72℃延长1.5分钟的35个循环,接着于72℃最终延伸15分钟。使用Qiaquick纯化试剂盒(Quiagen)按照制造商的说明书纯化PCR产物。
I.7.克隆和测序
使用1μl PCR产物(20ng DNA)按照制造商的说明书将新鲜的纯化的PCR产物克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)中。使用Montage质粒Miniprep96试剂盒(Millipore)实施质粒DNA纯化。将测序反应用M13正向和反向引物(分别具有序列SEQ ID N°5和SEQ ID N°6)使用ABI Prism BigDye Terminator循环测序准备反应试剂盒(cycle sequencing-ready reaction)试剂盒实施,并在ABI3730xl Genetic Analyzer上分析。使用脚本Assembler工具试剂盒完成序列扫迹(sequence trace)的碱基调用和质量剪辑(quality clipping)。
I.8.统计学方法
在此研究中使用ANOVA进行统计学分析。用III型平方和测试年龄、性别和得分对细菌和真菌细胞数目的影响。在图上视觉检查残数的正规性和方差的齐性(Normality of the residuals and homogeneity of the variance werevisually checked on plots)。用R程序实施所有分析。
更具体地,计算在具有和无头皮屑的个体间鉴定的每种微生物的密度相对于彼此的比率,以特别是基于Altman DG等(1994)描述的方法,测定头皮屑的诊断值。
在这点上,用于诊断受试者的薄皮状态的阳性预测值(PPV)如下计算:PPV=真阳性的数目/(真阳性的数目+假阳性的数目),
其中“真阳性”是测试做出阳性预测,并且受试者在金标准(gold standard)下具有阳性结果的事件,而“假阳性”是测试做出阳性预测,并且受试者在金标准下具有阴性结果的事件。
用于诊断受试者的薄皮状态的阴性预测值(NPV)如下计算:
NPV=真阴性的数目/(真阴性的数目+假阴性的数目)
其中“真阴性”是测试做出阴性预测,并且受试者在金标准下具有阴性结果的事件,而“假阴性”是测试做出阴性预测,并且受试者在金标准下具有阳性结果的事件。
用于诊断受试者的薄皮状态的灵敏性如下计算:
灵敏性=真阳性的数目/(真阳性的数目+假阳性的数目)。
最终,用于诊断受试者的薄皮状态的特异性如下计算:
特异性=真阴性的数目/(真阴性的数目+假阳性的数目)。
II.结果
II.1.有和无头皮屑的头皮上的微生物多样性
使用Blast分析,在分析的19名受试者的(有头皮屑的9名和无头皮屑的10名,组1)的头皮中鉴定出47个细菌类名。鉴定三个细菌门:放线菌门(Actinobacteria)(51%的序列)、硬壁菌门(Firmicutes)(42%的序列)和变形菌门(Proteobacteria)(6%的序列)(参见图3)。在属水平上,在19个头皮样品上观察到两个主要的属,包括丙酸杆菌属(所有序列的49%)和葡萄球菌属(所有序列的40%),而所有序列的剩余11%主要包括链球菌属(1.4%)、不动杆菌属(Acinetobacter)(1.8%)、棒杆菌属(Corynebacterium)(1.0%)、假单胞菌属(Pseudomonas)(1.5%)和摩拉克氏菌属(Moraxella)(1.6%)。将丙酸杆菌的序列分成痤疮丙酸杆菌(99.7%)和球形丙酸杆菌(0.3%),并且葡萄球菌的序列主要以表皮葡萄球菌(99.1%)和山羊葡萄球菌(0.5%)代表(图3)。
在同样是这些个体的头皮中鉴定出14个真菌类名(图4)。限制性马拉色菌是头皮上存在的主要真菌物种(所有序列的90%)(图4)。球形马拉色菌占所有序列的小于1%。我们在本文显示了头皮屑是头皮微生物菌群的不平衡的结果。
II.2.细菌和真菌群体的密度的不平衡与头皮屑的存在相关联。
由于三个主要的微生物物种仅存在于头皮上,在有和无头皮屑的个体中分析其定量分布(即密度)。在一年的两个时间对两个不同的群体样品实施基于定量q-PCR的分析以实现结果的更好的统计学验证。用于量化的PCR引物(参见表1)对丙酸杆菌属和葡萄球菌属是特异性的,但是由于痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌分别占鉴定的丙酸杆菌和葡萄球菌物种的99%,认为量化的丙酸杆菌和葡萄球菌群体实际上分别对应痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌。来自组-1的19名受试者和来自组-2的30名受试者导致总共29个有头皮屑的个体相对于20个无头皮屑的对照。
所有受试者中检出的细菌物种的数目对于丙酸杆菌从每cm21.0103至至1.3106(平均值2.1105)个细胞不等,对于葡萄球菌从每cm25.6101至6.2105(平均值4.8104)个细胞不等。限制性马拉色菌细胞的数目范围为每cm25.5101至1.1105(平均值1.1104)个细胞,并且占所有马拉色菌的主要部分。对细菌和真菌细胞数目差异进行的基于距离的ANOVA分析显示,在头皮屑头皮中,丙酸杆菌显著减少(p=0.002)(从3.5105至1.4105个细胞/cm2;p=0.04),限制性马拉色菌显著增加(从1.6103至1.3104个细胞/cm2;p=0.04),葡萄球菌显著增加(从2.1104至6.7104个细胞/cm2;p=0.02)(图1A)。研究真菌和细菌群体之间的比例。与无头皮屑的个体相比,限制性马拉色菌/丙酸杆菌比率在有头皮屑的受试者(平均比率=0.37)中显著更高(p=0.005)(图1B)。在细菌群落中,葡萄球菌/丙酸杆菌比率在有头皮屑的受试者中也从0.33显著增加至2.56(平均比率;p=0.004)(图1B)。变化不依赖于年龄和性别参数(数据未显示)。这些结果与从每个样品回收的每个物种测出的特异性克隆的数目一致(图3和4)。
通过比较有头皮屑的区域(M1)与无头皮屑的区域(M2)的微生物群体,在每个受试者中确认这些差异(图2)。对从M1和M2收集的样品进行qPCR分析发现,有头皮屑的受试者与无头皮屑的受试者相比,微生物菌群有类似变化。观察到限制性马拉色菌群体数量显著增加(从1.9103至7.0103个细胞/cm2;p=0.0006),葡萄球菌群体数量显著增加(从3.1104至6.7104个细胞/cm2;p=0.002),限制性马拉色菌/丙酸杆菌比率也显著增加,从0.18至0.33(平均值;p=0.03),同时伴有丙酸杆菌减少(从3.4105至1.4105个细胞/cm2;p=0.002)。II.3.与薄皮状态相关的诊断值
就有和无头皮屑的受试者的头皮上存在的限制性马拉色菌密度对痤疮丙酸杆菌密度的比率而言,已经获得了以下诊断值。
II.3.a)X1=0.019
薄皮 | 非薄皮 | |
阳性(R>X1) | VP=37 | FP=2 |
阴性(R<X1) | FN=12 | VN=18 |
测试特异性=76%;测试灵敏性=90%;阳性预测值:95%;阴性预测值:60%。
II.3.b)X1=0.013
薄皮 | 非薄皮 | |
阳性(R>X1) | VP=39 | FP=4 |
阴性(R<X1) | FN=10 | VN=16 |
测试特异性=80%;测试灵敏性=80%;阳性预测值:91%;阴性预测值:62%。
II.3.c)X1=0.008
薄皮 | 非薄皮 | |
阳性(R>X1) | VP=42 | FP=6 |
阴性(R<X1) | FN=7 | VN=14 |
测试特异性=85%;测试灵敏性=70%;阳性预测值:88%;阴性预测值:66%.
II.3.c)X1=0.005
薄皮 | 非薄皮 | |
阳性(R>X1) | VP=45 | FP=11 |
阴性(R<X1) | FN=4 | VN=9 |
测试特异性=92%;测试灵敏性=45%;阳性预测值:80%;阴性预测值:70%.
II.4.讨论
在头皮屑或非头皮屑头皮中已经发现了三个主要物种:痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌和限制性马拉色菌。关于人皮肤微生物菌群先前已经报告了这两个主要细菌物种的存在(Grice等,2009),其中显示了痤疮丙酸杆菌是富含皮脂的身体部位中占优势。
本数据显示了与其它研究形成对比,头皮屑不是由于一个真菌物种的较高发生率所致,而是由于头皮上真菌和细菌物种变化所致。虽然较早的报告提示了限制性马拉色菌和球形马拉色菌的存在与头皮屑有关,但是我们的研究已经显示了限制性马拉色菌是最主要的马拉色菌物种。特应性皮炎、脂溢性皮炎、或银屑病患者中的实时PCR量化也显示了限制性马拉色菌是头皮上最丰富的物种。
先前关于皮肤损伤中马拉色菌存在的报告证明了,损伤皮肤和健康皮肤的差异中展现出相同的物种,但是可以存在损伤特异性的亚系统发育型(sub-phylotype)。在头皮屑物种的目前分析中,我们还鉴定出痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌和限制性马拉色菌。使用clustalW比较表皮葡萄球菌的824个序列显示了两个主要系统发育型的存在,频率分别为44%和53%。痤疮丙酸杆菌的1005个序列的比较也显示了两个主要的系统发育型分别以40和50%的频率存在。使用通过测序和系统发生分析获得的限制性马拉色菌的2000个ITS-28S rDNA序列,我们发现,限制性马拉色菌有两个系统发育型。真菌或细菌系统发育型无一与头皮屑优先有关,因为在头皮屑和非头皮屑组中每个系统发育型的比例相同(数据未显示)。
II.5.结论
发明人已经证明,头皮屑与马拉色菌物种和表皮葡萄球菌的密度增加、以及痤疮丙酸杆菌的密度降低相关联。更具体而言,他们已经鉴定出这些微生物之间能表征薄皮状态及重度薄皮状态的比率,由此提供用于更好管理此种皮肤状况的工具。
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Claims (16)
1.一种诊断受试者的薄皮状态的体外方法,其包括下列步骤:
a.检测并量化来自受试者的微生物群体样品的马拉色菌(Malassezia sp.)的密度和丙酸杆菌(Propionibacterium sp.)的密度;
b.计算所述样品中存在的马拉色菌的密度和丙酸杆菌的密度之间的比率R;
c.比较所述比率与参照数值;
其中高于所述参照数值的比率R指示所述受试者中薄皮状态的存在。
2.根据权利要求1的方法,其中所述马拉色菌是限制性马拉色菌(Malassezia restricta)。
3.根据权利要求1的方法,其中所述丙酸杆菌是痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法,其中所述参照数值等于0.008,优选0.013,且更优选0.0196。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法,其中所述参照数值等于0.490,且其中高于0.490的比率R指示重度薄皮状态的存在。
6.根据权利要求1至4中任一项的方法,其中所述参照数值等于2.5,且其中高于2.5的比率R指示脂溢性皮炎(seborrheic dermatitis)的存在。
7.根据权利要求1至6中任一项的方法,其中通过定量PCR实施步骤a)。
8.根据权利要求7的方法,其中通过使用至少选自下组的核酸片段对马拉色菌实施所述定量PCR:序列SEQ ID N°7、SEQ ID N°8、SEQ ID N°9、SEQID N°10的核酸片段、其变体及其互补序列。
9.根据权利要求7的方法,其中通过使用至少选自下组的核酸片段实施针对限制性马拉色菌的所述定量PCR:序列SEQ ID N°11、SEQ ID N°12、SEQID N°13、SEQ ID N°14的核酸片段、其变体及其互补序列。
10.根据权利要求7的方法,其中通过使用至少选自下组的核酸片段实施针对丙酸杆菌的所述定量PCR:序列SEQ ID N°23、SEQ ID N°24、SEQ IDN°25的核酸片段、其变体及其互补序列。
11.根据权利要求7的方法,其中通过使用至少选自下组的核酸片段实施针对痤疮丙酸杆菌的所述定量PCR:序列SEQ ID N°27、SEQ ID N°28、SEQID N°25的核酸片段、其变体及其互补序列。
12.一种鉴定去头屑剂的方法,其包括下列步骤:
a.对受试者或头皮屑模型施用候选去头屑剂,其中所述受试者或所述模型上存在的马拉色菌的密度和丙酸杆菌的密度之间的比率R高于如权利要求1至6任一项限定的参照数值;
b.计算与所述药剂接触的所述受试者或所述模型上存在的马拉色菌的密度和丙酸杆菌的密度之间的比率R’;
其中低于或等于所述参照数值的比率R’指示所述药剂是去头屑剂。
13.一种在根据权利要求1至12任一项的方法中使用的试剂盒,其包含:
a.至少与马拉色菌核酸特异性杂交的核酸片段;和
b.至少与丙酸杆菌核酸核酸特异性杂交的核酸片段。
14.根据权利要求13的试剂盒,其中:
a.所述与马拉色菌核酸特异性杂交的核酸片段选自下组:序列SEQ IDN°7、SEQ ID N°8、SEQ ID N°9、SEQ ID N°10、SEQ ID N°11、SEQ ID N°12、SEQ ID N°13、SEQ ID N°14的核酸片段、其变体及其互补序列;且
b.所述与丙酸杆菌核酸特异性杂交的核酸片段选自下组:序列SEQ IDN°23、SEQ ID N°24、SEQ ID N°25、SEQ ID N°26、SEQ ID N°27、SEQ ID N°28的核酸片段、其变体及其互补序列。
15.一种在根据权利要求1至12中任一项的方法中使用的核酸阵列,其包含:
a.至少与马拉色菌核酸特异性杂交的核酸片段;和
b.至少与丙酸杆菌核酸特异性杂交的核酸片段。
16.根据权利要求15的核酸阵列,其中:
a.所述与马拉色菌核酸特异性杂交的核酸片段选自下组:序列SEQ IDN°7、SEQ ID N°8、SEQ ID N°9、SEQ ID N°10、SEQ ID N°11、SEQ ID N°12、SEQ ID N°13、SEQ ID N°14的核酸片段、其变体及其互补序列;且
b.所述与丙酸杆菌核酸特异性杂交的核酸片段选自下组:序列SEQ IDN°23、SEQ ID N°24、SEQ ID N°25、SEQ ID N°26、SEQ ID N°27、SEQ ID N°28的核酸片段、其变体及其互补序列。
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