CN114008220A

CN114008220A - 皮肤早期老化的诊断方法

Info

Publication number: CN114008220A
Application number: CN202080045787.7A
Authority: CN
Inventors: 菲利普·巴斯蒂安; C·克拉沃德; 纳斯瑞恩·保洛克巴
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 2019-06-24
Filing date: 2020-06-24
Publication date: 2022-02-01
Also published as: FR3097558A1; WO2020260390A1; FR3097558B1; US20220307094A1; EP3987066A1

Abstract

本发明涉及一种受试者的特别是与污染有关的皮肤早期老化的诊断方法，包括步骤(a)：在受试者的皮肤样本中确定至少一种标记物的水平，该至少一种标记物选自由以下项组成的组：含编码与序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少90％一致的ITS1区序列(“内部转录间隔区1”)的核酸的真菌，以及任选的含编码与序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10至少90％一致的ITS1区序列的核酸的真菌。

Description

皮肤早期老化的诊断方法

技术领域

本发明涉及皮肤早期老化的诊断方法。

背景技术

一些城市地区经常处于污染高峰。人们(尤其是在城市地区的人们)在日常环境中可能会因不同的空气污染物而受到对角蛋白材料，特别是对皮肤的多种有害影响。

在已知的污染物中，首先提及已成为大城镇的主要关注点的废气，废气会产生重金属，而且也会产生含有诸如多环芳烃(例如苯并a芘或苯并蒽)之类的分子的细颗粒。

特别是，这些污染物在皮肤层导致颗粒沉积在表皮表面，并在其他后果中引起皮肤早期老化，其特征是出现细纹和/或皱纹、大斑疹(large macules)、单纯性雀斑、红色斑块，和/或肤色暗沉和/或外观不均匀。

发明内容

本发明人已经表明，长期暴露于大气污染与皮肤真菌微生物组的变化和皮肤早期老化有关。

通过将暴露于污染确定为经过皮肤真菌微生物组的变化造成皮肤早期老化的一个因素，可以通过专门针对真菌微生物组的变化来更有效地预防和/或处理这种老化。

因此，非常需要特别是与污染相关的皮肤早期老化的诊断方法。

本发明满足了这种需要。

本发明源于发明人的意外发现，即来自表现出皮肤早期老化并暴露于长期污染的个体的皮肤样本(基于在其头发样本中检测到高水平污染物)与未表现出早期老化和未暴露于这种污染的个体相比某些真菌具有显著不同水平。

因此，本发明涉及一种受试者中特别是与污染有关的皮肤早期老化的诊断方法，包括步骤(a)：在受试者的皮肤样本，特别是受试者的皮肤表面的皮肤样本中确定至少一种标记物的水平，所述至少一种标记物选自由以下项组成的组：含编码与序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6至少90％一致的ITS1区(“内部转录间隔区1”)序列的核酸的真菌，以及任选的含编码与序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10至少90％一致的ITS1区序列的核酸的真菌。

在一个具体的实施方案中，所述至少一种标记物选自由念珠菌(Candida)属真菌、核盘菌(Sclerotiniaceae)科真菌、裸胞壳(Emericella)属真菌、肉座菌(Hypocreales)目真菌、毛霉(Mucor)属真菌、掷孢酵母(Sporobolomyces)属真菌，以及任选的马拉色菌(Malassezia)属真菌和隐球菌(Cryptococcus)属真菌组成的组。

在一个优选的实施方案中，所述至少一种标记物选自由念珠菌属真菌、核盘菌科真菌、裸胞壳属真菌、肉座菌目真菌、毛霉属真菌和掷孢酵母属真菌组成的组。

标记物

在本发明的上下文中使用的标记物选自由以下项组成的组：含编码与序列SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6至少90％一致的序列的ITSl区(“内部转录间隔区1”)的核酸的真菌，以及任选的含编码与序列SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10至少90％一致的ITS1区序列的核酸的真菌。

在一个具体的实施方案中，本发明上下文中使用的标记物选自由含编码与序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6至少90％一致的ITS1区序列的核酸的真菌组成的组。

“ITS1区”或“内部转录间隔区1”在本文中是指在染色体中位于核糖体RNA(rRNA)小亚基的基因与核糖体RNA(rRNA)的大亚基的基因之间的核糖体RNA基因区的内部转录间隔区(ITS)DNA序列或多顺反子rRNA前体转录物中对应的转录区。更具体地，ITS1区在真核生物中位于rRNA基因18S和5.8S之间。

因此，在本发明的上下文中使用的标记物可以选自由以下项组成的组：含与序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6至少90％一致的ITS1区序列的真菌，以及任选的含与序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：10至少90％一致的ITS1区序列的真菌。

在一个具体的实施方案中，本发明上下文中使用的标记物选自含与序列SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6至少90％一致的ITS1区序列的真菌组成的组。

在本发明的上下文中，使用全局比对(即在它们的整个序列上比较两个序列)来计算“一致性百分比”。用于比较两个或更多个序列的一致性的方法是技术人员熟知的。例如可以使用如Findley等人，(2013)Nature 498：367-370中描述的策划数据库上QIIME(版本1.9)中的“assign taxonomy.py”命令。

在一个具体的实施方案中，本发明的上下文中使用的标记物选自由以下项组成的组：含编码ITS1区，特别是与序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6至少91％一致，特别是至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或至少100％一致的ITS1区序列的核酸的真菌，以及任选的含编码ITS1区，特别是与序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10至少91％一致，特别是至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或至少100％序列一致的ITS1区序列的核酸的真菌。

在一个具体的实施方案中，在本发明的上下文中使用的标记物选自由含编码ITS1区，特别是与序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6至少91％一致，特别是至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或至少100％一致的ITS1区序列的核酸的真菌组成的组。

序列SEQ ID NO：1是念珠菌属真菌的ITS1的代表序列。

序列SEQ ID NO：2是核盘菌科真菌的ITS1的代表序列。

序列SEQ ID NO：3是裸胞壳属真菌的ITS1的代表序列。

序列SEQ ID NO：4是肉座菌目真菌的ITS1的代表序列。

序列SEQ ID NO：5是毛霉属真菌的ITS1的代表序列。

序列SEQ ID NO：6是掷孢酵母属真菌的ITS1的代表序列。

序列SEQ ID NO：7是代表马拉色菌属真菌(OTU F11231)的ITS1的代表序列。

序列SEQ ID NO：8是代表马拉色菌属真菌(OTU F4665)的ITS1的代表序列。

序列SEQ ID NO：9是代表马拉色菌属真菌(OTU F495)的ITS1的代表序列。

序列SEQ ID NO：10是隐球菌属真菌的ITS1的代表序列。

因此，在具体的实施方案中，所述至少一种标记物选自由念珠菌属真菌、核盘菌科真菌、裸胞壳属真菌、肉座菌目真菌、毛霉属真菌、掷孢酵母属真菌，以及任选的马拉色菌属真菌和隐球菌属真菌组成的组。

在优选的实施方案中，所述至少一种标记物选自由念珠菌属真菌、核盘菌科真菌、裸胞壳属真菌、肉座菌目真菌、毛霉属真菌和掷孢酵母属真菌组成的组。

“念珠菌属真菌”在本文中是指通常伴有菌丝体的或假菌丝体的丝状物的圆形或椭圆形的芽孢酵母，其代表种是白色念珠菌(Candida albicans)，取决于种，可在健康人的口腔、皮肤、消化系统和阴道菌群中形成共生体。

“核盘菌科真菌”在本文中是指属于柔膜菌(Helotiales)目的真菌，其通过菌核或基质繁殖。

“裸胞壳属真菌”在本文中是指曲霉菌(Aspergillus)属真菌的有性态。

“肉座菌目真菌”在本文中是指肉座菌亚纲真菌，当有性态已知时，其子实体是子囊壳。

“毛霉属真菌”在本文中是指毛霉目(order Mucorales)真菌，通常形成快速生长的白色至米色或灰色的菌落，并且具有可以是简单的或分枝的并形成顶端球状孢子囊的孔。

“掷孢酵母属真菌”在本文中是指掷孢目(order Sporidibolales)变形酵母，其有性态形式包括在掷孢菌属(genus Sporidibolus)中。

“马拉色菌属真菌”在本文中是指马拉色菌科(Malasseziaceae family)酵母，其在包括人在内的许多动物的皮肤表面上天然存在。

“隐球菌属真菌”在本文中是指银耳科(Tremellaceae family)酵母，其有性或有性态形是线黑粉菌属(genus Filobasidiella)。

诊断方法

本发明的诊断方法是一种特别是与污染有关的皮肤早期老化的诊断方法。

“皮肤早期老化”特别是指通常影响25岁至45岁年龄范围的人的皮肤老化的最初迹象，尤其可解释为细纹的出现、肤色暗沉和/或外观不均匀。

皮肤的早期老化具体由以下情况的出现而证实：细纹和/或皱纹、大斑疹、单纯性雀斑、红色斑块，和/或暗沉和/或不均匀外观。

因此，在具体的实施方案中，皮肤早期老化包括细纹和/或皱纹、大斑疹、单纯性雀斑、红色斑块，和/或肤色暗沉和/或外观不均匀的存在。

皮肤更特别是面部皮肤，尤其是脸颊和/或前额的皮肤、领口的皮肤、颈部的皮肤、手臂和前臂的皮肤。更优选地，皮肤是面部皮肤，特别是脸颊和/或前额的皮肤。

在具体的实施方案中，皮肤早期老化与污染有关，特别是由污染导致的皮肤早期老化。

“污染”在本文中是指长期暴露于颗粒物质，特别是多环芳烃(PAH)。

在具体的实施方案中，污染是暴露于颗粒物质，特别是PAH，PAH会导致在受试者头发中产生以下水平的PAH和PAH代谢物：

-比对照水平高至少1.8倍水平的2-OH-菲；

-比对照水平高至少1.6倍水平的3-OH-芴；

-比对照水平高至少1.7倍水平的3-OH-菲；

-比对照水平高至少1.8倍水平的B-b-荧蒽；

-比对照水平高至少1.7倍水平的苯并-g-h-i-苝；

-比对照水平高至少2倍水平的荧蒽；和/或

-比对照水平高至少1.6倍水平的芘，

对照水平通常是居住在低污染城市，特别是在一年的时间内有少于100天(特别是少于85天)是空气质量指数低于100的城市的受试者头发中的所述化合物的水平。

本发明的诊断方法包括步骤(a)：在受试者的皮肤样本，特别是表面皮肤样本中，确定选自由如在以上“标记物”部分中限定的真菌组成的组的所述至少一种标记物的水平。

在具体的实施方案中，样本中所述至少一种标记物的水平是样本中所述至少一种标记物的相对丰度。

“相对丰度”在本文中是指样本中指定分类群相对于分类群总数的以百分比计的相对量。

可以使用任何合适的技术来确定所述至少一种标记物的水平。

在具体的实施方案中，所述至少一种标记物的水平，特别是所述至少一种标记物的相对丰度通过测量相应的ITS1 DNA区的水平来确定。

优选地，所述至少一种标记物的水平通过PCR扩增结合对ITS1 DNA区的测序，特别是高通量测序来确定。

通常，提取皮肤样本中存在的真菌基因组DNA，然后使用靶向真菌ITS1 DNA区的引物对该真菌基因组DNA进行PCR，特别是如Leung等人，(2016)Microbiome 4∶46中所述。对获得的ITS1 DNA扩增子进行测序，以能够识别相应的真菌并测量每种识别的真菌ITS1 DNA的相对丰度。

在具体的实施方案中，本发明的诊断方法进一步包括由以下项组成的步骤：

(b)将在步骤(a)中测量的所述至少一种标记物的水平与对照进行比较；知

(c)基于步骤(b)中的比较，确定受试者的皮肤是否表现出特别是与污染相关的早期老化。

在具体的实施方案中，对照是参考值。

在具体的实施方案中，参考值通过确定的人群(例如确定的年龄组和/或具有限定的皮肤类型的人群)中所述标记物水平的平均值来确定。

在具体的实施方案中，参考值是居住在低污染城市，特别是在一年的时间内有少于100天(特别是少于85天)是空气质量指数低于100的城市的受试者群中，特别是如下所限定的受试者中所述标记物水平的平均值。

在具体的实施方案中，在以下情况下，受试者的皮肤被诊断为表现出特别是与污染相关的早期老化：

-在受试者的皮肤样本中测定的念珠菌属真菌的水平，特别是其相对丰度高于对照水平(特别是显著高于对照水平)；

-在受试者的皮肤样本中测定的核盘菌科真菌的水平，特别是其相对丰度高于对照水平(特别是显著高于对照水平)；

-在受试者的皮肤样本中测定的裸胞壳属真菌的水平，特别是其相对丰度高于对照水平(特别是显著高于对照水平)；

-在受试者的皮肤样本中测定的肉座菌目真菌的水平，特别是其相对丰度高于对照水平(特别是显著高于对照水平)；

-在受试者的皮肤样本中测定的毛霉属真菌的水平，特别是其相对丰度高于对照水平(特别是显著高于对照水平)；

-在受试者的皮肤样本中测定的掷孢酵母属真菌的水平，特别是其相对丰度高于对照水平(特别是显著高于对照水平)；

-在受试者的皮肤样本中测定的马拉色菌属真菌的水平，特别是其相对丰度低于对照水平(特别是显著低于对照水平)；和/或

-在受试者的皮肤样本中测定的隐球菌属真菌的水平，特别是其相对丰度低于对照水平(特别是显著高于对照水平)，

对照水平通常是居住在低污染城市，特别是在一年的时间内有少于100天(特别是少于85天)是空气质量指数低于100的城市的受试者的皮肤样本中所述标记物的水平(特别是所述标记物的相对丰度)。

标记物水平通常通过特别是通过PCR扩增结合对ITS1 DNA区的测序来测量相应的ITS1 DNA区的水平来测定，典型地如上所述。

在本发明的含义中，“显著低于”是指与对照水平相比，标记物水平在统计学上显著降低。

在本发明的含义中，“显著高于”是指与对照水平相比，标记物水平在统计学上显著增加。

在优选的实施方案中，本发明的诊断方法中使用的受试者的皮肤样本是从受试者的皮肤，优选受试者的面部，特别是受试者的脸颊和/或前额上采集(优选非侵入性地)样本。优选地，皮肤样本来自角质层，特别是来自角质层的表面。

角质层是离表皮最远的那层，并且包括皮肤表面。它主要由死细胞组成。

在一实施方案中，本发明的诊断方法包括从受试者，特别是从受试者皮肤表面采集皮肤样本的步骤。该步骤优选地以非侵入性方式进行，特别是不需要局部麻醉。

在优选的实施方案中，样本采集步骤通过特别是用湿棉签摩擦皮肤表面来进行。

在具体的实施方案中，因此通过摩擦皮肤表面来采集皮肤样本。

“受试者”在本文中是指人类，优选年龄为25岁至45岁的人。优选地，受试者是女性。优选地，受试者是亚洲类型的。

在具体的实施方案中，受试者的年龄在25岁至45岁之间。

本发明还涉及一种对受试者中表现出特别是与污染相关的早期老化的皮肤进行美容处理的方法，所述方法包括以下步骤：

A)通过实施本发明的诊断方法，将受试者诊断为表现出特别是与污染相关的皮肤早期老化；

B)如果受试者被诊断为表现出特别是与污染有关的皮肤早期老化，则用能够减少和/或减缓皮肤早期老化的化妆品组合物处理所述受试者的皮肤。

在具体的实施方案中，本发明的处理方法中使用的化妆品组合物包含益生菌和/或益生元，益生菌和/或益生元特别是能够促进共生菌群的存在。

在下面给出的附图和实施例中更详细地描述了本发明。

序列说明

附图说明

图1示出了真菌的集群和早期老化。灰色圆圈对应于有皱纹和色素沉着斑点的个体。左边的椭圆对应于集群：“早期老化”：n(总计)＝90(53保定/37大连)59％相对于41％。

具体实施方式

实施例

下面的实施例示出了对包括8种真菌的标志的识别，在暴露于长期污染的个体的皮肤样本中，这8种真菌受到显著调节(基于个体的头发样本中检测到高水平污染物)。

材料和方法

主要步骤：

-皮肤采样

-分析真菌的ITS1 rDNA

-测定微生物组标记物的相对丰度

-统计学研究

-皮肤早期老化的诊断。

受试者说明

在保定和大连(中国)，每个城市的所有受试者都来到设施中。在204名25岁至45岁的健康状况良好的中国女性中收集了皮肤样本，她们中，102名居住在河北省的记录了高度空气污染(约90μgPM_2.5/m³空气)的相对乡村和工业的保定市(中国北部的城市)，而102名居住在辽宁省的记录的空气污染程度较低(约30μgPM_2.5/m³空气)的城市化和现代化的大连市(中国北部的城市)。这些城市位于同一纬度区，并且在过去15年中已经共享了相似的气候和相等的UV暴露(UV指数)。

评估了居住在这两个城市的参与者12cm头发样本中对PAH(多环芳烃)的暴露(反映了一年的时间内的暴露程度)(Palazzi等人，(2018)Env.Int.121：1341-1354)。具体而言，在保定，母体PAH的中值浓度是大连浓度的1.5至2.8倍且PAH代谢物的中值浓度是大连浓度的1.1至2.3倍。在量化的母体PAH中，观察到菲、荧蒽、芘、芴、苊和蒽的水平较高，而对于PAH代谢物，9-OH芴、2-OH-萘和1-OH-蒽的含量较高(Palazzi等人，(2018)Env.Int.121：1341-1354)。

在临床水平上，观察到居住在保定的个体中几乎所有面部症状(包括皱纹和色素紊乱)的严重程度增加。此外，使用皮肤病学评估数据对受试者进行判别分析(Bourokba等人，在俄勒冈州波特兰市于2017年4月26日至29日在皮肤病学研究学会第76届年度会议上展示的海报)。这种分析得出了“早期老化”集群的定义，对应于204名中的n＝90名女性(保定53名，大连37名)。这些女性的平均年龄为36岁，并且她们表现出增加的皱纹和色素疾病(大斑疹、单纯性雀斑、红色斑块)水平。

受试者和样本收集

参与者在采样前1个月内都没有服用过全身性抗生素或抗真菌药，都没有患严重的皮肤病，或在采样前3个月内都没有使用过皮肤或全身性脱色/美白处理，或在采样前1个月都没有使用过去角质产品，在采样前3天，她们被要求使用提供的不含任何抗菌化合物的中性肥皂洗脸(一天一次)。最后一次洗头发和最后一次洗脸分别在采样前48小时和24小时。在采样之前，不允许在头皮、头发和面部使用其他产品。

在具有受控气氛的房间内于22℃和60％湿度下进行微生物群采样。使用加热到150℃的干燥无菌棉签收集用于微生物组分析的样本并用ST溶液(含0.1％吐温20的0.15MNaCl)预先润湿样本。对于脸颊样本，将拭子浸没在收集缓冲液中并在脸颊上用力摩擦60秒以覆盖1cm×2cm的表面。采样后，将每个棉签放入微管中，立即在液氮中冷冻，并在提取基因组DNA(gDNA)前在-80℃下保存。

真菌ITS1 rDNA的分析

-用于ITS测序的扩增子样本的制备。

使用PowerSoil

分离试剂盒(MO BIO Laboratories，Carlsbad，CA，USA)，按照修改后的制造商说明(如Leung等人，(2014)Appl.Environ.Microbiol.80：6760-6770所述)提取gDNA。此外，在C6洗脱后，将洗脱液再通过同一柱过滤器额外的时间以提高产量。平行提取不含DNA的阴性水对照物。用靶向ITS1区域的引物对每个gDNA样本进行PCR，一式三份，如Leung等人，(2016)Microbiome 4∶46所述。为了分析ITS1区，在PCR 7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)上制备扩增子PCR和索引PCR，并用DNA/RNA纯化珠(SeqMatic，Fremont，CA，USA)对扩增子进行纯化。文库的制备和250bp的真菌核酸在lllumina

平台上的双端测序由SeqMatic LLC(Fremont，CA，USA)进行。

-ITS序列的处理和生物信息学分析

在USEARCH中使用“-fastq_mergeairs”命令合并分别以fastq格式配对的真菌读数。在USEARCH中使用“-fastq_filter”命令过滤合并的读数以进行质量控制，最大预期错误率为0.01。在450bp处截止合并的读数，并且舍弃最短的读数。使用UPARSE算法以97％的序列一致性对过滤后的读数进行OTU分组(Edgar(2013)Nature Methods 10：996-998)。真菌OTU在被设计用于监测皮肤微生物组的有组织的真菌数据库上进行查询(Findley等人，(2013)Nature498：367-370)。使用UCHIME2(Edgar(2016)bioRxiv 074252)在高置信度模式下进行嵌合体的检测。超过5％的阴性对照物中存在的分类系中的OTU被认为是潜在的污染物(Leung等人，(2018)Microbiome 6∶26)，并从数据集中删除。此外，还去除了嵌合OTU、叶绿体和线粒体的OTU。在质量控制和去除不合意的读数后，总共保留了14649172个真菌读数。

统计学分析

使用了两种统计方法：对OTU丰度进行假设测试和使用分层多块分析(MAXVAR-A)进行多变量分析。

这些测试的结果是定性的：正常皮肤或表现出早期老化的皮肤。

-方法1：比较每种标记物或组合的OTU丰度。

在相对丰度数据的处理上，对OTU相对丰度进行了预过滤。舍弃所有个体中相对丰度低于0.1％的OTU。此外，还应用了CSS(“累积总和标度”)标准化，其纠正了由TSS(“总和标度”)标准化引起的在差异丰度评估上的偏差。使用R包metagenomeSeq(http://www.cbcb.umd.edu/software/metagenomeSeq)实施数据的CSS标准化。

通过使用v-检验(v-test)通过统计测试程序评估两组之间在OTU丰度方面的平均差异。V-检验值对应于感兴趣组中的平均OTU丰度(即早期老化)(列：类的平均值)与总人群的平均OTU丰度(列：总体平均值)之间的比较。正值表示感兴趣组中的OTU丰度较高，并且负值表示丰度较低。还计算了与每个v-检测值相关的p值(列：p值)。

计算了“早期老化”组以外的受试者的平均OTU丰度(列：集群1.3.4的平均值)。下表中给出了每组的CSS标准化后的OTU丰度和阈值。

-方法2：将与受试者的历史分组相关的真菌相对丰度谱与PAH化合物进行比较(保定/大连数据库)。

关于与PAH的全局相关性分析，对OTU相对丰度进行了预过滤。去除所有个体中相对丰度低于0.1％的OTU。此外，还应用了CSS标准化(“累积总和标度”)，其纠正了由TSS(“总和标度”)标准化引起的差异丰度评估的偏差。在OTU中，针对真菌选择了69个。将PAH测量值进行对数转换以遵循高斯分布。共有202名具有OTU和PAH数据的个体被纳入分析。考虑到变量选择，进行稀疏典型相关分析(sCCA)以选择在块之间的关系中处于活动状态的OTU和PAH描述符。使用PMD R包的MutiCCA.permute函数，通过置换程序来选择sCCA的稀疏性参数(Witten等人，(2009)Biostatistics 10：515-534；Tenenhaus等人，(2014)Biostatistics15：569-583)。最后，为了获得2个块中个体的共同表示，使用RGCCA R包进行分层多块分析(MAXVAR-A)(Tenenhaus等人，(2017)Psychometrika 82：737-777)。表新出早期老化迹象的受试者在图1中用圆圈圈出。

为了诊断，必须将新的谱与分组进行比较。如果新的谱包含在左侧的椭圆内，则受试者测试为阳性并表新出皮肤早期老化。

序列表

<110> 欧莱雅

<120> 皮肤早期老化的诊断方法

<130> BET 20P1981

<150> FR19 06830

<151> 2019-06-24

<160> 10

<170> PatentIn 3.5版本

<210> 1

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 念珠菌属的ITS1序列

<400> 1

gtaaaagtcg taacaaggtt tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta cagaatgaaa 60

agtgcttaac tgcatttttt cttacacatg tgtttttctt tttttgaaaa ctttgctttg 120

gtaggccttc tatatggggc ctgccagaga ttaaactcaa ccaaatttta tttaatgtca 180

accgattatt taatagtcaa aactttcaac aacggatctc ttggttctcg catcgatgaa 240

gaacgcagcg 250

<210> 2

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核盘菌科的ITS1序列

<400> 2

gtaaaagtcg taacaaggtt tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta cagagttcat 60

gcccgaaagg gtagacctcc cacccttgtg tattattact ttgttgcttt ggcgagctgc 120

cttcgggcct tgtatgctcg ccagagaata ccaaaactct ttttattaat gtcgtctgag 180

tactatataa tagttaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa 240

cgcagcgaaa 250

<210> 3

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 裸胞壳属的ITS1序列

<400> 3

gtaaaagtcg taacaaggtt tccgtaggtg aacctgcgga aggatcattg tcgtgaccct 60

gaccaaaaca gaccgcgcac gcgtcatcca atccgtcggc gacggcaccg tccgtcgctc 120

ggccaatgcc tcgaccacct cccctcctcg gagcgggtgg gggctcgggg taaaagaacc 180

cacggcgccg aaggcgtcaa ggaacactgt gcctaacccg ggggcatgtc tagcttgcta 240

gccgtccctc 250

<210> 4

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 肉座菌目的ITS1序列

<400> 4

gtaaaagtcg taacaaggtt tccgttggtg aaccagcgga gggatcatta tagagtgtaa 60

actccctaac ctttgtgaac atacctgttg cttcggcggt cctcaccggc cgccgaaggc 120

ctatattctt gaatttacat gaatttctga gtatcaaaca aaaataaata aaaactttca 180

gcaacggatc tcttggctct ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt 240

gaattgcaga 250

<210> 5

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 毛霉属的ITS1序列

<400> 5

gtaaaagtcg taacaaggtt tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta aataatcaat 60

aattttggct tgtccatcat tatctattta ctgtgaaacg tattattact tgacgcctga 120

gggatgttcc actgctataa ggataggcag cggaaatgtt aaccgagtca taatcaagct 180

taggcttggt atcctattat tatttaccaa aagaattcag aattaatatt gtaacataga 240

cgtaaaaaat 250

<210> 6

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 掷孢酵母属的ITS1序列

<400> 6

gtaaaagtcg taacaaggtt tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta gtgaataaat 60

agggtgtcca atttaacttg gaacccgacc ttctcacatc taaccctgtg catctgtata 120

taatggcgag caattttcga attgtgagcc atttcacttt ataaacacta gtctatgaat 180

gtaaaatttt tataacaata aaaactttca acaacggatc tcttggctct cgcatcgatg 240

aagaacgcag 250

<210> 7

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 马拉色菌属(OTU F11231)的ITS1序列

<400> 7

gtaaaagtcg taacaaggtt tctgtaggtg aatctgcagg aggatcatca gtgatgattt 60

gggcaggcca tacggacgcc aaaaagtgtc cctggccgcc tacacccact atacatccac 120

aaacccgtgt gcactgcctt ggagaaaggc ttcagagaag tttttgtggc ctctcttggg 180

gtctttcttc gctacagact cgaatggtta gtatgaacgt ggaacttggt tggaccgtca 240

ctggccaaaa 250

<210> 8

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 马拉色菌属(OTU F4665)的另一ITS1序列

<400> 8

gtaaagtcgt aacaaggttt ctgtaggtga acctgcagaa ggatcattag tgaagatttg 60

ggctggccat acggacgcca aaaagtgtcc ctggccgcct ccgcccacta tacctccaca 120

aacccgtgtt cactgtcttg gagaaaggct tcagagaagt tttttgtggc ctctcttggg 180

gtctttcttc gctacaaaat cgaatggtta gtatgaacgt ggaacttggt tggaccgtca 240

ctggccaaca 250

<210> 9

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 马拉色菌属(OTU F495)的另一ITS1序列

<400> 9

gtaaaagtcg taacaaggtt tctgtaggtg aacctgcaga aggatcatta gtgaagattt 60

gggcaggcca tacggacgcc acaaagtgtc cctggccgcc tacacccact atacatccac 120

aaacccgtgt gcactgtctt ggagaaaggc ttcttgagaa gttttgtggc ctctcttggg 180

gtctttcttc ttcgctacaa actcgaatgg ttagtatgaa cgtggaactt ggttggaccg 240

tcactggcca 250

<210> 10

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 隐球菌属的ITS1序列

<400> 10

gtaaaagtcg taacaaggtt tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta atgaatttag 60

attgaaccat aggcgaaagc cagtggttct tctttcatat ccataacacc tgtgcactgt 120

tggatgcttg catccacttt taaactaaac attattgtaa caaatgtagt cttattataa 180

cataataaaa ctttcaacaa cggatctctt ggctctcgca tcgatgaaga acgcagcgaa 240

atgcgataag 250

Claims

1.受试者的特别是与污染有关的皮肤早期老化的诊断方法，包括步骤(a)：在所述受试者的皮肤样本中确定至少一种标记物的水平，所述至少一种标记物选自由以下项组成的组：含编码与序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少90％一致的ITS1区(“内部转录间隔区1”)序列的核酸的真菌，以及任选的含编码与序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10至少90％一致的ITS1区序列的核酸的真菌。

2.根据权利要求1所述的诊断方法，其中，所述至少一种标记物选自由念珠菌属真菌、核盘菌科真菌、裸胞壳属真菌、肉座菌目真菌、毛霉属真菌、掷孢酵母属真菌，以及任选的马拉色菌属真菌和隐球菌属真菌组成的组。

3.根据权利要求1或2所述的诊断方法，其中，所述至少一种标记物选自由念珠菌属真菌、核盘菌科真菌、裸胞壳属真菌、肉座菌目真菌、毛霉属真菌和掷孢酵母属真菌组成的组。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的诊断方法，其中，所述方法进一步包括由以下项组成的步骤：

(b)将在步骤(a)中测量的所述至少一种标记物的水平与对照进行比较；以及

(c)基于步骤(b)中的比较，确定所述受试者的皮肤是否表现出特别是与污染相关的早期老化。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的诊断方法，其中，所述至少一种标记物的水平通过测量相应的ITS1 DNA区的水平来确定。

6.根据权利要求5所述的诊断方法，其中，所述至少一种标记物的水平通过PCR扩增结合对所述ITS1 DNA区的测序来确定。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的诊断方法，其中，所述皮肤样本通过摩擦皮肤表面来采集。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的诊断方法，其中，皮肤早期老化与污染有关。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的诊断方法，其中，所述受试者的年龄在25岁至45岁之间。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的诊断方法，其中，早期老化包括细纹和/或皱纹、大斑疹、单纯性雀斑、红色斑块，和/或肤色暗沉和/或不均匀的存在。