CN117751198A - 测定皮肤老化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过测量和/或调节选自细胞增殖速率、NFKB1基因表达、CDKN1A基因表达、CDKN2A基因表达、CEBPB基因表达以及它们的组合的特性来诊断和治疗快速老化皮肤，特别是年轻受试者的快速老化皮肤的方法。

Description

测定皮肤老化的方法
技术领域
本发明提供了诊断和治疗快速老化皮肤，特别是年轻受试者的快速老化皮肤的方法，该方法通过测量和/或调节此类皮肤中的细胞增殖速率、NFKB1基因表达、CDKN1A基因表达、CDKN2A基因表达或CEBPB基因表达来进行。还提供了筛选用于快速老化皮肤的活性剂和其他治疗的方法。
背景技术
皮肤老化的特征通常在于皮肤成纤维细胞功能的损伤，该损伤诱导细胞外基质的损失以及差的再生能力，最终导致皱纹和松垂。在若干特征中，已知增殖能力的丧失是与细胞衰老相关联的成纤维细胞老化的关键标志之一。尽管与老年群体相比，可证明年轻群体中的细胞增殖的显著差异，但是在年轻群体中经常观察到更高的变异性，从而提出了年轻群体中更高的供体间变异性的问题。
细胞衰老最初由Hayflick和Moorhead在1961年描述，其引入了细胞老化的理论，其中细胞具有有限的分裂能力。L.Hayflick，PS.Moorhead，Exp Cell Res 25(1961)585-621。这种增殖潜力的丧失导致细胞衰老所特有的细胞周期停滞。其伴随着细胞形态的改变、衰老相关的β-半乳糖苷酶活性增加以及各种细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶的释放，也称为衰老相关分泌表型(SASP)。
J Am Acad Dermatol 2018；78：29-39讨论了年龄为20岁至74岁的白种人女性皮肤中基因表达谱的年龄诱导和光诱导的变化。基因表达和个体发育分析揭示，与氧化应激、能量代谢、衰老和表皮屏障相关的途径从20岁到70岁发生了渐进性变化。发现来自看起来更年轻的女性子集的基因表达模式与实际上更年轻的女性的那些基因表达模式相似。具体地讲，虽然作者注意到在暴露于阳光的面部皮肤中增加的CDKN2A基因表达和老化外观，但是他们还指出在整个年龄组的避光臀部皮肤样品中CDKN2A表达保持相对不变。
Cell Res.2015年5月；25(5)：574-87.doi：10.1038/cr.2015.36描述了三维人类面部形态作为稳健的老化标记的用途。在这篇论文中，研究人员使用志愿者的3D面部成像来确定老化的面部特征，并且通过将他们的经算法预测的年龄与他们的实足年龄进行比较来确定缓慢老化者特征和快速老化者特征。将结果与志愿者的血清组成进行比较。没有在细胞水平或遗传水平上进行分析，该方法仅基于老化的外部/视觉迹象。仅当出现明显的老化迹象时，面部成像才诊断出快速老化者。
申请人现在已发现，令人惊讶的是，尽管临床上看起来年轻，但年轻皮肤实际上可能正快速老化，含有快速老化细胞。本发明人已经鉴定了信号传递快速老化皮肤细胞的若干生物途径。这些可继而被治疗、改变或调节以减缓快速老化皮肤的速率。这是特别有利的，因为具有快速老化皮肤的年轻受试者可能不能以其他方式确定需要治疗他们皮肤的老化迹象。
发明内容
本发明提供了一种诊断年轻受试者的快速老化皮肤的方法，该方法包括测量年龄为40岁或更小的受试者的皮肤样品中的细胞增殖速率和选自NFKB1、CDKN1A、CDKN2A、CEBPB以及它们的组合的基因的表达。
本发明还提供了一种评价对快速老化皮肤的治疗功效的方法，该方法依次包括：(a)将该治疗施用于年龄为40岁或更小的受试者的皮肤；以及(b)测量该受试者的皮肤样品中的细胞增殖速率和选自NFKB1、CDKN1A、CDKN2A、CEBPB以及它们的组合的基因的表达。
本发明还提供了筛选用于治疗快速老化皮肤的活性剂的方法，该方法包括：(a)将所述活性剂施用于来自年龄为40岁或更小的受试者的皮肤样品；(b)测量该皮肤样品中的细胞增殖速率和选自NFKB1、CDKN1A、CDKN2A、CEBPB以及它们的组合的基因的表达；(c)将所述测量结果与对照进行比较；以及(d)选择与该对照相比提供以下中的至少一种的所述活性剂：减少皮肤成纤维细胞群倍增时间、下调NFKB1基因表达、下调CDKN1A基因表达、下调CDKN2A基因表达和下调CEBPB基因表达。
附图说明
图1是时间(天)对实施例1中所述的供体在第0天、第4天和第10天的平均细胞计数(×10，000)的点图。
图2是汇总了实施例2中高增殖成纤维细胞和低增殖成纤维细胞之间基因表达的差异分析结果的火山图。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。将本文提及的所有出版物、专利申请、专利以及其它参考文献以引用方式并入本文。
如本文所用，“产品”任选地为成品包装的形式。在一个实施方案中，包装为容纳该组合物的容器，诸如塑料、金属或玻璃管或罐。产品还可含有另外的包装，诸如用于储存此类容器的塑料或硬纸板盒。在一个实施方案中，产品包含本发明的组合物并且含有指导使用者向皮肤或毛发施用组合物的说明书。
如本文所用，“局部施用”意指例如用手或涂敷器(诸如擦拭物、滚筒或喷雾器)直接涂抹在或铺展在外层皮肤、头皮或毛发上。
如本文所用，“美容上可接受的”意指该术语描述的成分适于与组织(例如，皮肤或毛发)接触使用而不会引起不适当的毒性、不相容性、不稳定性、刺激性、变应性应答等。
如本文所用，“活性剂”是对皮肤或毛发具有美容或治疗效果的化合物(合成的或天然的)。
如本文所用，“美容品”是指能保留、恢复、给予、刺激或增强体美外观或似乎能增进美貌或年轻的美化物质或制品，尤其是涉及组织或皮肤的外观时。
如本文所用，“美容上有效量”意指足以处理或预防一种或多种皮肤老化迹象、但充分低以避免严重副作用的量。化合物或组合物的美容上有效量将会随以下因素而变：所治疗的具体病症、最终用户的年龄和身体状况、所治疗/预防的病症的严重程度、治疗的持续时间、其它治疗的性质、所采用的具体化合物或产品/组合物、所采用的具体美容上可接受的载体等等。
如本文所用，“老化迹象”或“皮肤老化迹象”包括存在包括细纹和皱纹在内的纹路、弹性损失、皮肤不均、斑疤、皮肤厚度减小以及胶原、糖胺聚糖、蛋白聚糖、弹性蛋白或糖蛋白(包括纤连蛋白)的异常或减弱合成。在一个实施方案中，老化迹象选自存在纹路、细纹、皱纹、弹性损失以及胶原、糖胺聚糖、蛋白聚糖、弹性蛋白或糖蛋白(包括纤连蛋白)的异常或减弱合成。
如本文所用，“皱纹”包括微细纹、微皱纹或粗皱纹。皱纹的示例包括但不限于眼睛周围的微细纹(例如“鱼尾纹”)、前额和颊皱纹、眉心纹和嘴部周围的笑纹。
如本文所用，“弹性损失”包括皮肤或组织的弹性或结构完整性的损失，包括但不限于松垂、松弛和松散的组织。弹性或组织结构完整性的损失可由多种因素所致，包括但不限于疾病、老化、激素变化、机械创伤、环境损害，或者是向组织施用产品诸如美容品或药物的结果。
如本文所用，“肤色不均”意指与弥漫状或斑驳状色素沉着相关联的皮肤状况，色素沉着可分类为色素沉着过度，诸如发炎后色素沉着过度。
如本文所用，“斑疤”意指与发红或红斑相关联的皮肤状况。
如本文所用，“改善皮肤的紧致度”意指增强皮肤的紧致度或弹性、预防皮肤的紧致度或弹性损失、或者预防或治疗松垂、松弛和松散的皮肤。皮肤的紧致度或弹性可通过使用皮肤弹性测试仪测量。参见J.Serup、G.Jemec与G.Grove编辑的Handbook Of Non-Invasive Methods And The Skin，第66.1章(2006年)。皮肤弹性或紧致度的损失可由多种因素所致，包括但不限于老化、环境损害或向皮肤施用美容品的结果。
如本文所用，“改善皮肤的肌理”意指使皮肤表面平滑以除去皮肤表面上的隆起块或裂隙。
如本文所用，“改善皮肤中皱纹的外观”意指预防、延缓、停止或逆转皮肤上皱纹和微细纹形成的过程。
如本文所用，“预防”是指降低患上给定病症、疾病或障碍的风险。
更广泛地讲，本发明的方法和组合物还可用于治疗或预防美容的、皮肤病学的或其他病症和障碍，包括但不限于与皮肤、指/趾甲和毛发相关的感染、皮肤或黏膜皮肤组织的失衡或紊乱；口腔、阴道和肛门粘膜；角化障碍；炎症；与内在和外在老化相关联的变化，以及可能与皮肤系统相关或可能与皮肤系统无关的其他变化。表现形式包括但不限于油性皮肤；痤疮；红斑痤疮；老年斑；瑕疵皮肤；疹斑；脂肪团；皮肤病；皮炎；皮肤、指/趾甲和毛发感染；头皮屑；皮肤、指/趾甲和毛发的干燥或松弛；干燥症；炎症或湿疹；弹性组织变性；疱疹；角化过度；皮肤色素沉着过度；鱼鳞病；角化病；雀斑；黑斑；斑点皮肤；假性毛囊炎；光老化和光损伤；瘙痒症；牛皮癣；皮纹；妊娠纹；皮肤、指/趾甲板和毛发变薄；疣；皱纹；口腔或齿龈疾病；刺激、发炎、发红、不健康、受损或异常粘膜、皮肤、毛发、指/趾甲、鼻孔、耳道、肛门或阴道病症；真皮组分的分解、缺陷合成或修复；胶原、糖胺聚糖、蛋白聚糖和弹性蛋白的异常或减弱合成，以及此类组分在表皮中的水平降低；不均匀的肤色；皮肤、指/趾甲和毛发表面不均匀和粗糙；皮肤、指/趾甲和毛发的回弹力、弹性和可卷曲性损失或减少；松弛；缺乏皮肤、指/趾甲和毛发润滑和光泽；指/趾甲和毛发脆性和分叉；皮肤泛黄；反应性、刺激或毛细管扩张的皮肤；以及暗沉且看起来较老的皮肤、指/趾甲和毛发。此外，本发明的组合物可用于皮肤、指/趾甲和毛发的一般护理；改善皮肤肌理和毛孔、发亮和红润；使皮肤柔软、光滑、清新、均衡、明显干净、均匀肤色且更加亮白；增加皮肤填充度和丰满度；以及用于皮肤漂白和增亮以及伤口愈合；减少或防止腋下、裆部、手掌或身体的其它部分出汗或有汗液。
如本文所用，术语“受试者”意指人类。受试者可以是“年轻”受试者，即年龄为40岁或更小。受试者的年龄可以为35岁或更小。受试者年龄可以为20-35岁。
如本文所用，“快速老化皮肤″意指表现出与具有较大实足年龄的皮肤类似的一种或多种亚临床老化迹象的皮肤。
如本文所用，“缓慢老化皮肤″意指随着此类皮肤的实足年龄表现出一种或多种亚临床老化组分迹象的皮肤。
如本文所用，“亚临床老化迹象”意指尚未被视觉感知的表型特征，诸如细胞或分子老化迹象。
如本文所用，“对照”意指具有与测试的皮肤样品基本上相同的(即，在小于或大于约5岁内)实足年龄的皮肤的参考值。
除非另外指明，否则百分比或浓度是指重量百分比或重量浓度(即％(重量/重量))。除非另外阐明，否则所有范围均包括端值，例如，“4至9”包括端值4和9。
诊断快速老化皮肤的方法
本发明涉及诊断受试者的快速老化皮肤的方法。
优选地，受试者是年轻受试者。
优选地，皮肤是面部皮肤。例如，皮肤可以来自脸颊、前额、下巴、眼睛区域或颈部，然而，可使用来自身体的任何其他部分的皮肤，例如手臂、手、躯干或腿。
优选地，皮肤样品来自角质层。
该方法包括测量受试者的皮肤样品中的选自细胞增殖速率、NFKB1基因表达、CDKN1A基因表达、CDKN2A基因表达、CEBPB基因表达以及它们的组合的特性。
该方法可包括测量皮肤样品中的细胞增殖速率和选自NFKB1、CDKN1A、CDKN2A、CEBPB以及它们的组合的基因的表达。
该方法可包括测量年龄为40岁或更小的受试者的皮肤样品中的细胞增殖速率和选自NFKB1、CDKN1A、CDKN2A、CEBPB以及它们的组合的基因的表达。
可以以多种方式收集样品，如本领域已知的，包括穿孔活组织检查或非侵入式方法诸如胶带剥离、通过使用仪器诸如SkinSkan测量体内色氨酸荧光或其他类似方法、共焦拉曼或反射共焦显微镜或其他显微镜/光谱法、微针贴片或其他类型的基于粘合剂贴片的皮肤活检装置。
优选地，样品通过非侵入式方法收集。
可分析样品的细胞增殖速率。在此类情况下，可使用本领域已知的方法测量样品的例如以天为单位的皮肤成纤维细胞群体倍增时间。例如，下文实施例1中所述的增殖测定可用于测量细胞增殖速率。
在其中群体倍增时间为至少4天的皮肤可被诊断为快速老化皮肤。
可分析样品的以下基因表达中的一者或多者。转录组分析方法也是本领域所熟知的。例如，可使用下文实施例2中所述的转录组分析方法。
可分析样品的NFKB1基因表达。
与对照相比，在其中NFKB1基因表达上调的皮肤可被诊断为快速老化皮肤。
可分析样品的CDKN1A基因表达。
与对照相比，在其中CDKN1A基因表达上调的皮肤可被诊断为快速老化皮肤。
可分析样品的CDKN2A基因表达。
与对照相比，在其中CDKN2A基因表达上调的皮肤可被诊断为快速老化皮肤。
可分析样品的CEBPB基因表达。
与对照相比，在其中CEPBP表达上调的皮肤可被诊断为快速老化皮肤。
如果上述基因中一者的表达比相同基因在来自年龄在约+/-5岁内的供体的成纤维细胞群体中的平均表达高至少约20％，则认为该基因上调。
如果上述基因中一者的表达比相同基因在来自年龄在约+/-5岁内的供体的成纤维细胞群体中的平均表达高至少约30％，则认为该基因上调。
评价对快速老化皮肤的治疗功效的方法
本发明还提供评价对快速老化皮肤的治疗功效的方法。
可如上所述选择和收集受试者和皮肤。受试者可以为40岁或更小的年龄。
该方法包括首先将待评价的治疗施用于受试者的皮肤。接着，可测量受试者的皮肤样品中的以下特性中的一者：细胞增殖速率、NFKB1基因表达、CDKN1A基因表达、CDKN2A基因表达、CEBPB基因表达以及它们的组合。可测量细胞增殖连同NFKB1基因表达、CDKN1A基因表达、CDKN2A基因表达和CEBPB基因表达中的一者或多者。
任选地，在向受试者的皮肤施用治疗之前，可最初测量相同特性中的一者或多者以提供基准。这些可用作对照。
可如本文所述分析样品的细胞增殖速率。例如，下文实施例1中所述的增殖测定可用于测量细胞增殖速率。
如果治疗为皮肤样品提供少于4天的群体倍增时间，则可认为其对于治疗快速老化皮肤是有效的。
可分析样品的以下基因表达中的一者或多者。转录组分析方法也是本领域所熟知的。例如，可使用下文实施例2中所述的转录组分析方法。
可分析样品的NFKB1基因表达。
如果治疗提供NFKB1基因表达的下调，则可认为其对于治疗快速老化皮肤是有效的。
可分析样品的CDKN1A基因表达。
如果治疗提供CDKN1A基因表达的下调，则可认为其对于治疗快速老化皮肤是有效的。
可分析样品的CDKN2A基因表达。
如果治疗提供CDKN2A基因表达的下调，则可认为其对于治疗快速老化皮肤是有效的。
可分析样品的CEBPB基因表达。
如果治疗提供CEBPB基因表达的下调，则可认为其对于治疗快速老化皮肤是有效的。
如果待分析基因的表达降低至少约20％，则可认为上述治疗中的一者是有效的。
如果待分析基因的表达降低至少约30％，则可认为上述治疗中的一者是有效的。
治疗
治疗包括改善、预防或逆转皮肤病症、疾病或障碍的任何手段。它们可抑制、减缓进展，或延迟此类皮肤病症、疾病或障碍的发作，可以是身体上的(例如稳定可辨别的症状)，也可以是生理上的(例如稳定身体参数)，或者两者兼有。
该治疗可通过局部施用来施用。
该治疗可以口服施用，即以可摄取的形式。
该治疗可以为局部施用化妆品组合物。
该组合物可含有一种或多种活性剂。该活性剂可以是美容上可接受的活性剂。该活性剂可以为抗老化剂。
该活性剂包括例如抗老化剂、抗痤疮剂、光泽控制剂、抗微生物剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、外用止痛剂、防晒剂、光防护剂、抗氧化剂、角质层分离剂、表面活性剂、保温剂、营养物质、维生素、增能剂、抗汗剂、收敛剂、除臭剂、紧致剂、抗硬剂以及用于毛发和/或皮肤调理的试剂。
基于该组合物的总重量，该组合物中活性剂的量可在按该组合物的重量计约0.001％至约20％，例如，按该组合物的重量计约0.005％至约10％，诸如按组合物的重量计约0.01％至约5％的范围内。
该活性剂可选自例如α羟基酸，多羟基酸，二肽包括N-酰基二肽衍生物，三肽，过氧化苯甲酰，D-泛醇类胡萝卜素，类视色素诸如视黄醇和棕榈酸视黄酯，神经酰胺，多不饱和脂肪酸，必需脂肪酸，酶诸如漆酶，酶抑制剂，矿物质，激素诸如雌激素，类固醇如氢化可的松、2-二甲基氨乙醇，铜盐诸如氯化铜，多肽诸如六胜肽和三胜肽、含铜的那些，辅酶Q10，氨基酸诸如脯氨酸，维生素，乳糖醛酸，乙酰辅酶A，烟酸，核黄素，硫胺，核糖，电子转运蛋白诸如NADH和FADH2，天然提取物诸如来自芦荟、野甘菊、燕麦片、莳萝、黑莓、毛泡桐、阿斯彭柠檬的那些，间苯二酚诸如4-己基间苯二酚，姜黄素，糖胺诸如N-乙酰基葡糖胺，以及它们的衍生物和混合物。
维生素的示例包括但不限于维生素A、维生素B类(诸如，维生素B3、维生素B5和维生素B12)、维生素C、维生素K和不同形式的维生素E(像α、β、γ和Δ生育酚或它们的混合物)以及它们的衍生物。
其他羟基酸的示例包括但不限于乙醇酸、乳酸、苹果酸、水杨酸、柠檬酸和酒石酸。
抗氧化剂的示例包括但不限于水溶性抗氧化剂，诸如巯基化合物及其衍生物(例如，焦亚硫酸钠和N-酰基-半胱氨酸)、硫辛酸和二氢硫辛酸、白藜芦醇、乳铁蛋白以及抗坏血酸和抗坏血酸衍生物(例如，抗坏血酸棕榈酸酯和抗坏血酸多肽)。适用于本发明的组合物中的油溶性抗氧化剂包括但不限于丁基化羟基甲苯、类视色素(例如，视黄醇和棕榈酸视黄酯)、生育酚类(例如，醋酸生育酚酯)、生育三烯酚类和泛醌。含有适用于本发明的组合物中的抗氧化剂的天然提取物包括但不限于：含有类黄酮和异黄酮类以及它们的衍生物(例如染料木黄酮和木质素异黄酮(diadzein))的提取物、含有白藜芦醇的提取物等等。此类天然提取物的示例包括葡萄籽、绿茶、松树皮和蜂胶。
化妆品组合物还可包含美容上可接受的局部用载体。该载体可占组合物的约25重量％至约99.99重量％(例如占组合物的约80重量％至约99重量％)。在本发明的优选实施方案中，美容上可接受的局部用载体包括水。
可将组合物制成多种产品类型，包括(但不限于)洗剂、霜剂、凝胶、棒状物、喷剂、膏剂、清洁液体洗剂和固体皂、洗发剂和护发剂、发胶、糊剂、泡沫、粉末、摩丝、剃须霜、擦拭物、贴片、水凝胶、成膜产品、面膜和皮肤面膜、膜和化妆品，如粉底和睫毛膏。这些产品类型可含有多种美容上可接受的局部用载体，包括但不限于溶液、悬浮液、乳液(诸如微乳液和纳米乳液)、凝胶、固体和脂质体。下面是此类载体的非限制性示例。其它载体可由本领域的普通技术人员进行配制。
可用于本发明的组合物可被配制为溶液。溶液通常包含水性溶剂或有机溶剂(例如，约50％至约99.99％或约90％至约99％的美容上可接受的水性溶剂或有机溶剂)。合适的有机溶剂的示例包括：丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、甘油、1，2，4-丁三醇、山梨醇酯、1，2，6-己三醇、乙醇以及它们的混合物。
可用于本主题发明的组合物可配制为包含润肤剂的溶液。此类组合物优选含有约2％至约50％的润肤剂。如本文所用，“润肤剂”是指用于诸如通过预防水经表皮从皮肤流失来预防或缓解干燥的物质。润肤剂的示例包括但不限于在Pepe、Wenninger和McEwen编辑的International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook，第2930-2936页(美国化妆品及香料协会，Washington，D.C.，第9版，2002)(在下文中，“ICI手册”)中所述的那些。特别合适的润肤剂的示例包括植物油、矿物油、脂肪酸酯等。
可由此类溶液制备洗剂。洗剂通常含有约1％至约20％(例如，约5％至约10％)的润肤剂和约25％至约90％(例如，约60％至约80％)的水。
可由溶液配制的另一类产品为霜膏。霜膏通常包含约5％至约50％(例如，约10％至约20％)的润肤剂和约25％至约85％(例如，约50％至约75％)的水。
本发明的组合物可包含水，或者另选地为无水的或为不包含水而是包含有机溶剂和/或有机硅溶剂、油、脂质和蜡的膏剂。膏剂可含有动物油或植物油或半固体烃类的简单底料。油膏剂可含有约2％至约10％的润肤剂和约0.1％至约2％的增稠剂。增稠剂的示例包括但不限于ICI手册第2979-2984页中所述的那些。
组合物可被配制为乳液。如果局部用载体是乳液，则约1％至约10％(例如约2％至约5％)的该局部用载体含有乳化剂。乳化剂可为非离子的、阴离子的或阳离子的。乳化剂的示例包括但不限于ICI手册第2962-2971页中所述的那些。
洗剂和霜膏可被配制为乳液。通常此类洗剂含有0.5％至约5％的一种或多种乳化剂。此类霜膏通常含有约1％至约20％(例如，约5％至约10％)的润肤剂；约20％至约80％(例如30％至约70％)的水；以及约1％至约10％(例如，约2％至约5％)的乳化剂。
水包油型和油包水型的单乳液皮肤护理制剂诸如洗剂和霜膏是美容领域中熟知的并且可用于本主题发明。多相乳液组合物，诸如水包油包水型或油包水包油型，也可用于本主题发明。一般来讲，此类单乳液或多相乳液含有水、润肤剂和乳化剂作为主要成分。
该组合物也可配制为凝胶(例如，使用合适的胶凝剂的水性凝胶、醇类凝胶、醇/水凝胶或油性凝胶)。用于水性凝胶和/或醇凝胶的合适胶凝剂包括但不限于天然树胶、丙烯酸和丙烯酸酯聚合物和共聚物以及纤维素衍生物(例如羟甲基纤维素和羟丙基纤维素)。适用于油(诸如矿物油)的胶凝剂包括但不限于氢化丁烯/乙烯/苯乙烯共聚物和氢化乙烯/丙烯/苯乙烯共聚物。此类凝胶通常含有约0.1重量％至5重量％的此类胶凝剂。
该组合物也可被配制成固体制剂(例如，蜡基棒、条皂组合物、粉末或含有粉末的擦拭物)。
除了上述组分外，该组合物还可含有多种其它油溶性物质和/或水溶性物质，这些物质通常用于组合物中，按本领域既定的水平用于皮肤和毛发上。
该组合物中还可存在多种其它物质，如本领域已知的。这些包括湿润剂、pH调节剂、螯合剂(如，EDTA)、芳香剂、染料和防腐剂(如，对羟基苯甲酸脂)。
包含此类组合物的组合物和产品可使用本领域熟知的方法来制备。
在一个实施方案中，该组合物具有低pH。例如，pH可以小于约4或小于约3.3。然而，组合物不需要具有低pH。
局部用组合物可包含缓冲剂，诸如乳酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、葡糖酸、或葡糖酸内酯。优选地，缓冲剂为乳酸。
通常，该组合物包含约3重量％至约12重量％，或约4重量％至约8重量％的缓冲剂。
筛选用于治疗快速老化皮肤的活性剂的方法
本发明提供了筛选用于治疗快速老化皮肤的活性剂的方法，如下所述。
可如上所述选择和收集受试者和皮肤。
待筛选的活性剂包括上述活性剂。例如，待筛选的活性剂可以为抗老化活性剂。
该方法包括：(a)将该活性剂施用于皮肤样品；(b)测量所述皮肤样品中选自细胞增殖速率、NFKB1基因表达、CDKN1A基因表达、CDKN2A基因表达、CEBPB基因表达以及它们的组合的特性；(c)将所述特性与对照进行比较；以及(d)选择与该对照相比提供以下中的至少一种的所述活性剂：减少皮肤成纤维细胞群倍增时间、下调NFKB1基因表达、下调CDKN1A基因表达、下调CDKN2A基因表达和下调CEBPB基因表达。
该方法可包括：(a)将所述活性剂施用于来自年龄为40岁或更小的受试者的皮肤样品；(b)测量该皮肤样品中的细胞增殖速率和选自NFKB1、CDKN1A、CDKN2A、CEBPB以及它们的组合的基因的表达；(c)将所述测量结果与对照进行比较；以及(d)选择与该对照相比提供以下中的至少一种的所述活性剂：减少皮肤成纤维细胞群倍增时间、下调NFKB1基因表达、下调CDKN1A基因表达、下调CDKN2A基因表达和下调CEBPB基因表达。
可如本文所述分析样品的细胞增殖速率。例如，下文实施例1中所述的增殖测定可用于测量细胞增殖速率。
可使用本领域熟知的转录组分析方法来分析样品的基因表达。例如，可使用下文实施例2中所述的转录组分析方法。
实施例1
在以下研究中测试来自年轻供体和年老供体的皮肤细胞的增殖速率。将结果与皮肤科医生对供体的专家临床分级进行比较。
志愿者被分成两组：
组1：年龄范围20-33岁的“年轻供体”(n＝9)，和
组2：年龄范围61-68岁的“老年供体”(n＝9)。
细胞增殖速率分析如下。从在前臂掌侧上采集的两个3mm-穿孔活检组织的生长物中分离出皮肤成纤维细胞，并在37℃下在具有5％CO2的90％加湿培养箱中在补充有10％胎牛血清、1％两性霉素、0.04％庆大霉素和1％Glutamax的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养。将细胞扩增并每周传代。
使用以下增殖测定评估来自两组的成纤维细胞的增殖速率。
增殖测定
将细胞以4.10^4个细胞/孔铺板于24孔板中，并在37℃下在具有5％CO2的90％加湿培养箱中在补充有10％胎牛血清、1％两性霉素、0.04％庆大霉素和1％Glutamax的经Dulbecco改良的Eagle培养基中培养4天或10天。在第4天或第10天，分离细胞并用CoulterZ1ST(Beckman Coulter France)细胞计数器计数。
图1示出了年轻供体和年老供体的增殖速率。其是时间(天)对供体在第0天、第4天和第10天的平均细胞计数(×10,000)的点图。数据表明，令人惊讶的是尽管一些年轻供体表现出与其年龄一致的高增殖能力，但其他供体示出与在年老供体中观察到的类似的低增殖能力。
具体地，表1示出了在第4天年轻供体和年老供体中高增殖者和低增殖者中的每一者的平均群体倍增时间(“PD时间”，以天为单位)。细胞增殖在第10天达到稳定水平。(因为细胞应当处于增殖/指数期以计算群体倍增时间，所以从第10天起的增殖数据不包括在计算中。)
表l中：
PD＝[ln(收集的细胞数)-ln(接种的细胞数)]/ln(2)
PD时间＝[接种和收集之间的天数]/PD。
年轻供体、高增殖者具有2.76天的平均PD时间。年老供体具有4.43天的平均PD时间，年轻供体、低增殖者出乎意料地具有5.44天的平均PD时间，其与年老供体的PD时间没有统计学上的显著差异。表2示出了统计学分析的结果。使用双侧学生t检验进行统计学分析。
表1
表2
***在统计学上显著
NS在统计学上不显著
由皮肤科医生对相同的供体进行17种皮肤老化迹象的专业评级。在年轻供体和年老供体之间，17种迹象中的13种在统计学上显著不同(也使用双侧学生t检验)。然而，在年轻供体(高增殖者)和年轻供体(低增殖者)之间，17种迹象中只有3种显著不同：干燥、前额皱纹数目和前额皱纹深度。
令人惊讶的是，某些年轻供体(其皮肤看起来年轻，几乎没有临床老化迹象)具有一定程度的与来自年老供体的皮肤一致的低增殖皮肤细胞。这指示在年轻皮肤中存在亚临床老化，并且表明此类年轻皮肤相对于实足年龄而言正在快速老化。
实施例2
使用以下转录组分析对来自实施例1的年轻供体的成纤维细胞进行转录组分析。
转录组分析
将来自年轻供体组的细胞在80％-90％汇合时收获、沉淀并冷冻。使用RNeasyPlus Mini Kit(Qiagen，France)用Qiacube根据制造商的说明提取总RNA。对总RNA进行转录组微阵列谱分析。
对于转录组阵列数据，使用在limma R软件包中实现的RMA框架进行背景校正，然后进行分位数归一化(QN)。此程序旨在归一化阵列之间的中值表达。在归一化之前和之后使用大量数据可视化进行质量检查以正确评估QN和过滤的影响。使用limma进行差异分析，以鉴定在高增殖者(即缓慢老化者)和低增殖者(即快速老化者)之间差异表达的基因。然后使用fgsea R软件包进行基因集富集分析(GSEA)，以使用分子特征数据库(https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb)提示的基因集鉴定在上调或下调的基因中过表达的基因集。
结果在图2中示出，其是汇总了对高增殖成纤维细胞和低增殖成纤维细胞之间的基因表达进行差异分析的结果的火山图。蓝色点描绘了在低增殖成纤维细胞中上调的基因，然而橙色点描绘了在高增殖成纤维细胞中上调的基因(FDR q＜0.1和绝对log2 FC>log2(1.2))。以黑色突出的点对应于属于来自Reactome数据库的衰老途径的基因。
与NFKB1、CDKN1A、CDKN2A和CEBPB相关的基因在年轻供体低增殖者的成纤维细胞中被上调。已知这些标记与细胞衰老相关联。
这些结果证实了年轻供体的亚群的存在令人惊讶地表现出与在年老供体中观察到的那些增值能力相似的增殖能力。低增殖的年轻成纤维细胞显示出早期衰老的特征。衰老产生促炎微环境，已知其不仅促成皮肤老化迹象如伤口愈合缺陷、皱纹或松垂的出现，而且促成年龄相关疾病诸如癌症的发展。
该数据示出，年轻人群出乎意料地包括缓慢皮肤老化者和快速皮肤老化者两种。

Claims (11)

1.一种诊断年轻受试者的快速老化皮肤的方法，所述方法包括测量年龄为40岁或更小的受试者的皮肤样品中的细胞增殖速率和选自NFKB1、CDKN1A、CDKN2A、CEBPB以及它们的组合的基因的表达。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括将所述细胞增殖速率或基因表达与对照进行比较。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞增殖速率的对照是至少4天的皮肤成纤维细胞群倍增时间。
4.根据权利要求2所述的方法，其中基因表达的所述对照是比来自年龄在约+/-5岁内的供体的成纤维细胞群体中所述基因的平均表达高至少约20％的表达。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者年龄为20岁至35岁。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述皮肤样品通过非侵入式方法获得，所述非侵入式方法选自胶带剥离、测量体内色氨酸荧光、显微镜/光谱法、微针贴片和基于粘合剂贴片的皮肤活检装置。
7.一种评价对快速老化皮肤的治疗功效的方法，所述方法依次包括：(a)将所述治疗施用于年龄为40岁或更小的受试者的皮肤；以及(b)测量所述受试者的皮肤样品中的细胞增殖速率和选自NFKB1、CDKN1A、CDKN2A、CEBPB以及它们的组合的基因的表达。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包括将所述测量结果与对照进行比较。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述治疗是局部施用化妆品组合物。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述受试者年龄为20岁至35岁。
11.一种筛选用于治疗快速老化皮肤的活性剂的方法，所述方法包括：
(a)将所述活性剂施用于来自年龄为40岁或更小的受试者的皮肤样品；
(b)测量所述皮肤样品中的细胞增殖速率和选自NFKB1、CDKN1A、CDKN2A、CEBPB以及它们的组合的基因的表达；(c)将所述测量结果与对照进行比较；以及(d)选择与所述对照相比提供以下中的至少一种的所述活性剂：减少皮肤成纤维细胞群倍增时间、下调NFKB1基因表达、下调CDKN1A基因表达、下调CDKN2A基因表达和下调CEBPB基因表达。
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