CN101990578A - 存储稳定状态的核酸的新的皮肤取样试剂盒、通过使用该试剂盒的基因测试方法及其实践应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于基因测试的新的皮肤基因卡、使用该基因卡获得DNA和RNA及进行各种基因测试的方法及其实践应用。更具体地，本发明人已开发能够简单、安全和迅速地从人皮肤、毛发或粘膜获得样品并能够在室温下长期稳定存储和运送所得样品中包括的DNA和RNA的皮肤基因卡。使用所得DNA和RNA可以进行各种基因测试，该基因测试包括聚合酶链式反应(PCR)、逆转录(RT)-PCR、实时PCR、测序、杂交、DNA芯片分析、单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变分析、启动子甲基化分析、基因表达分析等。该基因皮肤测试结果可用于疾病预后、营养基因组测试、药物基因组测试、法医检验如身份鉴定、基因疾病诊断、皮肤病诊断等。此外，通过客观评价皮肤或毛发状态，可以为美容护理、美容学、皮肤病学和临床实践中的实践应用确立个性化的化妆品和皮肤护理系统。

Description

存储稳定状态的核酸的新的皮肤取样试剂盒、通过使用该试剂盒的基因测试方法及其实践应用

技术领域

本发明涉及用于基因测试的新的皮肤基因卡、使用该基因卡获得DNA和RNA及进行各种基因测试的方法及其实践应用。更具体地，本发明的发明人已开发能够简单、安全和迅速地从人皮肤、毛发或粘膜获得样品并能够在室温下长期稳定存储和运送所得样品中包括的DNA和RNA的皮肤基因卡。使用所得DNA和RNA进行各种基因测试，该基因测试包括聚合酶链式反应(PCR)、逆转录(RT)-PCR、实时PCR、测序、杂交、DNA芯片分析、单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变分析、启动子甲基化分析、基因表达分析等。该基因皮肤测试结果可用于疾病预后、营养基因组测试(nutrigenomic test)、药物基因组测试、法医检验，例如身份鉴定、基因疾病诊断、皮肤病诊断等。另外，通过客观评价皮肤或毛发状态，可以为美容护理、美容学、皮肤病学和临床实践中的实践应用确立个性化的化妆品和皮肤护理系统。

背景技术

包括人在内的多细胞有机体由众多细胞组成。细胞核具有存储遗传信息的DNA。储藏遗传信息的基本单位称为基因。基因是DNA的一部分。蛋白质介导所有生物现象和细胞功能。基因是引导和传递用于合成蛋白质的一系列命令的巨大信息单位。每个基因均具有合成一种或多种特异蛋白所需的特异遗传密码。

DNA具有双螺旋结构。每条螺旋链均由众多称为碱基的化学结构单位组成。有四种类型的DNA碱基：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)。这些碱基的序列或碱基序列决定遗传信息。为了将DNA遗传信息物质化为细胞质中的蛋白质生产，需要中间介体(intermediate mediator)，该介体称为RNA。DNA的遗传信息首先被复制到mRNA中。这个过程称为转录。然后，在细胞质中，在tRNA和rRNA(翻译)的帮助下，核糖体对mRNA的遗传信息解码成为蛋白质。三个碱基指定单个氨基酸。三核苷酸单位称为密码子。核糖体生产的蛋白质通过翻译后修饰制备成活化蛋白。当细胞分裂时，DNA复制并完全相同地转移到子细胞中。个体所有细胞中具有相同的DNA。所有细胞的类型、结构和功能，及个体的身体状态和疾病发展可通过在细胞中被表达的蛋白质的类别和量确定，该类别和量又可根据哪个RNA被转录到何种程度进行确定。也就是说，在每个细胞中被表达的基因类别和量的差异起到重要作用。实际上，在个体细胞中被表达的基因百分比仅为3-5％(Aressns J，Armstrong M，Gilissen R，Cohen N.The human genome：an introduction.Oncologist.2001；6：100-109)。

有机体具有的全组基因称为基因组。相比，在个体中被表达的所有基因(即，mRNA)的组称为转录组，以及表达的蛋白质的全部补体(complement)称为蛋白质组。人基因组占据总数超过30亿的碱基对，并据报道含有约30,000个基因。对于最近完成的人类基因组计划，其主要目标是确定全人类基因组的碱基序列，在使用基因诊断和处理疑难病症中取得显著发展，并打开了所谓个性化药物和预测药物的新纪元。

生物现象通过(1)基因组DNA的遗传信息、(2)基因的转录和(3)表达的蛋白质确定。最近，研究人员积极进行研究，从而自动分析所有这些信息。对于这个目的，微阵列或生物芯片是非常有用的。例如，使用如cDNA微阵列技术，试图研究生理学、病理学和皮肤功能。而且，聚合酶链式反应(PCR)或其他技术可用于诊断皮肤感染和检测病原体。尽管预期更好地理解皮肤病的诊断可通过经由基因测试准确评价皮肤状况实现，但实际应用或确切的结果却很少。基因皮肤测试似乎可应用到个性化皮肤处理、美容护理和化妆品中，但相关报道却很少(Fuller BR等人.Gene array technology and the search for cosmeceutical actives.在：Cosmoceuticals.Edited by Draelos ZD.Elsevier Saunders，2005)。为了将基因皮肤测试投入实际应用，需要解决许多问题。特别地，大量研究是关于怎样以非侵害的方式适当地获得皮肤样品，怎样分析基因，怎样诊断皮肤病和基于结果评价皮肤状况，以及怎样将其实际应用于个性化皮肤护理中。本发明的目的在于解决这些问题。

使用DNA或RNA样品进行基因研究的其中一个最大问题是室温下核酸被迅速降解。尤其，RNA可在几个小时内被核糖核酸酶(RNase A)降解，核糖核酸酶是在分离过程由细胞分泌的且其在环境中是丰富的。本发明的发明人已开发使用壳聚糖在室温下长时间以卡或液体形式稳定存储RNA和DNA的方法，并已获得专利或已申请相关专利。RNA和DNA卡、PCR和逆转录(RT)-PCT试剂盒，和基于此的微阵列芯片用于存储、运送(carry)和分析多DNA和RNA样品。在本发明中，RNA卡用于开发皮肤基因测试的试剂盒。

皮肤是身体最大的器官，平均面积为1.6m²并占成年人身体体重的约16％。它的结构、功能和生理机能都非常复杂。最近，随着分子遗传学和蛋白组学的发展，已发现关于皮肤结构、功能、生理机能、老化和疾病发展机制的新事实。

皮肤保护身体免受外部刺激或危险的损害，并，例如通过体温调节使身体习惯于环境变化。它的其他功能是感觉、分泌、排泄和内分泌荷尔蒙如维生素D和细胞因子等、免疫和再生。进一步地，它在美容护理中发挥着关键作用。

皮肤由外至内由三个主要层组成，表皮、真皮和皮下脂肪层(皮下组织)。皮肤附件包括毛发、皮脂腺、汗腺(分泌腺)、毛细血管等。

表皮是三个皮肤层中最薄的，但对皮肤保湿和皮肤保护发挥着重要作用。进一步地，它可以阻止水分流失和组织损伤以及病原体的侵害。组成表皮的细胞的主要类型是角质形成细胞，其中也存在黑素细胞、朗氏细胞和默克尔(Merkel)细胞。角质形成细胞在分化时从基底层向上移动，从而形成最外面的角化层(角质层)。死的角质形成细胞在皮肤表面脱落。角质层是防御皮肤的第一屏障。黑素细胞具有在角质形成细胞中延伸(extend)的长树突。黑色素被运送到角质形成细胞并吸收或分散UV，从而保护皮肤免受损伤。

在功能方面，皮肤可以看作是提供保护以免受有害物质或外部刺激影响的屏障。它对理解这种皮肤屏障机制，及生理和病理学都非常重要。皮肤屏障功能中最重要的是表皮的角质层。角质层由角层细胞(corneocytes)和脂质结构组成。角质层由蛋白质(40％)、水(40％)和脂质(10-20％)组成。若将皮肤层比作砖墙，角层细胞类似于砖，而脂质结构起灰泥的作用。

皮肤保湿是健康皮肤的先决条件。它主要通过角质层实现。角质层通过(1)角层细胞产生的天然保湿因子(NMF)、(2)角层细胞之间的脂质层、(3)细胞桥粒和(4)皮脂腺分泌的皮脂保持皮肤湿润。表皮的脂质层主要由神经酰胺、胆固醇和游离脂肪酸组成。

真皮厚度是表皮的约15-40倍，并占据皮肤的最大体积。它由两层组成，乳头状真皮层(papillary dermis)和网状真皮层。真皮的结构性组分(Structural component)是细胞、结缔组织和细胞外基质。真皮中存在的细胞包括成纤维细胞、组织细胞、肥大细胞、朗氏细胞、淋巴细胞和浆细胞。除此之外，还存在皮肤附件，例如血管、淋巴管、神经、立毛肌(arrector pili)、分泌腺、顶泌汗腺、小汗腺管(eccrine duct)、毛皮脂单位(pilosebaceous unit)、指甲(nail)等。真皮向表皮提供营养物，支撑表皮，保护身体免受皮肤损伤，通过与表皮配合再生皮肤，存储水分，调节体温，并可用作感觉受体(receptor of sensation)。

真皮的结缔组织富含纤维，例如胶原纤维、弹性纤维、网状纤维等。主要组分是胶原和弹性蛋白。特别地，胶原是丰富的。皮肤中有五种胶原型，型1、3、4、7和8。其中，型1是最丰富的，占80-85％。胶原和弹性蛋白形成表皮下的纤维结缔组织，从而支撑表皮和提供弹性和柔性。存在分解胶原的酶，其中最重要的是基质金属蛋白酶1(MMP1，胶原酶1)。组织中还存在抑制MMP1的物质。它称为金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)。皮肤中胶原含量通过胶原合酶、MMP和TIMP维持恒定。然而，当因减少的胶原合成、过度的MMP1作用、减少的TIMP或类似情况造成平衡破坏时，皮肤将失去弹性并因胶原减少而形成皱纹。除了自然老化过程之外，诸如UV、炎症和超氧化物基团等不良因素可加速MMP1的生成，从而加速皮肤老化和恶化皱纹。

真皮基质由糖胺聚糖或粘多糖组成。主要组分是透明质酸(也称为透明质多糖(hyaluronan))和硫酸软骨素。也包括硫酸乙酰肝素。这些物质具有非常强的保湿能力。皮肤中存在数种类型的透明质酸合成酶(HAS)。其中，HAS3存在于表皮角层细胞中，而HAS2存在于真皮成纤维细胞中。最近，观测到水通道蛋白水通道蛋白3(water channel protein aquaporin 3)(AQP3)在皮肤中被表达。该蛋白质在调节皮肤补水中发挥着重要作用。

皮下组织也称为皮下脂肪层，其由脂肪组织组成。它向表皮和真皮提供营养物，决定体形，维持体温，并用作身体的绝热体。它位于真皮下面，由血管、淋巴管、神经和脂肪细胞组成，并用作抵抗外压的垫层(cushion)。

根据皮脂和水分的含量，人的皮肤通常分为4种类型：(1)：正常型、(2)油型、(3)干型和(4)混合型。最近，添加了作为第5种皮肤类型的敏感型，且老化程度与皮肤类型一起被评价。然而，皮肤类型可不断地变化，因为它受各种因素影响，这些因素包括年龄、性别、荷尔蒙状态、营养状态、生活模式、环境等。皮肤类型的分类对适当的皮肤护理和化妆品的选择非常重要。

皮肤护理和化妆品是关于皮肤的最重要的事项。化妆品的定义在不同国家有所不同。在韩国和日本，化妆品被定义为涂、喷洒或其他方式施用到皮肤或毛发上从而保持人体洁净、美丽或健康并对人体作用小的物质。相比之下，在美国，化妆品被定义为用于漂洗、美化或增强人体外观而不改变结果或功能的物质。在欧洲，牙齿或口腔粘膜也被包括。相对地，具有药学效果或结构上或功能上改变人体的物质则归类为药物。最近，生产了许多属于在二者之间的对人皮肤的结构或功能产生效果的化妆品。它们称为药用化妆品(cosmeceutical)(Sung-ku Ahn，Seung-Hun Lee.Skin aesthetics.Korea Medical Book Publisher.2002；Cosmeceuticals.Edited by Draelos ZD.Elsevier Saunders，2005)。

基本上，化妆品必须是稳定、安全、有效和舒适的。在此，有效指的是在物理化学、生理学和心理学方面的有效。例如，它是指补水、抗皱、抗老、皮肤增白、软化、染色或清洁(cleanse)效果。因为不同的人皮肤类型和状况有所不同，因此选择合适的化妆品是重要的。进一步地，确定在使用化妆品之前和之后准确和客观评价效果的标准是重要的(Sung-ku Ahn，Seung-Hun Lee.Skin aesthetics.Korea Medical Book Publisher.2002)。

用于评价人皮肤状况和化妆品或药用化妆品效果的方法包括：(1)形态测试(成像研究)，(2)皮肤颜色分析，(3)皮肤柔软度和弹性测试，(4)皮肤温度和血流测试，(5)经皮水分流失(TEWL)测试，(6)皮肤水化测试(skin hydration test)，(7)脂质含量评价，(8)UV阻断效果测试，(9)毛发保湿和损伤评价和(10)超声测试(Sung-ku Ahn，Seung-Hun Lee.Skin aesthetics.Korea Medical Book Publisher.2002；Grove GL等人.Evaluating cosmeceutical efficiency.在：Cosmeceuticals.Edited by Draelos ZD.Elsevier Saunders，2005)。

然而，这些测试中大部分聚焦皮肤结构、形状、生理学或病理学之一，并因缺少客观性和再现性而局限于实际应用。因此，需要一种能够准确和客观评价人皮肤状况的新测试方法，从而有助于分类皮肤类型，选择个性化化妆品或药用化妆品，并在其应用后评价效果。这也是本发明所致力于的。

当今，美化和清洁人体和保持皮肤或毛发健康的化妆品的传统概念，随着积极改变和改进皮肤的功能化妆品的到来而改变。也就是说，可用作化妆品和药物的药用化妆品变成主流。化妆品工业是综合性工业，包括化学、生物、药物学和皮肤病学的基础应用技术。当前，因为在其中引入了分子遗传学，试图更准确地理解皮肤生理活性和分子病理学，并开发个性化皮肤护理、化妆品和药用化妆品。

皮肤患上的多种疾病具有多种症状和征象。皮肤病包括遗传病、精神皮肤病(psychocutaneous disorder)、光敏性皮肤病、物理因素诱导的皮肤病、职业性皮肤病、荨麻疹、红斑、药疹、湿疹、牛皮癣、免疫病症、感染病、性传播疾病、色素病症(pigmentary disorder)、血管病、结缔组织病症、皮下组织病症、皮脂腺和汗腺疾病、毛发病、指甲病、良性和恶性肿瘤、癌前病变和粘膜病。由诸如内分泌病或新陈代谢紊乱等全身疾病引起的皮肤病是罕见的。感染可通过细菌、肺结核菌、真菌、病毒、寄生虫等引起。性传播感染也可引起皮肤病。

皮肤中发生的病症包括痒(搔痒症)、灼热(scorching)、灼痛(burning)、疼痛(pain)、感觉减退(hypoesthesia)、麻木等。皮肤病相关的征象包括初始原发性损害和由原发性损害发展的继发性损害。原发性损害包括斑点(macule)、斑片(patch)、丘疹(papule)、斑块(plaque)、节瘤(nodule)、肿瘤(tumor)、风疹块(wheal)、小泡(vesicle)等，而继发性损害包含鳞屑(scale)、结皮(crust)、表皮脱落(excoriation)、糜烂(erosion)、溃疡(ulcer)、疤痕(scar)、开裂(fissure)和苔藓样硬化(lichenification)。

皮肤的诊断似乎容易，因为可直接看到。然而，不同皮肤病可展现出相似病症和征象，且对于相同的患者，和对于相同的疾病，根据阶段可观测到不同外观。因此，仅用经面谈病症的主观检查或征象的体格检查很难诊断。甚至皮肤科医生都会发现很难诊断一些疾病。诊断皮肤病的测试包括用于检测细菌感染的革兰氏染色和培养(Gram staining and culturing)、用于检测真菌感染的KOH染色和培养、用于检测单纯性疱疹和带状疱疹(herpes zoster)的Tzanck测试、用于检测疥疮的刮伤疥疮(scabies scraping)、用于检测梅毒的暗场检验(dark-field examination)、斑贴测试(patch test)、通过注射刺激皮肤、刺(pricking)或刮伤(scratching)并监测反应、皮肤划痕现象测试、玻片压诊(diascopic examination)、伍氏灯检查(Wood′s lamp examination)等。除非通过上面测试作出诊断，否则皮肤活组织检查是必要的，在该皮肤活组织检查中，皮肤组织在通过免疫组织化学染色或免疫荧光测试染色之后在光学显微镜下进行观测，或使用电子显微镜进行观测(Sung-ku Ahn，Seung-Hun Lee.Skin aesthetics.Korea Medical Book Publisher.2002；Korean Dermatological Association Textbook Publishing Committee.Dermatology.第4版.Ryo Moon Gak.2001)。

然而，所有前述测试仅在显微镜下监测皮肤损害的结构变化，而未能监测生理、功能、生物化学，及其分子和遗传性改变。因此，它们在准确性和效果上都有局限性。因此，迫切需要能够鉴定皮肤病的根本原因和发展及确定最佳的个性化治疗的新测试方法。

可通过在皮肤中被表达的基因、从而产生的蛋白质、碳水化合物、脂质等的组合物的变化，和组成皮肤的细胞的状态，确定皮肤状况和类型。不仅继承的遗传因素，还有后天的因素，例如环境因素、饮食和生活模式都可影响它们。因而，调查继承的遗传因素和检查皮肤中被表达的基因将提供对皮肤状况最准确和根本的认识。这也是本发明目的所致力于的。

发明内容

[技术问题]

目前，在皮肤病诊所、化妆品和整容整形诊所、美容护理店，和全世界化妆品公司中，都进行经面谈的医学检查、体格检查、理化检查，和使用各种仪器的形态检查，以评价皮肤状况和诊断皮肤病。然而，已有的测试方法在从根本上和客观上评价所有个体皮肤方面是有限的。进一步地，迄今为止，还没有科学上标准的测试方法。现在可获得的最客观的测试方法是在活组织检查之后监测皮肤微结构的变化。然而，该方法是非侵害的，不能监测生理、功能或生物化学变化。因此，需要能够准确和客观评价人皮肤状况，从而有助于皮肤类型分类，选择个性化化妆品或药用化妆品，和评价应用后的效果的新方法。本发明目的在于提供此种方法。

在这个方面，最有前途的方法是基因测试。通过皮肤中表达的基因，从而产生的蛋白质、碳水化合物、脂质等的组合物的变化，和组成皮肤的细胞的状态可确定皮肤状况及类型和皮肤病的发病。不仅继承的遗传因素，还有后天的因素，例如环境因素、饮食和生活模式都可影响它们。因而，调查继承的遗传因素和检查皮肤中表达的基因将提供对皮肤状况最准确和根本的认识。然而，为了实际应用皮肤基因，许多问题仍待解决。首先，安全获得适于测试和运送的皮肤样品的方法未确立。其次，从所得皮肤样品中获得特异基因和进行包括形态、突变和表达的各种基因测试的方法未确立。第三，将测试结果应用于实际临床诊断或化妆品目的的方法和标准未确立。如果可以安全和简单地获得，皮肤可能是用于各种基因测试的最佳样品。

[技术方案]

如上所述，人皮肤由数层组成。在真皮和表皮中，甚至在相同表皮中，不同的细胞，即，角质形成细胞、黑素细胞、朗氏细胞等表达不同基因。因此，确保稳定并具有统一厚度的皮肤取样的标准化和规范化是先决条件。除此之外，对于不仅适用于临床目的，而且适用于化妆品或其他目的的皮肤取样方法，该方法必须安全、非侵害且简单。如果可以，优选公众可以使用的“(自制(DIY))”方法。为了克服现有基因皮肤测试方法的不足，需要能够进行安全和稳定的皮肤取样的方法。除此之外，要保证从皮肤样品中获得优质和适量的DNA和RNA。

进一步地，利用皮肤基因卡获得包括在样品中的DNA和RNA，进行复杂和各种基因测试应当是可能的。此种测试的实施例如下：用于扩增特异基因的一些或所有DNA的聚合酶链式反应(PCR)，用于扩增特异表达的基因的一些或所有DNA的逆转录(RT)-PCR，用于量化基因表达水平的实时RT-PCR，使用质粒载体和E.coli克隆通过PCR和RT-PCR获得的基因，PCR之后的限制性片段长度多态性(RFLP)分析，经由自动测序分析或寡聚核苷酸微阵列(寡DNA芯片)和随后单核苷酸多态性和突变的分析的特异基因的碱基测序，经由cDNA微阵列的基因表达差异的同步分析，和经由甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸氢盐基因组测序的启动子甲基化作用的分析。

第三，所确立的基因测试方法应当适用于现行的临床实践、美容护理和其他领域。例如，需要通过准确评价皮肤保护身体、保湿、再生等功能更准确地和客观地分类皮肤类型，以便该结果可用于选择个性化皮肤护理、化妆品和药用化妆品。特别地，该测试方法应当对确定干燥、老化、光老化或敏感皮肤和治疗它们有帮助。除此之外，它应当可以准确诊断包括炎症、湿疹、免疫相关疾病、感染、牛皮癣等的疑难皮肤病，和应当可以选择适当的治疗。进一步地，该测试方法应当可应用于各种基因测试中，这些基因测试包括诊断遗传性基因疾病、身份鉴定和亲子认定、在器官移植之前的基因分型等等。

本发明旨在提供这些问题的解决方法。

[有益效果]

根据本发明的皮肤基因卡试剂盒能够从来自人体皮肤、毛发、粘膜等的各种样品中非侵害地和简单地取样，并能够在使得样品中包括的DNA和RNA甚至在室温下长时期安全的情况下存储和运送该样品。DNA和RNA可容易地和稳定地从样品中获得，且它们可应用于各种基因测试，这些基因测试包括聚合酶链式反应(PCR)、逆转录(RT)-PCR、实时PCR、PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)、Northern杂交、克隆、碱基测序、寡聚核苷酸微阵列分析、甲基化特异性PCR(MSP)、亚硫酸氢盐基因组测序等。因而，它可应用于单核苷酸多态性(SNP)分析、突变分析、基因表达分析等。可利用通过本发明确立的皮肤基因卡试剂盒和基因测试方法，通过检查在皮肤功能、生理和病理方面发挥关键作用的30个基因的表达更准确地评价皮肤状况，和更准确地和客观地分类皮肤类型。进一步地，该结果在选择个性化皮肤护理、化妆品和药用化妆品中有帮助。特别地，在美容护理和化妆品领域中，它将有助于诊断干燥、老化或敏感皮肤及护理和治疗它们。使用通过本发明确立的皮肤基因卡试剂盒和基因测试方法，可更准确地诊断包括肿瘤、炎症、湿疹、免疫相关性疾病、感染等多种皮肤病，和可为个体皮肤病选择个性化治疗。另外，本发明皮肤基因卡和基因测试方法可用于各种基因测试，这些基因测试包括简单和安全地诊断遗传性基因疾病、身份鉴定和亲子认定、在器官移植之前的基因分型等。

附图说明

以下结合附图进行详细说明，所披露示例性实施方式的上述和其他方面、特征和优势将由此更加明显，其中：

图1示出本发明的流程图；

图2示出通过将纸质绷带(3M)附着在RNA卡(Goodgene公司)上制备的皮肤基因卡，其作为本发明的一种实施方式。

图3示出关于是否可从皮肤基因卡中获得DNA的测试结果(泳道1：阴性对照，泳道2：存储一天后从皮肤基因卡中获得的样品，泳道3：存储3天后从皮肤基因卡中获得的样品，泳道4：存储7天后从皮肤基因卡中获得的样品)；

图4示出聚合酶链式反应(PCR)分析结果，该分析结果是关于在室温下长期存储后DNA是否没有降解地保持在利用皮肤基因卡获得的皮肤细胞中，并且是关于它是否可以被扩增和分析(泳道1：存储5天后从皮肤基因卡中获得的样品，泳道2：存储15天后从皮肤基因卡中获得的样品，泳道3：存储30天后从皮肤基因卡中获得的样品)；

图5示出利用EasySpin试剂盒(Intron)，从利用皮肤基因卡获得的皮肤样品中分离RNA的结果(泳道1：1Kbp大小的标记物，泳道2：1μg样品，泳道3：0.5μg样品)。

图6示出对β-肌动蛋白基因进行的逆转录(RT)-PCR的结果，该逆转录是通过使用利用试剂盒取样1天、1周和1月之后获得的RNA进行的，以便调查在室温下长期存储之后RNA是否没有降解地保持在利用皮肤基因卡获得的皮肤细胞中(泳道1：100bp DNA标记物，泳道2：阴性对照，泳道3：存储1天的样品，泳道4：存储1周的样品，泳道5：存储1月的样品)；

图7示出关于在采集带有根部的毛发样品之后，是否可从皮肤基因卡中分离出DNA的测试结果(泳道1：40Kbp T7DNA，泳道2：存储1天的样品，泳道3：存储1月的样品，泳道4：存储1年的样品)；

图8示出关于在采集带有根部的毛发样品之后，是否可从皮肤基因卡中分离出RNA的测试结果(泳道1：RNA标记物，泳道2：存储1天的样品，泳道3：存储1月的样品，泳道4：存储1年的样品)；

图9示出关于特异基因的PCR是否可以在没有从皮肤基因卡分离DNA的情况下进行的测试结果(泳道M：100bp标记物，泳道1：阴性对照，泳道2：阳性对照(HaCaT细胞系)，泳道3：来自正常成年人的皮肤样品)；

图10示出关于特异基因的RT-PCR是否可以在没有从皮肤基因卡分离RNA的情况下进行的测试结果(泳道M：100bp标记物，泳道1：阳性对照(HaCaT细胞系)，泳道2：来自正常成年人的皮肤样品)；

图11示出关于是否可以使用从皮肤基因卡分离的RNA进行实时PCR的测试结果(泳道2：在300ng的β-肌动蛋白，泳道3：在2000ng的β-肌动蛋白，泳道4：在30,000ng的β-肌动蛋白，泳道M：100bp DNA标记物，泳道5：MMP1基因的样品，泳道6：COL1A1基因的样品，泳道7：弹性蛋白基因的样品，泳道8：弹性蛋白酶基因的样品，泳道9：TIMP基因的样品，泳道10：抑弹性酶蛋白(elafin)基因的样品)；

图12示出用于克隆从皮肤基因卡获得的基因的基因扩增结果(泳道1：100bp DNA标记物，泳道2：MMP1基因产物)；

图13示出用于克隆通过PCR扩增的基因的载体图谱；

图14示出在将MMP1基因克隆进pGEM-T Easy载体的测序结果；

图15示出利用皮肤基因卡提取皮肤基因组DNA，和进行PCR以对心血管病相关基因的单核苷酸多态性(SNP)进行分析，及随后将产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳的结果(泳道1和13：100bpDNA大小标记物，泳道2和3：eNOS基因，泳道4和5：MTHFR基因，泳道6和7：AGT基因，泳道8：ACE基因，泳道9和10：AT1R基因，泳道11和12：ApoE基因)；

图16示出利用皮肤基因卡提取皮肤基因组DNA，和进行PCR以对心血管病相关基因进行SNP分析，及随后在用表3中给出的限制酶处理之后将产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳的结果(泳道1、12和13：100bp DNA大小标记物，泳道2和3：eNOS基因，泳道4和5：AGT基因，泳道6和7：ACE基因，泳道8：AT1R基因，泳道9和10：ApoE基因，泳道11和14：MTHFR基因)；

图17示出利用皮肤基因卡提取皮肤基因组DNA，和对在癌发生中发挥重要作用的p53肿瘤抑制基因进行PCR，及随后将产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳的结果(泳道1：100bp DNA大小标记物，泳道2：阴性对照，泳道3：阳性对照，泳道4和6：测试样品)；

图18示出将图17的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳、分离和纯化该产物和使用ABI 3130测序仪分析碱基序列以鉴定p53肿瘤抑制基因的突变(175C→A)的结果；

图19示出在利用皮肤基因卡获得鳞状细胞癌皮肤样品和存储之后，经由寡聚核苷酸微阵列对RNA样品的基因分型结果(使用CanScan DNA芯片(Goodgene)鉴定鳞状细胞癌患者的p53基因(外显子7、密码子282CGG→TGG)的突变)；

图20示出用于使用从皮肤基因卡获得的RNA鉴定特异基因表达的northern印迹测试结果(泳道M：RNA标记物，泳道1：来自正常成年人的样品1，泳道2：来自正常成年人的样品2，泳道3：来自正常成年人的样品3，泳道4：来自正常成年人的样品4)；

图21示意性示出仅位于DNA的CpG二核苷酸的5’-位上的胞嘧啶残基上的甲基化；

图22示出特异基因上的甲基化发生的测试结果，其中该特异基因来自从皮肤基因卡获得的DNA(泳道1：100bp DNA标记物，泳道2：阴性对照，泳道3：从皮肤基因卡获得的样品)；

图23示出化学修饰步骤，该步骤是用于使用从皮肤基因卡获得的DNA样品证实C碱基在基因的特定部分甲基化(当用亚硫酸氢钠处理DNA样品时，碱基序列中CpG岛的未甲基化的胞嘧啶碱基被尿嘧啶(胸腺嘧啶)取代)；

图24示出使用图23中的亚硫酸氢钠处理的DNA样品对MYOD基因进行PCR，和随后将产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳的结果(泳道1：100bp DNA大小标记物，泳道2：MYOD基因PCR产物)；

图25示出图24中的MYOD PCR产物的碱基测序结果，该测序通过使用ABI 3130测序仪进行，用以鉴定DNA是否被图23中的亚硫酸氢钠处理准确甲基化(如箭头所示，CpG岛的未甲基化的胞嘧啶碱基被尿嘧啶(胸腺嘧啶)取代)；

图26示出使用AmpFl STR Profiler Plus PCR扩增试剂盒(Applied Biosystem)进行9个短串联重复(STR)基因座(D3S1358、D5S818、D7S820、D8S 1179、D13S317、D18S51、D21S11、FGA和vWA)的多重PCR，并随后通过在1.5％琼脂糖凝胶上电泳的结果，用以利用皮肤基因卡提取的皮肤基因组DNA进行身份鉴定(亲子鉴定)(泳道1：500bp DNA大小标记物，泳道2和4：卡样品，泳道5：阴性对照，泳道6：100bp DNA大小标记物)

图27示出进行两个VNTR基因座(D1S80、D17S30)的PCR和随后在1.5％琼脂糖凝胶上电泳的结果，用以利用皮肤基因卡提取的皮肤基因组DNA进行身份鉴定(亲子鉴定)(泳道1-5：D1S80，泳道1：100bp DNA大小标记物，泳道2和4：卡样品，泳道5：阴性对照，泳道6-10：D17S30，泳道6：100bp DNA大小标记物，泳道7、8和9：卡样品，泳道10：阴性对照)；

图28示出使用ABI 3130基因分析仪(Applied Biosystem)和GeneMapper ID程序(Human Identification Detection，Applied Biosystems)(A：STR标记物D3S1358内部控制大小标记物(internal control size marker)，B和C：测量来自卡样品的STR标记物D3S1358PCR产品的标准)分析图26和27的PCR产物的结果；

图29示出进行代表性药物代谢基因，CYP2D6基因的PCR，和通过PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)调查CYP2D6多态性，和对利用皮肤基因卡提取的皮肤基因组DNA测序的结果；

图30示出基于图29的结果计算CYP2D6等位基因频率的结果；

图31示出进行代表基因的单个和多重PCR，随后将利用皮肤基因卡提取的皮肤基因组DNA在1.5％琼脂糖凝胶上电泳的结果(使用TNF-α基因进行单个PCR；泳道M：100bp DNA大小标记物，泳道9和10：卡样品，常规泳道(lane conventional)：从血液提取的DNA。使用5个基因(COMT、CYP1A1-1、CYP1B1、IL-6和VDR)进行多重PCR；泳道M：100bp DNA大小标记物，泳道9和10：卡样品，常规泳道：从血液提取的DNA)；

图32示出将图31的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳并分离和纯化产物之后使用ABI 3130测序仪进行碱基测序的结果，从而证实TNF-α基因的PCR结果不是假阳性；

图33示出在如图31中所述的多重-PCR之后使用ABI 3130基因分析仪(GeneMapper程序)分析，并用SNaPshot Multiplex试剂盒(Applied Biosystem)处理的结果，用以鉴定利用皮肤基因卡提取的皮肤基因组DNA的SNP，；

图34示出对18个营养基因组基因(涉及肥胖、抗氧化应激、解毒、心血管病、激素代谢、过敏症和骨代谢的基因)进行多重-PCR，并接着使用用于利用皮肤基因卡提取的皮肤基因组DNA的AW(抗老化和保持良好状态(Well-being))芯片(Goodgene)进行成像分析的结果(该结果表明激素代谢相关的CYP1A1基因的-3826A被G取代。)；

图35示出针对利用皮肤基因卡提取的皮肤基因组DNA，对引起基因疾病的其中一个基因APC基因进行PCR，接着将产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳的结果(泳道1：100bp DNA标记物，泳道2：来自卡样品的APC PCR产物)；

图36示出在将图35的APC PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳和随后分离和纯化该产物之后，使用ABI 3130测序仪，对APC基因的突变(1493G→A)的碱基测序的结果；

图37示出使用如实施例5中的皮肤基因卡获得皮肤样品、从其中合成cDNA、使用对皮肤癌相关的基因MAGE特异的引物进行PCR，和将产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳的结果(泳道1和9：100bp DNA标记物，泳道2和3：阴性对照，泳道4：阳性对照，泳道5和8：卡样品)；

图38示出从皮肤基因卡分离DNA和使用金黄色葡萄球菌(Staphylacoccus aureus)PCR试剂盒(Goodgene)分析葡萄球菌感染的结果(使用自动碱基测序仪对PCR产物的分析结果表明受金黄色葡萄球菌的感染)；

图39示出从使用皮肤基因卡获得的样品(肛门周围)中分离DNA和使用12STD多重PCR试剂盒(Goodgne)检测性传播疾病的结果(该结果表明受HPV的感染。泳道1：100bp大小的标记物，泳道2：来自样品的PCR产物，泳道3：STD B组(set)阳性对照)；

图40示出使用GG HPV基因分型芯片(Goodgene)对HPV阳性PCR产物成像分析的结果，其中该PCR产物来自实施例26中使用皮肤基因卡获得的样品(肛门周围)(该结果表明受HPV型11的感染)；

图41示出对DNA进行的巢式PCR的结果，该DNA是通过传统的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)技术，使用皮肤基因卡从带有瘤状斑(wart-like patch)的皮肤样品中获得的(泳道1：100bp DNA大小标记物，泳道2：阴性对照，泳道3：阳性对照，泳道4：来自从患者中获得的样品的PCR产物)；

图42示出使用利用皮肤基因卡获得的样品对MMP1基因(涉及皮肤状况和健康的一个基因)进行实时PCR的结果；

图43示出使用利用皮肤基因卡获得的样品对AQP3基因(涉及皮肤状况和健康的一个基因)进行实时PCR的结果；

图44示出使用利用皮肤基因卡获得的样品对Has3基因(涉及皮肤状况和健康的一个基因)进行实时PCR的结果；

图45示出使用利用皮肤基因卡获得的样品对酪氨酸酶(涉及皮肤状况和健康的一个基因)进行实时PCR的结果；

图46示出使用利用皮肤基因卡获得的样品对TRP1基因(涉及皮肤状况和健康的一个基因)进行实时PCR的结果；和

图47示出创建为年龄数据库(database for ages)的MMP1基因的表达谱。

具体实施方式

[最佳方式]

下文参考其中示出示例性实施方式的附图，更全面地描述示例性实施方式。然而，本披露内容可以以多种不同形式体现，而不应当理解为限制于在此提出的示例性实施方式。相反地，为了使本披露内容彻底且完全，提供了这些示例性实施方式，并向本领域中的技术人员全面表达了本披露内容的范围。在本说明书中，为了避免掩盖示出的实施方式，省略了众所周知的特征和技术的详述。

在此使用的术语仅是为了描述特定实施方式的目的，而不是要限制本披露内容。如在此使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”也倾向于包括复数形式，除非上下文中另外明确指出。而且，术语，一、一个等的使用不表示对量的限制，而是表示存在至少一个所提及的术语(item)。术语“第一”、“第二”等不暗示任何特定顺序，而是包括它们以识别单个元件。此外，术语第一、第二等的使用不表示任何顺序或重要性，而是术语第一、第二等可用于区分一个元件与另一个。应当进一步理解，当本说明书中使用术语“包含”或“包括”时，它们具体指存在所述特征、区域、整体、步骤、操作、元件，和/或组件，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、区域、整体、步骤、操作、元件、组件，和/或其组。

除非另外限定，在此使用的所有术语(包括技术和科学术语)与本领域技术人员通常理解的意思相同。应当进一步理解，诸如通常使用的字典中定义的那些术语应当解释为具有与它们在相关领域和本披露内容上下文中的意思一致的意思，而不应当按理想化或过度正式的意义进行理解，除非本文中有明确定义。

本发明涉及能够获得、运送和检查处于最佳状况的人皮肤样品以便可以充分保存包括在其中的基因的试剂盒(以下称为皮肤基因卡)、使用该试剂盒进行基因测试的方法、将该试剂盒应用于不同领域，例如医学、美容护理、整容术、遗传学等中的方法。

本发明的发明人已注意到通过充分获得皮肤样品和检查与皮肤功能、生理和病理相关的关键基因的表达或突变，可确切地了解个体皮肤状况。因而，他们旨在确立获得能够进行此种基因测试的处于最佳状况的皮肤样品的方法。为此，

1)基于本发明的发明人申请专利权的RNA卡和DNA卡来设计皮肤基因卡，并确立其制备方法。

2)确定使用该卡的最佳皮肤取样方法。

3)确立存储和递送皮肤样品的条件。

4)确立从所得皮肤样品中充分分离DNA和RNA的方法和cDNA合成条件。

5)确立重要的皮肤相关基因的基因测试方法，例如聚合酶链式反应(PCR)、逆转录(RT)-PCR、实时PCR、PCR-限制性片段长度多态性(RELP)、自动化碱基测序、DNA微阵列、甲基化特异性PCR(MSP)等。

6)确立系统，以便通过利用皮肤基因卡和5)的测试方法检查基因可准确地和客观地分类皮肤类型，且个性化皮肤护理、化妆品和药用化妆品可基于该结果进行选择。特别地，集中于检测和治疗干燥、老化、光老化和敏感皮肤。

7)确立系统，以便利用皮肤基因卡和5)的测试方法可诊断多种疑难皮肤病，例如炎症、湿疹、免疫相关性疾病、感染、牛皮癣等，且可选择最佳疗法。

8)确立系统，以便皮肤基因卡和5)的测试方法可用于检测遗传性基因疾病和各种基因测试，这些基因测试包括个体鉴定、亲子认定、器官移植之前的基因分型等。

这些总结在图1中。

根据本发明的皮肤基因卡的示意图在图2中示出。本发明的皮肤基因卡包含带部分和卡(衬底)部分。通过将带附于人体和从人体分离带，该带被用于获得人体组织，该卡部分用于保护、存储和运送带。该带可以是任何类型的胶带。在一种实施方式中，可使用对人体无害且允许医学用途的绷带(bandage tape)，特别是柔软的、低粘性纸质绷带。尤其，可使用3M的低粘性纸质绷带1500、1522或9874。衬底(卡)部分是用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的合成树脂、纸卡或薄膜、载玻片、塑料制品(plastic)、或纤维(fiber)制品，该衬底部分可与DNA和RNA形成稳定化合物，以便阻止DNA和RNA分别被脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶降解，及以便在室温下稳定地存储它们。进一步地，可将衬底部分浸入在适当形式和浓度的裂解缓冲液或水溶性壳聚糖溶液中。

优选地，人体样品可以是人皮肤。该皮肤样品可取自身体的任何部分。进一步地，人体样品可以是取自皮肤-粘膜界面(skin-mucosa interface)的毛发或粘膜，如嘴或肛门周围，或嘴里面。

虽然用于根据本发明的基因测试的人皮肤样品可使用本发明皮肤基因卡获得时，但是用于获得少量皮肤样品的任何其他凝胶或带型装置或卡可用于根据本发明的基因测试。

样品中靶物质组分可以是包括DNA在内的指示基因的任何物质。从皮肤样品中分离DNA可使用洗脱缓冲液(elution buffer)进行。然而，任何方法都可用于此目的。

更优选地，样品中靶物质组分可以是RNA。从皮肤样品中分离RNA和mRNA可使用洗脱缓冲液进行。然而，任何洗脱法都可用于此目的。

[本发明的方式]

现描述实施例和实验。以下实施例和实验仅用于示例目的，而不是要限制本披露内容的范围。实施例的修改和应用包括在本发明的范围内。

<步骤1>

获得皮肤样品的皮肤基因卡的制备及其性能验证

在这个步骤中，制备了皮肤基因卡并确立了它的制备方法。进一步地，确立了使用该卡获得最佳皮肤样品的方法及存储和运送该样品的条件。进一步地，确立了从皮肤样品分离DNA和RNA的条件，和合成cDNA的条件。另外，验证了分离的DNA和RNA的质量和数量。

详细情况如下。

实施例1.制备皮肤基因卡

本发明的皮肤基因卡包含带部分和衬底(卡)部分。该带用于通过附于人体和从人体移去来获得人体的组织，且卡部分用于保护、存储和运送带。该带可以是任何类型的胶带。在一种实施方式中，可使用对人体无害且允许医学用途的绷带，特别是柔软的、低粘性纸质绷带。尤其，可以使用3M的低粘性纸质绷带1500、1522或9874。衬底(卡)部分可以是用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的合成树脂、纸卡或薄膜、载玻片、塑料制品、或纤维制品，该衬底部分可与DNA和RNA形成稳定化合物，以便阻止DNA和RNA分别被脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶降解，并在室温下稳定存储它们。进一步地，可将衬底部分浸入在适当形式和浓度的裂解缓冲液或水溶性壳聚糖溶液中。使用高压釜(autoclave)将该卡在120℃和2大气压下浸入在用DEPC处理的水、壳聚糖和裂解缓冲液中30分钟，并在使用前对该卡进行灭菌和干燥。这是为了阻止DNA和RNA在分离期间被DNase和RNase污染。并且，壳聚糖、裂解缓冲液，及DNA和RNA卡可长时间保护核酸(图2)。

下表示出皮肤基因卡的组成和材料。

实施例2.利用皮肤基因卡获得皮肤样品的方法

将脱皮凝胶(peeling gel)应用在取样点上及其周围。通过用手摩擦除去角质，并用乙醇彻底除去脱皮凝胶。将本发明的皮肤基因卡附在取样点上，除去带部分的覆层(cover)。不久，移去该卡。在一种实施方式中，acnepris(Biolee)可用于脱皮凝胶。然而，可使用用于皮肤清洁的任何凝胶。卡附在皮肤上的持续时间可以是1分钟到12小时，通常30分钟。本发明的卡可附在任何皮肤部分上。为了对无皮肤病的那些人进行美容护理，可从前额、鼻子、下巴、眼周或脸颊正常进行取样。为了对疑似患有皮肤病的那些进行诊断，可直接在损害部分进行取样。在这种情况下，还从正常部分中取样用于比较是重要的。

实施例3.从皮肤基因卡分离DNA并对其进行鉴定

考虑到从微量皮肤细胞中分离DNA和阻止由卡中包括的物质的洗脱或其他因素致使的诸如PCR等酶反应的中断，确定从皮肤基因卡中分离DNA的方法。也可使用各种商业化的DNA分离试剂盒进行DNA的分离。然而，可使用普通的提取缓冲液根据已知方法，按如下描述的，进行该分离。DNA分离之后，将分离的DNA样品在琼脂糖凝胶上电泳，并用UV分光光度法进行分析。详细情况如下。

利用皮肤基因卡从正常成年人的面部获得皮肤样品，并分别将其存储1天、3天和1周。根据已知方法(Sambrook J and Russell DW.Molecular cloning：a laboratory manual.Cold Spring Harbor Press.2001：7.1.-7.88)从每个卡中分离基因组总DNA。使用三次蒸馏水。

1)将样品转移到1.5mL管中并装载在微量离心机中。在添加1x PBS(500μL)之后，在12,000rpm下进行离心2分钟，以便沉降细胞。

2)在漩涡下(under vortex)充分混合细胞与该溶液。

3)在12,000rpm下进行离心2分钟并除去上清液。

4)添加缓冲液TL(200μL)。

5)添加蛋白酶K(20μL)之后，在漩涡下充分混合该混合物。

6)在56℃下温育该混合物30分钟。

7)反应完成之后，以8,000rpm以上使该管旋降约10秒钟，以便粘附在盖子上的溶液落下。

8)添加缓冲液TB(400μL)并充分混合。以8,000rpm以上使该管旋降(spin down)约10秒钟，以便粘附在盖子上的溶液落下。

9)在收集管处装备旋柱(spin column)，并将上面反应溶液添加到旋柱中。

10)在8,000rpm下离心1分钟。

11)弃去通过该柱的滤出液，并安装另一个收集管。

12)添加缓冲液BW(700μL)之后，在8,000rpm下离心1分钟。

13)弃去通过该柱的滤出液，并安装另一个收集管。

14)添加缓冲液NW(500μL)之后，在12,000rpm下离心3分钟。

15)弃去通过该柱的滤出液，并安装1.5mL的新管。

16)在柱的中间部分添加缓冲液AE(200μL)或纯水之后，将该管在室温下放置2分钟。

17)在8,000rpm下离心1分钟。

18)立即对提取的基因组DNA进行PCR，或将其存储在-20℃下用于以后使用。

19)将提取的基因组DNA在0.8％琼脂糖凝胶上在100V下电泳，并在UV下对其进行检查。

20)将蒸馏水(200μL)添加到1.5mL新的微量离心管中，并在室温下放置1分钟。在8,000rpm下离心1分钟，从而洗脱DNA。用分光光度法测定分离的DNA的浓度，比较A260/A280，从而确定分离的DNA的纯度。A260/A280值在1.6和1.8之间。因此，利用皮肤基因卡可从1x2cm的皮肤区域中获得1-5μg(平均3μg)的纯DNA(图3)。

实施例4.利用皮肤基因卡长期存储DNA的验证。

通过PCR验证了DNA是否没有降解地保持在利用皮肤基因卡获得并在室温下长期存储之后的皮肤细胞中，以及DNA是否能够被扩增和分析。

利用皮肤基因卡从正常成年人的面部获得皮肤样品，并分别存储1天、1月和1年。从每个卡中分离基因组总DNA。如下进行PCR，从而验证是否靶基因被适当扩增。

因此，在已于室温下存储1天、1月和1年的所有DNA样品中，明显检出β-肌动蛋白。

该结果验证了通过使用本发明的皮肤基因卡基因组DNA可稳定存储至少一年，存储的DNA可进行PCR分析，而没有任何问题。本发明提供了DNA的稳定存储，其与现有的超低温度存储相似。存储温度从室温到-70℃变化。干燥黑暗区域适合于存储。

PCR

在以下一般性条件下，使用从皮肤基因卡提取的核酸作为模板，对存储1天、1月或1年之后的Gapdh基因进行PCR(45个循环)。

1)混合模板(7ul)和H₂O(6ul)与PCR混合物(10pM正向引物和反向引物各1ul、10x反应缓冲液2ul、5mM dNTP 2ul、50U/ul Taq聚合酶1ul)，从而制备反应溶液。

2)在95℃/10min、94℃/1min、55℃/1min、72℃/1min下进行反应，持续45个循环。

3)反应完成之后，以8,000rpm以上将管旋降约10秒，以便粘附到盖子上的溶液落下。

4)将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上在100V下电泳并在UV下对其进行检查。将一个结果实例示出在图4中。

实施例5.从皮肤基因卡分离RNA的验证

根据一般方法从利用皮肤基因卡获得的皮肤样品中分离RNA。可使用商业化的EasySpin试剂盒(Cat#17221，Intron)代替。分离的RNA样品的UV分光光度分析表明对于总共50μl获得了5-10ng/μL的RNA。OD260/280在1.5和1.8之间。那就是说，利用皮肤基因卡从1x2cm的皮肤区域中可获得250-500ng，(平均400ng)的纯RNA[图5]。

RNA分离

1)将样品转移到1.5mL管中。添加裂解缓冲溶液(200μL)之后，在漩涡下充分混合该样品和该溶液2分钟。

2)向其中添加氯仿(200μL)，从而除去脂质，并在漩涡下充分混合该样品和该溶液30秒。

3)在4℃和12,000rpm下离心5分钟之后，将上清液转移到新管中(需谨慎防止伴有下层液)。

*当使用EasySpin试剂盒(Intron)时，接着步骤4)-9)，否则转到10)。

4)将结合缓冲液(400μL)添加到分离的上清液中。

5)将溶液装载在柱上，并在室温下存放1分钟之后，在13,000rpm下进行离心30秒。

6)将漂洗缓冲液A(700μL)添加到该柱中，并在13,000rpm下进行离心30秒。

7)将漂洗缓冲液B(700μL)添加到该柱中，并在13,000rpm下进行离心30秒。

8)再次在4℃和13,000rpm下离心3分钟，从而彻底除去水。

9)添加洗脱缓冲液(50μL)，并在室温下存放1分钟之后，在4℃和13,000rpm下离心3分钟，从而获得RNA。

10)在添加异丙醇(与3)的上清液体积相等)之后，将该混合物存储在-70℃下1-2小时。

11)在4℃和13,000rpm下离心该样品30分钟，以便沉降RNA和弃去上清液。

12)使用真空干燥器干燥沉降的RNA，并将其溶解在纯蒸馏水(50ul)中。

13)将提取的总RNA在含有甲醛的1.8％琼脂糖凝胶上在100V下电泳，并在UV下对其进行检查。

实施例6.利用皮肤基因卡长期存储之后RNA状态的验证

在室温下长期存储核酸样品的问题是RNA可被核糖核酸酶降解，核糖核酸酶非常稳定并可在地球中的任何地方发现。通过逆转录(RT)-PCR分析验证了是否RNA没有降解地保持在利用皮肤基因卡获得并在室温下长期存储之后的皮肤细胞中，并验证了是否RNA可被扩增和分析。

利用皮肤基因卡从正常成年人的面部获得皮肤样品，并分别存储1天、1周和1月。从每个卡中分离RNA并如下进行PCR，从而验证靶基因是否被适当扩增。

结果，在已于室温下存储1天、1周和1月的所有皮肤样品中，明显检出β-肌动蛋白[图6]。

该结果验证使用本发明的皮肤基因卡RNA可稳定存储至少一月，以及存储的RNA可进行RT-PCR分析，而没有任何问题。本发明提供了RNA的稳定存储，其与现有的超低温度存储相似。存储温度从室温到-70℃变化。干燥黑暗区域适合于存储。

RT-PCR

在利用皮肤基因卡存储1天、1周或1月之后，在以下一般条件下，使用提取的RNA作为模板，进行RT-PCR。

1)混合RNA模板(13ul)与RT混合物(40ng/ul Oligo-dT 1ul、5x反应缓冲液4ul、10mM dNTP 2ul、10U/ul逆转录酶1ul、RNase抑制剂1ul)，从而制备反应溶液。

2)在50℃下温育该溶液1小时。

3)在完成反应之后，以8,000rpm以上将管旋降约10秒，以便粘附到盖子上的溶液落下。

4)混合该模板(13ul)和PCR混合物(10pM正向和反向引物各1ul、10x反应缓冲液2ul、5mM dNTP 2ul、50U/ul Taq聚合酶1ul)，从而制备反应溶液。

3)以预变性(95℃，10min)接着变性(94℃，1min)、退火(55℃，1min)和反应(72℃，1min)进行该反应，持续45个循环。

4)反应完成之后，以8,000rpm以上将该管旋降约10秒，以便粘附到盖子上的溶液落下。

5)将PCR产物在含有甲醛的1.8％琼脂糖凝胶上于100V下电泳并在UV下对其进行检查。

实施例7.利用皮肤基因卡获得毛发样品和从其中分离DNA

使用镊子，从人头皮选取五缕(strand)带有根部的毛发，并在利用皮肤基因卡存储1天、1月和1年之后，按与实施例3相似的方式分离DNA。用UV分光光度法分析分离的DNA样品[图7]。A260/280值在1.5和1.8之间。结果，从该毛发样品中可获得3-5μg(平均4μg)的纯DNA。

实施例8.利用皮肤基因卡获得毛发样品并从其中分离RNA

使用镊子，从人头皮选取五缕带有根部的毛发，并在如实施例7中利用皮肤基因卡存储之后，按与实施例5相似的方式分离RNA。将分离的RNA样品在2％琼脂糖凝胶上在100V下电泳[图8]。用UV分光光度法分析分离的RNA样品。A260/280值在1.5和1.8之间。结果，从该毛发样品中可获得1-2μg(平均1.5μg)的纯RNA。

<步骤2>

对利用皮肤基因卡获得的皮肤样品进行基因测试

在这一步中，确立了使用包括在利用皮肤基因卡获得的样品中的DNA和RNA进行主要基因测试的方法。首先，确立了在不从皮肤基因卡中分离DNA或RNA的情况下进行PCR和RT-PCR的方法。然后确立了实时PCR、PCR-RFLP、自动碱基测序、寡聚核苷酸微阵列、cDNA微阵列、甲基化特异性PCR(MSP)、硫酸氢盐基因组测序等的方法。

实施例9.在没有从皮肤基因卡分离DNA的情况下的PCR

当在没有从皮肤基因卡分离DNA的情况下进行RT-PCR时，除了要考虑实施例4中描述的要求之外，还必须考虑细胞裂解之后RNA或其他物质致使的诸如PCR等酶反应的中断的阻止。在这个实施例中，控制引物，从而使基因组DNA和靶RNA的PCR产物的大小不同，以便基因扩增可以仅发生在期望的基因组DNA中。

利用皮肤基因卡从正常成年人的面部获得皮肤样品。如下从每个卡中分离基因组DNA，并验证了是否靶基因被PCR适当扩增[图9]。

1)将该样品转移到1.5mL管中，并在添加Tris-EDTA(pH7.0)缓冲液(200μL)之后，通过漩涡5分钟从带上移去细胞。

2)在-70℃下存储样品5分钟之后，通过在60℃的加热块(heating block)中熔化1分钟使细胞壁破裂。

3)在4℃和12,000rpm下离心1分钟之后，将上清液转移到新管中。

4)混合模板(7ul)和H₂O(6ul)与PCR混合物(10pM正向和反向引物各1ul、10x反应缓冲液2ul、5mM dNTP 2ul、50U/ulTaq聚合酶1ul)，从而制备反应溶液。

5)以预变性(95℃，10min)接着变性(94℃，1min)、退火(55℃，1min)和反应(72℃，1min)进行该反应，持续45个循环。

6)反应完成之后，以8,000rpm以上将管旋降约10秒，以便粘附到盖子上的溶液落下。

7)将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上100V下电泳并在UV下对其进行检查。

实施例10.没有从皮肤基因卡分离RNA的情况下的RT-PCR

当在没有从皮肤基因卡分离RNA的情况下进行RT-PCR时，除了要考虑从皮肤细胞中分离微量RNA之外，还必须考虑细胞裂解之后基因组DNA或其他物质致使的诸如PCR等酶反应的中断的阻止。在这个实施例中，控制引物，从而使基因组DNA和靶RNA的PCR产物的大小不同，以便基因扩增可以仅发生在期望的RNA中。

利用皮肤基因卡从正常成年人的面部获得皮肤样品。如下从每个卡中分离RNA，并验证是否靶基因被RT-PCR适当扩增[图10]。

1)将该样品转移到1.5mL管中，并在添加Tris-EDTA(pH7.0)缓冲液(200μL)之后，通过漩涡5分钟从带中移去细胞。

2)在-70℃下存储样品5分钟之后，通过在60℃的加热块中熔化1分钟使细胞壁破裂。

3)在4℃和12,000rpm下离心1分钟之后，将上清液转移到新管中。

4)混合RNA模板(13ul)与RT混合物(40ng/ul Oligo-dT 1ul、5x反应缓冲液4ul、10mM dNTP 2ul、10U/ul逆转录酶1ul、RNase抑制剂1ul)，从而制备反应溶液。

5)在50℃下温育该溶液1小时。

6)在完成反应之后，以8,000rpm以上将管旋降约10秒，以便粘附到盖子上的溶液落下。

7)混合该模板(13ul)和PCR混合物(10pM正向和反向引物各1ul、10x反应缓冲液2ul、5mM dNTP 2ul、50U/ul Taq聚合酶1ul)，从而制备反应溶液。

8)以预变性(95℃，10min)接着变性(94℃，1min)、退火(55℃，1min)和反应(72℃，1min)进行该反应，持续45个循环。

9)反应完成之后，以8,000rpm以上将管旋降约10秒，以便粘附到盖子上的溶液落下。

10)将PCR产物在含有甲醛的1.8％琼脂糖凝胶上于100V下电泳并在UV下对其进行检查。

实施例11.利用皮肤基因卡的实时PCR

在从皮肤基因卡分离RNA之后，可如下进行实时PCR。

利用皮肤基因卡从20个正常成年人的面部获得皮肤样品，从每人获得3个。如实施例5中从每个卡中分离RNA，并验证了靶基因是否被一步法实时PCR适当扩增[图11]。

1)Light Cycler反应条件设定如下：

逆转录：50℃，20分钟。

预变性：94℃，5分钟。

扩增：94℃，15秒/55℃，20秒/72℃，20秒。

熔融曲线分析：95℃，5秒/64℃，15秒/95℃，0秒。

冷却：40℃，30秒。

2)如下混合用于实时PCR的反应溶液(反应数：3)：

*β-肌动蛋白(总共20ul)：

对照DNA模板1μL、3μL、5μL

DEPC H₂O 7.8μL、5.8μL、3.8μL

引物1ul

反应溶液10.2ul(反应溶液：cyber green混合物185ul+RT混合物3.7μL)′

*样品(总共20μL)：

Cyber Green混合物10μL

RT混合物0.2μL

引物1μL

模板1、3、5μL

DEPC H₂O 7.8、5.8、3.8μL

3)将反应溶液添加到毛细管中，并盖上盖子。

4)在台式离心机(table top centrifuge)上进行快速旋降(spin down)。

5)将毛细管安装在Light Cycler上，并开始运转。

实施例12.克隆从皮肤基因卡获得的基因

如下进行克隆，以便稳定实施例9和10中通过PCR和RT-PCR获得的基因产物。

为了以MMP1为例，首先对从根据本发明的皮肤基因卡获得的样品进行PCR。为此，制备了引物(5′-CCGGTTTTTCAAAGGGAATAA-3′和5′-CACAGTTCTAGGGAAGCCAAAG-3′)，通过90℃/5min随后95℃/30sec、55℃/30sec和72℃/30sec 30个循环进行PCR。PCR产物[图12]被纯化并通过连接至pGEM-T Easy载体中进行克隆[图13]。

使用ABI377，进行测序PCR，从而验证MMP1基因产物在pGEM-T Easy载体中的插入[图14]。详细情况如下。

1)为了使用MMP1基因产物作为用于测序的模板，重要的是设定足够的浓度。在本发明中，使用了10ng的MMP1基因。

2)将MMP1基因的正向或反向引物(3.2pmol)和terminator ready反应混合物(8μL，Perkin Elmer，USA)添加到PCR管中。在添加已灭菌的蒸馏水，调节最终体积至20μL之后，充分混合该混合物。

3)使用GeneAmp 2700Thermal Cycler对该混合物以96℃/10秒、50℃/5秒和60℃/6分钟25个循环进行测序PCR。

4)反应产物用乙醇沉淀，离心除去terminator ready反应混合物中的游离引物和荧光标记的双脱氧核苷酸(ddNTP)，然后干燥。

5)将所得DNA与甲酰胺、25mM EDTA(pH8.0)和蓝色右旋糖酐(blue dextran)的混合物及上样缓冲液(10μL)混合。在沸水中变性5分钟之后，将该样品放在冰上。将变性DNA样品加入之前用5.5％Long Ranger凝胶铸造(cast)的平板的每个孔中。进行电泳2-4小时，并使用ABI377自动测序仪(Perkin Elmer，USA)分析碱基序列。

结果，验证了MMP1基因被准确地扩增。证实了根据本发明扩增的基因产物插入在pGEM-T Easy载体中，并因而维持稳定。这表示本发明可应用于基因突变测试和癌症检测。

实施例13.利用皮肤基因卡的PCR-RFLP

对使用本发明皮肤基因卡获得和存储的皮肤基因组DNA样品进行PCR，接着进行RFLP，从而验证基因分型测试是否可能。对涉及心血管病发病的基因进行PCR，如下用特异性限制酶处理，然后对其进行电泳。结果表明多个基因型(genotype)可立即检出[图15和16]。

详细情况如下。使用本发明皮肤基因卡获得涉及成年人疾病涉及的下列6个基因，并在PCR管中将其制备成如下面表中的反应溶液。

[表1]

	eNOS1/2	MTHFR1/2	AGT1/2	ACE1	ACE2	AT1R	APOE1/2
								D.W.	20.8	20.8	19.3	19.1	17.6	20.3	17.8
10x缓冲液	3	3	3	3	3	3	3
								25mM MgCl2	2	2	2.5	2	2	3	2
2.5mM dNTP	1	1	2	1.2	1.2	1.5	1
								F(10pmole)	1	1	1	1	1	0.5	1
R(10pmole)	1	1	1	1	1	0.5	1
								DMSO	-	-	-	1.5	3	-	3
GenePol 5U/L	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
								模板DNA	1	1	1	1	1	1	1
最终体积(ul)	30	30	30	30	30	30	30

将容纳反应溶液的PCR管装载在PE2700 Thermal Cycler(Perkin Elmer，USA)上，如下进行基因扩增。

1.eNOS1/2、MTHFR1/2、AGT1/2、AT1R和ACE1基因：

95℃/5分钟，35个循环(95℃/30秒、58℃/30秒、72℃/40秒)，72℃/10分钟。

2.ACE2和APOE1/2基因：

95℃/5分钟，35个循环(95℃/30秒、65℃/30秒、72℃/40秒)，72℃/10分钟。

将每个基因的PCR产物在含有EtBr的1.2％琼脂糖凝胶上电泳。基因产物及其大小总结在表2中。

[表2]

为了进行所得PCR产物的RFLP，如下使用DNA Clean和Concentrator试剂盒(Research Corporation，CA USA)纯化除ACE基因之外的5个基因(eNOS、MTHFR、AGT、AT1R和APOE)的PCR产物。

1.向PCR产物(～25μL)中添加DNA结合溶液(50μL)。

2.将1的溶液转移到Zymo旋柱中并在13,000rpm下离心30秒。

3.使用移液管弃去收集管中收集的溶液。

4.将漂洗缓冲液(200μL)添加到柱中，并在13,000rpm下离心30秒(两次)。

5.在13,000rpm下离心40秒，从而彻底除去剩余的漂洗缓冲液。

6.在移去收集管之后，将新的1.5mL微量离心管装载到新的柱上。在添加已灭菌的三次蒸馏水(20μL)之后，在13,000rpm下离心40秒，用以洗脱。可替换地，可使用加热到约65℃的已灭菌的三次蒸馏水。

对于所得纯化的PCR产物，准备如表3中的限制酶。在适用于每个限制酶的反应条件下，在37℃下温育4-6小时。然后，通过2.5％的琼脂糖凝胶电泳监测每个基因的危险因素。

[表3]

实施例14.从皮肤基因卡获得的样品的自动碱基测序

使用本发明皮肤基因卡获得和存储鳞状细胞癌皮肤样品。验证了基因分型是否可以通过基因组DNA样品的自动碱基测序进行。对在癌发生中起重要作用的p53肿瘤抑制基因进行PCR，并如下进行自动碱基测序。验证了可检出p53的突变，而没有任何问题[图17和18，，表4]。

详细情况如下。

为了使用本发明的皮肤基因卡鉴定p53肿瘤抑制基因的突变，在PCR管中制备了如表4中的反应溶液。

[表4]

组成	ul
		D.W.	20.8
10x缓冲液	3
		25mM MgCl2	2
2.5mM dNTP	1
		F(10pmole)	1
R(10pmole)	1
		DMSO	-
GenePol 5U/L	0.2

模板DNA	1
		最终体积(uL)	30

将容纳反应溶液的PCR管安装在PE2700 Thermal Cycler(Perkin Elmer，USA)上，并如下进行扩增：94℃/5分钟，32个循环(95℃/30秒、60℃/30秒、72℃/30秒)，72℃/5分钟。

将该基因的PCR产物在含有EtBr的1.2％琼脂糖凝胶上电泳。因而如下使用DNA Clean和Concentrator试剂盒(Research Corporation，CA USA)纯化所得PCR产物。

1.向PCR产物(～25μL)中添加DNA结合溶液(50μL)。

2.将1的溶液转移到Zymo旋柱中并在13,000rpm下离心30秒。

3.使用移液管弃去收集管中收集的溶液。

4.将漂洗缓冲液(200μL)添加到柱中，并在13,000rpm下离心30秒(两次)。

5.在13,000rpm下离心40秒，从而彻底除去剩余的漂洗缓冲液。

6.在移去收集管之后，将新的1.5mL微量离心管装载到新的柱上。在添加已灭菌的三次蒸馏水(20μL)之后，在13,000rpm下离心40秒，用以洗脱。可替换地，可使用加热到约65℃的已灭菌的三次蒸馏水。

对于所得p53基因的纯化的PCR产物，使用ABI 3130(Applied Biosystems)自动测序仪进行碱基测序。

实施例15.经由寡聚核苷酸微阵列对利用皮肤基因卡获得的样品进行基因分型

如实施例13，使用本发明的皮肤基因卡获得和存储鳞状细胞癌皮肤样品。验证了基因分型是否可以经由RNA样品的寡聚核苷酸微阵列发生。对在癌发生中起重要作用的p53肿瘤抑制基因进行PCR，并如下进行自动碱基测序。验证了可检出p53的突变，而没有任何问题[图18]。

详细情况如下。使用CanScan DNA芯片(Goodgene)。

首先，根据已知方法，使用从皮肤基因卡获得的RNA合成cDNA。然后使用包括在CanScan DNA芯片中的PCR预混合物扩增p53基因。将PCR产物放置在CanScan DNA芯片上并进行微测序(mini-sequencing)。使用荧光扫描仪分析结果[图19]。

1.p53基因的扩增：

用于PCR的预混合物制备如下。

模板cDNA	～500ng
		Taq DNA聚合酶	0.1μL
对每个突变位点设定的引物	1μL
		MgCl2	1μL

10x缓冲液	3μL
		2.5mM dNTP	1μL
G溶液	4μL
		蒸馏水	至30μL
最终体积	30μL

在以下条件下使用制备的预混合物和PCR仪(PE2700)进行PCR。

2.用于微测序的PCR产物的片段化(fragmentation)

将所得PCR产物转移到新的PCR管中，并如下制备反应溶液。

1	纯化的PCR产物	15μL
			2	U1(0.1U/ul)	1μL
3	U2(0.1U/ul)	1μL
			4	10xU缓冲液	3μL
5	已灭菌的去离子水	10μL
				总体积	30μL

将由此制备的混合物在37℃下温育1小时。在95℃下煮10分钟之后，将该混合物存储在冰中。

3.微测序

将片段化的PCR产物(10μL)转移到新的PCR管中。在添加蒸馏水(50μL)和随后在95℃下变性10分钟之后，将该管放置在冰上。在另一个PCR管中如下制备反应溶液。将该反应溶液与变性的片段化的PCR产物充分混合。

1	10x反应缓冲液	12μL
			2	5μM ddATP	1μL
3	5μM ddCTP	1μL
			4	5μM ddGTP	1μL
5	5μM Cv5-ddMTP	1μL
			6	测序酶(2M/μl)	1μL
7	已灭菌的去离子水	40μL
			8	总体积	60μL

将制备的混合物缓慢地注入芯片的孔中。然后，将该芯片装载在杂交室上并在58℃下温育20分钟。在根据已知方法用漂洗缓冲液I和II漂洗之后，使用荧光扫描仪分析信号。

实施例16.Northern印迹法分析从皮肤基因卡获得的样品

对实施例8中从皮肤基因卡获得的RNA进行Northern印迹，以便鉴定特异基因的表达。

1)将RNA样品、5x甲醛凝胶电泳(gel-running)缓冲液(0.1M MOPS，pH7.0：40mM乙酸钠：5mM EDTA，2ul)、甲醛(3.5ul)和甲酰胺(10ul)添加到微离心管(microfuge tube)中。添加H₂O，调节最终体积至20ul。

2)将该混合物在65℃下温育15分钟，并将其放在冰上5分钟。离心5秒之后，混合该溶液和甲醛凝胶上样染料(2ul)。

3)将琼脂糖凝胶添加到含有1x甲醛凝胶电泳缓冲液的凝胶电泳池中，并在5V下预运行(pre-run)5分钟。

4)已通过将琼脂糖(0.6g)彻底溶解在DEPC-DW(31.1mL)中，冷却至约60℃，并然后添加5x甲醛凝胶电泳缓冲液(10mL)和甲醛溶液(8.9mL)制备琼脂糖凝胶。

5)将该样品装载在琼脂糖凝胶上并在3V/cm下运行。

6)当该样品移动约8cm时，撤去凝胶，并将其浸入含有0.5ug/mL溴化乙锭的0.1M乙酸铵溶液中。

7)30分钟后，在UV下照相之后，将该凝胶放置在之前已浸入在6x SSC缓冲液中的NC过滤器(filter)和3MM纸(3MM纸-凝胶-NC过滤器-3MM纸-纸巾)之间。

8)转移18小时之后，将NC过滤器浸入在6x SSC缓冲液中并室温下干燥30分钟。

9)将NC过滤器放置在3MM纸之间，并在80℃的真空烘箱中烘2小时。然后于42℃下对NC过滤器进行预杂交2小时(预杂交缓冲液：50％甲酰胺、5x SSPE、5x Denhardt溶液、0.1％SNS、100μg/mL变性的鲑精DNA)。

10)在向杂交溶液中添加用放射性同位素标记的MMP1基因的探针之后，在42℃下进行反应16小时。

11)用2x SSC和0.1％SDS缓冲液漂洗NC过滤器2次，每次持续5分钟，并在室温下干燥。

12)将干燥的NC过滤器暴露在X-射线薄膜中，从而检测基因表达[图20]。

实施例17.通过MSP分析从皮肤基因卡获得的DNA样品中的启动子甲基化

在较高级的真核细胞中DNA甲基化仅发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶残基的5’-位点上[图21]。因为这个变化主要发生在称为“CpG岛”的启动子的CpG富含部分，它在调节基因表达中是重要的。CpG岛处的超甲基化(hypermethylation)灭活已知频繁发生在人肿瘤抑制基因中的特异基因的表达。肿瘤抑制基因的灭活最终导致癌发生。

为了通过分析基因的启动子甲基化确立从皮肤基因卡获得的DNA样品的MSP方法，进行了下面的实验。

1)首先，用含有亚硫酸氢钠作为主要组分的CpGenome(tm)DNA修饰试剂盒(Cat.No.S7820，Intergen Co.，NY)处理从皮肤基因卡获得的DNA，从而将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。

2)MSP是假定两种模板碱基序列(即，甲基化和未甲基化)，基于在经亚硫酸氢钠处理的情况下根据基因组中的胞嘧啶残基是否已被甲基化从而基因组中的胞嘧啶残基是否转化成尿嘧啶的事实，选择两个引物组，以及评价来自PCR扩增谱的甲基化的技术。在这个实施例中，使用了能够扩增未甲基化的序列的引物组。

3)使用变性的DNA作为模板进行PCR，并鉴定了基因扩增[图22]。

该结果暗示特异基因的甲基化可通过对利用皮肤基因卡获得的DNA样品进行MSP来验证。

实施例18.通过亚硫酸氢盐基因组测序分析皮肤基因卡获得的DNA样品中的启动子甲基化

利用皮肤基因卡获得的DNA样品进行亚硫酸氢盐基因组测序，作为分析特异基因的启动子甲基化的另一方法。当用亚硫酸氢钠化学处理DNA时，DNA碱基序列的胞嘧啶残基转化成尿嘧啶。当对该产物进行PCR时，未甲基化的胞嘧啶转化成胸腺嘧啶。因此，可检出甲基化位点。详细情况如下。首先，可如下使用DNA甲基化试剂盒(Zymo)进行化学修饰。

1.将M-稀释缓冲液(10ul)添加到DNA溶液(90ul)中，并在37℃下温育该混合物15分钟。

2.在添加200ul的CT转化试剂溶液(通过漩涡彻底混合750ulD.W.和210ul M-稀释缓冲液)之后，轻轻地振荡该混合物，以在50℃下温育16小时(剩余的CT转化试剂溶液可存储在-20℃，以在1周内再利用)。

3.在冰上温育10分钟之后，添加M-结合缓冲液(800ul)。

4.将混合物(600ul)装载到Zympo-Spin I柱中，并在25℃和11,000rpm下离心(Eppendorf离心机)1分钟。

5.在弃去收集的废料之后，装载剩余样品并在25℃和11,000rpm下离心(Eppendorf离心机)1分钟。

6.在弃去收集的废料和随后装载M-漂洗缓冲液(200ul)之后，在25℃和11,000rpm下离心(Eppendorf离心机)1分钟。

7.在装载M-去磺化(M-desulphonation)缓冲液(200ul)之后，在室温下温育15分钟。

8.在25℃和11,000rpm下离心(Eppendorf离心机)1分钟。

9.在装载M-漂洗缓冲液(200ul)之后，在25℃和11,000rpm下离心(Eppendorf离心机)1分钟。

10.在将该柱转移到收集管和随后装载M-漂洗缓冲液(200ul)之后，在25℃和13,000rpm下离心(Eppendorf离心机)1分钟。

11.在向柱中装载预热的M-洗脱缓冲液(90ul，70℃)之后，将该柱转移到1.5mL管中。1分钟之后，在25℃和11,000rpm下离心(Eppendorf离心机)2分钟，从而洗脱修饰的DNA。

如下将修饰的DNA制备成反应溶液并使用热循环仪(Thermal Cycler)扩增。

【表5】

扩增反应溶液的组成和扩增条件

对扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。

通过剪下琼脂糖凝胶从扩增产物中获得DNA，并如下使用DNA清洗和浓缩试剂盒(DNA Clean and Concentrator kit)(Zymo Research Corporation，CA USA)对其进行纯化。

1.混合PCR产物(～25μL)与DNA结合溶液(50μL)。

2.将1的溶液转移到Zymo旋柱中并在13,000rpm下离心30秒。

3.使用移液管弃去收集管中收集的溶液。

4.将漂洗缓冲液(200μL)添加到该柱中，并在13,000rpm下离心30秒(两次)。

5.在13,000rpm下离心40秒，从而彻底除去剩余的漂洗缓冲液。

6.移去收集管之后，将新的1.5mL微量离心管装载到新的柱中。在添加已灭菌的三次蒸馏水(20μL)之后，在13,000rpm下离心40秒，用以洗脱。可替换地，使用加热到约65℃的已灭菌的三次蒸馏水。

使用碱基测序仪测定纯化的DNA的序列，从而鉴定特异位点处的甲基化(胞嘧啶→胸腺嘧啶)。

实施例19.使用从皮肤基因卡获得的样品进行身份鉴定

人染色体DNA具有串联重复序列。在重复序列中，14-70bp的那些称为可变数目串联重复(VNTR)，2-7bp的那些称为短串联重复(STR)。VNTR或STR是在两个或更多核苷酸的样式重复且重复序列彼此直接相邻时发生的多态性。因为它们在个体之间的长度不同，所以它们可用于身份和亲子鉴定。在这个实施例中，检查了VNTR基因座D1S80和D17S30，及STR基因座D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D18S51、D21S11、FGA和vWA。

19-1.VNTR和STR基因座的多重PCR

从利用皮肤基因卡获得的皮肤样品中提取基因组DNA。然后，使用VNTR-PCR和AmpFl STR Profiler Plus PCR扩增试剂盒(Applied Biosystems)扩增特异基因。PCR结果表明可以从皮肤样品中适当获得DNA并可对其进行分析[图26和27]。

19-2.身份鉴定

使用AmpFl STR Profiler Plus PCR扩增试剂盒，从所得基因组DNA获得STR，使用ABI 3130x1基因分析仪(Applied Biosystems)对其测序，并使用GeneMapper ID程序(Human Identification Detecton，Applied Biosystems)对其进行分析[图28]。

实施例20.使用碱基测序仪对从皮肤基因卡获得的样品进行药物基因组学测试

认识个体的单核苷酸多态性(SNP)使得可以认识个体对特异药物的响应和不良反应。所谓“药物基因组学测试”对药物发展、个性化药物的选择和对药物不良反应的最小化有帮助。在这个实施例中，验证了涉及药物代谢的代表基因的SNP分析是否可以对利用皮肤基因卡获得的样品进行。详细情况如下。结果表示涉及药物代谢的基因的SNP分析可以对利用皮肤基因卡获得的样品进行，并表示它对预测个体对特异药物的响应和不良反应，选择个性化药物，和最小化对药物不良反应有帮助。

20-1.CYP2D6基因分型

从利用皮肤基因卡获得的皮肤样品中提取基因组DNA。对CYP2D6基因，涉及药物代谢的代表基因进行基因分型分析。从该分析获得基因型和等位基因频率。该结果表明可从皮肤样品适当获得DNA并可对其进行分析。

实施例21.对从皮肤基因卡获得的样品进行营养基因组测试

21-1.基本原理

这个测试通过基于基因技术(多重-PCR/SNaPshot多重方法)的SNP分析，以认识个体基因多态性为基础，例如涉及氧化应激、肝脏解毒、心血管健康、激素代谢和免疫/骨健康的基因的突变。

21-2.单个或多重PCR

从利用皮肤基因卡获得的皮肤样品中提取基因组DNA。使用特异性的单个和多重PCR引物通过PCR扩增特异基因[图31]。PCR结果揭示可从皮肤样品中适当获得DNA并可对其进行分析。

21-3.测序和SNaPshot多重分析

利用获得的基因组DNA，通过使用测序和SNaPshot多重试剂盒(Applied Biosystems)，测定了SNP，并通过使用ABI 3130x1基因分析仪(GeneMapper program)进行基因分型[图32和33]。

21-4.使用抗老化和保持良好状态(Well being)芯片进行分析

使用如实施例3中利用皮肤基因卡获得的基因组DNA，通过已知多重方法扩增18个营养基因组基因(涉及肥胖、抗氧化应激、解毒、心血管病、激素代谢、过敏和骨代谢的基因)。用AW(抗老化和保持良好状态)芯片(Goodgene)的分析揭示营养基因组测试能够进行，而没有任何问题[图34]。详细情况如下。

1.片段化PCR产物，用于微测序

在新的PCR管中将18个基因的20个PCR产物制备成反应溶液。

1	纯化的PCR产物	15μL
			2	U1(0.1U/ul)	1μL
3	U2(0.1U/ul)	1μL
			4	10x U缓冲液	3μL
5	已灭菌的去离子水	10μL
				总体积	30μL

将由此制备的混合物在37℃下温育1小时。在95℃下煮10分钟之后，将该混合物存储在冰中。

2.微测序

将片段化的PCR产物(10μL)转移到新的PCR管中。在添加蒸馏水(50μL)和随后在95℃下变性10分钟之后，将该管放置在冰上。如下在另一个PCR管中制备反应溶液。充分混合该反应溶液与变性的片段化的PCR产物。

1	10x反应缓冲液	12μL
			2	5μM ddATP	1μL

3	5μM ddCTP	1μL
			4	5μM ddGTP	1μL
5	5μM Cv5-ddUTP	1μL
			6	测序酶(2U/ul)	1μL
7	已灭菌的去离子水	40μL
			8	总体积	60μL

将制备的混合物缓慢地注入芯片的孔中。然后，将该芯片装载在杂交室上并在58℃下温育20分钟。在根据已知方法用漂洗缓冲液I和II漂洗之后，使用荧光扫描仪分析信号。

实施例22.使用从皮肤基因卡获得的样品诊断基因疾病

从利用皮肤基因卡获得的皮肤样品获得基因组DNA。使用对APC基因特异的引物，通过40个PCR循环进行基因扩增。将扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳[图35]。通过剪下琼脂糖凝胶从扩增产物中获得DNA并进行纯化。使用3130序列分析系统对纯化的产物进行碱基测序，从而鉴定这些序列上的点突变[图36]。

实施例23.使用从皮肤基因卡获得的样品通过测试皮肤癌相关的基因进行诊断

使用本发明的皮肤基因卡从黑素瘤患者的肿瘤中获得组织。在使用RNA提取试剂盒(iNtRON)从其中提取RNA之后，合成了cDNA，并通过PCR鉴定了MAGE基因和管家基因β-肌动蛋白的表达。使用了对该基因特异的引物，并通过40个PCR循环鉴定了黑素瘤抗原(MAGE)的表达[图37]。

实施例24.使用从皮肤基因卡获得的样品通过测试皮肤感染相关的基因进行诊断

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus)、特别是耐甲氧西林葡萄球菌(MSR)/脓疱性毛囊炎、须疮、特应性、四环素耐性：PCR/测序/芯片

可从利用皮肤基因卡获得的样品中获得DNA。证实了使用金黄色葡萄球菌PCR试剂盒(Goodgene)是否可以检出感染性疾病。结果揭示了可检出感染性疾病，而没有任何问题。详细情况如下。

1.从皮肤基因卡分离DNA

1)将样品(1.5mL)转移到1.5mL管中，并装载在微量离心机中。在12,000rpm下离心2分钟，以便沉降细胞。

2)在除去上清液之后，添加1xPBS(500μL)。

3)在漩涡下充分混合细胞与溶液。

4)在12,000rpm下离心2分钟，并除去上清液。

5)添加缓冲液TL(200μL)。

6)在添加蛋白酶K(20μL)之后，在漩涡下充分混合该混合物。

7)在56℃下温育该混合物30分钟。

8)在完成反应之后，以8,000rpm以上将该管旋降约10秒，以便粘附在盖子上的溶液落下。

9)添加缓冲液TB(400μL)并充分混合。以8,000rpm以上将该管旋降约10秒，以便粘附在盖子上的溶液落下。

10)在收集管处装备旋柱，并将上述反应溶液添加到旋柱中。

11)在8,000rpm下离心1分钟。

12)弃去通过该柱的滤出液，并安装另一个收集管。

13)在添加缓冲液BW(700μL)之后，在8,000rpm下离心1分钟。

14)弃去通过该柱的滤出液，并安装另一个收集管。

15)在添加缓冲液NW(500μL)之后，在12,000rpm下离心3分钟。

16)弃去通过该柱的滤出液，并安装新的1.5mL管。

17)在柱的中间部分添加缓冲液AE(200μL)或纯水之后，将该管在室温下放置2分钟。

18)在8,000rpm下离心1分钟。

19)立即对提取的基因组DNA进行PCR，或将其存储在-20℃下用于以后使用。

20)将提取的基因组DNA在0.8％琼脂糖凝胶上在100V下电泳，并在UV下对其进行检查。

2.通过PCR鉴定金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的感染

1)将2x主混合物(master mix)(12.5μL)和引物混合物(2.5μL)添加到PCR管中。添加模板DNA(10μL)，调节最终体积至25μL并充分混合。

2)使用制备的预混合物和PCR仪进行PCR

3)在完成反应之后，将PCR产物(5μL)在2％琼脂糖凝胶上电泳。鉴定228bp产物。对产物进行测序分析(图38)。

实施例25.使用从皮肤基因卡获得的样品通过测试性传播疾病相关的基因进行诊断

从利用皮肤基因卡获得的样品(皮肤、口腔粘膜、阴道和肛门)中获得DNA。使用12STD多重PCR试剂盒(Goodgene)鉴定性传播疾病。验证了可以检出STD，而没有任何问题。详细情况如下。

1.从皮肤基因卡分离DNA

1)将样品(1.5mL)转移到1.5mL管中，并装载在微量离心机中。在12,000rpm下离心2分钟，以便沉降细胞。

2)在除去上清液之后，添加1x PBS(500μL)。

3)在漩涡下充分混合细胞与溶液。

4)在12,000rpm下离心2分钟，并除去上清液。

5)添加缓冲液TL(200μL)。

6)在添加蛋白酶K(20μL)之后，在漩涡下充分混合该混合物。

7)在56℃下温育该混合物30分钟。

8)在完成反应之后，以8,000rpm以上将该管旋降约10秒，以便粘附在盖子上的溶液落下。

9)添加缓冲液TB(400μL)并充分混合。以8,000rpm以上使该管旋降约10秒，以便粘附在盖子上的溶液落下。

10)在收集管处装备旋柱，并将上述反应溶液添加到旋柱中。

11)在8,000rpm下离心1分钟。

12)弃去通过该柱的滤出液，并安装另一个收集管。

13)在添加缓冲液BW(700μL)之后，在8,000rpm下离心1分钟。

14)弃去通过该柱的滤出液，并安装另一个收集管。

15)在添加缓冲液NW(500μL)之后，在12,000rpm下离心3分钟。

16)弃去通过该柱的滤出液，并安装新的1.5mL管。

17)在柱的中间部分添加缓冲液AE(200μL)或纯水之后，将该管在室温下放置2分钟。

18)在8,000rpm下离心1分钟。

19)立即对提取的基因组DNA进行PCR，或将其存储在-20℃下用于以后使用。

20)将提取的基因组DNA在0.8％琼脂糖凝胶上在100V下电泳，并在UV下对其进行检查。

2.使用STD多重PCR试剂盒进行PCR

组A(UU、MH、CTR、TV、MG和NG混合物)

组B(HD、GV、TP、HSV、CA和HPV混合物)

1)将2x主混合物(12.5μL)添加到PCR管中。

2)在添加STD引物A(或B)组(4.5μL)和基因组DNA(3μL)之后，添加蒸馏水，调节最终体积至25μL。充分混合之后，在以下条件下，使用PCR仪进行PCR。

3)变性(94℃，15分钟)；94℃/30秒、58℃/1.5分钟、72℃/1.5分钟的40个循环；反应(72℃/10分钟)。

4)将PCR产物(7-8μL)在2％琼脂糖凝胶上电泳并在UV下对其进行检查[图39]。

组A	预测大小(bp)	组B	预测大小(bp)
				解脲脲原体(UU)	869	杜克雷嗜血杆菌(HD)	496

人型支原体(MH)	502	阴道加德纳菌(GV)	419
				砂眼披衣菌	367	梅毒螺旋体(TP)	313
阴道毛滴虫(TV)	319	单纯疱疹病毒(HSV)	268
				生殖支原体(MG)	253	白色念珠菌	234
淋病奈瑟菌(NG)	214	人乳头状瘤病毒(HPV)	185

实施例26.使用从皮肤基因卡获得的样品通过测试病毒感染相关的基因进行诊断

从利用皮肤基因卡获得的样品(皮肤、口腔粘膜、阴道和肛门)中获得DNA。使用STD多重PCR试剂盒(Goodgene)鉴定病毒感染。验证了可检出病毒感染，而没有任何问题[图39]。使用GG HPV基因分型芯片(Goodgene)鉴定通过HPV的感染[图40]。详细情况如下。

1.从皮肤基因卡分离DNA

1)将样品(1.5mL)转移到1.5mL管中，并装载在微量离心机中。在12,000rpm下离心2分钟，以便沉降细胞。

2)在除去上清液之后，添加1x PBS(500μL)。

3)在漩涡下充分混合细胞与溶液。

4)在12,000rpm下离心2分钟，并除去上清液。

5)添加缓冲液TL(200μL)。

6)在添加蛋白酶K(20μL)之后，在漩涡下充分混合该混合物。

7)在56℃下温育该混合物30分钟。

8)在完成反应之后，以8,000rpm以上将该管旋降约10秒，以便粘附在盖子上的溶液落下。

9)添加缓冲液TB(400μL)并充分混合。以8,000rpm以上将该管旋降约10秒，以便粘附在盖子上的溶液落下。

10)在收集管处装备旋柱，并将上述反应溶液添加到旋柱中。

11)在8,000rpm下离心1分钟。

12)弃去通过该柱的滤出液，并安装另一个收集管。

13)在添加缓冲液BW(700μL)之后，在8,000rpm下离心1分钟。

14)弃去通过该柱的滤出液，并安装另一个收集管。

15)在添加缓冲液NW(500μL)之后，在12,000rpm下离心3分钟。

16)弃去通过该柱的滤出液，并安装新的1.5mL管。

17)在柱的中间部分添加缓冲液AE(200μL)或纯水之后，将该管在室温下放置2分钟。

18)在8,000rpm下离心1分钟。

19)立即对提取的基因组DNA进行PCR，或将其存储在-20℃下用于以后使用。

20)将提取的基因组DNA在0.8％琼脂糖凝胶上在100V下电泳，并在UV下对其进行检查。

2.对HPV芯片的PCR

1)向每个引物中添加预定量的纯水，从而彻底溶解该引物。将彻底溶解的引物存储在-20℃。纯水的添加量如下。

【表6】

向HPV PCR引物中添加的纯水量

编号	引物	纯水的添加量
			1	L1	210μL
2	L2	220μL
			3	H1	230μL
4	H2	250μL

2)在用银箔覆盖L1和L2引物之后存储它们，因为由于端基用花青5标记因而它们对光敏感。

每管的反应溶液的组成如下。

【表7】

用于HPV基因扩增的反应溶液的组成

试剂	体积(每个反应)
		预混合物	15μL
纯水	8μL
		L1引物	1μL
L2引物	1μL
		模板基因组DNA	5μL

*用于L1/L2和H1/H2的PCR组合物相似。

1)在冰上为每个样品制备两个预混合物(用于L和H基因)。

2)制备用于L和H基因的两个主混合物管。

3)将纯水添加到每个1.5mL的主混合物管中。

4)将相应的引物组(L1和L2组，H1和H2组)添加到每个主混合物管中，并充分混合。

5)将制备的L和H主混合物(10μL)添加到每个预混合管中。

6)将模板基因组DNA(5μL)添加到预混合管中并充分混合。

7)在离心情况下旋降片刻之后，在下面情况下对该混合物进行PCR。

【表8】

用于HPV基因扩增的PCR条件

(可选的)鉴定扩增的DNA

可通过在2％琼脂糖凝胶上电泳鉴定扩增的DNA

3.HPV DNA芯片反应

1)准备和反应样品数目一样多的新的1.5mL或200μL管。

2)向每个管中添加纯水(50μL)。

3)在HPV PCR产物中，添加L1(10μL)和H(5μL)并充分混合。

4)将该管存放在95℃的加热块中，持续3分钟。

5)将该管存放在冰上，持续5分钟。

6)通过离心，将该反应管旋降30秒。

7)向该管中添加HYB I缓冲液(65μL)并用移液管充分混合。

8)将制备的反应溶液缓慢地注入芯片表面上盖片的孔中。

检查芯片和反应室之间是否有气泡。如果有气泡，通过用戴着手套的手将其挤出去。

9)在48℃下进行芯片杂交，持续30分钟。

(杂交后漂洗)

1)在完成杂交之后，使用镊子从芯片上移去盖片。

2)将漂洗缓冲液1倒入罐中之后，使用定轨振荡器(orbital shaker)在室温下漂洗该芯片2分钟。

—可替换地，可通过将压挤瓶中的漂洗缓冲液喷洒到芯片表面进行漂洗，持续2分钟。

—如果反应芯片数目为1，则可将该芯片放在含有漂洗缓冲液(40mL)的50mL锥形管中，并振荡该管2分钟。

3)在弃去该漂洗缓冲液和添加漂洗缓冲液2之后，漂洗2分钟。

4)在漂洗之后，可使用旋转干燥器(spin dryer)或空气压缩机除去残留在芯片上的缓冲液(可替换地，可使用KimWipes除去该缓冲液。但不能用手触摸该芯片。)。

4.结果解释

1)如果所有H样点(spot)的SBR都为2.5以上，和所有L1样点的SBR都为2.5以上，则结果是阳性的。

2)如果HBB的SBR为2.5以上，和两个L1样点中仅一个样点的SBR是2.5以上，则再次进行该测试。

3)如果所有HBB样点的SBR都没有超过2.5，则从取样开始再次进行测试。

4)如果仅一个样点的结果是阳性或阴性的，则再次进行测试。

实施例27.使用从皮肤基因卡获得的样品通过测试结核感染相关的基因进行诊断

最近，结核发病率再次增大。尤其，抗生素耐药细菌的猖獗引起许多关注。在这个实施例中，调查了根据本发明的皮肤基因卡和基因测试方法是否对诊断难于诊断的结核有帮助。使用本发明皮肤基因卡从经活组织检查诊断为结核的患者中获得皮肤损害样品。将该样品添加到离心管中并用4％NaOH处理。然后，在添加已灭菌的蒸馏水，调整总体积至50mL之后，在3,000rpm下离心20分钟。在弃去上清液并添加Tris EDTA(10mM Tris-HCl[pH 8.0]，1mMEDTA)缓冲液之后，在7,000rpm下离心5分钟。重复这个步骤2次。在彻底除去上清液之后，将沉淀物溶解在50-200μL的5％Chelex 100和Tris EDTA缓冲液中。煮沸该混合物10分钟之后，在12,000rpm下离心5分钟。对上清液(1-2μL)进行PCR。将上清液(2μL)添加到10mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM KCl、1.5mMMgCl₂、400μM dNTP、20pM引物组和2.5U Taq DNA聚合酶的反应混合物(18μL)中。在充分混合之后，在以下条件下进行PCR。

【表9】

结核分枝杆菌DNA PCR引物

【表10】

结核分枝杆菌DNA PCR条件

PCR条件	第一步PCR	第二步PCR
			最初变性	96℃/3分钟	96℃/3分钟

循环	35个循环	25个循环
			变性	95℃/30秒	96℃/3分钟
退火	60℃/30秒	96℃/3分钟
			延伸	72℃/1分钟	96℃/3分钟
最终延伸	72℃/10分钟	96℃/3分钟
			PCR产物	239bp	194bp

在第二步PCR之后，在2％琼脂糖凝胶上在90V下电泳40分钟。然后，将凝胶板放置在透照灯上。当观测到285bp DNA片段时，评价该结果为阳性。100bp DNA梯(ladder)用作DNA大小标记物，且从分离于临床样品的结核分枝杆菌中提取的DNA用作阳性对照。为了减少交叉污染，从该样品提取DNA的步骤和扩增的步骤彼此分开[图41]。

实施例28.使用从皮肤基因卡获得的样品通过测试皮肤状况和健康相关的基因的表达进行诊断

从报道在皮肤中正常或病态表达的基因中，选择被认为在确定和分类皮肤状况和确定个性化皮肤护理中有帮助的候选基因。通过初步测试，选择了31个基因(8组)，这31个基因在皮肤基质蛋白的合成和降解、脂质代谢、黑素生成、保湿、皮肤细胞的增殖和再生、损伤修复、分化、死亡等中发挥重要作用，并涉及皮肤老化、光老化、再生、增白皮肤、弹性、保湿、油性、免疫、炎症等。确立了对这些基因和管家基因β-肌动蛋白的RT-PCR和实时PCR。适用于该基因的实时PCR的引物的碱基序列和反应条件在表11中给出。

作为具体实施例，下面描述了MMP1、HAS3、AQP3、酪氨酸酶和TRP3的实时PCR实验及其结果(对5个基因的实时PCR条件相同)[图42-46]。

【表11】

28-1.从皮肤基因卡获得的RNA的一步法RT-PCR和RT-PCR

使用了Light Cycler ver 3.5(Roche)和RT-PCR试剂盒(Cyber Green Cat#204243，Qiagen)并将上清液(8ul)用作模板。

表1中所列靶基因的引物用作引物。

Cyber Green试剂盒(Cat#204243)用于实时PCR。

1)RT-PCR

a.向a中加入获得的RNA(1μg)。

b.添加Oligo dT(100pmol，1ul)。

c.将该微型管存放在95℃，持续5分钟。

d.将该微型管放在冰上，持续5分钟。

e.在添加10mM dNTP、扩展RTase(Roche，20单位)、5x RT缓冲液(3ul)和RNase抑制剂(5单位)之后，添加H₂O，调节最终体积至30ul。

f.将微该型管存放在43℃，持续1小时，然后存放在95℃，持续5分钟。

g.将微该型管存储在4℃下(cDNA合成完成)。

2)实时PCR

a.光循环仪(Light Cycler)条件设置如下。

逆转录：50℃/20分钟。

预变性：94℃/5分钟。

扩增：94℃/15秒、55℃/20秒、72℃/20秒。

熔融曲线分析：95℃/5秒、64℃/15秒、95℃/0秒。

冷却：40℃/30秒。

b.通过混合下面物质制备用于实时PCR的反应溶液。

Cyber Green混合物10μL

RT混合物0.2μL

引物1μL

模板4、6、8μL

DEPC水4.8pL(至最终体积为20ul).

c.通过混合下面物质制备对照GAPDH。

模板4μL、6μL、8μL

DEPC H₂O 4.8μL、2.8μL、0.8μL

引物1ul

Cyber Green混合物反应溶液10.2ul(至最终体积为20ul).

*Cyber Green混合物反应溶液：Cyber Green混合物(185ul)+RT混合物(3.7μL)

d.将样品装载在毛细管上并关闭帽。

e.在桌面上使毛细管快速旋降。

f.将毛细管安装在Light Cycler上并开始运转。

实施例29.使用从皮肤基因卡获得的样品，基于皮肤状况和健康相关的基因的表达测试确立个性化皮肤护理的方针

这个实施例的目的在于将实施例28中确立的基因测试方法应用到皮肤护理、美容护理和化妆品中。首先，本发明人旨在确立能够更准确和客观分类皮肤类型并在选择个性化皮肤护理、化妆品和药用化妆品有帮助的系统。尤其，集中于准确地检测干燥、敏感、自然老化和光老化的皮肤，并提供准确的诊断和治疗。为了这个目的，研究了年龄在18和50之间的150个韩国妇女。所有受验者已在美容诊所或皮肤科诊所就诊，并已通过经面谈的医学检查、身体检查或使用各种仪器检查确定皮肤类型。她们均志愿参与这项基因测试。在她们当中，140人已使用Aphrodite皮肤诊断系统(PSI，首尔，韩国)确定她们的皮肤类型。该皮肤诊断系统测量了皮肤的油状况、水含量、角质层厚度、毛孔大小和皱纹深度，并评价了皮肤的油性、干燥度和老化度(agedness)。在这150个受验者中，78人(52.0％)被评价为正常皮肤，24人(16.0％)被评价为干型皮肤，16人(10.7％)被评价为油型皮肤，及32人(21.7％)被评价为混合型。在她们当中，12个被确定为具有严重的敏感皮肤，19个显示出明显的皮肤老化。22个有许多黑斑病。

正常皮肤指的是没有皮肤病和没有特殊不适的状况。在正常的皮肤中，角质化、角层细胞的丧失、保湿，及皮脂和汗的分泌处于良好的平衡中。肤质柔软并有光泽，皮肤表面光滑并有弹性，毛孔小，且肤色明亮。对于正常皮肤，用于平衡油和水含量的定期基础护理已足够。

在干性皮肤中，角质层中水含量低。当用皮肤水分测试仪(corneomoter)测量时，可测得角质层的异常低的保水能力。并且当用蒸发计测量时，可观测到异常增大的经皮水分流失。该皮肤表面粗糙并形成鳞屑。该皮肤易被轻微刺激损伤。该肤质柔软但无弹性。因为该皮肤薄，因而容易老化和损坏，并表现出敏感反应。洗脸之后，有拉伸(紧绷，stretch)的感觉。皮肤发痒并很难化妆。在冬天，该状况更严重。干皮肤易于形成敏感或老化皮肤。

油性皮肤有光泽，粗糙，且毛孔扩大。尤其明显的是包括额头、鼻子和下巴的所谓T型区。油性皮肤经常伴有痤疮和扩大的毛细血管，并容易在青春期后的青年中形成。

混合型皮肤指的是两种或更多皮肤类型的组合。在许多情况下，T型区(额头、鼻子和下巴)是油性的而U型区(面颊和眼周)是正常或干燥的。额头上容易形成痤疮和粉刺，而眼周周围容易形成皱纹。当将相同化妆品用于不同区时，可产生副作用。混合型皮肤常见于老年人中。

敏感性皮肤对季节或温度变化、环境变化例如，压力和UV，和与化妆品、肥皂或其他物质的接触表现出敏感反应。经常发生痒、耀斑和炎症，并经常伴有色素沉积和毛细血管的扩大。(Sung-ku Ahn，Seung-Hun Lee.Skin aesthetics.Korea Medical Book Publisher.2002)。

皮肤老化可分类为自然老化、内在老化或按时间顺序老化、基因老化、太阳光或光老化，由生活方式引起的老化、内分泌老化，由慢性消耗性疾病引起的老化、由重力引起的老化，或类似老化(Pierrrd GE.Ageing across the life span：time to think again.Journal of Cosmetic Dermatology.3：50-53；2004)。其中，内在老化和光老化是最常见和最重要的。这两个老化的机制、症状和征象不同。内在老化的特点是光滑的肤质、细而薄的皱纹、薄的表皮、正常或减少的弹性纤维、轻微减少的毛细血管，和如果有的话，阳性肿瘤。相比，光老化在整个皮肤结构都被太阳光，特别是UV损伤时形成，且它不正常地恢复。它的特点是粗而厚的皮肤，粗而深的皱纹，其中在弹性纤维变得异常厚时乳头真皮中发生Grenze区的日光性弹力组织变性，显著减少但扩大的毛细血管(导致皮肤变红)，和可发展成恶性肿瘤的常发生的癌前期病变(Korea Medical Book Publisher.2002；Korean Dermatological  Association Textbook Publishing Committee.Dermatology.第四版.Ryo Moon Gak.2001)。

使用本发明皮肤基因卡，从受验者的面部、面颊和眼周选取皮肤样品。对从样品中获得的RNA，进行用于实施例28中30个皮肤相关的关键基因和管家基因β-肌动蛋白的实时RT-PCR。此后，在统计学上分析了每个靶基因的表达在皮肤类型之间的差异。调查了与正常皮肤相比，特异基因在具体皮肤类型中的表达是否显著增大或减小。靶基因的表达被测定为相对β-肌动蛋白基因的表达的比率。当该值显著高于或低于正常皮肤组时，该结果被评价为有意义。在那种情况下，特异基因的高度表达或低度表达可视为与具体皮肤类型有关，并因而为确定皮肤类型的标准。本发明人试图发现用于诊断每种皮肤类型的靶基因的组合。例如，与正常皮肤相比，过敏性皮肤表现出，免疫和炎症相关的基因，例如白介素-1α、肿瘤坏死因子α、细胞间粘附分子-1(I-CAM1)等的表达显著提高。因此，对于具有敏感性皮肤的这些，必须提供能够阻止细胞因子过度表达和炎症的皮肤护理方法。必须避免使用刺激性化妆品或药用化妆品，且在施用化妆品之前，需要用于超敏感性的斑贴试验。作为另一个实施例，在皮肤严重老化的情况下，MMP-1的表达增大，而TIMP、原胶原-1、原胶原-3、超氧化物歧化酶(SOD)、表皮生长因子(EGF)和角质形成细胞生长因子(KGF)的表达减小。在那种情况下，需要集中于抑制MMP1和增补抗原、生长因子和抗氧化因子的皮肤护理。

有个不属于上面皮肤类型中任一种的情况。例如，黑色素相关基因的表达变化可导致色素沉积，例如黑斑病。在那种情况下，选择集中于抑制这些基因表达的化妆品和药用化妆品。

本发明人通过调查每个靶基因的表达与受验者年龄之间的关系，也试图找到与年龄紧密相关的基因。结果，他们鉴定出MMP-1的表达与年龄成正比。因而，MMP-1基因的表达测试可以是用于估计年龄的有用工具。

下面更详细地描述了相关实施例。

然而，所述基因测试自身也不是完美的，与其他测试结果结合是重要的。进一步地，根据皮肤的情况和部分，可以有多种改变和结合。除此之外，因为皮肤类型可以不断变化，需要皮肤护理之前和之后的对比测试。进一步地，通过后续的持续皮肤护理是重要的。除了皮肤护理之外，维持整个机体健康、适当的饮食和营养、良好的生活方式和心理健康对保持皮肤健康和美丽重要。

实施例29-1：基因测试和个性化皮肤护理用于油性皮肤的应用

在油性皮肤组中，相比正常皮肤，HMG CoA还原酶、脂肪酸合酶、在角质层和皮脂中的脂质合成中发挥重要作用的乙酰辅酶A羧化酶和丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)基因，和雄激素受体基因的表达显著增大。该结果表明这五个基因的增大表达与油性皮肤紧密相关。因此，当在基因测试中观测到此种现象时，可将该皮肤评价为油性皮肤。油性皮肤的护理主要集中于除去过多的皮脂。然而，重要的是要找到平衡点，因为表皮脂质的破坏可导致表皮屏障的破裂，从而导致干性皮肤。重要的是使用温和的药用化妆品到更有功效的药用化妆品。

(步骤1)清洁：

使用肥皂、洁肤乳和凝胶清洗面部。含有水杨酸的泡沫肥皂是合适的。

(步骤2)调色剂：

面部清洗之后，将金缕梅收敛剂和富含酒精的皮肤乳液施用到T型区(前额、眼周和鼻子)，从而除去皮脂。

(步骤3)保湿霜(moisturizer)：

包括维生素B3(烟酰胺)或天然维生素A(视黄醇(retinol))的保湿霜用于阻止皮肤干燥。

(步骤4)除去皮脂

使用包括能够结合到剩余皮脂并能够将其除去的聚合物组分的乳膏。每周使用该乳膏1-3次，并通过按摩除去油和残余物。

(步骤5)控制皮脂的化妆品

滑石粉型化妆品用于除去剩余皮脂。

(步骤6)维生素

如果继续分泌过多的皮脂，或形成严重的痤疮，则施用合成维生素A化合物(类视色素(retinoid))。

实施例29-2.基因测试和个性化皮肤护理用于干性皮肤的应用

在干性皮肤组中，相比正常皮肤组，合成在表皮中有功效的含水物质透明质酸(透明质多糖)的透明质酸合酶-3(HAS-3)、为水通道蛋白的水通道-3(AQP3)基因、为表皮中天然保湿因子(NMF)前体的丝聚合蛋白原(profillaggrin)基因、为脂质合酶的HMG辅酶A还原酶和脂肪酸合酶、乙酰辅酶A羧化酶、丝氨酸棕榈酰转移酶(SPI)基因，和原胶原-1基因的表达显著减小。此外，MMP-1基因的表达增大。这个结果表明该基因表达的变化与皮肤干燥度紧密相关。当因皮肤中没有生产NMF，或因脂质代谢或胶原合成的异常损害表皮屏障，致使皮肤缺少湿气时，该皮肤变得干燥。进一步地，皮肤干燥度与皮肤屏障损害和老化紧密相关。多种皮肤屏障损害相关的疾病，例如湿疹、牛皮癣、鱼鳞病(icthyosis)、特应性皮炎经常发生在干性皮肤中的事实和干燥皮肤经常发现在老年人和糖尿病患者中的事实可能是由这个机制造成的。显示此种表达谱的皮肤可被评价为干性皮肤。干性皮肤的护理集中于解决根本原因，即向角质层供给湿气和保持其潮湿并强化皮肤屏障，以便阻止水分流失。此外，集中于缓解瘙痒或灼痛感觉。详细情况如下。

1)含有温和表面活性剂的肥皂和身体清洁剂用于清洗面部。避免过度清洁。减少肥皂的使用。避开造成严重摩擦的衣服。

2)减少沐浴和淋浴的次数。保持室内温度低并维持适当湿度。

3)清洗面部之后，使用含有低酒精含量的润肤乳液。

4)使用富含油的滋养乳液(nourishing lotion)。

5)清洗面部之后，含有维生素A、C和E的乳膏，精油(essence)和油用于保湿。

6)通过定期使用乳膏或精油处理细小皱纹。

7)采取每周定期1-2次的包敷(pack)或按摩。

8)建议食用富含维生素A的食物。

9)使用能够供给和保持湿气的保湿霜或皮肤湿润剂(humectant)。使用天然保湿物质，例如氨基酸、尿素、吡咯烷酮羧酸(PCA)和乳酸钠、在皮肤保湿和皮肤屏障恢复中有帮助的泛醇(panthenol)、多元醇物质，例如甘醇和甘油，或聚合物保湿霜，例如透明质酸、硫酸软骨素、胶原等。

10)使用在皮肤表面上形成不渗透层从而阻止水分流失的闭塞剂(occlusive agent)。凡士林、羊毛脂、希蒙得木油(jojoba oil)、可可油(cocoa butter)、橄榄油、二甲基硅油、环甲硅油(cyclomethicone)，和脂肪酸络合物是适当的。

11)使用可使皮肤表面光滑和柔软的水包油或油包水型皮肤润肤剂(emollient)。可使用十六烷基硬脂酸酯、马来酸二辛酯、C12-C15烷基苯甲酸酯等的混合物。

12)施用能够取代存在于表皮角质层中的脂质的脂质，从而恢复皮肤屏障。在这种情况下，重要的是，通过等摩尔地混合神经酰胺、胆固醇和游离脂肪酸，或通过增强神经酰胺和胆固醇将脂质制备成天然脂质混合物，如天然角质层中。

13)建议避免使用皮肤药物。在皮肤出现严重瘙痒或继发性变化的情况下，可使用肾上腺皮质激素或抗组胺剂。

实施例29-3：基因测试和个性化皮肤护理用于混合型皮肤的应用

所有混合型皮肤的情况都是T型区的油性皮肤，和U型区的正常或干性皮肤的结合。在T型区中，与正常皮肤组相比，如实施例29-1，HMG辅酶A还原酶、脂肪酸合酶、乙酰辅酶A羧化酶、SPT和雄激素受体基因的表达显著增大。并且，在U型区中，与正常皮肤组相比，HAS-3、AQP3、丝聚合蛋白原、HMG辅酶A还原酶、脂肪酸合酶、乙酰辅酶A羧化酶、SPT和原胶原-1基因的表达显著降低。可按实施例29-1中护理油性部分，并可按实施例29-2中护理干性部分。

29-4：基因测试和个性化皮肤护理用于敏感性皮肤的应用

在敏感性皮肤中，与正常皮肤组相比，免疫和炎症相关的基因，例如，白介素-1α(IL1α)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、I-CAM等的表达显著增大。进一步地，如在干性皮肤中，与正常皮肤组相比，MMP1基因的表达增大，而丝聚合蛋白原、HMG辅酶A还原酶、脂肪酸合酶、乙酰辅酶A羧化酶、SPT和原胶原-1基因的表达显著减小。这可能是因为敏感性皮肤主要由表皮角层细胞中的细胞因子的增大的表达引起，该增大的表达是由外部或内在刺激造成的，其促进了免疫细胞的迁移和活化，并诱发炎症。这暗示敏感性皮肤可伴有皮肤屏障损害和皮肤干燥。IL-1α或TNFα基因的过度表达被评价为敏感性皮肤。敏感性皮肤的护理集中于解决根本原因，即降低刺激并抑制免疫和炎症。详细情况如下。

1)需要改变生活方式和环境。应当避免刺激皮肤的物质或环境。要避免温度突然变化，例如热水浴或热敷，及过度磨损或长时间洗澡。如果可以，要避免暴露于太阳光下。要减少辛辣和烫热食物的摄取。需要改善环境，例如宠物、毛皮垫子、虱类等。需要缓解心理压力。

2)使用刺激性较小的清洁剂或乳液。在清洗面部期间，使用弱碱性肥皂，从而减小刺激。

3)使用保湿乳液或乳膏提供适当的油和湿气。

4)应当避免使用刺激性的化妆品或药用化妆品。在施用化妆品前，可能需要用于超敏感性的斑贴测试。

5)最推荐的化妆品组分是对皮肤没有刺激且可减轻炎症的尿囊素(allantoin)和没药醇(bisabolol)，和在皮肤保湿和皮肤屏障恢复中有效的泛醇(panthenol)。在严重炎症的情况下或如果IL-1α和TNFα基因的表达水平比β-肌动蛋白的表达水平高，则可使用含有绿茶提取物的化妆品。

6)当暴露到太阳光下时，施用强的防晒霜或乳液。

实施例29-5：皮肤测试和个性化护理用于老化皮肤的应用

在老化皮肤中，尤其是光老化皮肤，观测到各种基因表达的变化。首先，降解真皮的主要蛋白质成分胶原的MMP-1的表达显著减小。并且，原胶原-1、原胶原-3和TIMP的表达增大，从而导致真皮纤维损失。其次，HMG辅酶A还原酶、脂肪酸合酶、涉及皮肤屏障的脂质生产的乙酰辅酶A羧化酶和SPT，和为天然保湿因子(NMF)前体的丝聚合蛋白原(profillaggrin)的表达减小，从而导致皮肤屏障损失。第三，除去超氧自由基和阻止其中发生的损害的重要酶，超氧化物歧化酶的表达减小。第四，皮肤再生所需的生长因子的表达显著减小，例如，表皮生长因子(EGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)和碱性成纤维细胞生长因子(碱性FGF)，和血管内皮生长因子(VEGF)。这表示生长因子的存储和不适当的组织再生可能是老化的重要原因。除此之外，光老化皮肤组中展现，抑弹性酶蛋白表达增大，弹性蛋白酶表达减小。该结果表示皮肤老化是由前述基因的表达的变化引起，并由皮肤组织的一般结构和功能不全产生。基因表达的此种变化可被诊断为皮肤老化，与年龄无关。老化皮肤的护理集中于解决根本原因。详细情况如下。

1)使用含有抗氧化物质的化妆品。口服可能是有帮助的。抗氧化物质包括植物源的物质和维生素。前者包括从绿茶、槲皮素(quercetin)、染料木素(genistein)、碧萝芷(pyncogenol)，鞣花酸(ellagic acid)或类似物质中提取的多酚，后者包括维生素E、维生素C、维生素A、α-硫辛酸、万有醌(ubiqinone)、艾地苯(idebenone)等。

2)可使用含有生长因子(EGF、KGF、bFGF)的化妆品。

3)可使用含有MMP1抑制性成分或胶原的化妆品。例如，可使用五肽Pal-KTTKS、胶原-1片段、从绿茶提取的多酚、槲皮素、果香菊素(nobilin)、新伐司他(neovastat)。

4)可使用能够取代存在于表皮角质层中的脂质的脂质。特别地，可以使用通过等摩尔地混合神经酰胺、胆固醇和游离脂肪酸，或通过增强神经酰胺和胆固醇制备的天然脂质混合物。

实施例29-6：基因测试和个性化皮肤护理用于黑色素相关的基因表达异常的应用

在150个受验者中，22个表现出明显的黑斑病。与正常皮肤组相比，她们的酪氨酸酶、TRP1和内皮素-1(ET1)基因的表达显著增大。其中，酪氨酸酶和TRP1是涉及黑素生成的关键基因，并推测ET-1是调节黑素细胞增殖的细胞因子。该结果表明这三个基因的过度表达与过多的色素沉积紧密相关。因此，该基因的过度表达可被评价为高风险的色素沉积。

通过施用可抑制酪氨酸酶活性或作用的氢醌、壬二酸、曲酸(kojic acid)、光甘草定(glabridin)、芦荟苦素(aloesin)、维生素A或维生素B3(烟酰胺(nicianamide))处理高风险组。可以考虑施用4％的氢醌，和维生素A。然后施用含有壬二酸、曲酸和光甘草定的保湿霜。

实施例29-7：应用于皮肤年龄的确定和皮肤护理

在这150个受验者中，58个表现出因年龄引起的明显光老化。这组的MMP1的表达表现出成比例的增大[图47]。一般地，已知MMP1的表达随着光老化的进行而增大。特别地，在约40岁，老化开始时，该表达开始突然增大。

已知皮肤老化开始于25岁左右。但是，充分进展是在约40岁时。随着皮肤变老，由于排泄减少、细胞再生缓慢，皮肤变得干燥，并由于老化的角质层的堆积，皮肤变得粗糙。进一步地，由于胶原合成减少且弹性蛋白变性，形成皱纹。此外，皮肤脱色并发生色素沉积，例如黑斑病和黑斑。表皮变得更薄且提供的皮肤保护更少。除此之外，由于皮肤厚度和皮肤屏障作用的减小，皮肤问题增大。这些生理作用可通过确定老化相关基因的表达水平来诊断。

在许多皮肤老化类型中，最重要的两种是内在老化和光老化。在150个受验者中，58个表现出进行性(progressing)皮肤老化。她们展现比正常组短的端粒，且MMP1的表达比β-肌动蛋白(内源对照)的表达大10-1,000倍。该结果揭示端粒长度和MMP1基因的过度表达与皮肤老化紧密相关。尤其，MMP1基因的过度表达，特别比β-肌动蛋白的表达大0.001或更多的过度表达可被诊断为有风险。

图47示出创建为用于预测受验者皮肤年龄的年龄数据库的MMP1基因的表达谱。例如，如果MMP1的相对表达为1×10^-3，则可预测受验者的皮肤年龄为30多岁。

虽然示出并描述了示例实施方式，本领域技术人员应当理解，其中可作出形式和细节的各种变化，而不偏离如所附权利要求限定的本公开的精神和范围。

此外，可以作出各种修改，从而使得特定情形或材料适合于本公开的教导，而不偏离其实质范围。因此，本公开不局限于作为实现本公开所认定的最佳方式公开的具体示例实施方式，本公开包括落入所附权利要求范围内的所有实施方式。

Claims (27)

1.一种皮肤基因卡，包含：

带部分，通过将所述带部分附着于人体并从人体分离而

获得来自人体的组织；和

卡部分，用于保护、存储和运送所述获得的组织。

2.根据权利要求1所述的皮肤基因卡，其中所述带是对人体无害且允许用于医学用途的低粘性纸质绷带。

3.根据权利要求1所述的皮肤基因卡，其中所述卡部分包括选自由纸质卡、载玻片、OHP薄膜、塑料、聚酯、纤维和金属组成的组的材料。

4.根据权利要求3所述的皮肤基因卡，其中所述卡部分包括纸质卡，并且所述纸质卡是通过使用高压釜灭菌，随后浸入分别用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的细胞裂解缓冲液、尿酸和/或壳聚糖中并干燥而制得的。

5.根据权利要求4所述的皮肤基因卡，其中所述纸质卡浸入在浓度为0.02％(w/v)到0.25％(w/v)的水溶性壳聚糖溶液中。

6.根据权利要求1所述的皮肤基因卡，其中所述来自人体的组织是毛发或粘膜，所述毛发或粘膜取自皮肤-粘膜界面，如嘴或肛门周围、或嘴里。

7.一种利用皮肤基因卡获得人体组织的方法，包括：

将根据权利要求1所述的皮肤基因卡的带部分附着于人体取样部分的皮肤上；和

从所述皮肤分离所述带部分。

8.根据权利要求7所述的利用皮肤基因卡获得人体组织的方法，在所述附着之前，进一步包括，使用脱皮凝胶除去取样部分的皮肤上或周围的角质。

9.根据权利要求7所述的利用皮肤基因卡获得人体组织的方法，其中，将附着于人体皮肤的所述带部分在1分钟至12小时之后分离。

10.一种用于从人体组织分离DNA的方法，包括：

使用根据权利要求1所述的皮肤基因卡获得人体组织；和

使用DNA提取方法分离DNA。

11.一种用于从人体组织分离RNA的方法，包括：

使用根据权利要求1所述的皮肤基因卡获得人体组织；和

使用RNA提取方法分离RNA。

12.一种在没有对分离的DNA进一步纯化的情况下使用根据权利要求1所述的皮肤基因卡进行聚合酶链式反应(PCR)的方法。

13.一种在没有对分离的DNA进一步纯化的情况下使用根据权利要求1所述的皮肤基因卡进行逆转录(RT)-PCR的方法。

14.一种利用皮肤基因卡进行身份鉴定的方法，包括

使用根据权利要求1所述的皮肤基因卡获得人体组织并从获得的组织中分离基因组DNA；

对使用分离的基因组DNA选择的展现短串联重复(STR)多态性的基因进行多重PCR；和

鉴定通过PCR扩增的基因信息。

15.一种利用皮肤基因卡进行药物基因组测试的方法，包括：

使用根据权利要求1所述的皮肤基因卡获得人体组织并从获得的组织中分离基因组DNA；

对使用分离的基因组DNA选择的药物代谢相关的基因进行多重PCR；和

鉴定通过PCR扩增的基因信息。

16.一种用于营养基因组测试的试剂盒，包含：

根据权利要求1所述的皮肤基因卡；和

用于基因的多重PCR的正向和反向引物，所述基因选自由肥胖、抗氧化应激、解毒、心血管病、激素代谢、过敏和骨代谢相关的基因组成的组。

17.一种用于诊断疾病的试剂盒，包含

根据权利要求1所述的皮肤基因卡；和

靶向疾病相关的基因的正向和反向引物。

18.根据权利要求17所述的用于诊断疾病的试剂盒，其中所述疾病是皮肤癌且所述基因是黑素瘤抗体。

19.根据权利要求17所述的用于诊断疾病的试剂盒，其中所述疾病是皮肤传染病且所述基因是病原体特异性基因。

20.根据权利要求19所述的用于诊断疾病的试剂盒，其中所述病原体是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

21.根据权利要求17所述的用于诊断疾病的试剂盒，其中所述疾病是性传播疾病且所述基因是病原体特异性基因。

22.根据权利要求21所述的用于诊断疾病的试剂盒，其中所述病原体选自由淋病奈瑟菌(N.gonorrhea)、砂眼披衣菌(C.trachomatis)、生殖支原体(M，genitalum)、人型支原体(M.hominis，)、解脲脲原体(U.urealyticum)、和阴道毛滴虫(T.vaginalis)组成的组。

23.根据权利要求21所述的用于诊断疾病的试剂盒，其中所述病原体选自由杜克雷嗜血杆菌(H.ducreyi)、阴道加德纳菌(G.vaginalis)、梅毒螺旋体(T.pallidum)、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus)、白色念珠菌(Candida albicans)和人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus)(HPV)组成的组。

24.根据权利要求17所述的用于诊断疾病的试剂盒，其中所述病原体是肺结核菌(Tubercle bacillus)特异性基因。

25.一种利用皮肤基因卡的皮肤基因表达测试的方法，包括：

使用根据权利要求1所述的皮肤基因卡获得人体组织并从获得的组织中分离基因组RNA；

对使用分离的基因组RNA选择的皮肤状况和健康相关的基因进行逆转录PCR；和

鉴定通过PCR扩增的基因的表达水平。

26.根据权利要求25所述的皮肤基因表达测试的方法，其中所述基因是选自由基质金属蛋白酶1(MMP1)、原胶原A1、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)、弹性蛋白、弹性蛋白酶、抑弹性酶蛋白、超氧化物岐化酶1(MnSOD、SOD1)、谷胱甘肽S-转移酶、p53、端粒酶、透明质酸合成酶3(HAS3)、水通道蛋白3(AQP3)、丝聚合蛋白原、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1)、内皮素-1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、I-CAM、主要组织相容性复合体2(MHC2)、3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)、脂肪酸合酶、乙酰辅酶A羧化酶、转化生长因子-β1、表皮生长因子(EGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、5-α还原酶和雄激素受体或管家基因组成的组的基因。

27.根据权利要求25所述的皮肤基因表达测试的方法，其中所述基因的表达水平通过实时PCR鉴定。

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