KR101267430B1 - 핵산을 안정적으로 보관하는 새로운 피부 유전자 카드와이를 이용한 유전자 분석방법, 그리고 이의 응용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전자 분석을 위한 새로운 피부 유전자 카드와 이로부터 DNA와 RNA를 분리하고 각종의 유전자분석을 수행하는 방법, 그리고 이를 응용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 피부 유전자 카드 (Skin gene card)는 본 발명자들의 특허제품인 DNA 및 RNA 카드를 응용한 것으로서, 인체의 여러 피부나 모발, 점막으로부터 시료를 간편하게 안전하며 신속하게 얻을 수 있고, 채취된 시료 내에 DNA와 RNA가 실온에서 안정적으로 장기 보존 및 우송 가능하게 한다. 본 피부 유전자 카드에서 DNA와 RNA의 획득이 용이하며, 이렇게 얻은 DNA와 RNA를 가지고 중합효소연쇄반응 (PCR)과 역전사-PCR, 실시간 PCR, PCR-제한단편길이다형성 (RFLP) 분석, 시퀀싱, 혼성화, DNA 칩 분석 등의 다양한 유전자 검사를 모두 수행할 수 있다. 이들 유전자 검사를 통해 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 분석, 유전자 돌연변이, 프로모터 메틸화 검색, 유전자발현 검색 등을 할 수 있다. 이는 질병 예측과 영양유전체학 검사, 약물유전체학 검사, 개인 식별 등 법의학적 검사, 유전질환 진단, 각종 피부 질환의 진단 등에 응용될 수 있으며, 아울러 피부나 모발 상태를 객관적으로 평가함으로써 맞춤식 화장품이나 맞춤식 발모 촉진제를 결정하는 데 도움이 될 수도 있다.

피부 유전자 카드, 유전자검사, 피부상태 검사, 피부질환 진단.

Description

핵산을 안정적으로 보관하는 새로운 피부 유전자 카드와 이를 이용한 유전자 분석방법, 그리고 이의 응용 방법{New Skin Sampling Kit Which Stores Nucleic Acids in Stable Status, Genetic Test Methods by using the kit and Their Practical Application}

도 1은 발명 순서 (flow sheet)를 나타낸다.

도2는 본 발명의 피부 유전자 카드의 한 구체예로서, (3M사의) 인체 사용 종이반창고 테이프와 (굿젠 ㈜의) RNA 카드를 결합시켜 만든 피부 유전자 카드를 나타낸다.

도 3은 피부 유전자 카드에서 DNA를 확보할 수 있는지 확인한 실험결과를 나타낸다 (레인 1: 음성 대조군, 레인 2: 피부 유전자 카드에서 1일 보관 후 채취한 샘플, 레인 3: 피부 유전자 카드에서 3일 보관 후 채취한 샘플, 레인 4: 피부 유전자 카드에서 7일 보관 후 채취한 샘플).

도 4는 피부 유전자 카드에서 채취한 피부세포의 DNA가 실온에서 장기간 보관하였을 때 보관된 DNA가 분해되지 않고 유지되어서 유전자 증폭과 분석이 가능한 가를 PCR분석을 통해 확인한 결과이다 (레인 1: 피부 유전자 카드에서 5일 동안 보관된 샘플, 레인 2: 피부 유전자 카드에서 15일 동안 보관된 샘플, 레인 3: 피부 유전자 카드에서 30일 동안 보관된 샘플).

도 5는 피부 유전자 카드를 이용하여 피부시료를 얻은 후 이로부터 RNA 분리가 가능한지 조사하기 위하여, Intron 사의 EasySpin Kit를 사용하여 RNA를 분리한 결과이다 (레인1: 1 Kbp 사이즈 마커, 레인 2: 1 ㎍의 샘플, 레인 3: 0.5 ug의 샘플).

도 6은 피부 유전자 카드에서 분리한 피부세포의 RNA가 실온에서 장기간 보관하였을 때 보관된 RNA가 분해되지 않고 유지되어서 유전자 증폭과 분석이 가능한지 조사하기 위하여, 키트에 피부채취 후 1일, 1주일, 1개월 후에 얻은 RNA을 이용하여 베타-액틴 유전자를 RT-PCR 한 결과이다 (레인 1: 100 bp DNA 마커, 레인 2: 음성대조군, 레인 3: 1일 된 샘플, 레인 4: 1주일 된 샘플, 레인 5: 1개월 된 샘플)

도 7는 모근이 붙은 상태의 모발을 피부 유전자 카드에 붙여 채취한 후, 키트로부터 DNA를 분리할 수 있는지 확인한 결과이다 (레인 1: 40 Kbp T7 DNA, 레인 2: 1일 보관된 샘플, 레인 3: 1개월 보관된 샘플, 레인 4: 1년 보관된 샘플).

도 8은 모근이 붙은 상태의 모발을 피부 유전자 카드에 붙여 채취한 후, 카드로부터 RNA를 분리할 수 있는지 확인한 결과이다 (레인 1: RNA 마커, 레인 2: 1일 보관된 샘플, 레인 3: 1개월 보관된 샘플, 레인 4: 1년 보관된 샘플).

도 9는 피부 유전자 카드에서 DNA 분리과정 없이 바로 특정유전자의 PCR이 가능한지 조사한 경과이다 (레인 M: 100 bp 마커, 레인 1: 음성대조군, 레인 2: 양성대조군 (HaCaT cell line 사용), 레인 3: 정상 성인의 피부 샘플).

도 10은 피부 유전자 카드에서 RNA 분리과정 없이 바로 특정유전자의 PCR이 가능한지 조사한 경과이다 (레인 M: 100 bp 마커, 레인 1: 양성대조군 (HaCaT cell line 사용), 레인 2: 정상 성인의 피부 샘플).

도 11은 피부 유전자 카드에서 RNA 분리 후 이를 이용하여 실시간 PCR을 수행할 수 있는지 조사한 결과이다 (레인2: 300 ng에 대한 베타-액틴, 레인 3: 2000 ng에 대한 베타-액틴, 레인 4: 30,000 ng에 대한 베타-액틴, 레인 M: 100 bp DNA 마커, 레인 5: MMP1 유전자에 대한 샘플, 레인 6: COL1A1유전자에 대한 샘플, 레인 7: Elastin 유전자에 대한 샘플, 레인 8: Elastase 유전자에 대한 샘플, 레인 9: 메탈로프로티나제의 조직 저해제 유전자에 대한 샘플, 레인 10: Elafin 유전자에 대한 샘플).

도 12는 피부 유전자 카드에서 확보한 유전자를 클로닝 하기 위해 먼저 유전자를 증폭시킨 결과이다 (레인 1: 100 bp DNA 마커, 레인 2: MMP1 유전자 산물).

도 13은 PCR을 통해 증폭된 유전자를 클로닝 하기 위해 사용한 벡터의 Map이다.

도 14는 MMP1 유전자를 pGEM-T Easy vector에 클로닝 한 후, 유전자의 클로닝 여부를 확인하기 위하여 시퀀싱한 결과이다.

도 15는 피부 유전자 카드를 이용하여 피부 게놈의 DNA를 추출 하여 심혈관 질환 관련 유전자들의 SNP를 분석 하기 위해 PCR 한 후 그 산물을 1.5% 아가로스 겔에 전기영동 한 사진이다. 레인 1 및 13 은 100bp DNA 사이즈 마커이며, 레인 2 및 3 은 eNOS 유전자 이며, 레인 4 및 5 는 MTHFR 유전자 이며, 레인 6 및 7은 AGT 유전자이며, 레인 8은 ACE 유전자이며, 레인 9 및 10은 AT1R 유전자 이며, 레인 11 및 12는 ApoE 유전자 이다.

도 16은 피부 유전자 카드를 이용하여 피부 게놈의 DNA를 추출하여 심혈관 질환 관련 유전자들의 SNP를 분석하기 위해 PCR 한 후 그 산물을 표 3에 언급된 제한 효소로 처리 한 후 1.5% 아가로스젤에 전기영동 한 사진이다. 레인 1,12 및 13 은 100bp DNA 사이즈 마커이며, 레인 2 및 3 은 eNOS 유전자 이며, 레인 4 및 5 는 AGT 유전자 이며, 레인 6 및 7은 ACE 유전자이며, 레인 8은 AT1R 유전자이며, 레인 9 및 10은 ApoE 유전자 이며, 레인 11 및 14은 MTHFR 유전자 이다.

도 17은 피부 유전자 카드를 이용하여 피부 게놈의 DNA를 추출하여 암발병에 중요한 역할을 하는 p53 종양억제유전자를 PCR 한 후 그 산물을 1.5% 아가로스 겔에 전기영동 한 사진이다. 레인 1 은 100bp DNA 사이즈 마커 이며, 레인 2 는 음성 대조군 이며, 레인 3 은 positive control 이며, 레인 4 및 6은 카드샘플이다.

도 18은 도 17 에서 언급된 PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔에 전기영동 한 후 그 산물을 분리 정제 한 후 p53 종양억제유전자의 돌연변이(175 C->A)를 ABI 3130 sequencer를 이용 하여 염기서열을 분석한 사진이다.

도 19는 피부 유전자 카드를 이용하여 피부의 편평상피암의 피부 검체를 채취 및 보관하였다가 그 RNA시료를 대상으로 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이방법을 이용하여 유전자 형 (genotyping)의 검사 결과이다. 본사의 CanScan DNA Chip을 사용하여, 편평상피암 환자의 p53 유전자의 돌연변이 (Exon 7의 codon 282 CGG가 TGG로 바뀌는 것을 chip 분석 결과 확인할 수 있었다.

도 20은 피부 유전자 카드에서 얻은 RNA를 이용하여 특정 유전자의 발현을 확인하는 Northern blotting 실험에 대한 결과이다 (레인 M: RNA 마커, 레인 1: 정상 성인의 샘플 1, 레인 2: 정상 성인의 샘플 2, 레인 3: 정상 성인의 샘플 3, 레인 4: 정상 성인의 샘플 4).

도 21는 DNA는 CpG dinucleotide의 cytosine 잔기의 5' 부분에서만 methylation이 일어나는데, 이에 대한 모식도이다.

도 22는 피부 유전자 카드에서 얻은 DNA에서 특정 유전자의 methylation 유무를 검사한 결과이다 (레인 1: 100 bp DNA 마커, 레인 2: 음성 대조군, 레인 3: 피부 유전자 채취 키트에서 얻은 샘플).

도 23은 피부 유전자 카드에서 피부유전자를 채취하여 분리한 DNA 시료를 사용하여 유전자의 특정 부위의 C 염기가 methylation 되어 있는지를 확인 하기 위한 chemical modification procedure 사진이다. 즉 DNA 시료에 sodium bisulfite를 처리 하면 염기서열의 CpG island 의 unmethylation 된 Cytosine 염기가 Uracil(thymine) 염기로 치환 된다.

도 24는 도 23에서 sodium bisulfite 처리된 DNA 시료를 이용 하여 MYOD 유전자를 PCR 한 후 그 산물을 1.5% 아가로스 겔에 전기영동 한 사진이다. 레인1은 100bp DNA 사이즈 마커 이며, 레인2는 MYOD 유전자 PCR 산물이다.

도 25는 도 23에서의 DNA가 중아황산나트륨 의해 정확하게 처리되었는지를 보기 위해 도 24에서의 MYOD PCR 산물을 ABI 3130 sequencer를 이용 하여 염기서열을 분석한 사진이다. 화살표에서 보이는 것처럼 CpG island 의 unmethylation 된 Cytosine 염기가 Uracil, 즉 thymine 염기로 치환 되었다.

도 26은 피부 유전자 카드를 이용하여 피부 게놈의 DNA를 추출하여 개인식별 (친자확인) 검사를 수행하기 위해 AmpFlSTR Profiler Plus PCR 증폭 Kit (Applied Biosystems사)를 사용 하여 총 9가지의 STR(D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D18S51, D21S11, FGA, 및 vWA) 좌위를 멀티플렉스-PCR 한 후 1.5% 아가로스 겔에 전기영동 한 사진이다. 레인1 은 500bp DNA 사이즈 마커 이며, 레인 2 및 4 는 카드샘플이며, 레인 5 는 음성 대조군 이며, 레인 6 은 100bp DNA 사이즈 마커 이다.

도 27은 피부 유전자 카드를 이용하여 피부 게놈의 DNA를 추출 하여 개인식별 (친자확인) 검사를 수행 하기 위해 2가지의 VNTR(D1S80, D17S30) 좌위를 PCR 한 후 1.5% 아가로스 겔에 전기영동 한 사진이다. 레인 1~5: D1S80, 레인 1 은 100bp DNA 사이즈 마커 이며, 레인 2 및 4 는 카드샘플이며, 레인 5는 음성 대조군이며, 레인 6~10: D17S30, 레인 6 은 100bp DNA 사이즈 마커 이며, 레인 7, 8 및 9 는 카드샘플이며, 레인 10은 음성 대조군 이다.

도 28는 피부 유전자 카드를 이용하여 피부 게놈의 DNA를 추출하고 도 26 과 27 에서 수행한 PCR 산물을 ABI 3130 Genetic analyzer (Applied Biosystems사)를 통해서 분석하고, GeneMapper ID Program (Human Identification Detecton, Applied Biosystems 사) 을 이용하여 분석 한 사진이다. A는 STR 마커 D3S1358 Internal control 사이즈 마커 이며, B 및 C 는 카드샘플의 STR 마커 D3S1358 의 PCR 산물의 크기측정 표준이다.

도 29는 피부 유전자 카드를 이용하여 피부 게놈의 DNA를 추출하여 약물유전 학적 검사를 수행하기 위해 대표적인 약물분해 유전자인 CYP2D6 를 PCR 한 후 PCR-RFLP 방법과 sequencing 방법을 이용하여 총 32개의 샘플에서의 CYP2D6 다형성을 조사 한 사진 이다.

도 30은 도 29에서 확인된 결과를 토대로 CYP2D6 의 대립 유전자의 빈도를 계산 한 사진이다.

도 31은 피부 유전자 카드를 이용하여 피부 게놈의 DNA를 추출하여 영양유전학적 검사를 수행 하기 위해 대표적 유전자들을 단독 및 멀티플렉스로 PCR 한 후 1.5% 아가로스 겔에 전기영동 한 사진이다. 단독 PCR은 TNF-a 유전자를 사용 하였고 레인 M은 100 bp DNA 사이즈 마커 이며, 레인 9 및 10 은 카드샘플이며, 레인 기존은 혈액에서 추출한 DNA 이다. 멀티플렉스-PCR 은 COMT, CYP1A1-1, CYP1B1, IL-6, VDR 총 5가지 유전자를 사용하였고 레인 M은 100bp DNA 사이즈 마커 이며, 레인 9 및 10 은 카드샘플이며, 레인 기존은 혈액에서 추출한 DNA 이다.

도 32는 도 31에서 언급한 TNF-a 유전자의 PCR 산물이 위양성 (false positive)이 아님을 확인하기 위해 PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔에 전기영동 한 후 그 산물을 분리 정제하고 ABI 3130 sequencer를 이용 하여 염기서열을 분석한 사진이다.

도 33은 피부 유전자 카드를 이용하여 피부 게놈의 DNA를 추출하여 도 31에서 언급한 것처럼 멀티플렉스-PCR 을 수행 하고 각각의 유전자의 SNP를 확인하기 위해 SNaPshot Multiplex Kit (Applied Biosystems 사)를 이용하여 처리 한 후 ABI 3130 Genetic analyzer (GeneMapper Program) 를 이용 하여 확인하였다.

도 34는 피부 유전자 카드로부터 얻어진 지노믹 DNA를 사용하여, 영양 유전체 (Nutrogenomic)에 관계하는 18개 유전자 (비만, 항산화 스트레스, 독소제거, 심혈관 질환, 호르몬 대사, 알러지 및 골대사에 관여하는 유전자)를 멀티플랙스 방법으로 증폭한 후, 본사의 AW (Anti-aging 및 Well being) chip을 이용하여 분석한 이미지 결과이다. 본 이미지 분석결과, 본 검체는 호르몬 대사관련 유전자인 CYP1A1 유전자의 -3826 A 가 G로 바뀌어 있음을 알 수 있었다.

도 35는 피부 유전자 카드를 이용하여 피부 게놈의 DNA를 추출 하여 선천성 유전병의 원인 유전자중 하나인 APC를 PCR 한 후 그 산물을 1.5% 아가로스 겔에 전기영동 한 사진이다. 레인 1 은 100bp DNA 마커 이며, 레인 2 는 카드 샘플에서의 APC PCR 산물이다.

도 36는 도 35 에서 언급된 APC PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔에 전기영동한 후 그 산물을 분리 정제한 후 APC 유전자의 돌연변이(1493 G->A)를 ABI 3130 sequencer를 이용하여 염기서열을 분석한 사진이다.

도 37는 앞의 실시 예 5의 방법대로 피부 유전자 카드를 이용하여 피부시료를 얻은 후 이로부터 cDNA를 합성한 후 피부암관련 유전자인 MAGE에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하고 그 산물을 1.5% 아가로스 겔에 전기영동 한 사진이다. 레인 1 및 9 는 100bp DNA 마커 이며, 레인 2 및 3 은 음성 대조군이며, 레인 4 는 양성 대조군이며, 레인 5 및 8 은 키트샘플이다.

도 38는 피부 유전자 카드에서 DNA를 분리하여. 본사의 Staphylococcus aureus PCR kit를 이용하여 Staphylococcus감염질환의 유무를 분석한 결과이다. 얻 어진 PCR product를 자동염기서열 분석기로 분석한 결과, Staphylococcus aureus가 감염되었음을 알 수 있었다.

도 39는 피부 유전자 카드를 이용하여 얻어진 검체 (홍문주위)로 부터 DNA를 분리하여 본사의 12 STD Multiplex PCR kit를 이용하여 성전파성 질환의 유무를 분석한 결과이다. 검사 결과, HPV 가 감염되었음을 알 수 있었다. 레인 1: 100bp사이즈 마커, 레인 2: 검체의 PCR 산물, 레인 3: STD B set 양성 대조군

도 40는 실시예 26의 피부 유전자 카드를 이용하여 얻어진 검체 (홍문주위)로 부터 HPV 양성 PCR product를 이용하여, 본사의 GG HPV Genotyping Chip을 사용하여 HPV를 분석한 이미지 결과이다. 그 결과 본 검체는 HPV type 11로 저위험군에 감염되었음을 알게 되었다.

도 41는 피부 유전자 카드로부터 채취된 사마귀 모양의 반흥이 있는 피부검체로부터 얻어진 DNA로 Mycobacterium tuberculosis conventional 한 방법으로 nested PCR 을 수행 한 결과이다. 레인 1: 100bp DNA 사이즈 마커, 레인 2: 음성대조군, 레인 3: 양성대조군, 레인 4: 환자의 검체로부터 얻어진 PCR product.

도 42 는 피부 유전자 카드에서 얻은 시료를 실시간 PCR을 이용하여 피부 상태와 건강에 관여하는 유전자중 하나인 MMP1을 검사한 결과이다.

도 43 는 피부 유전자 카드에서 얻은 시료를 실시간 PCR을 이용하여 피부 상태와 건강에 관여하는 유전자중 하나인 AQP3를 검사한 결과이다.

도 44 는 피부 유전자 카드에서 얻은 시료를 실시간 PCR을 이용하여 피부 상태와 건강에 관여하는 유전자중 하나인 Has3를 검사한 결과이다.

도 45 는 피부 유전자 카드에서 얻은 시료를 실시간 PCR을 이용하여 피부 상태와 건강에 관여하는 유전자중 하나인 Thyrosinase를 검사한 결과이다.

도 46 는 피부 유전자 카드에서 얻은 시료를 실시간 PCR을 이용하여 피부 상태와 건강에 관여하는 유전자중 하나인 TRP1을 검사한 결과이다.

도 47 는 MMP1 유전자의 발현 양상을 연령 별로 Data Base화한 것이다.

(기술분야)

본 발명은 유전자 분석을 위한 새로운 피부 유전자 카드와 여기에서 DNA와 RNA를 획득하고 각종의 유전자분석을 시행하는 방법, 그리고 이를 응용하는 방법에 대한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명의 발명자들은 인체의 여러 피부나 모발, 점막으로부터 시료를 간편하게 안전하며 신속하게 얻을 수 있고, 채취된 시료 내에 DNA와 RNA가 실온에서 안정적으로 장기 보존 및 우송 가능하게 하는 피부 유전자 카드 (피부 유전자 카드)를 개발하였으며, 이로부터 DNA와 RNA를 얻고. 이렇게 얻은 DNA와 RNA를 이용하여 중합효소연쇄반응 (PCR)과 역전사-PCR, 실시간 PCR, 시퀀싱, 혼성화, DNA 칩 분석 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 분석, 유전자 돌연변이, 프로모터 메틸화 검색, 유전자발현 검색 등의 다양한 유전자 검사를 모두 수행할 수 있다. 아울러 이들 피부유전자검사를 질병 예측과 영양유전체학 검사, 약물유전체학 검사, 개인 식별 등 법의학적 검사, 유전질환 진단, 각종 피부 질환의 진단 등에 응용하며, 피부나 모발 상태를 객관적으로 평가함으로써 맞춤식 화장품과 피부관리를 하는 시스템을 수립하여 미용과 화장품학, 피부과학 등 임상진료에 실질적으로 이용한다.

(종래기술)

인체를 포함한 다세포생물은 수많은 세포로 이루어져 있으며, 세포 중심의 핵에는 유전정보를 보관하는 DNA가 존재한다. 유전정보의 단위를 유전자(gene)라고 하며, 이는 DNA로 구성되어 있다. 세포의 모든 생명현상과 기능은 단백질에 의해 이루어지며, 유전자는 단백질을 만들기 위한 명령체계를 지시 전달하는 광대한 정보단위이다. 하나의 유전자는 하나 또는 다수의 특정 단백질을 만드는데 필요한 특수한 암호코드를 가지고 있다.

DNA의 모양은 이중 나선구조를 이루고 있고, 각각의 나선가닥에는 염기(base)라고 불리는 수많은 화학구조단위로 구성되어 있다. DNA의 염기에는 아데닌(A), 사이토신(C), 구아닌(G), 타이민(T)의 4가지 종류가 있는데, 이 염기의 배열된 순서, 또는 염기서열(base sequence)이 곧 그 유전정보를 결정한다. DNA의 유전정보가 세포질 내에서 단백질 생산으로 나타나기 위해서는 중간 매개물질이 필요하며, 이를 RNA라고 한다. DNA의 유전정보는 일차 mRNA로 바뀌며, 이를 전사(transcription)과정이라고 한다. mRNA의 유전정보는 세포질의 리보솜에서 tRNA와 rRNA의 도움 하에 단백질로 해석(translation)된다. 3개의 염기가 하나의 아미노산을 지정하며, 이러한 3개 염기의 단위를 코돈(codon)이라고 한다. 리보솜에서 1차 생산된 단백질은 해석-후 변형(post-translational modification)을 거쳐 최종 적인 활성 단백질로 만들어진다. 세포가 분열될 때 DNA는 똑같이 복제(replication)되어 자손 세포에 전달된다. 한 인간에서 모든 세포의 DNA는 모두 동일하다. 생체 내 모든 세포의 형태, 구조, 기능, 건강 상태 및 발병 여부는 세포에서 발현(expression)되는 단백질의 종류와 양에 따라 결정되며, 이는 다시 어떤 유전자의 RNA가 어느 정도 전사(transcription)되느냐에 의해 결정된다. 즉, 개개 세포마다 발현되는 유전자의 종류와 양이 서로 다르기 때문에 차이가 생기는 것이며, 실제 각 세포 별로 발현되는 유전자의 백분율은 3～5%에 지나지 않는다 (Aressns J, Armstrong M, Gilissen R, Cohen N. The human genome: an introduction. Oncologist. 2001;6:100-109).

한 생물체가 가지고 있는 모든 유전자의 총체를 유전체 또는 게놈(genome)이라고 한다. 이에 대해 한 개체에서 전사되는 유전자(즉 mRNA)의 총체를 전사체 (transcriptome)라고 하고 발현되는 단백질의 총체를 단백질체 (proteome)라고 한다. 인간 게놈은 30억 개의 염기로 이루어지며, 약 3만개의 유전자가 존재하는 것으로 보고되고 있다. 최근 인간 게놈 전체의 염기서열을 판독하는 인간게놈프로젝트가 완성되어 유전자를 이용한 난치성 질환의 진단과 치료에 획기적인 발전이 이루어지고 있으며, 소위 맞춤의학, 예측의학의 시대가 열리고 있다.

생명현상은 (1)게놈 DNA의 유전정보, (2)유전자의 전사, (3)발현되는 단백질의 3가지에 의해 결정된다. 최근 이들의 정보를 총체적으로 자동 분석하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이를 위해 특히 마이크로어레이 또는 바이오 칩(biochip)이 도움이 된다. 피부의 경우에도 유전자연구가 최근 활발하게 시도되고 있다. 예컨대 cDNA 마이크로어레이등의 방법을 피부의 생리와 병리, 기능 등의 연구에 이용하려는 시도가 이루어지고 있으며, PCR 등의 방법을 이용하여 피부 감염의 유무와 원인균을 진단하는 데 사용하기도 한다. 유전자검사를 통해 피부의 상태를 정확히 평가하고 피부질환을 더 상세하게 이해하고 진단할 수 있을 것이라는 인식은 있으나, 실지 응용이나 뚜렷한 성과는 보기 드문 상태이다. 피부유전자검사를 맞춤식 피부 치료나 미용 및 화장에도 응용할 수 있을 것으로 보이나 이에 대한 보고도 찾기 힘들다. (Fuller BR et al. Gene array technology and the search for cosmeceutical actives. In In: Cosmoceuticals. Edited by Draelos ZD. Elsevier Saunders, 2005). 피부유전자검사를 실용화하기 위해서는 해결되어야 할 수많은 문제가 남아있다. 특히 피부의 검체를 어떻게 비침해적으로 적절하게 채취하며, 어떻게 그 유전자를 분석하며, 그 결과를 피부질환 진단과 미용상태 평가, 그리고 맞춤식 피부관리에 실제 응용하느냐에 대한 구체적인 연구가 필수적이다. 본 발명은 이를 해결하려는 데 주목적이 있다.

DNA나 RNA시료를 이용한 유전자 연구에 있어서 가장 큰 문제점 중 하나는 이들 핵산이 실온에 두면 급속하게 분해된다는 것이다. 특히 RNA의 경우 분리 과정 중 파괴된 세포로부터 분비되며 환경에서 다량으로 존재하는 리보뉴클레아제 (Ribonuclease, RNase A) 에 의해 대부분이 수시간 내에 급속하게 분해되는 문제점이 있다. 이에 본 발명자들은 키토산을 이용하여 카드나 액체 형태로 RNA와 DNA를 실온에서 안정적으로 장기간 보관이 가능하고 유전자 발현 분석에도 간편하게 사용할 수 있는 방법을 개발하여 특허를 취득하거나 출원중인 상태이다. 아울러 이를 응용한 RNA와 DNA 카드, PCR 및RT-PCR 키트 및 마이크로어레이 용 칩은 다수의 DNA와 RNA 샘플을 보관하고 운반하며 분석하는데 이용되고 있다. 본 발명에서는 이러한 RNA카드를 피부 유전자 검사 키트 개발에 응용하였다.

피부는 성인에서 평균 면적이 1.6m2, 중량은 체중의 평균 16%를 차지하는 가장 큰 기관으로 구조와 기능, 해부 및 생리학적으로 매우 복잡하다. 최근 분자유전학과 단백질체학의 발달에 따라 피부의 구조와 기능, 생리, 노화, 질병 발생의 메커니즘에 대해 많은 새로운 사실들이 밝혀지고 있다.

피부는 외부의 자극이나 위험으로부터 신체를 보호하고 체온 조절 등 주위의 변화에 순응하는 역할을 한다. 그 외에도 피부는 감각, 분비, 배설, Vitamin D 등의 호르몬과 사이토카인 (cytokine)을 생산하는 내분비 기능 및 면역기능, 재생 등의 기능이 있으며, 미용에 있어서는 결정적 역할을 한다.

피부는 바깥 층에서부터 크게 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하조직(subcutaneous tissue)의 독특한 3개 층으로 나누어지고, 부속기관으로 모발(hair), 피지선(sebaceous gland), 땀샘(sweat gland, 에크린선), 모세혈관 등으로 구성되어 있다.

표피는 피부 3개 층 중 가장 얇은 층이나 피부의 보습 및 보호를 담당하는 중요한 기능을 하며, 또한 조직의 수분 소실과 손상을 방어하고 세균 침입도 방지한다. 표피는 주로 각질형성세포 (keratinocyte)로 이루어져 있으며, 그 외에 멜라닌형성 세포 (melanocyte), 랑게르한스 세포 (Langerhan's cell), 머켈세포 (Merkel cell)가 존재한다. 각질형성세포는 기저층에서부터 위로 올라가면서 분화 하여 가장 바깥의 각질층을 형성하며, 피부표면에서는 노화된 각질세포가 계속 떨어져 나간다. 각질층은 피부를 방어하는 첫번째의 장벽이 된다. 멜라닌세포는 긴 수지상돌기를 가지고 각질형성세포사이로 뻗어 있으며, 각질형성세포로 전달된 멜라닌은 자외선을 흡수 내지 산란시켜서 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 막아준다.

피부는 기능적으로 볼 때 외계의 해로운 물질이나 자극으로부터 보호하는 장벽이라고 볼 수 있으며, 이러한 피부장벽의 메커니즘과 생리 및 병리를 정확하게 이해하는 것이 무엇보다도 중요하다. 피부 장벽 중 가장 중요한 것은 표피의 각질층이다. 각질 층은 구조적으로 볼 때 각질세포 (corneocyte)와 지질구조로 이루어 진다. 각질 층의 성분은 단백 40%, 수분 40%, 지질 10-20%로 나타난다. 피부장벽을 벽돌담에 견주어 볼 때 각질세포는 벽돌, 그리고 지질구조는 회반죽 역할을 한다.

피부의 습도유지는 건강한 피부를 유지하는 기본 조건이며, 각질층에 의해 1차적으로 이루어 진다. 각질층은 (1) 각질세포가 생산하는 천연보습인자 (natural moisturizing factor, NMF), (2) 각질세포사이에 존재하는 지질층, (3) 교소체 (desmoasome), 그리고 (4) 피지선으로부터 분비되는 피지 등에 의해 수분을 유지한다. 표피지질의 주성분은 ceramide와 콜레스테롤, 자유지방산 (free fatty acid)으로 이루어 진다.

진피는 그 두께가 표피의 15-40배로 피부의 대부분을 이루며 유두진피 (papillary dermis)와 망상진피 (reticular dermis)의 2층으로 이루어져 있다. 진피는 세포들과 결체조직, 세포간 기질 (extracelluar matrix)로 이루어져 있다. 세 포로는 섬유모세포와 조직구, 비만세포, 랑거한스세포, 림프구, 형질세포를 포함한 세포들이 존재한다. 아울러 혈관과 림프관, 신경, 기모근과 에크린선, 아포크린 한선, 한관, 모피지 단위, 조갑 (nail) 등의 피부부속기 (skin appendage)가 존재한다. 진피는 표피에 영양분을 공급하며 표피를 지지하고, 피부의 손상으로부터 신체를 보호하며 표피와 상호작용하여 피부를 재생시키고, 수분을 저장하고 체온을 조절하며 감각에 대한 수용체역할을 한다.

진피의 결체조직은 교원섬유와 탄력섬유, 세망섬유 등 섬유가 풍부한 것이 특징이며, 그 주성분은 콜라겐 (collagen)와 엘라스틴 (elastin) 이고, 특히 콜라겐이 가장 많다. 피부에는 1형과 3형, 4, 7, 8형의 5가지 형의 콜라겐이 존재하며, 1형이 80-85%로 가장 많다. 콜라겐과 엘라스틴은 표피 아래에 있는 섬유성 결체조직을 형성하여 표피를 지지하여 탄력성과 유연성을 제공한다. 콜라겐을 분해하는 효소가 존재하며, 그 중 가장 중요한 것이 matrix metalloproteinase type 1(MMP1, collagenase 1)이다. 조직 내에는 MMP1을 억제하는 물질도 존재하며 이를 tissue inhibitior of metalloproteinase (TIMP)라고 한다. 피부 내 콜라겐의 양은 콜라겐 합성효소와 MMP및 TIMP에 의해 일정하게 유지된다. 그러나 피부 내 콜라겐의 합성 저하나 MMP1의 과도 작용, TIMP 감소 등으로 인해 균형이 깨져서 피부의 콜라겐이 감소될 때 피부탄력이 없어지고 주름이 발생한다. 이는 자연의 노화 현상이며, 아울러 자외선이나 염증, 슈퍼옥시드기 (superixide) 등의 나쁜 인자도 MMP1을 촉진하고, 그 결과 피부노화를 앞당기며 주름을 악화시킨다.

진피의 기질은 점단백다당 (mucoplysaccharide)인 glycosaminoglycan으로 이루어져 있으며, 그 주성분은 히라루론산 (hyaluronic acid)와 콘드로이틴 설페이트 (chorndrotin sulfate)이고, 일부 헤파란설페이트 (heparan sulfate)도 포함되어 있다. 이들은 매우 강력한 수분 보존기능을 가진다. 피부에는 여러가지 유형의 히라루론산 합성효소 (hyaluronan synthase, HAS)가 존재하며, 그 중 표피 각질세포에는 제 3형의 HAS가, 그리고 진피 섬유모세포에는 2형의 HAS가 존재한다. 최근 피부에 물경로 단백 (water channel protein)인 aquaporin(AQP)의 3번 째 형 (AQP3)이 발현됨이 발견되었으며, 이들이 피부 수분조절에 중요한 역할을 가능성도 제기되고 있다.

피하조직은 피하지방층이라고 하며 지방조직으로 되어 있으며, 표피 및 진피로의 영양공급, 체형결정, 체온유지 등의 역할을 맡고 있으며 몸의 열 절연체로써 작용한다. 진피 밑에 있으며 혈관, 림프관, 신경, 지방세포로 구성되며 압박에 잘 견딜 수 있도록 쿠션 역할을 한다.

인체 피부의 유형은 피지와 수분의 함유량에 따라 (1) 정상형, (2) 지성(oily type), (3) 건성 (dry skin), (4) 혼합형 (mixed type)의 4가지로 분류되는 것이 보통이다. 여기에 5번째로 민감성(sensitive) 피부가 추가되는 추세이며, 노화의 정도를 추가로 평가한다. 그러나 연령과 성별, 호르몬 상태, 영양상태, 생활 습관, 환경 등의 다양한 요소에 의해 영향을 받으므로 피부의 유형은 항상 변할 수 있다. 이러한 피부 유형의 분류는 적절한 피부 관리와 화장품의 선택에 있어서 매우 중요하다.

피부와 관련하여 가장 중요한 것 중 하나가 피부 미용과 화장품이다. 화장품 (cosmetics)의 정의는 국가 별로 다소 차이가 있으나 국내나 일본의 경우 인체를 청결 또는 미화하고 피부 또는 모발을 건강하게 유지하기 위해서 도찰, 살포, 기타 유사한 방법으로 사용되는 물품으로서 인체에 대한 작용이 경미한 것을 가리킨다. 이에 대해 미국의 경우 인체의 구조, 기능의 변화 없이 청결 또는 아름답게 하고 매력을 촉진하여 외모를 변형시키기 위해 인체에 적용되는 물품을 가리키고, 유럽의 경우 치아나 구강점막도 그 영역에 포함시키고 있다. 이에 대해 약리적인 영향을 나타내거나 인체의 구조, 기능에 변화를 주는 것은 약물로 분류가 된다. 다만 최근에는 이 양자 사이에 어디에 속하는 화장품으로서 인체 피부의 구조나 기능에 영향을 미치는 것들이 다수 나오고 있는 바 이들을 미용약품 (cosmecuticals)이라고 한다 (안 성구, 이 승현. 피부미학. 고려의학. 2002년; Cosmoceuticals. Edited by Draelos ZD. Elsevier Saunders, 2005).

화장품은 기본적으로 안정적이어야 하고, 안전해야 하며, 유용해야 하고 사용성이 뛰어나야 하는 4가지 조건을 가진다. 여기에서 유용성은 물리화학과 생리, 심리학적 측면에서 효과를 가리키며, 예컨대 보습, 주름방지, 노화억제, 미백, 유연, 색체, 청결 효과를 가리킨다. 개인마다 피부의 형과 상태는 모두 틀리므로 개인 별로 적합한 화장품을 선택하는 것이 중요하다. 아울러 사용 전후에 비교하여 그 효과를 정확하고 객관적으로 평가할 수 있는 기준을 세우는 것이 중요하다 (안 성구, 이 승현. 피부미학. 고려의학. 2002년).

인체 피부의 상태를 평가하며, 화장품이나 미용약품을 투여한 후 그 효과를 판정하는 데 도움이 되는 검사로는 크게 (1) 형태학적 검사법 (imaging study)들과 (2) 피부의 색을 분석하는 방법들, (3) 피부의 단단함과 탄력성을 검사하는 방법들, (4) 피부 온도 및 혈류 검사법들, (5) 표피를 통한 수분소실(transepidermal water loss, TEWL)의 정도를 검사하는 방법들, (6) 피부 보습(hydration) 정도를 검사하는 방법들, (7) 지질성분조성 평가방법, (8) 자외선차단효과 측정법들, (9) 모발의 수분, 손상 평가 방법들, (10) 초음파 등의 7가지 종류가 있다 (안 성구, 이 승현. 피부미학. 고려의학. 2002년; Grove GL et al. Evaluating cosmeceutical efficiency. In: Cosmoceuticals. Edited by Draelos ZD. Elsevier Saunders, 2005).

그러나 이들 대부분의 검사는 피부의 구조나 형태, 기능, 생리 및 병리의 어느 한가지 부분들만 집중적으로 조사하므로 주관적이어서 객관적이지 못하며, 재현성이 부족하여 실제 응용에 한계가 있다. 따라서 인체 피부의 상태를 정확하고 객관적으로 평가하며, 분류에 도움이 되고, 개인별로 적절한 화장품이나 미용약물을 맞춤식으로 선택하고, 투여 후 그 효과를 판정하는 데 도움이 되는 새로운 검사가 필요하다. 본 발명의 한 목적도 여기에 있다.

오늘날 화장품은 인체를 아름답게 하고 청결하게 하며 피부나 모발을 건강하게 유지하기 위한 기존의 화장품의 개념에서 나아가 이제는 적극적으로 피부를 변화, 개선시킬 수 있는 기능성 화장품으로 바뀌고 있으며, 화장품과 약물의 기능을 혼용하는 미용약물 (cosmeceuticals)이 주류가 되어가는 경향이다. 화장품산업은 화학과 생물학, 약학, 피부과학의 기초기술과 응용기술이 복합되는 종합산업이다. 여기에 최근에는 분자유전학이 도입되어 피부의 생리활성과 분자병리를 더 정확하 게 이해하며, 개개인의 피부에 맞는 맞춤식의 피부관리와 화장품, 미용약물을 개발하려는 시도가 이루어 지고 있다.

피부에는 다양한 질환이 발생하며, 다양한 증상 (symptom)과 징후 (sign)를 나타낸다. 피부에 나타나는 질환으로는 유전성질환, 신경피부질환, 광손상, 물리적 인자에 의한 피부질환, 직업성 피부질환, 두드러기 (urticaria )와 홍반(erythema) 및 약진 (drug erution), 습진 (eczema), 건선 (psoriasis), 면역이상 질환, 감염, 성인성질환 (sexually transmitted diseases), 색소이상증, 혈관질환, 결합조직질환 (connective tissue disorders), 피하지방질환, 피지선 및 한선의 질환, 모발질환, 조갑 (nail)의 질환, 양성 및 악성종양과 전암병변 (precancerous lesion), 점막질환 등이 있으며, 내분비질환이나 대사 이상 등 전신질환에 의해 피부질환이 나타나는 경우도 적지 않다. 감염도 원인균이 박테리아, 결핵균, 진균 (fungus), 바이러스, 기생충 등 다양하며, 성감염도 중요한 피부질환이다.

피부에 나타나는 증상으로는 소양감 (itching, pruritus)과 작열감, 얼얼힌 감각, 동통, 지각감퇴, 무감각증 등이 있다. 피부의 징후에는 크게 초기 병변인 원발진 (primary lesion)과 원발진이 진행되어서 오는 속발진 (secondary lesion)이 있다. 원발진에는 반점 (macule), 반 (patch), 구진 (papule), 판 (plaque), 결절 (nodule), 종양 (tumor), 팽진, 소수포 (vesicle) 등이 있으며, 속발진으로는 인설 (scale). 가피 (crust), 찰상 (excoriation), 미란 (erosion), 궤양 (ulcer), 반흔 (scar), 균열 (fissure), 태선화 (Lichenification)이 있다.

피부는 직접 들여다 볼 수 있어서 진단이 쉬울 것으로 보인다. 그러나 피부에 발생하는 다양한 질환은 서로 유사한 증상과 징후를 보일 수 있으며, 동일한 환자에서 동일한 질환도 시기에 따라 변화하여 다른 양상을 보일 수 있다. 따라서 주관적 증상의 문진이나 징후의 이학적 검사만으로는 진단이 어려운 경우가 많고, 전문의들의 경우에도 감별진단에 어려움을 겪는 경우가 많다. 피부질환 진단을 위한 검사로는 피부 세균 감염의 검사인 그람염색과 배양검사, 진균 감염에 대한 검사인 KOH 염색과 배양, 단숨 및 대상 포진(herpes simplex and herpes zoster)의 검사인 쟁크검사 (Tzanck test), 옴의 검사인 옴소파 (Scabies scraping), 매독 (syphilis)에 대한 암시야검사 (dark field examination), 첩포시험 (patch test), 피부를 주사 (injection)나 단자 (prick), 소파 (scratch) 등으로 자극하여 반응을 보는 검사, 피부묘기증 (dermographism), 압시경 검사 (diascopicexamination), 우드경 검사 (Wood lamp examination) 등이 있다. 이상의 검사로 진단이 내려 지지 않을 때에는 피부 생검 (biopsy), 즉 조직검사를 한 후 염색하에 광학현미경으로 보거나, 면역조직화학염색 (immunohistochemical staining) 으로 보는 방법, 면역형광검사 (immunofluorescence test), 전자현미경으로 관찰하는 방법이 사용된다 (안 성구, 이 승헌. 피부미학. 고려의학. 2002년.; 대한피부과학 교과서 펀찬위원회 편저. 피부과학. 개정 4판. 여문각. 2001년).

그러나 이상의 모든 검사는 피부 병변의 형태를 미시적으로 보는 검사일 뿐, 그 생리적 변화나 기능적 변화, 생화학적 변화, 분자적 변화, 유전자적 변화는 보지 못한다는 단점이 있고, 따라서 그 정확도와 유용성에는 한계가 있다. 따라서 피부 질환이 있을 때 이의 근본적 원인과 변화를 파악하고, 각각에 따라 최적의 맞춤 식 치료법을 결정할 수 있는 새로운 검사법이 절실한 상황이다.

피부의 상태와 유형은 그 피부에서 발현되는 유전자와, 이에 따라 만들어지는 단백, 탄수화물, 지질 등의 구성요소의 변화, 구성 세포의 상태에 따라 결정되며, 여기에는 타고난 유전적 소양과 후천적 요인, 예컨대 환경적 요인과 식사, 생활 습관 등이 함께 작용하여 나타난다. 따라서 피부의 타고난 유전적 소인을 검사하고, 나아가 피부에서 발현되는 유전자를 조사하면 그 피부의 상태를 가장 정확하고 근본적으로 검사할 수 있을 것이다. 본 발명의 주제도 여기에 있다.

현재 국내외의 피부과 및 미용성형클리닉과 미용전문상점, 화장품 회사 등에서 피부의 상태를 평가하고 피부 질환을 진단하기 위해 문진이나 신체검사와 다양한 물리화학적 검사와 장비, 형태학적 검사장비들 이용되고 있다. 그러나 이들 검사법은 개개인의 피부에 대해 근원적이고 객관적으로 평가하기에는 모두 한계가 있고, 과학적으로 표준화된 검사법은 없는 실정이다. 그나마 가장 객관적이라 할 수 있는 것이 생검 후 조직검사로 피부의 미세 구조의 변화를 보는 방법이나, 이는 침해적이며, 형태에 초점을 두고 검사하므로 기능이나 구성 성분, 생리, 생화학적 변화는 알 수 없다는 한계가 있다. 따라서 인체 피부의 상태를 정확하고 객관적으로 평가하며, 피부 유형 분류에 도움이 되고, 개인별로 적절한 화장품이나 미용약물을 맞춤식으로 선택하고, 투여 후 그 효과를 판정하는 데 도움이 되며, 나아가 각종 피부 질환을 정확하고 간편하며 신속하게 파악할 수 있는 새로운 검사가 필요하다. 이를 해결하려는 데 본 발명의 목적이 있다.

이를 위해 가장 유력한 방법은 유전자검사법이다. 피부의 상태 및 유형과 건강 및 질환 발병은 그 피부에서 발현되는 유전자와, 이에 따라 만들어지는 단백, 탄수화물, 지질 등의 구성요소의 변화, 구성 세포의 상태에 따라 결정되며, 여기에는 타고난 유전적 소양과 후천적 요인, 예컨대 감염이나 자외선과 같은 환경적 요인과 식사, 생활 습관 등이 함께 작용하여 나타난다. 따라서 피부의 타고난 유전적 소인을 검사하고, 나아가 피부에서 발현되는 유전자를 조사하면 그 피부의 상태를 가장 정확하고 근본적으로 검사할 수 있을 것으로 판단된다. 그러나 피부유전자를 현실에 적용하기 위해서는 많은 문제점들이 해결되지 않은 상태이다. 첫째, 검사에 적합한 상태로 안전하게 피부 시료를 얻는 방법, 운송 방법 들이 수립되어 있지 않다. 둘째, 얻어진 피부 시료를 가지고 특정 유전자를 얻을 수 있고 이의 다형성 (polymorphism)과 돌연변이, 발현 여부와 그 정도를 분석하는 등의 다양한 유전자 검사를 할 수 있는 방법이 수립되어 있지 않다. 셋째, 수립된 방법을 이용하여 실제 임상 진료나 미용 분야에 이용할 수 있는 방법과 그 기준이 수립되어 있지 않다. 한편 안전하고 간편하게 얻을 수 있다면 피부는 유전자검사에 최적의 시료가 될 수 있으며, 이를 이용한 유전자검사는 각종 유전자검사나 진단에 광범위하게 이용될 수 있을 것이다.

상기한 문제점들 중 첫째로 인간의 피부는 여러 층의 겹으로 이루어져 있고 진피 및 표피마다, 또한 같은 표피 내에서도 각질형성세포와 멜라닌형성세포, 랑거한스세포 등의 여러 다른 세포들이 층을 이루며 서로 다른 유전자들을 발현한다. 따라서 안정되게 일정한 두께로 피부를 채취할 수 있도록 규격화와 표준화가 이루어져야 할 것이 피부 유전자 측정에 대해서 선결되어야 할 조건이라고 하겠다. 아울러 어떤 피부 채취법이 임상 분야뿐 아니라 미용 분야 등에서도 광범위하게 이용되기 위해서는 안전하고 비침해적이어야 하며, 또한 용이해야 하는 것이 중요하다. 가급적 일반 대중이 자가 채취할 수 있는 소위 "Do it your self (DIY)" 방법이 되는 것이 좋다. 피부 유전자 측정에 대해서 이러한 단점들을 극복하기 위해서는 안전하고 확실하게 일정 부위 이상의 피부를 채취할 수 방법이 필요하다. 나아가 이러한 DIY 채취 키트로서 얻은 피부 시료에서 적정 양과 양질의 DNA와 RNA를 얻을 수 있음이 확인되어야 한다.

둘째로, 피부 유전자 카드로 얻어진 시료 내에 들어 있는 DNA와 RNA를 가지고 오늘날 사용되는 복잡 다양한 유전자검사 들을 모두 시행할 수 있도록 해야 한다. 예컨대 특정 유전자의 DNA의 전체 내지 일부를 증폭할 수 있는 polymerase chain reaction (PCR) 방법과 발현된 특정 유전자의 RNA의 전체 내지 일부를 증폭할 수 있는 역전사 (RT)-PCR 방법, 유전자의 발현의 정도를 양적으로 계산할 수 있는 실시간 RT-PCR, PCR 및 RT-PCR로 얻은 유전자를 플라스미드 벡터와 대장균을 이용하여 클로닝 하는 법, PCR후 restriction fragment length polymorphism (RFLP)으로 분석하는 법, 자동염기서열분석법 (automated sequencing analysis)이나 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 (oligo DNA chip)으로 특정 유전자의 염기서열을 분석하고 단일핵산유전자다형성 (single nucleotide polymorphism)과 돌연변이를 분석하는 법, cDNA 마이크로어레이로 다수 유전자의 발현의 차이를 동시에 분석하 는 법, methylation specific PCR (MSP)과 bisulfite genomic sequencing으로 프로모터 메틸화 여부를 분석하는 방법 등이 모두 수립되어야 한다.

셋째, 수립된 유전자 검사법이 실제 임상 진료나 미용 분야, 그리고 제반 유전자검사 및 사업에 이용할 수 있도록 해야 한다. 예컨대 신체 보호나 보습, 재생 등 피부의 각종 기능을 정확하게 평가하여 앞에 기술한 피부의 유형의 분류를 더 정확하고 객관적으로 하고, 그 결과를 맞춤식 피부관리나 맞춤식 화장품 및 미용약물의 선택에 이용할 수 있어야 한다. 특히 건성 피부, 노화 피부, 광노화, 민감성 피부의 판별과 처치에 도움이 되어 야 한다. 아울러 염증이나 습진, 면역성 질환, 감염, 건선 등 각종의 해결이 어려운 피부 질환을 정확하게 진단하며 적정 치료법을 선택할 수 있도록 해야 한다. 또한 선천성의 유전 질환의 진단과 개인 식별 및 친자 감식, 장기 이식 전의 면역유전자 형 검사 등의 제반 유전자 검사 사업에 이용될 수 있어야 할 것이다.

본 발명에서는 상기한 과제들을 해결하려는 것이다.

본 발명은 인체의 피부를 그 내부의 유전자가 적절하게 잘 보존되도록 최적의 조건으로 채취하며 운반하고 검사 시까지 보관할 수 있는 키트 (이상 피부 유전자 카드 (피부 유전자 카드)라고 명명함)와 이를 이용하여 유전자검사를 하는 방법 과 이를 의학과 미용 화장품학, 유전학 등의 제반 분야에 응용하는 방법에 대한 것이다.

본 발명자는 피부 시료를 적절하게 채취한 후 이를 가지고 피부의 기능과 생리, 병리에 관련된 중요 유전자의 발현이나 변이를 조사하면 개개인의 피부 상태를 정확하게 파악할 수 있을 것이라는 점에 착안하여, 우선적으로 이러한 유전자 측정을 가능하게 해주기 위해 최적의 상태를 제공할 수 있는 피부 채취 방법을 확립하고자 하였다. 피부 유전자 카드 발명의 구성과 순서는 다음과 같다.

1) 발명자들이 이미 발명하여 특허를 취득한 RNA카드와 DNA카드를 응용하여 피부 유전자 카드를 고안한 후 그 제조방법을 확립하고,

2) 제조된 카드에 의한 최적의 피부 채취방법을 결정하고,

3) 피부 검체 보관 및 배송 조건을 확립하고,

4) 채취된 피부 검체로부터 적합한 DNA 및 RNA 분리 방법 및 cDNA 합성조건을 확립하며,

5) 채취된 피부로부터 피부에 중요한 유전자들의 PCR과 RT-PCR 방법, 실시간 PCR, PCR-RFLP, 자동염기서열분석, DNA 마이크로어레이, MSP등의 유전자 검사 방법을 수립하고

6) 피부 유전자 카드와 5)의 방법들을 이용하여 피부의 기능과 생리, 병리에 중요한 역할을 하는 핵심 유전자들을 검사하여 피부의 유형을 정확하고 객관적으로 분류할 수 있도록 하고, 그 결과에 따라 맞춤식 피부관리나 맞춤식 화장품 및 미용약물을 선택하는 데 도움이 될 수 있도록 시스템을 수립하였다. 특히 건성 피부, 노화 피부, 광노화, 민감성 피부의 판별과 처치에 도움이 될 수 있도록 하는 데 주안을 두었다.

7) 피부 유전자 카드와 5)의 방법들을 이용하여 종양과 염증, 습진, 면역성 질환, 감염, 건선 등 각종의 해결이 어려운 피부 질환을 진단하여 최적의 치료법을 선택할 수 있도록 시스템을 수립하였다.

8) 피부 유전자 카드와 5)의 방법들을 이용하여 선천성 유전 질환의 진단과 개인 식별 및 친자 감식, 장기 이식 전의 면역유전자 형 검사 등의 제반 유전자 검사 사업에 이용될 수 있도록 시스템을 수립하였다.

이상 열거한 발명의 순서는 도면 1에 요약하였다.

본 발명의 핵심이 되는 피부 유전자 카드의 대표적인 형태와 모식도를 도면 2에 나타내었다. 본 발명의 피부 유전자 카드는 테이프부분과 기판인 카드 부분의 두 부분으로 이루어져 있고, 테이프는 인체 조직에 부착하였다 떼면서 조직을 채취하는 데 사용되며, 카드 부분은 이렇게 조직을 채취한 테이프를 부착하여 보호하며, 보관하고 이송하는 데 이용되는 역할을 하며, 테이프는 어떤 종류의 접착테이프도 가능하나, 인체에 무해하고 의료용으로 사용이 허용된 반창고를 사용하며, 그 중에서도 부드러운 저접착형의 종이반창고를 사용하며, 특히 3M 사가 제조 판매하는 저접착력 형의 제조번호 1500, 1522, 9874를 사용하며, 기판 (카드) 부분은 DNA및 RNA와 안정된 결합물을 형성하며 DNA와 RNA가 각각 디옥시리보뉴클레아제와 리보뉴클레아제에 의해 분해되는 것을 막고, 실온에서 안정된 상태로 보존할 수 있도록 DEPC로 처리하고 용해완충액 및 적절한 성상과 농도의 수용성 키토산 용액을 함유시킨 종이 카드나 필름, 유리슬라이드, 플라스틱, 섬유, 합성수지 등을 사용한다.

본 발명에서 채취 하는 인체 시료는 인체의 피부가 바람직하며, 그 부위는 어는 부위 피부라도 무방하다. 아울러 모발 채취와 검사에도 사용이 가능하며, 입가나 항문 주위 등의 피부 점막 경계부나 구강 내 등 점막에서 채취해도 무방하다.

본 발명의 유전자 검사에서 사용되는 인체의 피부 시료는 본 발명의 피부 유전자 카드로 얻는 것이 가장 바람직하지만, 피부 세포를 소량 채취하기 위한 겔 타입 및 또는 테이프 타입의 어떠한 채취 장치 또는 카드도 본 발명의 유전자 검사에 이용될 수 있다.

시료 중 표적 물질의 성분은 유전자 탐색의 지표가 되는 어떤 형태의 것도 가능하지만, DNA가 사용될 수 있으며, 피부 시료로부터 DNA의 분리는 본 발명의 용출 완충액을 사용하는 것이 가장 바람직하지만, 동일 목적으로 사용되는 어떤 종류의 적정 방법도 사용될 수 있다.

시료 중 표적 물질의 성분으로 RNA가 더 바람직하며, 피부 시료로부터 RNA및 mRNA의 분리는 본 발명의 용출 완충액을 사용하는 것이 가장 바람직하지만 동일 목적으로 사용되는 어떤 종류의 용출 방법도 사용될 수 있다.

이하 하기 실시 예와 도면를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예에 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 이를 변형 내지 응용하는 방법도 본 발명의 범위에 해당한다.

[발명의 실시예]

<1단계 실시예 >

피부에서 시료를 채취하는 카드인 피부 유전자 카드의 제작과 그 성능 입증

본 1단계에서는 피부 유전자 카드를 제조하고 그 제조방법을 확립하고, 제조된 카드에 의한 최적의 피부 채취방법과 검체 보관 및 배송 조건을 확립하고, 채취된 피부 검체로부터 적합한 DNA 및 RNA 분리 방법 및 cDNA 합성조건을 확립하며, 이렇게 분리된 DNA와 RNA의 질과 양을 확인하였다.

구체적인 방법은 다음과 같다.

실시 예. 1. 피부 유전자 카드의 제조

본 발명의 피부 유전자 카드는 테이프부분과 기판 (카드)부분의 2부분으로 이루어져 있고, 테이프는 인체 조직에 부착하였다 떼면서 조직을 채취하는 데 사용되며, 카드 부분은 이렇게 조직을 채취한 테이프를 부착하여 보호하며, 보관하고 이송하는 데 이용되는 역할을 한다. 테이프는 어떤 종류의 접착테이프도 가능하나, 인체에 무해하고 의료용으로 사용이 허용된 반창고를 사용하며, 그 중에서도 부드러운 저접착형의 종이반창고를 사용하며, 특히 3M 사가 제조 판매하는 저접착력 형의 제조번호 1500, 1522, 9874를 사용한다. 기판 (카드) 부분은 DNA및 RNA와 안정된 결합물을 형성하며 DNA와 RNA가 각각 디옥시리보뉴클레아제와 리보뉴클레아제에 의해 분해되는 것을 막고, 실온에서 안정된 상태로 보존할 수 있도록 하였다. 이를 위해 DEPC로 처리하여 만든 용해완충액 (lysis buffer solution) 및 적절한 성상과 농도의 수용성 키토산 용액을 함유시킨 종이 카드나 필름, 유리슬라이드, 플라스틱, 섬유, 합성수지 등을 사용한다. 카드 재질을 고온고압 멸균기 (autocleave)를 이용하여 120℃, 2기압에서 30분 동안 DEPC treated H2O, 키토산, 그리고 lysis buffer 에 침지 멸균 후 건조하여 사용 하였다. 이는 DNA 및 RNA 분리 시 문제가 될 수 있는 DNase 및 RNase로 부터의 오염을 방지하기 위해서 이다. 또한, 키토산, lysis buffer, RNA 및 DNA card의 성분은 핵산의 장기간 보호에 도움을 준다. (도면 2)

아래 표는 피부유전자 카드의 구성 성분과 그 재질에 대한 것이다.

실시 예. 2. 피부 유전자 카드를 이용하여 피부 시료를 채취하는 방법

채취 부위와 주위 피부에 필링겔을 바른 후 손으로 문질러 각질을 제거한 후 알코올 거즈로 깨끗이 닦아낸다. 본 발명의 피부 유전자 카드의 테이프 부분의 덮개를 띄어낸 후 채취할 피부 부위에 붙인다. 적정 시간이 경과된 후 카드를 떼어낸다. 여기에서 필링겔은 바이오리(주)사의 아크네쁘리를 사용하였으나 피부 세정을 위해 동 업계에서 사용되는 어떤 종류의 겔을 사용해도 무방하다. 피부에 카드를 부착하는 시간은 1분에서 12시간까지 모두 무방하나, 통상 30분으로 한다. 본 발명의 카드는 피부의 어떤 부위에 붙여도 무방하다. 그러나 피부에 질환이 없는 사람에서 미용학적 목적으로 사용할 때는 이마나 코, 턱, 눈가, 빰에서 채취하는 것이 보통이다. 물론 피부 질환이 의심되는 환자에서 정확한 진단을 요할 때는 병변 부 위에서 바로 채취하면 되며, 이 때 정상 부위에서도 채취하여 비교할 수 있도록 하는 것이 중요하다.

실시 예. 3. 피부 유전자 카드에서 DNA를 분리하여 확인

피부 유전자 카드로부터의 DNA 분리방법은 극소량의 피부 세포로부터 DNA의 분리하는 조건과 카드내의 물질의 용출 또는 기타 환경이 PCR등의 효소 반응을 저해하지 않는 조건을 고려하여 선정되었다. DNA 분리는 상업화된 여러 DNA 분리 키트를 사용해도 무방하나, 통상의 추출 완충액 (extraction buffer)을 이용하여 공지의 방법대로 다음과 같이 수행하면 적합하다. DNA분리 후 분리된 DNA시료를 agarose 겔에서의 전기영동과 자외선 분광광도계 (UV spectrophotometry)로 확인하였다. 그 방법과 결과는 다음과 같다.

피부 유전자 카드를 이용하여 정상 성인의 얼굴에서 피부를 채취한 후 채취한지 각각 하루, 3일, 일주일 동안 각각 보관해 두었다. 이들 카드에서 각각 전체 게놈 DNA를 분리하였으며, 그 방법은 다음과 같이 공지의 방법 (Sambrook J 및 Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Press. 2001:7.1.-7.88)에 따라 수행하였다. 물은 3차 증류수를 사용한다.

1) 1.5㎖ 튜브에 채취한 샘플을 옮겨 미세원심분리기에 넣고, 500㎕ 1x PBS를 넣고 12,000 rpm에서 2분간 원심 분리하여 세포를 가라앉힌다.

2) Vortex를 이용하여 세포를 용액과 잘 섞어 준다.

3) 12,000 rpm에서 2분간 원심 분리하여 상층액을 제거한다.

4) 200㎕ Buffer TL를 첨가한다.

5) 20㎕ Protease K를 첨가한 후, vortex를 이용하여 잘 혼합하여 준다.

6) 항온조 56℃에서 30분간 정치 반응한다.

7) 반응이 끝난 튜브는 8,000 rpm이상에서 10초 정도 spin down하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.

8) 400㎕ Buffer TB를 첨가하고, 잘 혼합하여 준다. 8000 rpm이상에서 10초 정도 spin down하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.

9) Spin column을 Collection 튜브에 장착한 후, 위의 반응액을 Spin column에 넣는다.

10) 8,000 rpm에서 1분간 원심 분리한다.

11) Column을 통과한 여과액은 버리고 다시 collection 튜브를 장착한다.

12) 700㎕ Buffer BW를 첨가하고 8,000 rpm에서 1분간 원심 분리한다.

13) Column을 통과한 여과액은 버리고 다시 collection 튜브를 장착한다.

14) 500㎕ Buffer NW를 첨가하고 12,000 rpm에서 3분간 원심 분리한다.

15) Column을 통과한 여과액은 버리고 새로운 1.5ml 튜브를 장착한다.

16) 200㎕ Buffer AE 나 정제수를 column의 중앙에 첨가하고, 2분간 실온에 방치한다.

17) 8,000 rpm에서 1분간 원심 분리한다.

18) 추출된 게놈DNA는 곧바로 PCR에 사용 가능하며, 장기간 보존 시에는 -20℃에 보관하여 사용 가능하다.

19) 추출된 게놈DNA는 0.8% 한천 (agarose) 젤에 넣고, 100V에서 전기영동을 실시하여 자외선 하에 확인하였다.

20) 다시 새 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브에 증류수 200㎕를 넣어 실온에서 1분간 방치 후, 다시 8000 rpm에서 1분간 원심분리를 하여 DNA를 용출(elution)시킨다. 이렇게 분리된 DNA는 분광광도계를 이용하여 농도를 측정하고, 분리된 DNA의 순도를 알기 위해 A260/A280 비를 비교한다. 이 때 DNA의 순도는 분광광도계측정에서 A260/280가 1.6 에서 1.8사이로 나타난다. 이상의 방법으로 피부 1x2cm 직경의 피부 유전자 카드에서 1-5ug, 평균 3㎍의 순수한 DNA를 얻을 수가 있다 [도 3].

실시 예. 4. 피부 유전자 카드에 장기 보관 시 DNA가 유지되는지 확인

앞의 실시예에서 나아가 피부 유전자 카드에 채취한 피부세포의 DNA가 실온에서 장기간 보관하였을 때 보관된 DNA가 분해되지 않고 유지되어서 유전자 증폭과 분석이 가능한 가를 PCR분석을 통해 다음과 같이 확인하였다.

앞에서와 같이 피부 유전자 카드를 이용하여 정상 성인의 얼굴에서 피부를 채취한 후 채취한지 각각 1일, 1개월, 1년간 동안 각각 보관해 두었다. 이들 카드들에서 각각 전체 지놈 DNA를 분리하였으며, 아래의 방법을 따라 PCR 반응을 수행하여 표적 유전자들이 적절하게 증폭되는 지를 확인하였다.

PCR 실험 결과, 1일, 1개월, 1년 동안 실온에서 보관하였던 DNA 샘플의 모두에서 베타-액틴 유전자가 뚜렷하게 검출되었다.

이와 같은 결과는 본 발명의 방법에 따라 피부 유전자 카드를 이용하여 게놈 DNA를 보관하는 방법이 최소 1년 이상 DNA를 안정적으로 유지시킬 수 있고, 보관된 DNA를 PCR분석에 사용하는데도 문제가 없으며 기존의 초저온 냉동고 보관법과 비교하여 유사하게 DNA를 안정적으로 보관할 수 있음을 확인하였다. 본 실시예에서의 보관 온도는 실온에서 -70℃까지로 다양하며, 습하지 않은 암소에 보관하는 것이 바람직하다.

PCR방법

피부를 채취한 후 채취한지 각각 1일, 1개월, 1년간 동안 유전자 카드에서 장기 보관한 후 추출한 핵산을 주형로 하여 Gapdh 유전자를 아래의 일반적인 PCR 반응 조건으로 45 사이클 반응을 한다.

1) PCR 믹스 (10pM 순방향 및 역방향 프라이머 각각1ul, 10X 반응 완충액 2 ul, 5 mM dNTP 2ul, 50U/ul Taq polymerase 1ul)에 위의 주형 7ul와 H2O 6ul를 섞어 반응액을 준비한다.

2) 95℃/10 min, 94℃/ 1min, 55℃/1min, 72℃/1min의 반응 조건으로 45 사이클 반응을 한다.

3)반응이 끝난 튜브는 8,000 rpm이상에서 10초 정도 spin down하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.

4) 증폭된 PCR 산물는 0.8% 아가로스 겔에 넣고, 100V에서 전기영동을 실시하여 자외선 하에 확인하였다. 그 결과의 한 예를 도 4에 나타내었다.

실시 예. 5. 피부 유전자 카드에서 RNA를 분리하여 확인

앞의 방법대로 피부 유전자 카드를 이용하여 피부시료를 얻은 후 이로부터 채취 후에 RNA를 분리하였으며, 그 분리 방법은 통상의 방법을 이용하여 다음과 같이 하였다. 이 대신 상업화된 키트인 Intron사의 EasySpin Kit (Cat #17221)를 사용하여도 무방하다. 이후 분리된 RNA시료를 자외선 분광광도계 (UV spectrophotometry)로 확인하면 전체 50 ul의 용적으로 할 때 ul당 5-10 ng의 RNA를 얻을 수 있으며, 이 때 OD260/280은 1.5에서 1.8사이로 나타났다. 즉 이상의 방법으로 피부 1x2cm 직경의 피부 유전자 카드에서 250-500ng, 평균 400 ng의 순수한 RNA를 얻을 수가 있다 [도 5].

RNA분리 방법

1) 1.5㎖ 튜브에 채취한 샘플을 옮겨 넣고, 200㎕ lysis buffer를 넣어준 후 2분간 vortex하여 샘플과 용액을 잘 섞어 준다.

2) 여기에 지질 제거를 위하여 Chloroform 200㎕ 첨가 후 30초간 다시 vortex하여 샘플과 용액을 잘 섞어 준다.

3) 4℃, 12,000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 상층 액을 새로운 tube에 옮긴다 (이때, 하층 액이 따라오지 않게 주의 하여야 한다)

* 4) ~ 9)은 기존의 상업화 된 Intron사의 EasySpin Kit 이용 방법이며 3)번

이후 10)으로 바로 넘어가는 방법도 이용 가능하다.

4) 새로 분리한 상등액에400㎕ Binding Buffer를 첨가한다.

5) Column에 위의 기 처리된 용액을 넣고 상온에서 1분간 방치 후, 13000 rpm, 30초간 원심분리 한다.

6) 위 Column에 Washing Buffer A를 700 ㎕ 넣고 13000 rpm, 30초간 원심분리 한다.

7) 위 Column에 Washing Buffer B를 700 ㎕ 넣고 13000 rpm, 30초간 원심분리 한다.

8) 빈 column을 4℃, 13000 rpm 에서 3분간 다시 원심분리 하여 물기를 완벽히 제거한다.

9) 50㎕의 Elution Buffer를 넣고 상온에서 1분간 방치 후 4℃, 13000 rpm, 3분간 원심분리 하여 RNA를 획득할 수 있다.

10) 3)번 상층액과 동일 양의 isopropanol을 넣고 - 70℃에서 1~2시간 보관한다.

11) 위 보관 샘플을 4℃, 13000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 RNA를 침전 시키고 상등액은 버린다.

12) 침전된 RNA를 vacuum Dryer를 이용하여 건조 시킨 후 순수 증류수 50ul에 녹인다.

13) 추출된 total RNA는 formaldehyde 함유의 1.8% 아가로스 겔에 넣고, 100V에서 전기영동을 실시하여 자외선하에 확인하였다.

실시 예. 6. 피부 유전자 카드에 장기 보관 시 RNA가 유지되는 지를 확인

핵산시료를 실온에서 장기 보관 시 문제가 되는 것은 매우 안정적이고 지구상 어디에서도 존재하고 강력하게 작용하는 리보뉴클레아제에 의해 RNA가 분해될 수 있다는 것이다. 이에 앞의 실시예 5에서 나아가 피부 유전자카드에 채취한 피부세포의 RNA가 실온에서 장기간 보관하였을 때 보관된 RNA가 분해되지 않고 유지되어서 유전자 증폭과 분석이 가능한 가를 RT (역전사) PCR분석을 통해 다음과 같이 확인하였다.

앞에서와 같이 피부 유전자 카드를 이용하여 정상 성인의 얼굴에서 각각 3개씩의 피부를 채취한 후 각각 1일과 1주, 1개월 동안 각각 보관해 두었다. 이들 카드들에서 각각 RNA를 분리하였으며, 아래의 방법을 따라 RT-PCR 반응을 수행하여 표적 유전자들이 적절하게 증폭되는 지를 확인하였다.

RT-PCR 실험 결과, 1일, 1주, 1개월 동안 피부 유전자 카드 내에서 실온 보관하였던 피부시료 모두에서 베타-액틴 유전자가 뚜렷하게 검출되었다 [도 6].

이와 같은 결과는 본 발명의 방법에 따라 피부 유전자 카드를 이용하여 보관하는 방법이 최소 1개월 이상 RNA를 안정적으로 유지시킬 수 있고, 보관된 RNA를 RT-PCR분석에 사용하는데도 문제가 없으며 기존의 초저온 냉동고 보관법과 비교하여 유사하게 RNA를 안정적으로 보관할 수 있음을 확인하였다. 본 실시 예에서의 보관 온도는 실온에서 -70℃까지로 다양하며, 습하지 않은 암소에 보관하는 것이 바람직하다.

RT-PCR방법

피부를 채취한 후 채취한지 각각 1일, 1개월, 1년간 동안 피부 유전자 카드에서 장기 보관한 후 추출한 RNA을 주형로 하여 아래의 일반적인 RT-PCR 반응 조건으로 반응을 한다.

1) RT mix (40 ng/ul Oligo-dT 1ul, 5X 반응 완충액 4ul, 10mM dNTP 2ul, 10U/ul reverse transcriptase 1ul, RNase inhibitor 1ul )에 위의 RNA 주형 13ul 섞어 반응액을 준비한다.

2) 항온조 50℃에서 1시간 정치 반응한다.

3) 반응이 끝난 튜브는 8,000 rpm이상에서 10초 정도 spin down하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.

4) PCR mix (10pM 순방향 및 역방향 프라이머 각각1ul, 10X 반응 완충액 2ul, 5mM dNTP 2ul, 50U/ul Taq polymerase 1ul )에 위의 주형 13ul를 섞어 반응액을 준비한다.

3) Pre 변성 95℃, 10min, 이후 변성 94℃, 1min, 어닐링 55℃, 1min, Reaction 72℃, 1min의 반응 조건으로 45 사이클 반응을 한다.

4) 반응이 끝난 튜브는 8,000 rpm이상에서 10초 정도 spin down하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.

5) 증폭된 PCR 산물는 1.8% 한천 (agarose) 젤에 넣고, 100V에서 전기영동을 실시하여 자외선 하에 확인하였다.

실시 예. 7. 피부 유전자 카드를 이용하여 모발시료를 채취하고 여기에서 DNA를 분리하는 방법

인체의 두피에서 핀세트 (forcep)을 이용하여 5개의 모발을 모근이 붙은 상태로 채취한 후 피부 유전자 카드에 붙여서 1일, 1개월, 1년 보관 해 두었다가 실시 예 3의 방법에 따라 DNA를 분리하였다. 이후 분리된 DNA시료를 자외선 분광광도계 (UV spectrophotometry)로 확인하였다 [도 7]. 이로서 DNA의 순도는 분광광도계측정에서 A260/280가 1.5 에서 1.8사이로 나타났다. 이상의 방법으로 5개의 모발에서 3-5μg, 평균 4 μg의 순수한 DNA를 얻을 수가 있다.

실시 예. 8. 피부 유전자 카드를 이용하여 모발시료를 채취하여 여기에서 RNA를 분리하는 방법

실시 예 7의 방법에 따라 인체의 두피에서 모발을 모근이 붙은 상태로 채취한 후 피부 유전자 카드에 붙여서 보관 해 두었다가 실시 예 5의 방법에 따라 RNA를 분리하였다. 이후 분리된 RNA시료를 2% 한천 겔에서 100V로 전기영동 하여 확인하였다 [도 8].

아울러 자외선 분광광도계로 분석한 결과 RNA의 순도는 분광광도계측정에서 A260/280가 1.5 에서 1.8사이로 나타났다. 이상의 방법으로 5개의 모발에서 1-2μg, 평균 1.5 μg의 순수한 RNA를 얻을 수가 있다.

<2단계 실시예 >

피부 유전자 카드를 이용하여 얻은 피부검체를 대상으로 사용한 각종 유전자 검사

본 단계에서는 피부 유전자 카드에 채취된 시료 내에 들어 있는 DNA와 RNA를 가지고 주요 유전자검사 들을 수행하는 방법을 확립하였다. 먼저 피부 유전자 카드에서 DNA나 RNA를 분리하지 않고 바로 PCR및 RT-PCR을 하는 방법을 수립하였으며, 아울러 실시간 PCR과 PCR-RFLP, 자동염기서열분석, 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 , cDNA 마이크로어레이, MSP, bisulfite 게놈 시퀀싱 등의 방법을 수립하였다.

실시 예. 9. 피부 유전자 카드에서 DNA분리 과정 없이 바로 PCR을 하는 방법

앞의 실시 예 4에서와는 달리 피부 유전자 카드로부터의 DNA의 직접 분리방법은 극소량의 피부 세포로부터 DNA의 분리하는 조건뿐 아니라 여러 세포 파쇄 후 물질 특히 RNA 등이PCR의 효소 반응을 저해하지 않는 조건을 고려하여야 한다. 본 실험에서는 게놈 DNA와 목표 유전자 RNA와의 PCR 산물의 크기가 다르게 프라이머를 조정하여 원하는 게놈 DNA에서 만 유전자가 증폭 될 수 있는 방법을 수립하였다.

앞에서와 같이 피부 유전자 카드를 이용하여 정상 성인의 얼굴에서 피부를 채취한 후 이들 카드들에서 아래의 방법을 따라 각각 게놈 DNA를 분리한 후 PCR 반응을 수행하여 표적 유전자들이 적절하게 증폭되는 지를 확인하였다 [도 9].

1) 1.5㎖ 튜브에 채취한 샘플을 옮겨 넣고, 200㎕ Tris-EDTA (pH 7.0) buffer를 넣어준 후 5분간 vortex하여 세포가 Tape으로부터 분리 시킨다.

2) 이 샘플을 -70℃에서 5분간 보관 후 60℃ heating block 에서 1분간 녹이며 세포벽을 파괴한다.

3) 4℃, 12,000 rpm에서 1분간 원심 분리하여 상층 액을 새로운 tube에 옮긴다.

4) PCR mix (10pM 순방향 및 역방향 프라이머 각각1ul, 10X 반응 완충액 2ul, 5mM dNTP 2ul, 50 U/ul Taq polymerase 1ul )에 위의 주형 7ul와 H2O 6ul를 섞어 반응액을 준비한다.

5) Pre 변성 95℃, 10 min, 이후 변성 94℃, 1 min, 어닐링 55℃, 1min, Reaction 72℃, 1min의 반응 조건으로 45 사이클 반응을 한다.

6) 반응이 끝난 튜브는 8,000 rpm이상에서 10초 정도 spin down하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.

7) 증폭된 PCR 산물는 0.8% 아가로스 겔에 넣고, 100V에서 전기영동을 실시하여 자외선 하에 확인하였다.

실시 예. 10. 피부 유전자 카드에서 RNA분리 과정 없이 바로 RT-PCR을 하는 방법

피부 유전자 카드로부터의 RNA의 직접 분리방법은 극소량의 피부 세포로부터 RNA의 분리하는 조건과 여러 세포 파쇄 후 물질 특히 게놈 DNA 등이PCR의 효소 반응을 저해하지 않는 조건을 고려하여야 한다. 본 실험에서는 게놈 DNA와 목표 유전자 RNA와의 PCR 산물의 크기가 다르게 프라이머를 조정하여 원하는 유전자 RNA에서 만 유전자가 증폭 될 수 있는 방법을 수립하였다.

앞에서와 같이 피부 유전자 카드를 이용하여 정상 성인의 얼굴에서 피부 를 채취한 후 이들 카드들에서 아래의 방법을 따라 각각 RNA를 분리한 후 RT-PCR 반응을 수행하여 표적 유전자들이 적절하게 증폭되는 지를 확인하였다 [도 10].

1) 1.5㎖ 튜브에 채취한 샘플을 옮겨 넣고, 200㎕ Tris-EDTA(pH 7.0) buffer를 넣어준 후 5분간 vortex하여 세포가 Tape으로부터 분리 시킨다.

2) 이 샘플을 -70℃에서 5분간 보관 후 60℃ heating block 에서 1분간 녹이며 세포벽을 파괴한다.

3) 4℃, 12,000 rpm에서 1분간 원심 분리하여 상층 액을 새로운 tube에 옮긴다.

5) RT mix (40 ng/ul Oligo-dT 1ul, 5X 반응 완충액 4ul, 10mM dNTP 2ul, 10U/ul reverse transcriptase 1 ul, RNase inhibitor 1ul)에 위의 RNA 주형 13 ul를 섞어 반응액을 준비한다.

6) 항온조 50℃에서 1시간 정치 반응한다.

7) 반응이 끝난 튜브는 8,000 rpm이상에서 10초 정도 spin down하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.

8) PCR mix (10 pM 순방향 및 역방향 프라이머 각각1ul, 10X 반응 완충액 2ul, 5mM dNTP 2ul, 50 U/ul Taq polymerase 1ul )에 위의 주형 13ul를 섞어 반응액을 준비한다.

9) Pre 변성 95℃, 10min, 이후 변성 94℃, 1min, 어닐링 55℃, 1min, 반응 72℃, 1min의 반응 조건으로 45 사이클 반응을 한다.

10) 반응이 끝난 튜브는 8,000 rpm이상에서 10초 정도 spin down하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.

11) 추출된 PCR 산물는 1.8% 한천 (agarose) 젤에 넣고, 100V에서 전기영동을 실시하여 자외선 하에 확인하였다.

실시 예. 11. 피부 유전자 카드에서 실시간 PCR을 하는 방법

피부 유전자 카드로부터의 RNA의 분리 후 아래와 같은 방법으로 실시간 PCR을 수행할 수 있음을 보여 준다.

앞에서와 같이 피부 유전자 카드를 이용하여 정상 성인 20명의 얼굴에서 각각 3개씩의 피부를 채취한 후 이들 카드들에서 실시 예 5와 같이 통상의 방법을 이용하여 각각 RNA를 분리한 후 one step Real RT-PCR을 통해 목적 유전자가 올바르게 증폭되는 지를 확인하였다 [도 11].

1) Light Cycler의 반응 조건을 아래와 같이 맞춘다.

역전사 : 50℃, 20 min.

Pre 변성 : 94℃, 5min.

증폭 : 94℃, 15sec / 55℃, 20sec / 72℃, 20sec.

Melt curve analysis : 95℃, 5sec / 64℃, 15sec / 95℃, 0sec.

Cooling : 40℃, 30sec

2) 아래와 같이 실시간 PCR용 반응 액들을 섞는다. (반응 개수: β-actin 3개)

* 베타 액틴 (total 20 ul)

Control DNA 주형 1㎕, 3㎕, 5㎕

DEPC H2O 7.8㎕, 5.8㎕, 3.8㎕

프라이머 1ul

반응액 10.2ul (반응액: cyber green mix 185ul에 RT mix 3.7㎕를 섞음.)

* 샘플 (total 20㎕):

Cyber Green mix 10㎕,

RT mix 0.2㎕,

프라이머 1㎕,

주형 1, 3, 5㎕,

DEPC H2O 7.8, 5.8, 3.8㎕

3) 위 반응핵을 Capillary에 넣은 후 Capillary의 뚜껑을 닫는다.

4) Table top centrifuge에서 Quick으로 spin down한다.

5) Light Cycler에 Capillary를 거치 후 run start.

실시 예. 12. 피부 유전자 카드에서 얻은 유전자로 클로닝을 하는 방법

실시 예 9와10에 따라 피부 유전자 카드에서 PCR 및 RT-PCR을 수행하여 얻은 유전자 산물을 안정되게 유지하여 사용하기 위해서, 다음과 같은 방법으로 클로닝 을 수행하였다.

MMP1을 예를 들면, 이 유전자를 클로닝하기 위하여, 먼저 본 발명의 방법에 따라 피부 유전자 카드에서 얻은 시료에서 PCR을 수행하였다. 이를 위하여 프라이머를 제작하였고 (5'-CCGGTTTTTCAAAGGGAATAA-3'와 5'-CACAGTTCTAGGGAAGCCAAAG-3') 이를 이용하여 PCR을 수행하였고, 조건은 95℃에서 5분 반응 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초를 30 cycle 반응시켰다. 생성된 PCR 산물 [도 12]을 정제한 후, pGEM-T Easy vector [도 13]에 ligation 하여 클로닝 하였다.

pGEM-T Easy vector에 끼어들어간 MMP1 유전자 산물을 확인하기 위하여, sequencing PCR을 수행하였고, ABI377 기종을 이용하여 염기서열을 분석하였다 [도 14]. 그 방법은 다음과 같다.

1) MMP1 유전자 산물을 서열분석 (sequencing) 반응의 주형으로 이용하기 위해, 적합한 농도로 맞추는 것이 중요한 바, 본 발명에서는 MMP1유전자 10 ng을 이용하였다.

2) PCR 튜브에 MMP1 유전자의 순방향 또는 역방향 프라이머 가운데 하나를 3.2 pmol, 반응 혼합물 (Terminator ready reaction mix; Perkin Elmer, USA) 8㎕를 넣고 최종 20㎕가 되도록 멸균 증류수를 넣어 잘 혼합한다.

3) 상기 혼합물을 96℃에서 10초, 50℃에서 5초 및 60℃에서 6분간 25회, 진앰프 2700 열 순환기를 사용하여 sequencing PCR 반응을 수행하였다.

4) 얻어진 반응 산물을 에탄올로 침전시키고 원심분리하여 유리 프라이머 (free 프라이머)와 반응혼합물 (terminator ready reaction mix)내의 형광부착 디디옥시뉴클레오티드 (dideoxynucleotide) (fluorescence labeled ddNTPs)를 제거하고 건조시켰다.

5) 이렇게 얻어진 DNA는 포름아마이드, 25mM EDTA (pH 8.0), 블루 덱스트란 (blue dextran) 혼합물과 로딩 (loading) 완충용액 10㎕를 혼합하여, 끓는 물에서 5분간 변성시킨 후, 샘플을 얼음에 놓고 미리 5.5% 롱 레인저 겔로 캐스팅 (casting)한 플레이트의 각 웰에 변성 DNA 샘플을 넣고 2 내지 4시간 동안 전기영동을 수행하여 ABI377 자동서열분석기 (Perkin Elmer, USA)의 소프트웨어를 이용하여 염기서열을 분석하였다.

서열 분석 결과 MMP1 유전자가 정확하게 증폭되었음을 확인하였고, 따라서 본 발명의 방법에 따라 증폭된 유전자 산물은 pGEM-T Easy vector에 끼어 들어가 안정된 상태로 유지할 수 있음을 확인하였고, 이는 나아가 유전자돌연변이 검사와 암 검색에도 유용함을 나타내는 것이다.

실시 예. 13. 피부 유전자 카드에서 PCR-RFLP를 하는 방법

본 발명의 피부 유전자 카드를 이용하여 채취 및 보관하였던 피부 게놈의 DNA검체를 대상으로 PCR 후 RFLP 분석방법을 이용하여 유전자 형(genotyping)의 검사가 가능한지를 분석하였다. 심혈관질환 발병에 연관이 있는 유전자들을 PCR한 후 다음과 같이 특정 제한 효소들로 처리하여 전기영동으로 그 결과를 분석한 결과, 다수의 유전자형을 함께 검색하는데 손색이 없음을 확인 하였다 [도 15. 도 16].

그 방법을 자세히 기술하면 다음과 같다. 본 발명의 파부유전자카드 를 이용하여 다음과 같은 성인병에 관련된 6개 유전자를 아래 표와 같은 반응액을 이용하여 PCR 튜브에 각각 준비하였다.

상기에서 만들어진 반응액이 들어있는 PCR 튜브를 PE2700 열순환기(Perkin Elmer, USA)에 넣어 아래와 같이 각 유전자에 따라 증폭을 하였다.

1. eNOS1/2, MTHFR1/2, AGT1/2, AT1R, ACE1 유전자의 경우:

95℃/5min, 35 Cycels (95℃/30 sec, 58℃/30 sec, 72℃/40 sec), 72℃/10min

2. ACE2와 APOE1/2 유전자의 경우:

95℃/5min, 35 Cycels (95℃/30 sec, 65℃/30 sec, 72℃/40 sec), 72℃/10min

상기에서 얻어진 각각의 유전자의 PCR 산물은 EtBr이 들어있는 1.2% 아가로즈 겔 상에서 전기영동을 수행하여 확인하였다. 그 각각의 유전자 산물의 크기는 다음의 표 2와 같다.

이렇게 얻어진 PCR 산물을 가지고 RFLP를 수행하기 위해 우선 ACE 유전자 만을 제외한 나머지 5개 유전자 (eNOS, MTHFR, AGT, AT1R, APOE)의 PCR 물을 DNA Clean 및 Concentrator kit(Zymo Research Corporation, CA USA)를 이용하여 다음과 같이 정제하였다.

1. PCR 산물 (약 25㎕)에 2배 용적의 DNA 결합용액(binding solution) 50㎕를 넣는다.

2. 미리 장착한 자이모(zymo) 스핀 컬럼에 상기 1을 모두 넣고 13,000rpm에서 30초간 원심분리 한다.

3. 수집 튜브에 모아진 용액을 피펫으로 버린다.

4. 세척용 완충액 200㎕를 상기 컬럼에 넣어 13,000rpm에서 30초간 원심분리 한다 (2번 반복).

5. 빈 튜브로 13,000rpm에서 40초간 원심분리하여 남아 있는 세척완충액을 완전히 제거한다.

6. 수집 튜브를 제거하고 깨끗한 1.5ml 미세원심분리 튜브를 새 컬럼에 장착시킨 후, 멸균된 3차 증류수 20㎕를 넣고 13,000rpm에서 40초간 원심분리하여 용출(elution) 시켰다. 혹은 65℃정도로 가열한 멸균 3차 증류수를 이용하기도 한다.

상기와 같은 방법으로 정제되어 얻어진 PCR 산물에 대해 하단에 명시된 각 유전자별로 맞는 제한효소를 각 제한효소의 반응조건에 맞게 준비한 후, 37℃ 수조에서 4-6시간 반응하였고, 이후 2.5% 아가로즈 겔 전기영동에서 각 유전자의 위험도를 검색하였다.

실시예. 14. 피부 유전자 카드에서 얻은 시료로 자동염기서열분석울 하는 방법

본 발명의 피부 유전자 카드를 이용하여 피부의 편평상피암의 피부 검체를 채취 및 보관하였다가 그 게놈 DNA시료를 대상으로 자동염기서열분석법을 이용하여 유전자 형(genotyping)의 검사가 가능한지를 분석하였다. 암발병에 중요한 역할을 하는 p53 종양억제유전자를 PCR한 후 다음과 같은 방법으로 자동염기서열분석을 수행하여 분석한 결과 p53의 돌연변이를 검색하는데 문제가 없음을 확인 하였다 [도 17, 도 18, 표 4].

본 실시예의 방법을 좀 더 자세히 기술하면 다음과 같다.

본 발명의 피부 유전자 카드를 이용하여 p53 종양억제유전자의 돌연변이를 확인 하기 위해 아래 표와 같은 반응액을 이용하여 PCR 튜브에 각각 준비하였다.

상기에서 만들어진 반응액이 들어있는 PCR 튜브를 PE2700 열순환기 (Perkin Elmer, USA)에 넣어 아래와 같이 증폭을 하였다. PCR 조건은 94℃/5min, 32 Cycels (95℃/30 sec, 60℃/30 sec, 72℃/30 sec), 72℃/5min 이다.

상기에서 얻어진 유전자의 PCR 산물을 EtBr이 들어있는 1.2% 아가로즈 겔 상에서 전기영동을 수행하여 확인하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 DNA Clean 및 Concentrator kit (Zymo Research Corporation, CA USA)를 이용하여 다음과 같이 정제하였다.

1. PCR 산물 (약 25㎕)에 2배 용적의 DNA 결합용액(binding solution) 50 ㎕를 넣는다.

2. 미리 장착한 자이모(zymo) 스핀 컬럼에 상기 1을 모두 넣고 13,000rpm에서 30초간 원심분리 한다.

3. 수집 튜브에 모아진 용액을 피펫으로 버린다.

4. 세척용 완충액 200㎕를 상기 컬럼에 넣어 13,000 rpm에서 30초간 원심분리 한다 (2번 반복).

5. 빈 튜브로 13,000rpm에서 40초간 원심분리하여 남아 있는 세척완충액을 완전히 제거한다.

6. 수집 튜브를 제거하고 깨끗한 1.5ml 미세원심분리 튜브를 새 컬럼에 장착시킨 후, 멸균된 3차 증류수 20 ㎕를 넣고 13,000rpm에서 40초간 원심분리하여 용출(elution) 시켰다. 혹은 65℃정도로 가열한 멸균 3차 증류수를 이용할 수 있다.

상기와 같은 방법으로 정제되어 얻어진 p53유전자의 PCR 산물을 ABI 3130(Applied Biosystems) 자동염기분석기의 매뉴얼에 따라 처리 하여 염기서열을 분석하였다.

실시 예. 15 피부 유전자 카드에서 얻은 시료로 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이로 유전자형을 분석하는 방법

앞의 실시예 13에서와 같이 본 발명의 피부 유전자 카드를 이용하여 피부의 편평상피암의 피부 검체를 채취 및 보관하였다가 그 RNA시료를 대상으로 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이방법을 이용하여 유전자 형(genotyping)의 검사가 가능한지를 분석하였다. 암발병에 중요한 역할을 하는 p53 종양억제유전자를 PCR한 후 다음과 같은 방법으로 자동염기서열분석을 수행하여 분석한 결과 p53의 돌연변이를 검색하는데 문제가 없음을 확인 하였다 [도 18].

본 실시예를 좀 더 자세히 기술하면 다음과 같다. 본 발명에는 굿젠(주)사의 CanScan DNA chip을 사용하였다.

우선, 피부유전자 카드로부터 얻어진 RNA를 이용하여, 공지의 방법으로 cDNA를 합성하고, p53 유전자를 CanScan DNA chip에 들어있는 PCR premix를 이용하여 p53을 증폭하여, CanScan DNA chip위에 PCR 산물을 올려 놓고, 미니시퀀싱 방법으로 반응을 하여, 그 결과를 형광 스캐너를 이용하여 분석하였다 [도 19].

1. p53유전자 증폭:

PCR을 위한 premix를 아래의 표와 같이 준비를 하였다.

상기의 표와 같이 제조한 premix를 PCR machine(PE2700)을이용하여 아래의 표와 같은 조건으로 수행하였다.

2. 미니시퀀싱을 위한 PCR 산물의 분절

상기에서 얻어진 PCR product를 아래의 표와 같이 새로운 PCR 튜브에 넣어 준비를 하였다.

이렇게 준비한 혼합물을 37℃에서 1시간 반응을 한 후, 95℃에서 10분 간 끓여 준 후, 얼음에 넣어 반응을 시작하기 전 까지 보관하였다.

3. 미니시퀀싱 (minisequencing) 반응

분절시켜 준비하여 얼음 위에 준비해 놓은 분절된 PCR product 10 ㎕ 를 새로운 PCR 튜브에 넣고, 증류수를 50㎕넣어 준 후 다시 , 95℃에서 10분 간 변성 시켜 준 후, 얼음 위에 놓고, 또 다른 PCR 튜브에 아래의 표와 같이 반응액을 준비하여, 여기에 변성 시켜 준비하여 얼음 위에 준비해 놓은 분절된 PCR product를 넣어 잘 섞어 준다.

이렇게 준비한 mixture를 칩의 가장자리에 있는 구멍에 천천히 주입하였다. 그런 다음 칩을 Hybridization chamber 위에 놓고 58℃에서 20분간 반응을 한 후, Washing buffer I과 II를 이용하여 공지의 방법으로 세척을 한 후 형광스캐너를 이용하여 그 시그널을 분석하였다.

실시 예. 16. 피부 유전자 카드에서 얻은 시료로 Northern blotting 분석을 하는 방법

실시 예 8에 따라 피부 유전자 카드에서 얻은 RNA을 이용하여, 특정 유전자의 발현 유무 및 그 정도를 분석하기 위하여, Northern blotting을 수행하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다.

1) Microfuge tube에 RNA 샘플과 5x formaldehyge gel-funning buffer (0.1 M MOPS, pH7.0: 40 mM sodium acetate: 5 mM EDTA) 2 ul, formaldehyde 3.5 ul, formamide 10 ul을 넣고, H2O를 첨가하여 최종적으로 20 ul로 맞추었다.

2) 65℃에서 15 min 반응시킨 후, 5분 동안 ice에 넣어두었다. 5초간 원심분리하여 용액을 tube 아래로 모은 후 2 ul의 formaldehyde gel-loading dye와 섞었다.

3) 아가로스 겔을 1x formaldehyde gel-running buffer가 든 gel running tank에 넣고 5 V로 5분동안 pre-running 하였다.

4) 아가로스 겔은 0.6 g agarose를 DEPC-DW 31.1 ml에 넣어 완전히 녹이고 60℃정도까지 식힌 후, 10 ml 5x formaldehyge gel-funning buffer와 8.9 ml formaldehyde 용액을 첨가하여 제작하였다.

5) 샘플을 아가로스 겔에 loading 한 후 3 V/cm로 running 하였다.

6) 샘플이 약 8 cm 이동하였을 때, gel을 꺼내 0.5 ug/ml의 ethidium bromide가 포함된 0.1 M ammonium acetate 용액에 담구어 두었다.

7) 30분 후 UV아래에서 사진을 찍고, gel이 6X SSC buffer에 미리 담구어 놓은 NC filter와 3 MM paper 사이에 오도록 두었다 (3 MM papter-gel-NC filter-3 MM papter-paper towel).

8) 18시간 동안 transfer 한 후, 6X SSC buffer에 NC filter를 담가둔 후 30분간 상온에서 말렸다.

9) NC filter를 3 MM paper 사이에 끼워 넣은 후, 80℃의 vacuum oven에서 2 시간 동안 baking 하였다. NC filter를 2시간 동안 42℃에서 pre-hybridization 시켰다 (Pre-hybridization buffer: 50% formamide, 5X SSPE, 5X denhardt's solution, 0.1% SNS, 100 ug/ml denatured salmon sperm DNA).

10) 방사선 동위원소를 MMP1 유전자에 대한probe에 표지 시킨 후, 이를 hybridization 용액에 첨가하고, 16시간 동안 42℃동안 반응시켰다.

11) NC filter를 2X SSC, 0.1% SDS buffer로 5분씩 2회 washing 한 후, NC filter를 상온에서 말렸다.

12) 말린 NC filter는 X-ray film에 노출 시킨 후 유전자의 발현 유무를 검출하였다 [도 20].

실시 예. 17. 피부 유전자 카드에서 얻은 DNA시료에서 MSP로 프로모터메틸화를 분석하는 방법

고등진핵생물에서 유전물질인 DNA는 CpG dinucleotide의 cytosine 잔기의 5' 부분에서만 methylation이 일어난다 [도 21]. 이러한 변화는 많은 유전자의 promoter 부분에 위치하는 CpG island라고 알려진 CpG-rich 부분에서 주로 일어나기 때문에 유전자발현에 중요한 조절효과를 발휘한다. CpG island의 methylation의 심화는 특정유전자의 발현을 비활성화시키고, 이러한 비활성화는 사람의 암에서 주로 암억제유전자 (tumor suppressor gene)에서 많이 일어난다고 알려져 있다. 암억제유전자의 비활성화는 궁극적으로 암유발의 중요한 원인이 된다.

본 연구에서는 유전자의 프로모터메틸화를 분석함으로써 피부 유전자채취 키트에서 얻은 DNA 시료를 이용하여 유전자 검사방법중 하나인 methylation specific PCR 방법을 수립하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다.

1) 먼저, 피부 유전자 카드에서 채취한 DNA를 sodium bisulfite가 주성분인 CpGenome(tm) DNA modification kit (Cat. No. S7820, Intergen Co., NY)로 처리하여 메틸화 되지 않은 시토신을 우라실로 변화시켰다.

2) MSP는 게놈 내 시토신이 메틸화 여부에 따라 sodium bisulfite 처리 시 우라실로 변화되거나 또는 변하지 않는 특성을 이용하여, 메틸화 또는 비메틸화 염기서열에 따른 2종류의 원형(주형) 염기서열을 가정하고, 이를 토대로 두 종류의 프라이머 sets를 선택하여 PCR증폭 양상에 따라 메틸화를 평가하는 방법으로, 본 연구에 사용된 프라이머 sets의 종류는 unmethylated sequence를 증폭시킬 수 있는 프라이머 를 이용하였다.

3) 변성시킨 DNA를 주형으로 하여 PCR 후, 유전자의 증폭을 확인하였다 [도 22].

이러한 결과는 피부 유전자 카드를 이용하여 확보한 DNA시료를 대상으로 하여 MSP를 통해 특정유전자의 메틸화 여부를 조사할 수 있음을 시사한다.

실시 예. 18. 피부 유전자 카드에서 얻은 DNA시료에서 bisulfite genomic sequencing법으로 프로모터메틸화를 분석하는 방법

피부 유전자 카드에서 채취한 DNA 시료를 사용하여, 특정 유전자의 프로모터 메틸화 분석 방법 중의 하나인 Bisulfite genomic sequencing법을 실시하였다. DNA를 Sodium bisuilfite로 처리하여 화학적 변형이 일어나게 하면 DNA 염기서열중의 하나인 시토신이 우라실로 변하게 된다. 이 산물을 PCR하게 되면 메틸화 되지 않은 시토신의 위치가 티민으로 변하기 때문에 메틸화된 위치를 찾아낼 수 있다. 자세한 실험방법은 아래와 같다. 우선 자이모사의 DNA methylation kit를 사용하여 아래와 같은 과정을 거쳐 화학적인 변형을 수행하였다.

1. 90 ul DNA solution에 10 ul M-Dilution Buffer를 넣고 37°C에서 15분간 배양한다.

2. CT Conversion Reagent solution (750 ul D.W.와 210 ul M-Dilution Buffer를 넣고 vortexing하여 완전히 녹임) 200 ul를 넣고, 차광상태로 50°C에서 16시간 gently shaking incubation 한다. (남은 CT Conversion Reagent solution은 -20°C에 보관하여 1주일내에는 사용이 가능함.)

3. ice에서 10분간 incubation 하고 800 ul M-Binding Buffer를 첨가한다.

4. Zymo-Spin I Column에 mixture 600 ul를 loading하고, 25°C에서 11000 rpm (Eppendorf 원심분리기)으로 1분간 원심분리한다.

5. Collection tube 상의 waste를 버리고 나머지 샘플을 loading한 후, 25°C에서 11000 rpm (Eppendorf 원심분리기)으로 1분간 원심분리한다.

6. Collection tube 상의 waste를 버리고, M-Wash buffer 200 ul를 loading한 후, 25°C에서 11000 rpm (Eppendorf 원심분리기)으로 1분간 원심분리한다.

7. 200 ul M-Desulphonation Buffer를 loading하고 상온에서 15분간 incubation한다.

8. 25°C에서 11000 rpm (Eppendorf 원심분리기)으로 1분간 원심분리한다.

9. M-Wash buffer 200 ul를 loading한 후, 25°C에서 11000 rpm (Eppendorf 원심분리기)으로 1분간 원심분리한다.

10. 새 Collection tube로 Column을 옮기고, M-Wash buffer 200 ul를 loading한 후, 25°C에서 13000 rpm (Eppendorf 원심분리기)으로 1분간 원심분리한다.

11. 70°C prewarmed M-Elution Buffer 90 ul를 column에 loading 후, column을 1.5 ml tube로 옮겨 1분간 방치하고, 25°C에서 11000 rpm (Eppendorf 원심분리기)으로 2분간 원심분리하여 modified DNA를 elution한다.

Modified DNA를 아래와 같은 반응액을 준비하여 열 순환기로 증폭 시켰다.

증폭된 산물을 아래와 같이 2%의 아가로즈 젤에 전기영동 하여 산물을 확인하였다.

해당 증폭 산물 위치의 아가로즈 젤을 칼로 오려내어 DNA를 정제한 후 DNA Clean 및 Concentrator kit(Zymo Research Corporation, CA USA)를 이용하여 다음과 같이 정제하였다.

1. PCR 산물 (약 25㎕)에 2배 용적의 DNA 결합용액(binding solution) 50㎕를 넣는다.

2. 미리 장착한 자이모(zymo) 스핀 컬럼에 상기 1을 모두 넣고 13,000rpm에서 30초간 원심분리 한다.

3. 수집 튜브에 모아진 용액을 피펫으로 버린다.

4. 세척용 완충액 200㎕를 상기 컬럼에 넣어 13,000rpm에서 30초간 원심분리 한다 (2번 반복).

5. 빈 튜브로 13,000rpm에서 40초간 원심분리하여 남아 있는 세척완충액을 완전히 제거한다.

6. 수집 튜브를 제거하고 깨끗한 1.5ml 미세원심분리 튜브를 새 컬럼에 장착시킨 후, 멸균된 3차 증류수 20㎕를 넣고 13,000rpm에서 40초간 원심분리하여 용출(elution) 시켰다. 혹은 65℃정도로 가열한 멸균 3차 증류수를 이용하기도 한다.

정제된 DNA를 염기서열 분석기를 이용하여 염기서열을 분석하여 특정 위치의 시토신이 티민으로 바뀌었는지의 여부를 조사함으로서 메틸화를 판단할 수 있었다.

실시 예. 19. 피부 유전자 카드에서 얻은 시료로 개인 식별에 응용하는 방법

인간 염색체의 DNA에는 초 변이성 단위반복구조 (tandem repeat sequence) 가 존재한다. 이러한 반복서열에서 반복단위의 염기서열이 대개 14-70 bp 인 것을 VNTR (variable number of tandem repeats), 2-7 bp 인 것을 STR (short tandem repeats) 이라고 부른다. 즉, VNTR 또는 STR 은 일정한 중심염기서열 (core sequence) 이 직렬반복 (tandem repeat) 됨으로써 나타나는 반복염기서열 (repetive sequence) 로 사람마다 반복되는 횟수가 달라짐으로써 나타나는 길이의 다형성 (Polymorphism) 이며, 이를 검사하면 각 개인을 식별 할 수 있으며 또한 생물학적 친부, 친모 관계를 확인 할 수 있다. 이 실험에서 검사된 VNTR 유전자 좌위는 D1S80과 D17S30, STR 유전자 좌위는 D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D18S51, D21S11, FGA, 및 vWA로 하여 총 11 개의 유전자 좌위를 비교 하였다.

19-1. VNTRs-PCR 및 STRs Loci Multiplex PCR

상기 피부 채취 키트를 이용하여 피부를 채취한 후 게놈 DNA를 추출하며, 특정 VNTRs-PCR 및 AmpFlSTR Profiler Plus PCR 증폭 Kit (Applied Biosystems사)를 이용한 멀티플렉스-PCR을 수행하여 특정 유전자들을 증폭하였다. PCR 결과는 아래와 같으며 이는 채취된 피부 검체로부터 적합한 DNA를 획득 분석할 수 있음을 의미한다 [도 26, 도 27].

19-2. 인간의 개인 식별 (Human Identification) 검사

상기 실시한 방법을 이용하여 게놈 DNA를 획득하고, AmpFlSTR Profiler Plus PCR 증폭 Kit (Applied Biosystems사)를 통해 사람마다 반복되는 횟수가 달라짐으로써 나타나는 길이의 다형성 (Polymorphism) 인 STR (short tandem repeats) 를 획득하여 ABI 3130xl Genetic analyzer (Applied Biosystems사)를 통해서 결정하고, GeneMapper ID Program (Human Identification Detecton, Applied Biosystems 사) 을 도 28에서와 같이 분석하였다.

실시 예. 20. 피부 유전자 카드에서 얻은 시료로 염기서열분석장비를 이용하여 약물유전체학적 검사에 응용하는 방법

개개인의 SNP를 파악함으로써 그 개인의 특정 약물에 대한 반응 및 부작용의 발병 여부를 파악할 수 있다. 이를 소위 약물유전체검사 (pharmacogenomics)라고 하며, 이는 약물 개발과 맞춤식 약물의 선택, 그리고 약물의 이상반응에 의한 부작용 최소화에 도움이 된다. 이에 본 피부 유전자 카드로 얻은 시료를 대상으로 염기서열분석장비를 이용하여 약물대사에 관련되는 대표적인 유전자의 SNP를 분석하는 것이 가능함을 확인하였다. 그 방법은 다음과 같다. 이러한 결과는 본 발명의 본 피부 유전자 카드로 얻은 시료로 중요 약물의 대사에 관련되는 유전자의 SNP를 파악하는 것이 가능하며, 따라서 향후 어떤 개인의 특정 약물에 대한 반응 및 부작용의 발병 여부를 예측하며 맞춤식 약물을 선택하며 약물의 부작용을 최소화하는 데 도움이 될 수 있을 것임을 가리킨다.

20-1. CYP2D6 Genotyping

상기 피부 채취 키트를 이용하여 피부를 채취한 후 게놈 DNA를 추출하여 대표적인 약물대사 관련 유전자 CYP2D6의 Genotype 분석을 실시하였으며, Genotype 결과를 토대로 genotype과 allele Frequency를 얻었다. 본 결과는 채취된 피부 검체로부터 적합한 DNA를 획득 분석할 수 있음을 의미한다.

실시 예. 21. 피부 유전자 카드에서 얻은 시료로 영양유전체학적 검사를 수행하고 응용하는 방법

21-1. 염기서열분석장비 이용 방법

이 검사는 산화적 스트레스 (Oxidative stress), 간 해독 (Liver Detoxification), 심혈관 (Cardiovascular Health), 호르몬 대사 (Hormone Metabolism), 면역력 / 골격 유지 (Immuno / Osteo Health) 관련 유전자의 돌연변이를 유전공학적 기법[멀티플렉스-PCR (Polymerase Chain Reaction) / SNaPshot Multiplex method를 통한SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) 분석]을 통해 개인별 유전적인 다양성 (Genetic Polymorphism)을 파악하는 것이 기본 원리이다.

21-2. Single 또는 Multiplex PCR

상기 피부 채취 키트를 이용하여 피부를 채취한 후 게놈 DNA를 추출하며, 특정 Single 및 멀티플렉스-PCR 프라이머s를 이용하여 PCR을 수행하여 특정 유전자들을 증폭하였다 [도 31]. PCR 결과는 채취된 피부 검체로부터 적합한 DNA를 획득 분석할 수 있음을 의미한다.

21-3. Sequencing 및 SNaPshot Multiplex reaction 분석

상기 실시한 방법을 이용하여 게놈 DNA를 획득하여 유전자 염기서열 (Sequencing) 분석 및 SNaPshot Multiplex Kit (Applied Biosystems 사)를 이용하여 개인적 유전자 염기서열 다양성 (SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms)을 측정하여 Genotyping (ABI 3130xl Genetic analyzer, GeneMapper Program)을 실시 하였다 [도 32, 도 33].

21-4. Anti-aging 및 Well being Chip을 이용한 분석

피부유전자로부터 상기 예 3의 방법으로 얻어진 지노믹 DNA를 사용하여, 다음과 같은 방법으로 영양유전체에 관계하는18개 유전자 (비만, 항산화 스트레스, 독소제거, 심혈관 질환, 호르몬 대사, 알러지 및 골대사에 관여하는 유전자)를 공지의 방법을 이용하여 멀티플랙스 방법으로 증폭한 후, 본사의 AW(Anti-aging 및 Well being) chip을 이용하여 분석한 결과, 영양유전체 검사를 하는데 문제가 없음을 확인 하였다 [도 34]. 그 상세한 방법은 다음과 같다.

1. 미니시퀀싱을 위한 PCR 산물의 분절

18개 유전자의 20개 PCR product를 아래의 표와 같이 새로운 PCR 튜브에 넣어 준비를 하였다.

이렇게 준비한 혼합물을 37℃에서 1시간 반응을 한 후, 95℃에서 10분 간 끓여 준 후, 얼음에 넣어 반응을 시작하기 전 까지 보관하였다.

2. 미니시퀀싱 반응

분절시켜 준비하여 얼음 위에 준비해 놓은 분절된 PCR product 10 ㎕ 를 새로운 PCR 튜브에 넣고, 증류수를 50㎕넣어 준 후 다시 , 95℃에서 10분 간 변성 시켜 준 후, 얼음 위에 놓고, 또 다른 PCR 튜브에 아래의 표와 같이 반응액을 준비하여, 여기에 변성 시켜 준비하여 얼음 위에 준비해 놓은 분절된 PCR product를 넣어 잘 섞어 준다.

이렇게 준비한 mixture를 칩의 가장자리에 있는 구멍에 천천히 주입하였다. 그런 다음 칩을 Hybridization chamber 위에 놓고 58℃에서 20분간 반응을 한 후, Washing buffer I과 II를 이용하여 공지의 방법으로 세척을 한 후 형광스캐너를 이용하여 그 시그널을 분석하였다.

실시 예. 22. 피부 유전자 카드에서 얻은 시료로 유전병진단에 응용하는 방법

상기 피부 채취 키트를 이용하여 피부를 채취한 후 게놈 DNA를 획득하여 APC 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 40순환의 PCR을 수행하여 해당 유전자를 증폭하였다. 증폭 산물을 도 35와 같이 아가로즈 젤 상에서 전기영동을 수행한 후 증폭된 산물의 크기에 맞는 위치의 산물을 칼로 채취하여 DNA만을 다시 정제하였다. 정제된 산물을 3130 sequence analyze system을 이용, 염기서열을 분석하여 염기서열 상의 점 돌연변이가 존재하는지 확인하였다 [도 36].

실시 예. 23. 피부 유전자 카드에서 얻은 시료로 피부암관련 유전자의 검사를 수행하여 진단에 응용하는 방법

흑색종 환자의 암종괴에서 본 발명의 피부 유전자 카드로 일부 조직을 채취한 후 여기에서 RNA를 RNA extraction kit (iNtRON)를 이용하여 추출한 후, cDNA를 합성한 후 PCR을 통해 MAGE유전자와 house keeping gene인 β-actin의 발현 여부를 확인하였다. 각각 유전자 별로 특이적인 프라이머를 이용하였으며, 이를 40 순환으로 증폭시켜 Melanoma antigen (MAGE)의 발현을 확인하였다 [도 37].

실시 예. 24. 피부 유전자 카드에서 얻은 시료로 피부감염 관련 유전자의 검사를 수행하여 진단에 응용하는 방법

황색포도구균 Staphylococcus aureus, 특히 methicillin resiastant staphylococcus (MSR) / 농포성 모낭염, 모창, Atopy, Tetracycline resistance

: PCR/ Sequencing/ Chip

상기의 피부유전자 카드를 이용하여 얻어진 검체를 다음과 같은 방법으로 DNA를 얻어 본사의 Staphylococcus aureus PCR kit를 이용하여 감염질환의 유무를 분석한 결과, 감염질환을 검사를 하는데 문제가 없음을 확인하였다. 상세한 방법은 다음과 같다.

1. 피부유전자 카드에서DNA 분리하는 방법

1) 1.5㎖ 튜브에 채취한 샘플을 1.5㎖을 옮겨 미세원심분리기에 넣고, 12,000 rpm에서 2분간 원심 분리하여 세포를 가라앉힌다.

2) 상층액을 제거하고 500㎕ 1x PBS로 첨가한다.

3) Vortex를 이용하여 세포를 용액과 잘 섞어 준다.

4) 12,000 rpm에서 2분간 원심 분리하여 상층액을 제거한다.

5) 200㎕ Buffer TL를 첨가한다.

6) 20㎕ Protease K를 첨가한 후, vortex를 이용하여 잘 혼합하여 준다.

7) 항온조 56℃에서 30분간 정치 반응한다.

8) 반응이 끝난 튜브는 8,000 rpm이상에서 10초 정도 spin down하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.

9) 400㎕ Buffer TB를 첨가하고, 잘 혼합하여 준다. 8000 rpm이상에서 10초 정도 spin down하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.

10) Spin column을 Collection 튜브에 장착한 후, 위의 반응액을 Spin column에 넣는다.

11) 8,000 rpm에서 1분간 원심 분리한다.

12) Column을 통과한 여과액은 버리고 다시 collection 튜브를 장착한다.

13) 700㎕ Buffer BW를 첨가하고 8,000 rpm에서 1분간 원심 분리한다.

14) Column을 통과한 여과액은 버리고 다시 collection 튜브를 장착한다.

15) 500㎕ Buffer NW를 첨가하고 12,000 rpm에서 3분간 원심 분리한다.

16) Column을 통과한 여과액은 버리고 새로운 1.5ml 튜브를 장착한다.

17) 200㎕ Buffer AE 나 정제수를 column의 중앙에 첨가하고, 2분간 실온에 방치한다.

18) 8,000 rpm에서 1분간 원심 분리한다.

19) 추출된 게놈DNA는 곧바로 PCR에 사용 가능하며, 장기간 보존 시에는 -20℃에 보관할 수 있다.

20) 추출된 게놈DNA는 0.8% 한천 젤에 전기 영동하여 UV하에서 확인 가능하다.

2.Staphylococcus aureus 의 감염유무 확인 PCR 방법

1) PCR 튜브에 2x master mix 12.5㎕를 넣고, 프라이머 mix 2.5㎕를 넣어 준 후, 주형 DNA를 10㎕를 넣어 최종 25㎕로 만든 후, 잘 섞어 주었다.

2) 상기와 같이 만든 mixture를 PCR machine에 넣어 다음의 표와 같은 조건으로 PCR 을 진행 하였다.

3) 반응이 끝난 PCR product 5㎕를 2% 아가로즈 겔에 넣어 전기영동을 수행한 후, 228bp 크기의 산물을 확인하였고, 이를 확인하기 위하여 시퀀싱을 수행하였다 (도 38).

실시 예. 25. 피부 유전자 카드에서 얻은 시료로 성감염 관련 유전자의 검사를 수행하여 진단에 응용하는 방법

상기의 피부 유전자 카드를 이용하여 얻어진 검체 (피부, 구강점막. 질, 홍문주위)를 다음과 같은 방법으로 DNA를 얻어 본사의 12 STD Multiplex PCR kit를 이용하여 성전파성 질환의 유무를 분석한 결과, STD 검사를 하는데 문제가 없음을 확인 하였다. 상세한 방법은 다음과 같다.

1. 피부 유전자 카드로부터 DNA 분리

1) 1.5㎖ 튜브에 채취한 샘플을 1.5㎖을 옮겨 미세원심분리기에 넣고, 12,000 rpm에서 2분간 원심 분리하여 세포를 가라앉힌다.

2) 상층액을 제거하고 500㎕ 1x PBS로 첨가한다.

3) Vortex를 이용하여 세포를 용액과 잘 섞어 준다.

4) 12,000 rpm에서 2분간 원심 분리하여 상층액을 제거한다.

5) 200㎕ Buffer TL를 첨가한다.

6) 20㎕ Protease K를 첨가한 후, vortex를 이용하여 잘 혼합하여 준다.

7) 항온조 56℃에서 30분간 정치 반응한다.

8) 반응이 끝난 튜브는 8,000 rpm이상에서 10초 정도 spin down하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.

9) 400㎕ Buffer TB를 첨가하고, 잘 혼합하여 준다. 8000 rpm이상에서 10초 정도 spin down하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.

10) Spin column을 Collection 튜브에 장착한 후, 위의 반응액을 Spin column에 넣는다.

11) 8,000 rpm에서 1분간 원심 분리한다.

12) Column을 통과한 여과액은 버리고 다시 collection 튜브를 장착한다.

13) 700㎕ Buffer BW를 첨가하고 8,000 rpm에서 1분간 원심 분리한다.

14) Column을 통과한 여과액은 버리고 다시 collection 튜브를 장착한다.

15) 500㎕ Buffer NW를 첨가하고 12,000 rpm에서 3분간 원심 분리한다.

16) Column을 통과한 여과액은 버리고 새로운 1.5ml 튜브를 장착한다.

17) 200㎕ Buffer AE 나 정제수를 column의 중앙에 첨가하고, 2분간 실온에 방치한다.

18) 8,000 rpm에서 1분간 원심 분리한다.

19) 추출된 게놈DNA는 곧바로 PCR에 사용 가능하며, 장기간 보존 시에는 -20℃에 보관할 수 있다.

20) 추출된 게놈DNA는 0.8% 한천 젤에 전기 영동하여 UV하에서 확인 가능하다.

2. STD Multiplex PCR kit를 이용한 PCR (Polymerase Chain Reaction) 방법

Set A (UU, MH, CTR, TV, MG 및 NG Mix)

Set B (HD, GV, TP, HSV, CA 및 HPV Mix)

1) 12.5㎕ 의 2x Master mix 를 PCR 튜브에 넣고

2) 4.5㎕의 STD 프라이머 A (or B)set 를 넣은 후, 3㎕의 게놈 DNA를 첨가 한 후, 증류수로 최종 25㎕가 되게 만들어 준다음 잘 섞어준 후, PCR machine에서 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행 하였다.

3) 94℃ 15분간 변성시켜 주고, 94℃ 30초, 58℃ 1.5분, 72℃ 1.5분간 40 Cycles을 진행하고, 마지막으로 72℃ 10분 간 반응을 하였다.

4) PCR 수행 후, 7-8㎕의 PCR product를 2% 아가로즈 겔에 넣어 전기영동을 한후 UV하에서 확인하여 다음의 표에 나타낸 PCR product 크기를 비교하여 분석하였다 [도 39].

실시 예. 26. 피부 유전자 카드에서 얻은 시료로 바이러스 감염 관련 유전자의 검사를 수행하여 진단에 응용하는 방법

상기의 피부유전자 채취 키트를 이용하여 얻어진 피부, 구강점막. 질, 홍문주위 조직에서 다음과 같은 방법으로 DNA를 얻고, 굿젠 ㈜의 성전파성 질환 (sexually transmitted disease, STD)에 대한 멀티플레스 형의 PCR 키트와 염기서열분석 장비를 이용하여 성전파성 질환의 유무를 분석한 결과, STD 검사를 하는데 문제가 없음을 확인 하였으며 [도 39], 그 중 인유두종 바이러스 (human papilloma virus, HPV)의 감염유무는 굿젠 ㈜의 GG HPV Genotyping Chip을 사용하였다 [도 40]. 그 상세한 방법은 다음과 같다.

1. 피부유전자 채취키트로부터 DNA 분리

1) 1.5㎖ 튜브에 채취한 샘플을 1.5㎖을 옮겨 미세원심분리기에 넣고, 12,000 rpm에서 2분간 원심 분리하여 세포를 가라앉힌다.

2) 상층액을 제거하고 500㎕ 1x PBS로 첨가한다.

3) Vortex를 이용하여 세포를 용액과 잘 섞어 준다.

4) 12,000 rpm에서 2분간 원심 분리하여 상층액을 제거한다.

5) 200㎕ Buffer TL를 첨가한다.

6) 20㎕ Protease K를 첨가한 후, vortex를 이용하여 잘 혼합하여 준다.

7) 항온조 56℃에서 30분간 정치 반응한다.

8) 반응이 끝난 튜브는 8,000 rpm이상에서 10초 정도 spin down하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.

9) 400㎕ Buffer TB를 첨가하고, 잘 혼합하여 준다. 8000 rpm이상에서 10초 정도 spin down하여 뚜껑에 묻어 있는 용액을 떨군다.

10) Spin column을 Collection 튜브에 장착한 후, 위의 반응액을 Spin column에 넣는다.

11) 8,000 rpm에서 1분간 원심 분리한다.

12) Column을 통과한 여과액은 버리고 다시 collection 튜브를 장착한다.

13) 700㎕ Buffer BW를 첨가하고 8,000 rpm에서 1분간 원심 분리한다.

14) Column을 통과한 여과액은 버리고 다시 collection 튜브를 장착한다.

15) 500㎕ Buffer NW를 첨가하고 12,000 rpm에서 3분간 원심 분리한다.

16) Column을 통과한 여과액은 버리고 새로운 1.5ml 튜브를 장착한다.

17) 200㎕ Buffer AE 나 정제수를 column의 중앙에 첨가하고, 2분간 실온에 방치한다.

18) 8,000 rpm에서 1분간 원심 분리한다.

19) 추출된 게놈DNA는 곧바로 PCR에 사용 가능하며, 장기간 보존 시에는 -20℃에 보관할 수 있다.

20) 추출된 게놈DNA는 0.8% 한천 젤에 전기 영동하여 UV하에서 확인 가능하다.

2. HPV 칩을 위한 PCR 방법

1) 각 프라이머에 정해진 양만큼 정제수를 첨가하여 완전히 녹인다. 완전히 녹인 후에는 -20℃에 보관할 수 있다. 정제수 첨가량은 다음의 표6과 같다.

2) L2, H2 프라이머의 경우, cyanine 5로 말단이 라벨되어 빛에 약하므로 은박 호일로 싸서 보관한다.

각 반응 튜브당 조성은 다음과 같다.

1) 한 샘플당 2개씩(유전자 L및 H용)의 premix를 얼음 위에 준비한다.

2) L과 H유전자에 각각에 대한 2개의 master mix용 튜브를 준비한다.

3) Master mix용 1.5㎖ 튜브에 필요 양의 정제수를 각각 넣는다.

4) 각 master mix 튜브에 필요한 개수에 해당하는 프라이머세트(L1과 L2 세트, H1과 H2세트)를 첨가하여 잘 섞는다.

5) 위 과정에서 준비한 L과 H master mixture를 각각의 Premix 튜브에 각각 10㎕씩 분주한다.

6) 주형(게놈 DNA)를 프라이머가 첨가된 premix 튜브에 각각 5㎕를 첨가한 후, 잘 섞어준다.

7) 원심 분리기에서 간략하게 spin-down후, PCR machine에 넣어 아래의 표8와 같이 반응시킨다.

선택 사항) HPV 증폭 DNA의 확인

- 증폭된 DNA는 다음과 같이 2% 한천 젤을 이용하여 전기 영동으로 확인 가능하다.

3. HPV DNA chip 반응

1) 반응할 샘플 수만큼 새로운 1.5㎖나 200㎕ 튜브를 준비한다.

2) 위 튜브에 50㎕씩 정제수를 분주한다.

3) HPV PCR산물 중 L1은 10㎕를 첨가하고, H산물은 5㎕를 첨가하여 잘 섞는다.

4) 위 튜브를 95℃로 준비한 heat block에 3분간 방치한다.

5) 위 튜브를 바로 얼음에서 5분간 방치한다.

6) 반응 튜브를 원심분리기를 이용하여 30초간 spin-down하여 용액을 떨군다.

7) 위 튜브에 HYB I Buffer를 65㎕를 첨가하여 pipette으로 잘 섞어 준다.

8) 준비한 반응액을 칩 표면에 부착된 cover slip 위에 있는 주입구(구멍)에 천천히 주입한다.

- 이때 칩과 반응 chamber사이에 기포가 있는지 부착이 잘 되어있는지를 확인한다. 혹시 기포가 있다면 글러브를 낀 손으로 기포를 밀어내듯이 쓸어준다.

9) 48℃ 반응조에서 30분간 칩을 교잡 반응시킨다.

〔교잡 반응 후 세척〕

1) 교잡 반응이 끝나면, 칩에서 cover slip을 핀셋으로 제거한다.

2) 준비한 세척 용액 washing buffer1을 Jar 에 붓고 반응한 칩을 Orbital shaker를 이용하여 실온에서 2분간 세척한다.

- 세척 용액이 들어 있는 Squeeze 병으로 2분간 칩의 반응 표면에 분사하여 세척할 수 있다.

-만약 반응 칩이 1개라면, 50㎖ conical 튜브에 40㎖의 washing buffer를 넣고 반응한 칩을 넣은 후, 상하로 2분간 흔들어 세척할 수 있다.

3) 사용한 washing buffer를 버리고 새로이 washing buffer 2를 넣어 다시 2분간 세척한다.

4) 세척 후에도 칩에 남은 버퍼를 제거하기 위해 spin dryer나 air compressor를 사용할 수 있다 (간단히 킴와이프 종이로 살짝 덮어 칩에 묻어 있는 버퍼를 제거할 수 있다. 단, 손으로 반응 부위를 만져서는 절대 안 된다).

4. 결과 판독

1) 위의 결과에서 모든 H spot의 SBR이 2.5이상이며, L1 spot 모두 SBR 2.5이상일 때만 양성으로 판단한다.

2) HBB SBR 2.5이상이며 L1 두 spot중에 단일 spot만 SBR 2.5이상일 경우, 재시험한다.

3) HBB spot 모두 SBR2.5가 넘지 않을 경우, 검체의 샘플링부터 다시 한다.

4) SBR 결과 판독 시 단일 spot만이 SBR값이 양성 또는 음성으로 나올 경우, 재시험한다.

실시 예. 27. 피부 유전자 카드에서 얻은 시료로 결핵감염 관련 유전자의 검사를 수행하여 진단에 응용하는 방법

결핵의 유병률은 최근 다시 느는 추세이며, 특히 항균제 내성 균주의 창궐이 보고되고 있어서 많은 우려를 낳고 있다. 이에 본 피부 유전자 카드와 유전자검사로 진단이 모호한 피부결핵의 진단에 도움이 되는 지를 다음과 같이 조사하였다. 생검에 의해 피부 결핵으로 확진된 환자의 피부병변 검체를 본 발명의 피부 유전자 카드로 채취한 후 이를 원심분리튜브에 넣고 4% NaOH로 처리 하고 전체 용적이 50 mL가 되도록 멸균증류수를 첨가 혼합 후 3,000 rpm으로 20분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 침전물을 Tris EDTA (10 mM Tris-HCl [pH 8.0 ],1 mM EDTA)완충액으로 풀어 7,000 rpm으로 5분간 원심 분리하는 과정을 2 회 더 반복 후 상층액을 완전히 제거한 후 침전물을 50-200㎕의 5%Chelex 100과 Tris EDTA 완충액에 용해시켰다. 이를 10분간 끓여준 후 12,000 rpm으로 5분간 원심분리 하였다. 상층액 1-2 ㎕를 취하여 중합효소연쇄반응에 사용하였다. 반응 혼합 10mM Tris-HCl (pH 8.0), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 400μM, dNTPs, 20pM 프라이머 sets, 2.5U Taq DNA polymerase를 넣어 최종 18㎕가 된 mixture에 2㎕의 상층액을 넣어 20 ㎕가 되도록 하여 잘 섞어 준 후 다음의 표와 같은 조건으로 중합효소연쇄반응을 수행하였다.

이차 중합효소연쇄반응 후 준비된 2 %아가로즈겔에 90 V 에서 40분간 이동시킨 후 겔판을 transilluminator 위에 올려 놓고 DNA 분획을 확인하여 285 bp 크기의 분획이 보이면 양성으로 판정하였다. DNA 크기 표지자는 100 bp DNA ladder를 이용하였고, 임상검체에서 분리된 Mycobacterium tuberculosis 균주에서 DNA를 추출하여 양성대조로 하였다. 중합효소연쇄반응의 교차오염을 줄이기 위해 검체에서 DNA를 추출하는 과정과 증폭하는 과정을 각각 분리하여 실시하였다 [도 41].

실시 예. 28. 피부 유전자 카드에서 얻은 시료로 피부의 상태와 건강에 관여 하는 유전자의 발현을 검사하는 방법

피부에서 정상 내지 병리적으로 발현된다고 문헌에 보고되는 여러 유전자 들 중에서 피부의 상태 파악과 분류, 나아가 맞춤식 피부관리 결정에 도움이 될 수 있을 것으로 추측되는 유전자를 선정하였다. 1차 검사를 통해 피부의 기질단백의 합성 및 분해, 지질대사, 멜라닌합성, 보습, 피부세포의 증식과 재생, 손상 복구, 분화, 사망 등에 중요한 역할을 하며, 나아가 피부 노화나 광노화, 재생, 미백, 탄력, 보습, 유분, 면역과 염증 등에 관계하는 8개 군의 전체 31개 유전자들을 선정하였으며, 이들과 housekeeping 유전자인 베타-액틴에 대해 각각 RT-PCR및 실시간 PCR의 조건을 수립하였다. 각 유전자별 RealTime PCR에 적합한 프라이머의 유전자 염기 서열과 반응조건은 아래 표 11과 같다.

구체적인 실예로 MMP1과 HAS3, AQP3, Tyrosinase, TRP3을 실시간 PCR 실험과 그 결과를 아래에 기제하였다 (실예로 사용한 5가지의 유전자에 대한 실시간 PCR 조건은 모두 동일함) [도 42- 도 46].

28-1. 피부 유전자 카드부터 채취한 RNA로부터 one- step RT-PCR 및 RT-PCR

- Roche사의 Light Cycler ver3.5을 이용하여 Quiagen 사의 RT-PCR kit (Cyber Green Cat# : 204243) 를 이용하였으며 주형는 위 상등액 8ul를 사용하였다.

- 프라이머로는 아래 표1에서 선정된target 유전자의 프라이머 사용하였다.

- 실시간 PCR을 위해서 상기Cyber Green kit (Cat# : 204243) 를 사용하였다.

1) RT-PCR

a. 채취한 RNA를 1 ug을 microtube에 넣는다.

b. oligo dT (100 pmol) 1 ul를 항목 a에 첨가한다.

c. 95℃에서 5분 둔다.

d. ice에 5분 둔다.

e. 10 mM dNTP와 Expand RTase (Roche) 20 unit, 5x RT buffer 3 ul, RNase inhibitor 5 unit을 넣고 H2O로 최종 30 ul로 맞춘다.

f. 43℃에서 1 시간 둔 후, 95℃에서 5분 둔다.

g. 4℃에서 보관한다 (cDNA 합성 완료).

2) Real-time PCR

a. Light Cycler의 반응 조건을 아래와 같이 맞춘다.

역전사 : 50℃, 20 min.

Pre 변성 : 94℃, 5min.

증폭 : 94℃, 15sec / 55℃, 20sec / 72℃, 20sec.

Melt curve analysis : 95℃, 5sec / 64℃, 15sec / 95℃, 0sec.

Cooling: 40℃, 30sec

b. 아래와 같이 실시간 PCR용 반응 액들을 섞는다.

Cyber Green mix 10㎕

RT mix 0.2㎕

프라이머 1㎕

주형 4, 6, 8㎕

DEPC water 4.8 ㎕ (각 샘플당 최종 20 ul로 맞춘다).

c. Control용 GAPDH는 다음과 같이 섞는다.

4㎕, 6㎕, 8㎕ 주형

4.8㎕, 2.8㎕, 0.8㎕ DEPC H2O

프라이머 1ul

cyber green mixture 반응액 10.2ul (각 샘플당 최종 20 ul로 맞춘다).

* cyber green mixture 반응액: cyber green mix 185ul에 RT mix 3.7㎕를 섞음

d. Capillary에 샘플을 넣고 capillary의 뚜껑을 닫는다.

e. Table top Spin 에서 Quick으로 spin down한다.

f. Light Cycler에 Capillary를 거치 후 run start.

실시 예. 29. 피부 유전자채취 키트에서 얻은 시료로 피부의 상태와 건강에 관게하는 유전자의 발현을 검사하여 이를 이용하여 맞춤식 피부관리 지침을 세우는 방법

본 실시예는 앞의 실시예 28에서 수립된 유전자검사법을 피부관리와 미용학, 화장품학에 응용하려는 데 목적이 있다. 무엇보다도 피부의 유형을 더 정확하고 객관적으로 분류하며, 나아가 그 결과에 따라 맞춤식의 피부관리나 맞춤식 화장품 및 미용약물을 선택하는 데 도움이 될 수 있도록 시스템을 수립하고자 하였다. 특히 미용과 화장품학에서 가장 문제가 되는 것이 건성 피부와 민감성 피부, 자연 혹은 광 노화 피부 들인 바 유전자검사를 통해 이들을 정확히 감별하고 원인을 정확히 분석함으로써 정확한 진단과 맞춤식 처치가 가능하도록 하는 데 주안을 두었다. 이를 위해 연령이 18세에서 50세 사이인 대한민국의 성인 여성 150 명을 대상으로 하여 본 연구를 하였다. 대상자들은 모두 미용클리닉이나 피부과클리닉에 내원했던 사람들로 문진과 이학적검사, 다양한 기계적 검사를 거쳐 의료진에 의해 그 피부유형이 판정되었던 사람들로서 모두 본 유전자 검사에 자원하였다. 이들 중 140례 에서는 Aphrodite 피부검사장비 (PSI 주식회사, 서울, 대한민국)를 이용한 피부 상태 판정도 거쳤다. 본 검사장비에서는 피부의 유성 (oily condition) 정도와 수분함유 정도, 각질의 두께를 측정하며, 모공의 크기와 주름의 굵기를 측정한 후 유성정도와 건성정도, 노화정도를 예측한다. 본 연구의 대상이 된 150명 중 78명 (52.0%)이 정상 피부군, 24명이 건성 피부군 (16.0%), 16명이 지성 피부군 (10.7%), 32명이 복합 피부군 (21.7%)으로 각각 판정되었다. 이 중 12명은 중한 민감성 피부를 가지고 있는 것으로 나타났으며, 19명은 뚜렷하게 피부노화의 소견을 보이는 것으로 진단되었다. 22명은 기미 (melasma)가 많은 형태를 보였다.

여기에서 정상 피부군은 피부질환이 없으며 본인이 특별한 불편함을 못 느끼는 상태로 각질화나 각질세포의 탈락, 수분의 유지, 피지와 땀 분비의 균형이 잘 유지된 상태이다. 이들 경우 피부결이 섬세하고 윤기가 있으며, 피부표면이 매끄럽고 탄력성이 좋으며, 모공이 미세하고 피부색이 맑다. 이들의 경우 규칙적인 기초 관리로 유, 수분의 균형을 유지해 주면 충분하다.

건성 피부형은 각질층의 수분 함량이 감소된 형으로 Corneomoter로 측정하면 각질의 수분보유능력이 비정상적으로 낮게 나타난다. 아울러 Evaporimeter로 측정하면 경표피수분소실이 비정상적으로 증가되어 나타난다. 피부표면이 거칠고 인설이 생기며 미세한 자극에도 쉽게 손상을 받는다. 피부결은 섬세하나 탄력이 소실되고 피부가 얇아져서 노화가 앞당겨지고 소실되고 흔히 민감한 반응을 보인다. 세안 후 피부가 당기는 느낌이 들며, 소양감이 있고, 화장이 잘 받지 않으며, 겨울에 증세가 더 심해진다. 건성 피부는 민감성 피부나 노화 피부로 악화되기 쉽다.

지성 피부는 얼굴에 기름기가 많아서 빈들거리며, 피부가 거칠고 모공이 커져 있다. 특히 소위 T 부위인 이마와 코, 턱에 뚜렷하게 나타난다. 여드름과 모세혈관 확장이 흔히 동반되며 사춘기 이후의 젊은 나이에 잘 생긴다.

복합피부는 2가지 이상의 피부유형이 혼합되어 존재하는 것이다. 특히 이마, 코, 턱 등 소위 T영역에는 지성이고, 뺨과 눈주위의 소위 U영역에는 정상이거나 건성으로 나타나는 경우가 많다. 이런 경우 이마에는 여드름과 면포 (comedon)가 잘 생기고 눈가에는 주름이 잘 생기며, 같은 종류 화장품을 여러 부위에 함께 사용할 때 잘 받지 않고 부작용이 오는 경우도 많다. 주로 중년 이후에 흔하다.

민감성 피부는 계절이나 온도 변화, 스트레스, 자외선 등의 환경적 변화나 화장품, 비누 등의 접촉물질에 대해 예민한 반응을 보이는 경우이다. 소양증을 흔히 호소하며 피부에 발적 (flare)과 염증 반응이 잘 생기며, 피부의 색소 침착과 미세 모세혈관 확장이 흔히 동반된다 (안 성구, 이 승헌. 피부미학. 고려의학. 2002년).

피부의 노화에는 자연의 내인성 내지 연대기적 노화 (intrinsic, chronological aging), 유전적 노화, 광 노화 (solar 혹은 photo aging), 생활습관에 따른 노화, 내분비에 의한 노화, 만성소모성 질환에 의한 노화, 중력에 의한 노화 등 여러 가지 유형이 있다 (Pierrrd GE. Ageing across the life span: time to think again. Journal of Cosmetic Dermatology. 3:50-53;2004), 그 중 가장 흔하고 중요한 2가지 유형은 내인성 노화와 광노화이며, 이 양자는 발병 기전과, 병태, 예후가 서로 다르다. 내인성 노화의 경우 피부결은 매끈하며 주름은 가늘고 얇으며, 표피는 얇아지고 탄력섬유 (elastic fiber)는 정상이거나 감소하며, 미세 혈관구조가 약간 감소하며, 피부에 종양이 생기더라도 거의 항상 양성 종양만 생긴다. 이에 대해 광노화는 피부의 전층 조직이 일광, 특히 자외선에 의해 손상을 받고, 이것이 비정상적으로 교정이 되면서 발생한다. 광노화의 경우 피부가 거칠고 두꺼워지고 거칠고 깊은 주름이 생기며, 탄력섬유가 비정상적으로 두꺼워져서 유두진피에 그렌즈영역 (Grenze zone)이 나타나는 소위 일광 탄력섬유증 (solar ealstosis)을 보이고, 미세혈관은 현저히 감소하나 흔히 모세혈관이 확장되며 붉은 빛을 띠고, 피부에 전암 병변이 드물지 않게 나타나며, 악성 종양이 발생할 수 있다 (대한 피부과학 교과서 편찬위원회. 피부과학. 개정4판. 여문각. 2001년).

본 연구의 대상인 들에서 각각 얼굴의 이마와 빰 및 눈가 주름 부위에서 각각 본 발명의 피부 유전자 카드를 이용하여 피부를 채취하였으며, 이들 검체 내 RNA를 시료로 하여 각각 앞의 실시예 28에서의 방법대로 30개 피부관련 중요유전자와 하우스키핑유전자인 베타 액틴에 대해 각각 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 이후 각각에서 표적유전자의 발현 정도가 특정 피부 유형별로 차이가 있는 지를 통계분석 하였으며, 특정 피부 유형에서 정상 피부유형 군에 비해 특정 유전자의 발현이 유의하게 상승되거나 감소되어 있는 지를 조사하였다. 여기에서 표적 유전자의 발현정도는 그 유전자와 베타 액틴 유전자의 발현 비로서 나타내었다. 만약 이 수치가 정상 피부군의 그것에 비해 유의하게 더 높게 나타나거나 유의하게 더 낮게 나타날 때는 의미가 있는 것으로 판독하고, 이 경우 특정 유전자의 과잉 발현 혹은 과소 발현이 특정 피부 유형과 관계가 있으며, 따라서 특정 피부 유형의 판별에 기준이 될 수 있을 것으로 판정하였다. 각 피부유형을 진단할 수 있는 표적 유전자의 조합을 찾고자 하였다. 예컨대 민감성 피부의 경우 정상 피부군에 비해 interleukin-1 alpha와 tumor necrosis factor alpha, intercellular adhesion molecule-1 (I-CAM1) 등의 면역 및 염증 계통 유전자의 발현이 현저하게 증가되어 나타난다. 이런 경우 과잉발현 사이토카인과 염증을 차단하는 데 주안을 두고 피부관리법을 제공하며, 자극성 있는 화장품이나 미용약물 투여는 자제해야 하며, 화장품을 투여할 때는 사전에 첩포검사로 과민반응이 나타나지 않는 지를 확인한 후 투여하도록 한다. 또 다른 예로 심각한 피부노화가 있는 경우 MMP-1의 발현이 증가되며 tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP), procollagen-1과 procollagen-3, superoxide dismutase(SOD), epidermal growth factor (EGF), keratnocyte growth factor (KGF)의 유전자의 발현은 감소된다. 이런 경우 MMP1을 억제하며 콜라젠과 성장인자, 항산화제를 보완하는 데 주안을 두고 피부관리를 한다.

그 외에 상기한 피부유형 분류에는 들지 않는 경우도 나타난다. 예컨대 멜라닌관련 유전자의 발현에 변화가 있는 경우 기미 등 색소침착이 존재하거나 호발할 위험이 크며, 이런 경우 이들 유전자의 발현을 억제하는 데 주안을 두고 화장품과 미용약물을 선택한다.

아울러 각 표적 유전자의 발현 정도와 대상인의 연령의 상관관계를 조사하여, 연령과 밀접한 관계가 있는 유전자를 찾고자 하였다. 그 결과 MMP-1의 발현 정도가 연령과 정비례하여 나타남을 확인하였고, MMP-1유전자의 발현 정도 검사가 피부의 나이를 예측하는 유력한 수단이 됨을 알 수 있었다.

이하 본 실시 예를 좀 더 상세히 기술한다.

다만 본 유전자검사는 자체만으로 절대적인 것은 아니므로 여타 검사의 결과와 종합하여 평가하는 것이 중요하다. 또한 증례 별로, 그리고 부위 별로 다양한 변형이나 혼합형이 나타나는 데 대해 잘 대처해야 한다. 아울러 피부의 유형은 끊임없이 변화할 수 있으므로 피부관리 전 후로 비교검사가 필요하며, 아울러 추적 검사를 하여 계속 피부관리를 잘 하는 것이 중요하다. 아울러 건강하고 아름다운 피부를 유지하기 위해서는 피부관리 만이 아니라 전신 건강의 유지, 적절한 식사와 영양, 좋은 생활습관과 정신건강이 중요함을 명심하여 전체적으로 건강할 수 있도록 total health care를 하는 것이 중요하다.

실시 예. 29-1: 지성 피부군의 유전자검사 와 맞춤식 피부관리에의 응용

지성피부군의 경우 각질층의 지질과 피지 내 지질의 합성에 핵심적 역할을 하는 효소인 HMG CoA reductase와 fatty acid synthase, acetyl CoA carboxylase, serine palmitoyl transferase (SPT)의 유전자와 androgen receptor유전자의 발현이 정상 피부군에 비해 유의하게 증가되어 나타났다. 이러한 결과는 이들 5가지 유전자들의 발현의 증가가 지성 피부 발생의 원인과 중요한 연관이 있으며, 이러한 유전자검사 소견을 보일 경우 지성 피부로 판정할 수 있음을 가리킨다. 따라서 이러한 유전자소견을 보일 경우 지성 피부에 맞추어서 과잉피지 제거에 주안을 두고 다음과 같이 관리하도록 한다. 다만 이 때 유의해야 할 것은 지성을 지나치게 억제하려다가 표피지질을 파괴하면 표피장벽이 파괴되고 건성 피부화할 수 있으므로 균형을 맞추어야 하며, 약한 것부터 시작하여 단계적으로 더 강한 미용약물을 사용하는 것이 옳다.

(1단계) 세정:

비누와 클렌징 로션 (cleansing lotion) 및 젤을 사용하여 세안을 한다. 세안 시 비누는 살리실산 (salicylic acid)의 성분이 있는 거품비누가 적합하다.

(2단계) 토너 사용:

세안 후 witch hazel 수렴제 (astringent)와 알코올성분이 풍부한 화장수 (skin lotion)를 이용하여 유성이 강한 이마와 두 눈가풀 사이, 코등의 소위 T 부위에 도포하여 피지를 제거한다.

(3단계) 가습제 (moisturizer) 사용:

비타민 B3 (nicianamide) 성분이나 자연의 비타민 A인 레티놀계통의 성분이 함유된 보습제를 투여하여 세정과 함께 피부 건성화를 방지한다.

(4단계) 피지 제거

남아있는 피지와 결합하여 제거하는 중합체 (polymer) 성분이 들어간 크림을 사용하며, 1주에 1-3회 팩을 하고 마사지를 하여 기름기와 노폐물을 제거한다.

(5단계) 피지 조절 화장품

남아있는 피지를 제거하기 위해 분 (talcum powder) 형태의 화장품을 사용한다.

(6단계) 비타민 제제

이상의 방법으로도 해결되지 않고 과잉 피지 분비가 계속되거나 여드름이 심하게 나타나면 합성비타민 A제제 (retinoids)를 투여한다.

실시 예. 29.2: 건성 피부군의 유전자검사 와 맞춤식 피부관리에의 응용

건성 피부군의 경우 표피 내의 강력한 수분함유물질인 히라루론산 (hyaluronic acid, hyaluronan)을 합성하는 효소인 hyaluronate synthase-3 (HAS-3)와 물경로단백 (water channel protein)인 aquaporin-3(AQP3)의 유전자, 표피의 천연보습인자 (natural moisturizing factor, NMF)의 전구물질인 profillaggrin의 유전자와 지질합성 효소인 HMG CoA reductase와 fatty acid synthase, acetyl CoA carboxylase, serine palmitoyl transferase (SPT)의 유전자, 그리고 procollagen-1 유전자의 발현이 정상 피부군에 비해 유의하게 감소되어 나타났다. 아울러 MMP-1 유전자의 발현은 증가되어 나타났다. 이러한 결과는 건성 피부의 발생원인이 상기한 유전자 변화와 깊은 연관이 있음을 가리키며, 피부에서 자연의 보습인자들을 생성하는데 문제가 있어서 수분을 못 만들 때, 지질대사이상이나 콜라겐 단백 합성에 장애가 있어서 표피장벽이 손상되고 이 때문에 수분이 소실됨으로 인해서 건성피부가 발생한다고 볼 수 있다. 이는 또한 건성 피부가 피부의 장벽 손상 및 노화와 깊은 연관이 있으며, 피부장벽에 손상이 있어서 발병하는 각종 피부질환, 예컨대 습진이나 건선, 어린선 (icthyosis), 아토피피부염 (atopic dermatitis), 그리고 노인성 피부, 당뇨환자의 피부 등에서 건성 피부가 흔하게 발생하는 것도 상기한 메커니즘 때문인 것으로 볼 수 있다. 또한 상기한 유전자 변화소견을 보일 때 건성 피부로 판정할 수 있음을 가리킨다. 따라서 이런 경우 건성 피부로 판정하고, 그 근본원인을 해결하는 데, 즉 각질층에 부족한 수분을 공급하고 유지시키며, 피부보호장벽을 보완시켜서 수분이 소실되지 않도록 하는 데 주안을 두고, 이와 함께 소양감과 타는 감각 등의 증상을 해결한다. 그 구체적 방법을 정리하면 다음과 같다.

1) 순한 계면활성제가 포함된 비누와 바디클렌저를 이용하여 세안을 하며, 과도한 세정은 피하도록 한다. 가급적 비누 사용은 자제하거나 또는 가볍게 사용한다. 마찰이 심한 의복은 가급적 피하도록 한다.

2) 목욕과 샤워의 횟수를 가능한 줄이고 실내 온도는 가능한 한 낮게 유지하며 실내의 습도도 적당하게 유지시킨다.

3) 세안 후 에는 알코올함량이 낮아서 유연효과가 좋은 화장수를 사용한다.

4) 영양화장수는 유분이 많은 것을 사용한다.

5) 세안 후에는 보습효과가 좋은, 비타민 A와 C, E가 포함된 크림과 엣센스 (essence), 오일을 발라서 수분을 공급한다.

6) 잔주름은 아이크림이나 엣센스를 주기적으로 사용한다.

7) 주 1-2회 팩이나 마사지를 정기적으로 시행한다.

8) 비타민 A함유 음식물 섭취를 권장한다.

9) 피부에 수분을 공급하고 유지할 수 있는 보습제 내지 피부 습윤제 (humectant)를 투여한다. 아미노산과 요소, pyrrolidone carboxylic acid (PCA), 젖산염 (sodium lactate)과 같은 천연 보습물질, 보습효과와 피부장벽 재건에 도움이 되는 비타민인 판테놀 (panthenol), 그리고 글리세롤이나 글리세린 같은 폴리올 계통의 제품, 혹은 고분자 보습제인 히아루론산이나 코드로이틴 황산염, 콜라겐 등을 투여한다.

10) 피부표면에 불투과성 막을 형성하여 수분 손실을 방지하는 피부 밀폐제 (occlusive agent)를 투여한다. 바셀린계통 물질과 lanolin, jojoba oil, covoa butter, olive oil, dimethicone, cyclomethicone 등과 지방의 복합체가 적합하다.

11) 지성 물질의 유액(oil in water 또는 water in oil)으로 피부표면을 매끄럽고 부드럽게 만들어 주는 피부 연화제 (emollient)를 투여한다. 이의 성분으로는 cetyl stearate와 dicaprulyl maleate, C12-15 alkyl benzoate 등을 혼합하도록 한다.

12) 표피 각질에 존재하는 지질을 대치할 수 있는 지질을 투여하여 피부 장벽을 회복시킨다. 이 경우의 지질은 자연의 피부각질에서와 성분을 동일하게, 즉 세라마이드와 콜레스테롤, 자유지방산을 동일한 몰비나 혹은 세라마이드와 콜레스테롤을 강화시킨 형태로 혼합한 천연의 지질복합체 (natural lipid mixture)를 투여하는 것이 중요하다.

13) 가급적 피부약제 사용은 피하는 것이 좋으나, 소양증이 심하거나 피부에 2차적 변화가 동반되면 그 때에 한해서 부신피질호르몬제나 항히스타민제를 사용한다.

실시 예. 29-3: 복합성 피부군의 유전자검사 와 맞춤식 피부관리에의 응용

복합피부는 거의 항상 이마, 코, 턱 등 소위 T영역에는 지성이고, 뺨과 눈주위의 소위 U영역에는 정상이거나 건성으로 나타났다. 이런 경우 T 영역의 유전자검사에서는 앞의 실시예 30-1에서와 같이 HMG CoA reductase와 fatty acid synthase, acetyl CoA carboxylase, SPT의 유전자와 androgen receptor유전자의 발현이 정상 피부군에 비해 유의하게 증가되어 나타났다. 아울러 U 영역에서는 HAS-3와 AQP3, profillaggrin, HMG CoA reductase, fatty acid synthase, acetyl CoA carboxylase,, SPT, procollagen-1 유전자의 발현이 정상 피부군에 비해 유의하게 감소되어 나타났다. 이들 경우 부위 별로, 그리고 부위 별 유전자검사 소견에 따라 지성인 부위는 실시예 29-1에서와 같이, 그리고 건성인 부위는 실시예 29-2에서와 같은 용법대로 피부관리를 서로 달리 하면 된다.

실시 예. 29-4: 민감성 피부군의 유전자검사 와 맞춤식 피부관리에의 응용

민감성 피부의 경우 정상 피부군에 비해 interleukin-1 alpha(IL1α)와 tumor necrosis factor alpha (TNFα), I-CAM등의 면역 및 염증 계통 유전자의 발현이 현저하게 증가되어 나타났다. 아울러 흔히 건성피부군의 그것과 동일한 유전자검사 소견, 즉 MMP1 유전자의 발현 증가와 profillaggrin, HMG CoA reductase, fatty acid synthase, acetyl CoA carboxylase,, SPT, procollagen-1유전자의 발현이 정상 피부군에 비해 유의하게 감소된 소견이 나타났다. 이러한 결과는 민감성 피부의 발생원인이 1차적으로 외부의 자극, 혹은 내인적 자극에 의해 표피의 작질세포에서 사이토카인의 발현이 증가되어 이것이 면역세포 및 혈관내피의 이동과 활성화를 촉진하고, 염증을 야기하기 때문으로 볼 수 있다. 이는 또한 민감성 피부의 경우 피부의 장벽 손상과 건성피부를 동반하기 쉬움을 가리킨다. 또한 상기한 IL-1α, TNFα 유전자의 과발현의 소견을 보일 때 민감성 피부로 판정할 수 있음을 가리킨다. 따라서 이런 경우 민감성 피부로 판정하고, 그 근본원인을 해결하는 데, 즉 자극을 줄이며, 면역발동과 염증을 억제하는 데 주안을 두고, 다음과 같이 관리하도록 한다..

1) 생활습관과 환경을 바꾸도록 한다. 피부에 자극을 주는 물질이나 환경은 회피하도록 한다. 고온에서의 목욕이나 찜질 등 급격한 온도 변화를 피하고, 과도한 마찰이나 장시간 목욕은 피하도록 한다. 일광 노출도 가급적 피하도록 한다. 악화시키는 음식은 피하고, 뜨거운 음식 섭취는 가급적 줄이도록 한다. 애완동물이나 털이불, 진드기 등의 주위 환경은 개선시킨다. 정신적 스트레스는 완화시킨다.

2) 클렌징, 화장수 사용시 저자극 제품을 이용하도록 한다.

세안시 약알칼리성 비누를 사용하여 심한 자극을 줄이도록 한다

3) 모이스쳐 로션이나 크림으로 적당한 유분과 수분을 공급하도록 한다.

4) 자극성 있는 화장품이나 미용약물 투여는 자제해야 하며, 화장품을 투여할 때는 사전에 습포검사로 과민반응이 나타나지 않는 지를 확인한 후 투여하는 것이 원칙이다.

5) 가장 권장할 만 한 화장품의 성분으로 피부에 자극을 주지 않으면서 염증을 줄이는 알란토인 (allantoin)과 비사보롤 (bisabolol), 그리고 피부 보습과 피부장벽 재건에 효과가 뛰어난 판토넬이 좋다. 염증이 심할 때, 혹은 IL-1α와 TNFα의 유전자 발현정도가 베타 엑틴 대비 1.0이상으로 매우 높을 때에는 녹차성분 화장품을 사용하는 것도 좋다.

6) 일광에 과잉으로 노출될 때는 강력한 일광차단 (sunscreen) 크림이나 로션을 바르도록 한다.

실시 예. 29-5: 노화 피부군의 유전자검사 와 맞춤식 피부관리에의 응용

노화 피부, 특히 광노화 피부의 경우 다수의 유전자의 발현의 변화를 보였다. 첫째, 진피의 주성분 단백인 콜라겐을 분해하는 효소인 MMP-1의 발현이 현저하게 감소되며 procollagen-1과 procollagen-3, TIMP의 발현이 증가되어서 진피 섬유의 결손을 보여 주었다. 둘째, 피부장벽의 지질을 생산하는 효소인 HMG CoA reductase, fatty acid synthase, acetyl CoA carboxylase,, SPT, 그리고 천연보습인자의 전구 물질인 profillaggrin의 유전자 발현이 모두 감소되어 나타나 피부장벽의 결손이 일어남을 보여주었다. 셋째, 피부에 생긴 과산화물인 슈퍼옥시드 기 (superoxide radical)을 제거하여 이로 인한 손상을 막는 중요 효소인 슈퍼옥시드디스뮤타제 (superoxide dismutase)의 발현이 감소되어 나타나서, 피부 내 중요 항산화기전에 부전이 옴을 보여주었다. 넷째, 피부 조직의 재생에 필요한 성장인자 (growth factor)들인 epidermal growth factor (EGF), keratnocyte growth factor (KGF), basic fibroblast growth factor (basic FGF), 그리고 혈관형성인자인 vascular endothelial growth factor (VEGF)의 발현이 현저히 감소되어 이들 성장인자의 부족과 조직 재생 부전이 노화의 중요 원인이 될 수 있음을 보여 주었다. 아울러 광노화 피부군의 경우에는 상기한 변화 들 외에 elafin유전자의 발현이 증가되며, 엘라스틴 분해효소(elastase)가 감소되어 나타났다. 이러한 결과는 피부노화의 발생원인이 상기한 다수 유전자의 발현변화에 따른 총체적 결과이며, 피부 조직의 구조와 기능의 총체적 부전으로 인해 옴을 가리킨다. 아울러 연령에 상관없이 상기한 유전자 변화를 보일 때 중한 피부노화가 있는 것으로 판정할 수 있다. 따라서 이런 경우 유전자 검사에 나타난 근본원인을 해결하는 데, 주안을 두고, 다음과 같이 관리하도록 한다..

1) 항산화제 물질을 함유한 화장품을 투여한다. 혹은 이를 경구로 투여하는 것도 도움이 된다. 항산화 기능 물질로는 식물성 계통과 비타민 계통이 있다. 전자로는 녹차추출 polyphenol, quercetin, genistein, pyncogenol, ellagic acid 등이 있고, 후자로는 비타민 E와 비타민 C, 비타민 A 제제, alpha lipoic acid, ubiqinone, idebenone 등이 있다.

2) 성장인자 (EGF, KGF, bFGF)를 함유한 화장품을 투여할 수 있다.

3) MMP1을 억제하는 성분을 함유하거나 콜라겐을 함유하는 화장품을 투여할 수 있다. 예컨대 pentapeptide인 Pal-KTTKS나 1형 콜라겐 분절 (collagen-1 fragment), 녹차추출 polyphenol, quercetin, nobilin, neovastat 등이 있다.

4) 표피 각질에 존재하는 지질을 대치할 수 있는 지질, 특히 세라마이드와 콜레스테롤, 자유지방산을 동일한 몰비나 혹은 세라마이드와 콜레스테롤을 강화시킨 형태로 혼합한 천연의 지질복합체 (natural lipid mixture)를 투여하는 것이 도움이 된다.

실시 예. 29-6. 멜라닌계통 유전자 발현 이상과 맞춤식 피부관리에의 응용

본 실시예 연구의 대상 전체 200례 중 00례는 기미가 뚜렷하게 나타났으며, 이들 군의 경우 본 피부유전자검사 시 tyrosinase와 TRP1, endothelin-1 (ET1)의 유전자 발현이 정상 피부군에 비해 유의하게 증가되어 나타났다. 이 중 tyrosinase와 TRP1은 멜라닌의 생성에 관련되는 핵심 유전자이며, ET-1은 멜라닌세포의 증식을 조절하는 것으로 추측되는 사이토카인이다. 이러한 결과는 이들 3가지 유전자의 과발현이 피부색소 과침착의 원인과 밀접한 연관이 있으며, 이들 유전자의 과발현이 있을 때 피부색소 과침착 고위험군으로 판정할 수 있음을 가리킨다.

이들 고위험군의 경우 근본 원인인 tyrosinase의 활성이나 작용을 억제하는 미용약물인 하이드로퀴논 (hydroquinone)과 아젤라인산 (azelaic acid), 코지산 (kojic acid), 글라비리딘 (glabiridin), 알로에신 (aloesin), 비타민 A나 비타민 B3 (nicianamide) 제제 등을 투여한다. 가장 고려할만한 용법은 4% 하이드로퀴논을 비타민 A제제와 함께 먼저 투여하고, 이후 이어서 아젤라인산과 코지산, 글라비리딘을 함유한 가습제 (moisturizer)를 바르는 것이다.

실시 예. 29-7: 피부나이 결정과 이의 피부관리에의 응용

본 실시예 연구의 대상 전체 150례 중 58명은 나이의 증가에 따라 광노화 현상이 뚜렷하게 나타났으며, 이들 군의 경우 본 피부유전자검사 결과 정비례하여 발현량이 증가하는 MMP1을 도47과 같이 볼 수 있다. 통상적으로 MMP1은 collagen 분해 효소로 광 노화가 진행 됨에 따라 발현량이 증가한다고 알려져 있다. 특히 노화현상이 나타나기 시작하는 40세를 전후한 시기에 발현량의 증감의 폭이 커짐을 알 수 있다.

통상적으로 피부노화는 25세를 전후하여 진행되기 시작한다고 알려져 있다. 그러나 본격적으로 노화현상이 나타나기 시작하는 것은 40세를 전후한 시기이다. 피부노화는 여러 가지 현상으로 나타나게 되는데, 대표적인 현상은 피지 분비량이 감소되어 피부가 건조해지며, 세포재생이 늦어지고, 노화 각질이 많이 쌓여서 피부가 거칠어진다. 또한 표피를 지탱해주는 콜라겐의 합성량이 감소 되고 엘라스틴(탄력섬유)이 변성되어 주름이 생긴다. 아울러, 피부색이 얼룩지고 기미, 검버섯 등 과색소 침착 증상이 나타나며, 표피가 얇아져서 피부 보호 기능이 약화 된다. 그 밖의 현상으로는 피부 두께의 감소와 관련된 피부 장벽작용의 저하로 인한 피부 트러블의 증가를 들 수 있다. 이러한 생리적인 작용은 모두 노화에 관계된 유전자 발현의 량을 측정하는 것으로써 진단이 가능하다.

위에서의 설명과 같이 피부의 노화의 여러 가지 중 가장 흔하고 중요한 2가지 유형은 내인성 노화와 광노화이며, 본 실시예 연구의 대상 전체 150례 중 58례는 위와 같은 노화가 진행 되는 피부 상태로 평가되며 이들은 정상군에 비해 Telomere의 길이가 짧아지며, MMP1의 발현량의 증가가 베타엑틴 ( endogenous control ) 대비 10배에서 1000배 이상으로 유의하게 증가되어 나타났다. 이러한 결과는 Telomere의 길이와 MMP1 유전자의 과발현이 피부 노화원인과 밀접한 연관이 있음을 의미한다. 특히 MMP1유전자의 과발현이 있을 때, 특히 베타 엑틴 대비 발현비가 0.001이상으로 나타날 때 피부 노화의 진행이 위험군으로 판정할 수 있음을 가리킨다.

본 실시 예에서는 MMP1 유전자의 발현 양상을 연령 별로 Data Base화 하였으며 (도 47) Data Base 상에서 그 값의 위치를 자리매김 함으로써 피 검사자의 피부나이를 예측한다. 예를 들어 어떤 이의 MMP1 상대 발현 비율이 1e-3 이었다면 이 사람의 피부 나이는 30대 초반 부근으로 추정할 수 있다.

본 발명의 피부 유전자 카드 키트는 인체의 여러 부위 피부조직과 모발, 점 막 등 다양한 시료를 비침해적이고 간편하게 채취하고 그 시료 내의 DNA와 RNA가 실온에서도 장기간 안전하게 유지되는 상태로 보관하고 이송 및 배달할 수 있게 해 준다. 이렇게 얻어진 시료로 DNA와 RNA를 용이하고 안정적으로 획득이 가능하며, PCR과 역전사 PCR, 실시간 PCR, PCR-RFLP, Northern hybridization, 크로닝, 염기서열분석, 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 분석, MSP 및 바이설파이트 지놈시퀀싱 등의 유전자 검사가 모두 가능해 지고, 이는 곧 SNP 분석, 돌연변이 분석, 유전자발현 분석 등에 적용할 수 있다. 본 발명에서 수립된 피부 유전자 카드 키트와 유전자검사 방법을 이용하여 피부의 기능과 생리, 병리에 중요한 역할을 하는 핵심 유전자 30여 종의 발현을 검사함으로써 피부의 상태를 더 정확히 평가하고 유형을 더 정확하고 객관적으로 분류할 수 있으며, 나아가 그 결과에 따라 각각의 피부에 맞는 맞춤식의 피부관리와 맞춤식 화장품 및 미용약물을 선택할 수 있다. 특히 미용과 화장품 분야에서 문제가 되는 건성 피부, 노화 피부, 민감성 피부 들의 판별하고 관리 및 처치하는데 도움이 된다. 본 발명에서 수립된 피부 유전자 카드 키트와 유전자검사 방법을 이용하여 종양과 염증, 습진, 면역성 질환, 감염 등 각종 피부 질환을 더 정확하게 진단할 수 있으며, 개개 피부질환의 근본적 원인에 따라 맞춤식 치료법을 선택하는데 도움이 될 수도 있다. 아울러 본 발명의 피부 유전자 카드와 유전자검사 방법들을 이용하면 간편하고 안전하게 선천성 유전 질환의 진단이나 개인 식별 및 친자 감식, 장기 이식 전의 면역유전자 형 검사 등의 여러 가지 유전자 검사 사업에 이용할 수 있다.

<110> GOODGENE INC. MOON, WOO CHUL <120> New Skin Sampling Kit Which Stores Nucleic Acids in Stable Status, Genetic Test Methods by using the kit and Their Practical Application <130> KR06P0982 <140> 10-2006-0097649 <141> 2006-10-04 <160> 62 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 ccggtttttc aaagggaata a 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 cacagttcta gggaagccaa ag 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 ggcggccagg gctccgaccc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 aattcctggt ctggggcacc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 aattccgacc tcgtcatcag 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 6 ggcttggtaa ccctttatac atca 24 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> 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Claims (27)

1. 피부유전자 카드를 이용한 피부유전자의 RT-PCR 방법으로서,

   상기 피부 유전자 카드는

   1) 인체 조직에 부착 및 탈착을 통하여 조직을 채취하는 용도로 사용되는 조직 채취용 테이프 부분; 및

   2) 조직을 채취한 테이프를 부착하여 보호하며 보관하고 이송하는 용도의 종이카드부분으로 구성되고,

   상기 피부 유전자는 MMP1, COL1A1, 메탈로프로티나제의 조직저해제, 엘라스틴, 엘라스티나제, 엘라핀, MnSOD, 글루타티온 S 트랜스퍼라제, p53, 텔로머라제, HAS3, AQP3, 프로필라그린, 티로시나제(TYR), TRP1, 엔도텔린-1, IL-1a, TNF-α, I-CAM, MHC2, HMG-CoA 리덕타제, 지방산 신타제, 아세틴 CoA 카르복실라제, 세린팔미티올 트랜스퍼라제, TGF, 표피성장인자, 케라티노사이트 성장인자, VEGF, 5-α 리덕타제, 또는 안드로겐 리셉터 유전자이고,

   상기 RT-PCR은 하기의 프라이머 서열을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 피부유전자 카드를 이용한 피부유전자의 RT-PCR 방법.

   

   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 테이프는 인체에 무해한 의료용으로 사용이 허용된, 저접착형의 종이 반창고인 것을 특징으로 하는, 피부유전자 카드를 이용한 피부유전자의 RT-PCR 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 인체 조직은 모발, 입가, 항문 주위의 피부 점막 경계부 및 구강 내 점막으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 피부유전자 카드를 이용한 피부유전자의 RT-PCR 방법.
4. 피부유전자 카드 및 RT-PCR 증폭용 프라이머를 포함하는 유전체 검사용 키트로서,

   상기 피부유전자 카드는,

   1) 인체 조직에 부착 및 탈착을 통하여 조직을 채취하는 용도로 사용되는 조직 채취용 테이프 부분, 및 2) 조직을 채취한 테이프를 부착하여 보호하며 보관하고 이송하는 용도의 종이카드부분으로 구성되고,

   상기 RT-PCR 증폭용 프라이머는 하기의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전체 검사용 키트.

   

   
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