KR20210068545A - 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법 - Google Patents

피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법 Download PDF

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Abstract

피험체의 RNA 를 고정밀도로 해석하는 방법의 제공. 피험체로부터 채취한 RNA 함유 피부 표상 지질을 0 ℃ 이하에서 보존하는 것을 포함하는, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법. 피험체의 피부 표상 지질에 함유되는 RNA 를 cDNA 로 변환시킨 후에 멀티플렉스 PCR 에 의해 증폭시키고, 얻어진 반응 산물을 정제하는 것을 포함하는, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법.

Description

피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법
본 발명은, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법, 및 그 핵산을 사용한 피험체의 피부의 해석 방법에 관한 것이다.
생체 시료 중의 분자 (핵산, 단백질, 대사물 등) 의 해석에 의해 인간의 생체 내의 현재, 나아가서는 장래의 생리 상태를 조사하는 기술이 개발되어 있다. 그 중에서도, 핵산 분자를 사용한 해석은, 망라적인 해석 방법이 확립되어 있는 점에서 한 번의 해석으로 풍부한 정보를 얻을 수 있는 것, 및 일염기 다형이나 RNA 기능 등에 관한 많은 연구 보고에 기초하여 해석 결과의 기능적인 연결이 용이한 것과 같은 이점을 갖는다.
생체의 다양한 조직 중에서도, 피부는, 외계와 접하고 있는 점에서, 침습성 낮게 생체 시료를 채취할 수 있는 조직으로서 주목받고 있다. 피부로부터의 비침습적인 핵산의 채취 및 해석법으로서, 적신 코튼 스왑 (면구 (綿球)) 으로 피부 표면을 닦음으로써 인간 피부 샘플을 채취하고, RNA 프로파일링을 실시하는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 1). 특허문헌 1 에는, 피부 표상 (表上) 지질로부터 피험체의 피부 세포에서 유래하는 RNA 등의 핵산을 분리하고, 생체의 해석용의 시료로서 사용하는 것이 기재되어 있다.
국제공개공보 제2018/008319호
Forensic Sci Int Genet, 2012, 6 (5) : 565-577
일 실시형태에 있어서, 본 발명은, 피험체로부터 채취한 RNA 함유 피부 표상 지질을 0 ℃ 이하에서 보존하는 것을 포함하는, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법을 제공한다.
다른 일 실시형태에 있어서, 본 발명은, 피험체의 피부 표상 지질에 함유되는 RNA 를 역전사에 의해 cDNA 로 변환시키고, 이어서 그 cDNA 를 멀티플렉스 PCR 에 제공하는 것, 및
그 PCR 의 반응 산물을 정제하는 것
을 포함하는, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법을 제공한다.
다른 일 실시형태에 있어서, 본 발명은, 상기 방법으로 조제한 핵산을 해석하는 것을 포함하는, 피험체의 피부, 피부 이외의 부위, 또는 전신의 상태의 해석 방법을 제공한다.
다른 일 실시형태에 있어서, 본 발명은, 상기 방법으로 조제한 핵산을 해석하는 것을 포함하는, 피험체에 대한 피부 외용제, 피내 (皮內) 투여제, 첩부제, 경구제 또는 주사제의 효과 또는 효능의 평가 방법을 제공한다.
다른 일 실시형태에 있어서, 본 발명은, 상기 방법으로 조제한 핵산을 해석하는 것을 포함하는, 피험체의 혈중 성분 농도의 해석 방법을 제공한다.
도 1 은, SSL 중 RNA 의 안정성에 대한 보존 온도의 영향. 18S : 18S 리보소말 RNA, 28S : 28S 리보소말 RNA.
도 2 는, SSL 유래 RNA 에 있어서의 아토피성 피부염 관련 마커의 발현.
도 3 은, 기계 학습 모델에 기초한 SSL 유래 RNA 발현량으로부터의 혈중 테스토스테론 농도의 예측값. 종축은 예측값, 횡축은 실측값을 나타낸다.
도 4 는, 기계 학습 모델에 기초한 SSL 유래 RNA 발현량으로부터의 혈중의 각종 성분의 농도의 예측 결과.
도 5 는, 세안료의 사용에 의해 발현이 상승하는 22 종의 RNA 군의 발현량 (0 day) 에 기초한 피험자의 군 분류.
도 6 은, 세안료의 사용에 의한 각층 (角層) 수분량의 변화.
도 7 은, 앙케이트 결과에 기초한 세안료 사용후의 보습 효과를 실감한 자의 비율.
도 8 은, 피지 분비량이 높은 군, 낮은 군에 있어서의 BSG 및 HCAR2 의 발현.
도 9 는, 수분량이 높은 군, 낮은 군에 있어서의 ASPRV1 및 PADI3 의 발현.
도 10 은, 피부의 붉은기가 높은 군, 낮은 군에 있어서의 SOCS3, JUNB 및 IL-1B 의 발현.
도 11 은, 기계 학습 모델에 기초한 SSL 유래 RNA 발현량으로부터의 피부 상태의 예측값. 종축은 예측값, 횡축은 실측값을 나타낸다.
도 12 는, 기계 학습 모델에 기초한 SSL 유래 RNA 발현량으로부터의 혈중 코르티솔 농도의 예측값. 종축은 예측값, 횡축은 실측값을 나타낸다.
도 13 은, 기계 학습 모델에 기초한 SSL 유래 RNA 발현량으로부터의 누적 자외선 노출 시간의 예측값. 종축은 예측값, 횡축은 피험자로부터의 앙케이트에 기초한 산출값을 나타낸다.
본 명세서 중에서 인용된 모든 특허문헌, 비특허문헌, 및 그 밖의 간행물은, 그 전체가 본 명세서 중에 있어서 참고로서 원용된다.
본 명세서 중에 개시되는 유전자의 명칭은, NCBI ([www.ncbi.nlm.nih.gov/]) 에 기재가 있는 오피셜 심볼 (Official Symbol) 에 따른다. 한편으로 유전자 온톨로지 (GO) 에 관해서는, String ([string-db.org/]) 에 기재가 있는 Pathway ID. 에 따른다.
본 발명은, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법, 및 그 핵산을 사용한 피험체의 피부의 해석 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 의하면, 피험체의 피부 표상 지질에 포함되는 피부 세포에서 유래하는 핵산 시료를 안정적으로 보존할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 핵산 시료를 사용한 해석 (예를 들어, 유전자 해석, 진단 등) 의 정밀도를 향상시킨다. 또한, 본 발명의 방법으로 조제된 피부 세포 유래의 핵산 시료에 포함되는 특정 마커 유전자 유래의 성분의 농도는, 혈중에 존재하는 각종 성분의 농도에 상관하기 때문에, 그 핵산 시료를 사용함으로써 비침습적인 혈중 성분 농도 측정이 가능해진다.
RNA 는 분해되기 쉬운 성질을 갖기 때문에, 특수한 처리가 실시되어 있는 경우 이외에는, -80 ℃ 라는 특별한 저온 조건하에서 보존되는 것이 통상적이다. 분해에 의해 RNA 의 양이 감소한 시료를 사용한 경우, 해석의 정밀도는 저하된다. RNA 를 역전사 반응에 의해 cDNA 로 변환시켜 보존하는 경우에도, 원래의 RNA 가 불안정한 상태에 있는 경우에는 충분한 양의 cDNA 를 얻을 수 없기 때문에, 역시 해석의 정밀도는 저하된다.
본 발명자는, 이전에 피부 표상에 존재하는 지질 (피부 표상 지질) 에 피험체의 피부 세포에서 유래하는 RNA 가 함유되어 있고, 이것을 사용하여 생체의 해석이 가능한 것을 알아내어, 특허 출원하였다 (특허문헌 1). 이번에 또한 본 발명자는, 당해 피부 표상 지질에 함유되는 RNA 가 일반적인 저온 조건에서 보존 가능한 것, 또한 종래의 -80 ℃ 라는 특별한 저온 조건이 아니어도 안정적으로 보존 가능한 것을 알아냈다. 또한 본 발명자는, 당해 피부 표상 지질로부터 분리한 RNA 를, 소정의 조건에서의 역전사 반응 및 PCR 에 돌리고, 이어서 정제함으로써, RNA 함유량이 적은 피부 표상 지질로부터라도 해석에 충분한 양의 핵산 시료를 획득할 수 있는 것을 알아냈다.
따라서, 일 양태에 있어서, 본 발명은, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법을 제공한다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명에 의한 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법은, 피험체로부터 채취한 RNA 함유 피부 표상 지질을 0 ℃ 이하에서 보존하는 것을 포함한다. 다른 일 실시형태에 있어서, 본 발명에 의한 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법은, 피험체의 피부 표상 지질에 함유되는 RNA 를 역전사에 의해 cDNA 로 변환시키고, 이어서 그 cDNA 를 멀티플렉스 PCR 에 돌리는 것, 및 그 PCR 의 반응 산물을 정제하는 것을 포함한다.
본 명세서에 있어서,「피부 표상 지질 (skin surface lipids ; SSL)」이란, 피부의 표상에 존재하는 지용성 획분을 말하며, 피지로 불리기도 한다. 일반적으로, SSL 은, 피부에 있는 피지선 등의 외분비선으로부터 분비된 분비물을 주로 함유하고, 피부 표면을 덮는 얇은 층의 형태로 피부 표상에 존재하고 있다.
본 명세서에 있어서,「피부」란, 특별히 한정하지 않는 한, 체표의 표피, 진피, 모낭, 그리고 땀샘, 피지선 및 그 밖의 선 (腺) 등의 조직을 포함하는 영역의 총칭이다.
본 발명의 방법에 의해 조제되는 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산은, DNA, RNA 등 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 RNA, 또는 그 RNA 로부터 조제된 DNA 이다. RNA 로는, mRNA, tRNA, rRNA, small RNA (예를 들어, microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA), Piwi-interacting RNA (piRNA) 등), long intergenic non-coding (linc) RNA 등을 들 수 있다. mRNA 는, 단백질을 코드하는 RNA 이며, 대부분은 1000 nt 이상의 길이를 갖는다. miRNA, siRNA, piRNA 및 lincRNA 는, 단백질을 코드하지 않는 non-coding (nc) RNA 이다. miRNA 는, ncRNA 중, 길이 19 - 30 nt 정도의 작은 RNA 이다. lincRNA 는, mRNA 와 동일하게 poly-A 를 갖는 긴 non-coding RNA 이며, 200 nt 이상의 길이를 갖는다 (비특허문헌 1). 보다 바람직하게는, 본 발명의 방법에 있어서 조제되는 RNA 는, 200 nt 이상의 길이를 갖는 RNA 이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 방법에 있어서 조제되는 RNA 는, mRNA 및 lincRNA 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종이다. 본 발명의 방법에 있어서 조제되는 DNA 의 예로는, 전술한 RNA 로부터 조제된 cDNA, 그 cDNA 로부터의 반응 산물 (예를 들어 PCR 산물, 클론 DNA 등) 등을 들 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서의 피험체는, 피부 상에 SSL 을 갖는 생물이면 된다. 피험체의 예로는, 인간 및 비인간 포유 동물을 포함하는 포유 동물을 들 수 있고, 바람직하게는 인간이다. 바람직하게는, 그 피험체는, 자신의 핵산의 해석을 필요로 하거나 또는 원하는 인간 또는 비인간 포유 동물이다. 또 바람직하게는, 그 피험체는, 피부에 있어서의 유전자 발현 해석, 또는 핵산을 사용한 피부 혹은 피부 이외의 부위의 상태의 해석을 필요로 하거나 또는 원하는 인간 또는 비인간 포유 동물이다.
피험체로부터 채취된 SSL 은, 그 피험체의 피부 세포에서 발현된 RNA 를 함유하고, 바람직하게는 그 피험체의 표피, 피지선, 모낭, 땀샘, 및 진피 중 어느 것에서 발현된 RNA 를 함유하고, 보다 바람직하게는 그 피험체의 표피, 피지선, 모낭, 및 땀샘 중 어느 것에서 발현된 RNA 를 함유한다 (특허문헌 1 참조). 따라서, 본 발명의 방법에 의해 조제되는 피험체의 피부 세포에서 유래하는 RNA 는, 바람직하게는 피험체의 표피, 피지선, 모낭, 땀샘 및 진피에서 선택되는 적어도 1 부위 유래의 RNA 이고, 보다 바람직하게는 표피, 피지선, 모낭 및 땀샘에서 선택되는 적어도 1 부위 유래의 RNA 이다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은, 피험체의 SSL 을 채취하는 것을 추가로 포함하고 있어도 된다. SSL 이 채취되는 피부의 부위로는, 머리, 얼굴, 목, 체간 (體幹), 수족 등의 신체의 임의의 부위의 피부, 아토피, 여드름, 건조, 염증 (붉은기), 종양 등의 질환을 갖는 피부, 창상을 갖는 피부 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다. 또, SSL 이 채취되는 피부의 부위는, 바람직하게는 손바닥, 등부, 발바닥, 또는 손가락의 피부를 포함하지 않는다.
피험체의 피부로부터의 SSL 의 채취에는, 피부로부터의 SSL 의 회수 또는 제거에 사용되고 있는 모든 수단을 채용할 수 있다. 바람직하게는, 후술하는 SSL 흡수성 소재, SSL 접착성 소재, 또는 피부로부터 SSL 을 문질러 떨어뜨리는 기구를 사용할 수 있다. SSL 흡수성 소재 또는 SSL 접착성 소재로는, SSL 에 친화성을 갖는 소재이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 폴리프로필렌, 펄프 등을 들 수 있다. 피부로부터의 SSL 의 채취 절차의 보다 상세한 예로는, 기름 종이, 기름 제거 필름 등의 시트상 소재에 SSL 을 흡수시키는 방법, 유리판, 테이프 등에 SSL 을 접착시키는 방법, 스패튤라, 스크레이퍼 등에 의해 SSL 을 문질러 떨어뜨려 회수하는 방법 등을 들 수 있다. SSL 의 흡착성을 향상시키기 위해, 지용성이 높은 용매를 미리 함유시킨 SSL 흡수성 소재를 사용해도 된다. 한편, SSL 흡수성 소재는, 수용성이 높은 용매나 수분을 함유하고 있으면 SSL 의 흡착이 저해되기 때문에, 수용성이 높은 용매나 수분의 함유량이 적은 것이 바람직하다. SSL 흡수성 소재는, 건조한 상태에서 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서는, 당해 채취된 RNA 함유 SSL 은 0 ℃ 이하의 저온 조건에서 보존된다. 당해 채취된 RNA 함유 SSL 은, RNA 의 분해를 최대한 억제하기 위해, 채취 후 가능한 한 신속하게 소정의 저온 조건에서 보존하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서의 그 RNA 함유 SSL 의 보존의 온도 조건은, 0 ℃ 이하이면 되는데, 바람직하게는 -20 ± 20 ℃ ∼ -80 ± 20 ℃, 보다 바람직하게는 -20 ± 10 ℃ ∼ -80 ± 10 ℃, 더욱 바람직하게는 -20 ± 20 ℃ ∼ -40 ± 20 ℃, 더욱 바람직하게는 -20 ± 10 ℃ ∼ -40 ± 10 ℃, 더욱 바람직하게는 -20 ± 10 ℃, 더욱 바람직하게는 -20 ± 5 ℃ 이다. 이 온도 조건은, 종래 일반적인 RNA 의 보존 조건 (예를 들어 -80 ℃) 과 비교하여 상당히 마일드한 조건이다. 따라서, 본 발명에 있어서의 그 RNA 함유 SSL 을 바람직한 저온 조건에서 보존하려면, 초저온 냉동고나 전용의 보존 용기 등의 특별한 기기를 사용할 필요가 없고, 통상적인 냉동고나 냉장고의 냉동실을 사용할 수 있다. 또 본 발명에 있어서의 그 RNA 함유 SSL 의 그 저온 조건에서의 보존의 기간은, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 12 개월 이하, 예를 들어 6 시간 이상 12 개월 이하, 보다 바람직하게는 6 개월 이하, 예를 들어 1 일간 이상 6 개월 이하, 더욱 바람직하게는 3 개월 이하, 예를 들어 3 일간 이상 3 개월 이하이다.
채취한 당해 RNA 함유 SSL 로부터의 RNA 의 분리에는, 생체 시료로부터의 RNA 의 추출 또는 정제에 통상적으로 사용되는 방법, 예를 들어, 페놀/클로로포름법, AGPC (acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) 법, 또는 TRIzol (등록 상표), RNeasy (등록 상표), QIAzol (등록 상표) 등의 칼럼을 사용한 방법, 실리카를 코팅한 특수한 자성체 입자를 사용하는 방법, Solid Phase Reversible Immobilization 자성체 입자를 사용하는 방법, ISOGEN 등의 시판되는 RNA 추출 시약에 의한 추출 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시형태에 있어서, 당해 RNA 함유 SSL 로부터 분리된 RNA (SSL 유래 RNA) 는, RNA 의 형태인 채로 각종 해석에 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 그 SSL 유래 RNA 는, DNA 로 변환된다. 바람직하게는, 그 SSL 유래 RNA 를 역전사에 의해 cDNA 로 변환시키고, 이어서 그 cDNA 를 PCR 에 돌리고, 얻어진 반응 산물을 정제한다. 그 역전사에는, 해석하고자 하는 특정한 RNA 를 표적으로 한 프라이머를 사용해도 되지만, 보다 포괄적인 핵산의 보존 및 해석을 위해서는 랜덤 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다. 또 그 PCR 에서는, 해석하고자 하는 특정한 DNA 를 표적으로 한 프라이머 페어를 사용하여 그 특정한 DNA 만을 증폭시켜도 되지만, 복수의 프라이머 페어를 사용하여 복수의 DNA 를 증폭시켜도 된다. 바람직하게는, 그 PCR 은, 멀티플렉스 PCR 이다. 이것은, PCR 반응계에 복수의 프라이머쌍을 동시에 사용함으로써, 복수의 유전자 영역을 동시에 증폭시키는 방법이다. 멀티플렉스 PCR 은, 시판되는 키트 (예를 들어, Ion AmpliSeqTranscriptome 인간 유전자 발현 키트 ; 라이프 테크놀로지즈 재팬 주식회사 등) 를 사용하여 실시할 수 있다.
RNA 의 역전사에는, 일반적인 역전사 효소 또는 역전사 시약 키트를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 정확성 및 효율성이 높은 역전사 효소 또는 역전사 시약 키트가 사용되며, 그 예로는, M-MLV 역전사 효소 (M-MLV Reverse Transcriptase) 및 그 개변체, 혹은 시판되는 역전사 효소 또는 역전사 시약 키트, 예를 들어 PrimeScript (등록 상표) 역전사 효소 시리즈 (다카라 바이오사), SuperScript (등록 상표) 역전사 효소 시리즈 (Thermo Scientific 사) 등을 들 수 있다. SuperScript (등록 상표) III 역전사 효소, SuperScript (등록 상표) VILO cDNA 합성 키크 (모두 Thermo Scientific 사) 등이 바람직하게 사용된다.
당해 역전사 및 PCR 의 반응 조건을 조정함으로써, PCR 반응 산물의 수율이 보다 향상되고, 나아가서는 그것을 사용한 해석의 정밀도가 보다 향상된다. 바람직하게는, 그 역전사에서의 신장 반응에 있어서, 온도를 바람직하게는 42 ℃ ± 1 ℃, 보다 바람직하게는 42 ℃ ± 0.5 ℃, 더욱 바람직하게는 42 ℃ ± 0.25 ℃ 로 조정하고, 한편, 반응 시간을 바람직하게는 60 분간 이상, 보다 바람직하게는 80 ∼ 100 분간으로 조정한다. 또 바람직하게는, 그 PCR 에 있어서의 어닐링 및 신장 반응의 온도는, 바람직하게는 62 ℃ ± 1 ℃, 보다 바람직하게는 62 ℃ ± 0.5 ℃, 더욱 바람직하게는 62 ℃ ± 0.25 ℃ 이다. 따라서, 그 PCR 에서는, 바람직하게는 어닐링 및 신장 반응이 1 스텝으로 실시된다. 그 어닐링 및 신장 반응의 스텝의 시간은, 증폭시켜야 할 DNA 의 사이즈 등에 의존하여 조정될 수 있지만, 바람직하게는 14 ∼ 18 분간이다. 그 PCR 에 있어서의 변성 반응의 조건은, 증폭시켜야 할 DNA 에 의존하여 조정될 수 있지만, 바람직하게는 95 ∼ 99 ℃ 에서 10 ∼ 60 초간이다. 상기와 같은 온도 및 시간에서의 역전사 및 PCR 은, 일반적으로 PCR 에 사용되는 서멀 사이클러를 사용하여 실행할 수 있다.
당해 PCR 로 얻어진 반응 산물의 정제는, 반응 산물의 사이즈 분리에 의해 실시되는 것이 바람직하다. 사이즈 분리에 의해, 목적으로 하는 PCR 반응 산물을, PCR 반응액 중에 함유되는 프라이머나 그 밖의 불순물로부터 분리할 수 있다. DNA 의 사이즈 분리는, 예를 들어, 사이즈 분리 칼럼이나, 사이즈 분리 칩, 사이즈 분리에 이용 가능한 자기 비드 등에 의해 실시할 수 있다. 사이즈 분리에 이용 가능한 자기 비드의 바람직한 예로는, Ampure XP 등의 Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) 자성 비드를 들 수 있다. Ampure XP 와 DNA 용액을 혼합하면, DNA 는 자성 비드의 표면에 코팅된 카르복실기에 흡착되고, 마그넷을 사용하여 자성 비드만을 회수함으로써 DNA 가 정제된다. 또 Ampure XP 용액과 DNA 용액의 혼합비를 변화시키면 자성 비드에 흡착되는 DNA 의 분자 사이즈가 변화한다. 이 원리를 이용함으로써, 포착하고자 하는 특정한 분자 사이즈의 DNA 를 자성 비드 상에 회수하고, 그 이외의 분자 사이즈의 DNA 나 불순물을 정제하는 것이 가능하다.
정제된 PCR 반응 산물에 대하여, 그 후의 해석을 실시하기 위해 필요한 추가적인 처리를 실시해도 된다. 예를 들어, DNA 의 시퀀싱이나 프래그먼트 해석을 위해, 정제된 PCR 반응 산물을, 적절한 버퍼 용액으로 조제하거나, PCR 증폭된 DNA 에 포함되는 PCR 프라이머 영역을 절단하거나, 증폭된 DNA 에 어댑터 서열을 추가로 부가하거나 해도 된다. 예를 들어, 정제된 PCR 반응 산물을 버퍼 용액으로 조제하고, 증폭 DNA 에 대하여 PCR 프라이머 서열의 제거 및 어댑터 라이게이션을 실시하고, 얻어진 반응 산물을, 필요에 따라 증폭시켜, 각종 해석을 위한 라이브러리를 조제할 수 있다. 이들 조작은, 예를 들어, SuperScript (등록 상표) VILO cDNA 합성 키트 (라이프 테크놀로지즈 재팬 주식회사) 에 부속되어 있는 5×VILO RT Reaction Mix, 및 Ion AmpliSeq Transcriptome 인간 유전자 발현 키트 (라이프 테크놀로지즈 재팬 주식회사) 에 부속되어 있는 5×Ion AmpliSeq HiFi Mix, 및 Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Core Panel 을 사용하여, 각 키트 부속의 프로토콜에 따라서 실시할 수 있다.
당해 역전사 및 PCR 에 돌리는 SSL 유래 RNA 는, 생체로부터 채취한 직후의 RNA 함유 SSL 에서 유래하는 RNA, 또는 생체로부터 채취한 후 실온 혹은 냉장 보존되어 있던 RNA 함유 SSL 에서 유래하는 RNA 여도 되지만, 생체로부터 채취한 후, 0 ℃ 이하에서 보존되어 있던 RNA 함유 SSL 에서 유래하는 RNA 가 바람직하다. 그 0 ℃ 이하의 보존은, -80 ℃ 에서의 보존이어도 되지만, 바람직하게는 -20 ± 10 ℃, 보다 바람직하게는 -20 ± 5 ℃ 에서의 보존이다. 그 SSL 유래 RNA 는, SSL 로부터 분리된 후, 즉시 상기 역전사나 PCR 에 사용되어도 되는데, 사용까지 통상적인 방법으로 보존되어도 된다.
본 발명의 방법에 의해 SSL 유래 RNA 로부터 조제된 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산은, 핵산을 사용하는 각종 해석 또는 진단에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또, 상기 본 발명에 의한 핵산의 조제 방법에 의해 조제한 핵산을 해석하는 것을 포함하는, 핵산의 해석 방법을 제공한다. 상기 서술한 본 발명에 의한 핵산의 조제 방법에 의해 조제한 핵산이다. 본 발명에 의해 조제된 핵산을 사용하여 실시할 수 있는 해석이나 진단의 예로는, 이하를 들 수 있다 :
(ⅰ) 피험체의 피부에 관한 유전자 발현 해석 및 그 밖의 유전자 정보의 해석, 그리고 그것들의 해석에 기초한 피험체의 피부에 관한 기능 해석, 등 ;
(ⅱ) 피험체의 피부의 질환 또는 상태의 해석, 예를 들어, 피부의 건강 상태 (예를 들어, 피지 분비, 수분량, 붉은기, 아토피성 피부염, 민감 피부 등의 피부 상태) 의 평가, 피부의 상태의 현상 예측 혹은 장래 예측, 피부의 누적 자외선 노출 시간 등의 과거의 이력의 예측, 피부 질환의 진단 혹은 예후 진단, 피부암의 진단 혹은 예후 진단, 피부의 미세 변화의 평가, 등 ;
(ⅲ) 전술한 피험체의 피부의 질환 또는 상태의 해석을 이용한, 피부 외용제, 피내 투여제, 첩부제, 경구제, 주사제 등의 효과 또는 효능의 평가 ;
(ⅳ) 피험체의 피부 이외의 부위 또는 전신의 상태의 해석, 예를 들어, 전신적인 건강 상태의 평가 혹은 장래 예측, 및 신경 질환, 심혈관 질환, 대사성 질환, 암 등의 각종 질환의 진단 혹은 예후 진단, 등 ;
(ⅴ) 피험체의 혈중 성분 농도의 해석.
본 발명에 의해 조제된 핵산을 사용한 해석이나 진단의 보다 상세한 예를 이하에 나타낸다.
유전자 발현 해석
특허문헌 1 에 개시되어 있는 바와 같이, SSL 은, 피험체 유래의 mRNA 등의 고분자량 RNA 를 풍부하게 함유한다. SSL 은, 피험체로부터 비침습적으로 채취할 수 있는 mRNA 의 공급원이며, 유전자 발현 해석용의 생체 시료로서 유용하다. 또한, SSL 중의 mRNA 는, 피지선, 모낭 및 표피의 유전자 발현 프로파일을 반영하고 있다 (특허문헌 1 의 실시예 1 ∼ 4 를 참조). 따라서, 본 발명에 의해 조제된 핵산은, 피부, 특히 피지선, 모낭 및 표피의 유전자 발현 해석용의 생체 시료로서 바람직하다.
피부의 해석
본 발명에 의해 조제된 핵산을 시료로 하여, 피험체의 피부를 해석할 수 있다. 그 피부의 해석의 예로는, 전술한 유전자 발현 해석, 피부 상태의 해석 등을 들 수 있다. 그 피부 상태의 해석의 예로는, 소정의 질환 또는 상태를 갖거나 또는 갖지 않는 피부의 검출을 들 수 있다. 소정의 질환 또는 상태의 예로는, 피지량의 부족 혹은 과다, 피부 수분량의 부족 혹은 과다, 붉은기, 아토피성 피부염, 민감 피부 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 의해 조제된 핵산으로부터 피험체의 피부에 있어서의 피지량, 피부 수분량, 붉은기, 아토피성 피부염, 민감 피부 등의 소정의 질환 또는 상태의 마커 유전자의 발현 레벨을 해석함으로써, 그 피험체의 피부가 그 소정의 질환 또는 상태를 갖는지의 여부를 결정할 수 있다. 바람직하게는, 피험체에 대해 취득한 소정의 질환 또는 상태의 마커 유전자의 발현 레벨을, 그 소정의 질환 또는 상태를 갖는 군 (양성 대조) 또는 갖지 않는 군 (음성 대조) 의 SSL 로부터 본 발명의 방법에 의해 조제한 핵산에 있어서의 그 마커 유전자의 발현 레벨과 비교함으로써, 그 피험체의 피부가 그 소정의 질환 또는 상태를 갖는지의 여부를 결정할 수 있다. 마커 유전자에는 공지된 피부 상태 관련 마커 유전자를 사용할 수 있다.
피부의 해석의 다른 예로는, 피부 상태의 예측을 들 수 있고, 그 피부 상태의 예로는, 피부 물성의 예측, 피부의 육안 관찰 또는 촉진 (觸診) 평가의 예측, 피지 조성의 예측 등을 들 수 있다. 그 피부 물성의 예로는, 각층 수분량, 경피 수분 증산량 (TEWL), 피지량, 멜라닌량, 홍반량 등을 들 수 있다. 그 피부의 육안 관찰 또는 촉진 평가의 예로는, 통상적으로는 전문 판정원이 육안 관찰 또는 촉진에 의해 평가하는 피부의 상태를 들 수 있다. 그 육안 관찰 평가의 보다 구체적인 예로는,「깨끗함」,「투명감」,「밝기」,「윤기」,「기미」,「다크서클 두드러짐」,「노란기」,「전체 붉은기」,「볼 살결 주름」,「입꼬리 처짐」,「인설 (鱗屑)」,「여드름」,「볼의 모공 두드러짐」,「코의 모공 두드러짐」등의 유무 또는 정도의 평가를 들 수 있으며, 촉진 평가의 예로는「까칠함」,「촉촉함」등의 유무 또는 정도의 평가를 들 수 있다. 그 피지 조성의 예로는, 피지를 구성하는 유리 지방산 (FFA), 왁스에스테르 (WE), 콜레스테롤에스테르 (ChE), 스쿠알렌 (SQ), 스쿠알렌에폭사이드 (SQepo), 산화스쿠알렌 (SQOOH), 디아실글리세롤 (DAG), 트리아실글리세롤 (TAG) 등의 성분의 양을 들 수 있다.
후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, SSL 유래 RNA 해석으로부터 얻어지는 RNA 발현 프로파일과, 그것에 연결되는 각종 피부 상태의 측정값이나 평가값에 관한 데이터를 상관 해석함으로써, 각종 피부 상태와 관련성이 높은 유전자를 선택하여, 예측 모델의 구축에 사용할 수 있다. 피부 상태의 예측에 사용하는 구체적인 관련 유전자로는, 표 8 에 나타내는 유전자를 들 수 있다.
예측 모델의 구축에 사용하는 관련성이 높은 유전자의 발현 데이터로서 다수의 유전자 데이터를 하는 경우에는, 필요에 따라, 주성분 분석에 의해 데이터를 압축하고 나서 예측 모델의 구축을 실시해도 된다.
예측 모델의 구축에 있어서의 알고리즘은, 기계 학습에 사용하는 알고리즘 등의 공지된 것을 이용할 수 있다. 기계 학습 알고리즘의 예로는, 선형 회귀 모델 (Linear model), 라쏘 회귀 (Lasso), 랜덤 포레스트 (Random Forest), 뉴럴 네트워크 (Neural net), 선형 커널의 서포트 벡터 머신 (SVM (linear)), rbf 커널의 서포트 벡터 머신 (SVM (rbf)) 등의 알고리즘을 들 수 있다. 구축된 예측 모델에 검증용의 데이터를 입력하여 예측값을 산출하고, 그 예측값과 실측값의 차의 제곱 평균 제곱근 오차 (RMSE) 가 가장 작은 모델을, 최적 모델로서 선택할 수 있다.
피부의 해석의 다른 예로는, 피부의 누적 자외선 노출 시간의 예측을 들 수 있다. 일반적으로 누적 자외선 노출 시간은, 생활 습관이나 옥외 레저 활동에 관한 앙케이트 조사에 기초하여 자외선 노출 시간을 예측하여 산출된다. 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, SSL 유래 RNA 해석으로부터 얻어지는 RNA 발현 프로파일과, 그것에 연결되는 누적 자외선 노출 시간의 산출 데이터를 상관 해석함으로써, 누적 자외선 노출 시간과 관련성이 높은 유전자를 선택하여, 예측 모델을 구축할 수 있다. 모델 구축의 절차는 상기 서술과 동일하다.
혹은, 그 소정의 질환 또는 상태를 갖는 군 (양성 대조) 또는 갖지 않는 군 (음성 대조) 의 SSL 로부터 조제한 핵산의 발현 레벨을 분석하고, 양 군 사이에서 유의한 발현 레벨의 변동이 확인된 유전자를 피부 상태 관련 마커 유전자로서 사용할 수 있다. 구체적으로는, 아토피성 피부염에 대한 마커 유전자로는, 후술하는 시험예 6 에 있어서 정상인과 비교하여 아토피성 피부염 환자에게 있어서 유의하게 발현이 저하된 1911 개의 유전자군 (표 7-1 ∼ 7-24 의 (A)) 에서 선택되는 1 개 이상의 유전자, 그리고 아토피성 피부염과의 강한 관련성이 확인된 생물학적 프로세스 (biological process, BP) 인 GO : 0050911 에 포함되는 후각 수용체 (olfactory receptor, OR) 중, 정상인과 비교하여 아토피성 피부염 환자에게 있어서 발현이 저하된 370 종의 OR 유전자군 (표 7-1 ∼ 7-11 의 (B)), 그리고 피부염의 중증도에 따라 발현이 저하된 368 종의 OR 유전자군 (표 7-1 ∼ 7-11 의 (C)) 및 284 종의 OR 유전자군 (표 7-1 ∼ 7-11 의 (D)) 에서 선택되는 1 개 이상의 유전자를 들 수 있다. 민감 피부에 대한 마커 유전자로는, 후술하는 시험예 7 에 있어서 민감 피부의 자각 증상이 없는 군과 비교하여 자각 증상이 있는 군에 있어서 유의하게 발현이 저하된 693 개의 유전자군 (표 7-1 ∼ 7-20 의 (E)) 에서 선택되는 1 개 이상의 유전자, 그리고 민감 피부와의 강한 관련성이 확인된 생물학적 프로세스 (biological process, BP) 인 GO : 0050911 에 포함되는 후각 수용체 (olfactory receptor, OR) 중, 민감 피부의 자각 증상이 없는 군과 비교하여 자각 증상이 있는 군에 있어서 발현이 저하된 344 종의 OR 유전자군 (표 7-1 ∼ 7-10 의 (F)) 에서 선택되는 1 개 이상의 유전자를 들 수 있다. 붉은기에 대한 마커 유전자로는, 후술하는 시험예 8 에 있어서 피부의 붉은기가 강한 군과 약한 군 사이에서 유의하게 발현이 변동되어 있던 703 개의 유전자군 (표 7-1 ∼ 7-20 의 (G)) 에서 선택되는 1 개 이상의 유전자를 들 수 있다. 피부 수분량에 대한 마커 유전자로는, 후술하는 시험예 8 에 있어서 각층 수분량이 많은 군과 적은 군 사이에서 유의하게 발현이 변동되어 있던 553 개의 유전자군 (표 7-1 ∼ 7-16 의 (H)) 에서 선택되는 1 개 이상의 유전자를 들 수 있다. 피지량에 대한 마커 유전자로는, 후술하는 시험예 8 에 있어서 피지량이 많은 군과 적은 군 사이에서 유의하게 발현이 변동되어 있던 594 개의 유전자군 (표 7-1 ∼ 7-17 의 (I)) 에서 선택되는 1 개 이상의 유전자를 들 수 있다.
또한, 전술한 피험체에 있어서의 피부의 질환 또는 상태의 해석에 기초하여, 그 피험체에 대한 소여 (所與) 의 피부 외용제, 피내 투여제, 첩부제, 경구제, 주사제 등의 효과 또는 효능을 평가할 수 있다. 예를 들어, 피험체의 피부에 있어서의 전술한 피부의 질환 또는 상태에 대한 마커 유전자의 발현을 조사함으로써, 그 스킨 케어 제품의 사용이 피험체의 피부에 주는 효과 또는 효능을 평가할 수 있다. 당해 평가에 사용되는 피부의 질환 또는 상태에 대한 마커의 예로는, BNIP3, CALML3, GAL, HSPA5, JUNB, KIF13B, KRT14, KRT17, KRT6A, OVOL1, PPIF, PRDM1, RBM3, RPLP1, RPS4X, SEPT9, SOAT1, SPNS2, UBB, VCP, WIPI2, 및 YPEL3 에서 선택되는 1 개 이상의 유전자를 들 수 있다.
혈중의 각종 성분 농도의 해석
본 발명에 의해 조제된 핵산을 시료로 하여, 피험체의 혈중에 존재하는 각종 성분의 농도를 해석할 수 있다. 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, SSL 유래 RNA 중의 관련 마커 유전자 유래의 RNA 발현량과 혈중의 각종 성분의 농도 데이터에 기초하여 구축된 기계 학습 모델을 사용하여, 피험체의 SSL 유래 RNA 중의 관련 마커 유전자 유래의 RNA 발현량으로부터, 그 피험체의 혈중 성분 농도를 예측할 수 있었다. 따라서, SSL 유래 RNA 중의 관련 마커 유전자 유래의 RNA 발현량에 기초하여, 혈중의 각종 성분의 농도를 정량할 수 있다. 기계 학습 모델은, 전술한 피부 상태의 예측 모델의 구축의 절차에 준하여 구축할 수 있다. 본 발명에 의해 해석되는 혈중에 존재하는 각종 성분의 예로는, 호르몬, 인슐린, 중성 지질, γ-GTP, LDL-콜레스테롤 등을 들 수 있다. 그 혈중 호르몬의 예로는, 테스토스테론, 디하이드로테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로에피안드로스테론 등의 안드로겐, 에스트론, 에스트라디올 등의 에스트로겐, 프로게스테론, 코르티솔 등을 들 수 있다. 이 중, 테스토스테론, 코르티솔이 바람직하다. 혈중의 각종 성분의 농도의 정량에 사용되는 SSL 유래 RNA 중의 관련 마커 유전자 유래의 RNA 는, 그 발현량이 그 혈중 성분 농도와 상대적으로 높은 상관을 나타내는 것에서 선택할 수 있다. 바람직하게는, 집단에 대해 SSL 유래 RNA 의 발현량과 목적으로 하는 성분의 혈중 농도를 측정하고, 각 RNA 의 발현량과 그 혈중 성분의 농도의 상관을 조사하여, 상대적으로 높은 상관을 나타내는 RNA 를 선택하면 된다.
예를 들어, 혈중의 테스토스테론, 인슐린, 중성 지방, γ-GTP, LDL-콜레스테롤 각각의 농도 정량에 사용하는 SSL 유래 RNA 중의 관련 마커 유전자 유래의 RNA 의 예로는, 이하에 나타내는 인간 유전자에서 유래하는 RNA 군에서 선택되는 적어도 1 개, 바람직하게는 전부가 사용된다 :
(테스토스테론) SCARNA16, PRSS27, RDBP, PSMB10, SBNO1, EMC3, MAR9, C20orf112, C14orf2, 및 CCDC90B ;
(인슐린) EAPP, SDE2, LYAR, ZNF493, PSMB10, FAM71A, GPANK1, FGD4, MRPL43, 및 CMPK1 ;
(중성 지방) CCDC9, C6orf106, CERK, HSD3B2, SUN2, FNDC4, GRAMD1C, DGAT2, ALPL, HOMER3, MTHFS, ADIPOR1, RBM3, EXOC8, 및 ARHGEF37 ;
(γ-GTP) TMEM38A, BTN3A2, NAP1L2, ABCA2, ALPL, SECTM1, C17orf62, GNB2, R3HDM4, LRG1, SBNO2, CD14, MLLT1, NINJ2, 및 LIMD2 ;
(LDL-콜레스테롤) THTPA, LOC100506023, ZNF700, TAB3, PLEKHA1, ZNF845, FXC1, CUL4A, NDUFV1, 및 AMZ2.
SSL 유래 RNA 를 사용한 혈중 성분 농도 정량의 바람직한 절차를, 혈중 테스토스테론 농도 정량을 예로 이하에 설명한다 : 먼저, 인간 집단으로부터 얻은 SSL 유래 RNA 에 포함되고, 혈중 테스토스테론 농도와 높은 상관을 갖는 상기 10 종의 유전자 (SCARNA16, PRSS27, RDBP, PSMB10, SBNO1, EMC3, MAR9, C20orf112, C14orf2 및 CCDC90B) 의 RNA 의 발현량 데이터를 설명 변수로 하고, 그 집단으로부터 얻은 혈중 테스토스테론 농도 데이터를 목적 변수로 한 기계 학습에 의해, 그 RNA 의 발현량으로부터 혈중 테스토스테론 농도를 예측하기 위한 최적의 예측 모델을 구축한다. 한편, 혈중 테스토스테론 농도를 조사하고자 하는 인간 피험체로부터 SSL 유래 RNA 를 채취한다. 구축된 모델에 기초하여, 그 피험체의 SSL 유래 RNA 중의 상기 10 종의 유전자의 RNA 의 발현량 데이터로부터, 그 피험체의 혈중 테스토스테론 농도의 예측값을 산출할 수 있다.
병리학적 진단
최근의 보고에 따르면, 암 세포에서 발현이 변화하는 RNA 군 중의 약 63 ％ 가 단백질을 코드하는 mRNA 이다 (Cancer Res. 2016, 76, 216-226). 따라서, mRNA 의 발현 상태를 측정함으로써, 암 등의 질환에 의한 세포의 생리 상태의 변화를 보다 충실히 파악할 수 있어, 보다 정확한 신체 상태의 진단이 가능해지는 것으로 생각된다. SSL 은, mRNA 를 풍부하게 함유하고 있고, 또한 암과의 관련성이 보고되어 있는 SOD2 의 mRNA 를 함유한다 (Physiol Genomics, 2003, 16, 29-37 ; Cancer Res, 2001, 61, 6082-6088). 따라서, SSL 은, 피부암 등의 암의 진단 혹은 예후 진단용의 생체 시료로서 유용하다.
최근, 비만, 알츠하이머, 유방암, 심질환 등의 피부 이외의 조직에서의 질환을 갖는 환자에게 있어서 피부 중의 분자의 발현이 변동되는 것, 따라서 "피부는 체내의 건강 상태의 창 (window to body's health)" 이라고 할 수 있는 것이 보고되어 있다 (Eur J Pharm Sci. 2013, 50, 546-556). 따라서, SSL 중의 mRNA 의 발현 상태를 측정함으로써, 피험체의 피부 이외의 부위에 있어서의 생리 상태, 또는 전신적인 생리 상태를 해석할 수 있을 가능성이 있다.
non-coding RNA 해석
최근, 세포의 유전자 발현에 있어서의 miRNA, lincRNA 등의 non-coding (nc) RNA 의 관여가 주목되어, 활발히 연구가 진행되고 있다. 또 종래 오줌이나 혈청 중의 miRNA 를 사용한 비침습 혹은 저침습적인 암 등의 진단 방법이 개발되고 있다 (예를 들어, Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105, 10513-10518 ; Urol Oncol, 2010, 28, 655-661). SSL 로부터 조제되는 miRNA, lincRNA 등의 ncRNA 를, 상기 연구나 진단을 위한 시료에 사용할 수 있다.
핵산 마커의 스크리닝 또는 검출
SSL 로부터 조제한 핵산을 시료로 하여, 질환 혹은 상태의 핵산 마커의 스크리닝이나 검출을 실시할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 질환 혹은 상태의 핵산 마커란, 그 발현이, 소여의 질환 혹은 상태의 판정 또는 그 리스크 판정을 위한 지표가 되는 핵산을 말한다. 바람직하게는, 핵산 마커는 RNA 마커이고, 그 RNA 는, 바람직하게는 mRNA, miRNA, 혹은 lincRNA 이다. 그 핵산 마커가 타깃으로 하는 질환 혹은 상태로는, 예를 들어, 각종 피부 질환 (아토피성 피부염 등), 피부의 건강 상태 (민감 피부, 광 노화, 염증 (붉은기), 건조, 수분 혹은 유분량, 피부의 탄력, 칙칙함 등) ; 그리고, 상기「병리학적 진단」의 항에서 서술한, 피부암 등의 암, 및 비만, 알츠하이머, 유방암, 심질환 등의 피부 이외의 조직에서의 질환을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. 핵산의 발현의 해석은, Real-time PCR , 마이크로어레이, 차세대 시퀸서를 사용한 RNA 발현 해석 등의 공지된 수단에 따라서 실시할 수 있다.
일례는, 질환 혹은 상태의 핵산 마커의 선택 방법이다. 그 방법에서는, 소정의 질환 혹은 상태 또는 그 리스크를 갖는 집단을 피험체로 하여, 본 발명의 핵산의 조제 방법에 따라서, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산을 조제한다. 그 집단으로부터 조제된 핵산에 대해, 그 발현 (발현 레벨 등) 을 대조의 발현과 비교한다. 그 대조로는, 그 소정의 질환 혹은 상태 또는 그 리스크를 갖지 않는 집단, 및 그것에 기초한 통계학적 데이터 등을 들 수 있다. 대조와 비교하여 상이한 발현을 나타내는 핵산을, 그 소정의 질환 혹은 상태의 마커 또는 그 후보로서 선택할 수 있다. 그와 같이 하여 선택된 핵산 마커 또는 그 후보의 예로서, 표 7-1 ∼ 7-24 에 기재된 마커 유전자를 들 수 있다.
다른 일례는, 질환 혹은 상태의 핵산 마커의 검출 방법, 또는 그 마커 검출에 기초한 질환 혹은 상태, 또는 그 리스크의 판정 방법이다. 그 방법에서는, 소정의 질환 혹은 상태, 또는 그 리스크의 판정을 원하거나 또는 필요로 하는 피험체로부터, 본 발명의 핵산의 조제 방법에 따라서, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산을 조제한다. 이어서, 조제된 핵산으로부터 소정의 질환 혹은 상태의 핵산 마커를 검출한다. 그 핵산 마커의 유무나 발현량에 기초하여, 피험체의 그 질환 혹은 상태, 또는 그 리스크를 판정한다.
본 발명에 의해 조제된 핵산의 해석은, 핵산의 해석에 사용되는 통상적인 방법, 예를 들어 Real-time PCR , RT-PCR , 마이크로어레이, 시퀀싱, 크로마토그래피 등에 의해 실시할 수 있지만, 본 발명에 의한 핵산의 해석 수법은 이것들에 한정되지 않는다.
본 발명의 예시적 실시형태로서, 이하의 물질, 제조 방법, 용도, 방법 등을 추가로 본 명세서에 개시한다. 단, 본 발명은 이들 실시형태에 한정되지 않는다.
〔1〕피험체로부터 채취한 RNA 함유 피부 표상 지질을 0 ℃ 이하에서 보존하는 것을 포함하는, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법.
〔2〕상기 보존의 온도가, 바람직하게는 -20 ± 20 ℃ ∼ -80 ± 20 ℃, 보다 바람직하게는 -20 ± 10 ℃ ∼ -80 ± 10 ℃, 더욱 바람직하게는 -20 ± 20 ℃ ∼ -40 ± 20 ℃, 더욱 바람직하게는 -20 ± 10 ℃ ∼ -40 ± 10 ℃, 더욱 바람직하게는 -20 ± 10 ℃, 더욱 바람직하게는 -20 ± 5 ℃ 인,〔1〕에 기재된 방법.
〔3〕상기 보존의 기간이, 바람직하게는 12 개월 이하, 예를 들어 6 시간 이상 12 개월 이하, 보다 바람직하게는 6 개월 이하, 예를 들어 1 일간 이상 6 개월 이하, 더욱 바람직하게는 3 개월 이하, 예를 들어 3 일간 이상 3 개월 이하인,〔1〕또는〔2〕에 기재된 방법.
〔4〕피험체의 피부 표상 지질에 함유되는 RNA 를 역전사에 의해 cDNA 로 변환시키고, 이어서 그 cDNA 를 멀티플렉스 PCR 에 돌리는 것, 및
그 PCR 의 반응 산물을 정제하는 것
을 포함하는, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법.
〔5〕상기 멀티플렉스 PCR 에 있어서의 어닐링 및 신장 반응의 온도가, 바람직하게는 62 ℃ ± 1 ℃, 보다 바람직하게는 62 ℃ ± 0.5 ℃, 더욱 바람직하게는 62 ℃ ± 0.25 ℃ 인,〔4〕에 기재된 방법.
〔6〕바람직하게는, 상기 역전사에서의 신장 반응이 이하의 조건에서 실시되는,〔4〕또는〔5〕에 기재된 방법 :
42 ℃ ± 1 ℃ 에서 60 분간 이상 ;
42 ℃ ± 1 ℃ 에서 80 ∼ 100 분간 ;
42 ℃ ± 0.5 ℃ 에서 60 분간 이상 ;
42 ℃ ± 0.5 ℃ 에서 80 ∼ 100 분간 ;
42 ℃ ± 0.25 ℃ 에서 60 분간 이상 ; 또는
42 ℃ ± 0.25 ℃ 에서 80 ∼ 100 분간.
〔7〕바람직하게는, 상기 PCR 의 반응 산물의 정제가, 사이즈 분리에 의한 정제인,〔4〕∼〔6〕중 어느 한 항에 기재된 방법.
〔8〕바람직하게는, 상기 피험체의 피부 표상 지질에 함유되는 RNA 가, 그 피험체의 피부 표상 지질로부터 RNA 를 분리함으로써 조제되는,〔4〕∼〔7〕중 어느 한 항에 기재된 방법.
〔9〕상기 피험체의 피부 표상 지질이, 바람직하게는 0 ℃ 이하, 보다 바람직하게는 -20 ± 20 ℃ ∼ -80 ± 20 ℃, 보다 바람직하게는 -20 ± 10 ℃ ∼ -80 ± 10 ℃, 더욱 바람직하게는 -20 ± 20 ℃ ∼ -40 ± 20 ℃, 더욱 바람직하게는 -20 ± 10 ℃ ∼ -40 ± 10 ℃, 더욱 바람직하게는 -20 ± 10 ℃, 더욱 바람직하게는 -20 ± 5 ℃ 에서 보존되어 있던 것인,〔4〕∼〔8〕중 어느 한 항에 기재된 방법.
〔10〕상기 피험체의 피부 표상 지질이, 바람직하게는 12 개월 이하, 예를 들어 6 시간 이상 12 개월 이하, 보다 바람직하게는 6 개월 이하, 예를 들어 1 일간 이상 6 개월 이하, 더욱 바람직하게는 3 개월 이하, 예를 들어 3 일간 이상 3 개월 이하 보존되어 있던 것인,〔9〕에 기재된 방법.
〔11〕〔1〕∼〔10〕중 어느 한 항에 기재된 방법으로 조제한 핵산을 해석하는 것을 포함하는, 피험체의 피부, 피부 이외의 부위, 또는 전신의 상태의 해석 방법.
〔12〕상기 해석이
바람직하게는, 피부의 질환 또는 상태의 해석이고,
보다 바람직하게는,
붉은기, 민감 피부 또는 아토피성 피부염을 갖거나 또는 갖지 않는 피부의 검출이거나,
피지량 또는 피부 수분량이 많거나 또는 적은 피부의 검출이거나,
피부 상태의 예측, 예를 들어 피부 물성의 예측, 피부의 육안 관찰 혹은 촉진 평가의 예측, 또는 피지 조성의 예측이거나,
피부의 누적 자외선 노출 시간의 예측인,
〔11〕에 기재된 해석 방법.
〔13〕바람직하게는,
상기 해석이 아토피성 피부염을 갖거나 또는 갖지 않는 피부의 검출이고, 상기 핵산이 표 7-1 ∼ 7-11 의 (B), (C) 및 (D) 에 기재된 유전자에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부이거나,
상기 해석이 경증 또는 중등증의 아토피성 피부염을 갖거나 또는 아토피성 피부염을 갖지 않는 피부의 검출이고, 상기 핵산이 표 7-1 ∼ 7-11 의 (C) 및 (D) 에 기재된 유전자에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부이거나,
상기 해석이, 민감 피부를 갖거나 또는 갖지 않는 피부의 검출이고, 상기 핵산이, 표 7-1 ∼ 7-20 의 (E) 에 기재된 유전자에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부이거나,
상기 해석이, 민감 피부를 갖거나 또는 갖지 않는 피부의 검출이고, 상기 핵산이, 표 7-1 ∼ 7-10 의 (F) 에 기재된 유전자에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부이거나,
상기 해석이, 붉은기를 갖거나 또는 갖지 않는 피부의 검출이고, 상기 핵산이, 표 7-1 ∼ 7-20 의 (G) 에 기재된 유전자에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부이거나,
상기 해석이, 수분량이 많거나 또는 적은 피부의 검출이고, 상기 핵산이, 표 7-1 ∼ 7-16 의 (H) 에 기재된 유전자에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부이거나,
상기 해석이, 피지량이 많거나 또는 적은 피부의 검출이고, 상기 핵산이, 표 7-1 ∼ 7-17 의 (I) 에 기재된 유전자에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부이거나,
상기 해석이, 피부 물성의 예측, 피부의 육안 관찰 혹은 촉진 평가의 예측, 또는 피지 조성의 예측이고, 상기 핵산이, 표 8 에 기재된 유전자에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부인,
〔11〕에 기재된 방법.
〔14〕〔1〕∼〔10〕중 어느 한 항에 기재된 방법으로 조제한 핵산을 해석하는 것을 포함하는, 피험체에 대한 피부 외용제, 피내 투여제, 첩부제, 경구제 또는 주사제의 효과 또는 효능의 평가 방법.
〔15〕상기 피험체에 대한 피부 외용제, 피내 투여제, 첩부제, 경구제 또는 주사제의 효과 또는 효능이, 바람직하게는, 스킨 케어 제품에 의한 피험체의 피부 상태의 개선 효과이고, 상기 핵산이, 바람직하게는 BNIP3, CALML3, GAL, HSPA5, JUNB, KIF13B, KRT14, KRT17, KRT6A, OVOL1, PPIF, PRDM1, RBM3, RPLP1, RPS4X, SEPT9, SOAT1, SPNS2, UBB, VCP, WIPI2, 및 YPEL3 에서 선택되는 적어도 1 종이고, 보다 바람직하게는 전부인,〔14〕에 기재된 방법.
〔16〕〔1〕∼〔10〕중 어느 한 항에 기재된 방법으로 조제한 핵산을 해석하는 것을 포함하는, 피험체의 혈중 성분 농도의 해석 방법.
〔17〕바람직하게는, 상기 혈중 성분이 호르몬, 인슐린, 중성 지방, γ-GTP, 또는 L-콜레스테롤인,〔16〕에 기재된 해석 방법.
〔18〕상기 호르몬이,
바람직하게는 테스토스테론, 디하이드로테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로에피안드로스테론, 에스트론, 에스트라디올, 프로게스테론, 또는 코르티솔이고,
보다 바람직하게는 테스토스테론 또는 코르티솔인,
〔17〕에 기재된 해석 방법.
〔19〕상기 혈중 성분이 바람직하게는 테스토스테론이고, 상기 핵산이, 바람직하게는 SCARNA16, PRSS27, RDBP, PSMB10, SBNO1, EMC3, MAR9, C20orf112, C14orf2, 및 CCDC90B 로 이루어지는 10 유전자에서 유래하는 10 종의 RNA 에서 선택되는 적어도 1 종이고, 보다 바람직하게는 그 10 종의 RNA 인,〔16〕에 기재된 해석 방법.
〔20〕상기 혈중 성분이 바람직하게는 인슐린이고, 상기 핵산이, 바람직하게는 EAPP, SDE2, LYAR, ZNF493, PSMB10, FAM71A, GPANK1, FGD4, MRPL43, 및 CMPK1 로 이루어지는 10 유전자에서 유래하는 10 종의 RNA 에서 선택되는 적어도 1 종이고, 보다 바람직하게는 그 10 종의 RNA 인,〔16〕에 기재된 해석 방법.
〔21〕상기 혈중 성분이 바람직하게는 중성 지방이고, 상기 핵산이, 바람직하게는 CCDC9, C6orf106, CERK, HSD3B2, SUN2, FNDC4, GRAMD1C, DGAT2, ALPL, HOMER3, MTHFS, ADIPOR1, RBM3, EXOC8, 및 ARHGEF37 로 이루어지는 15 유전자에서 유래하는 15 종의 RNA 에서 선택되는 적어도 1 종이고, 보다 바람직하게는 그 15 종의 RNA 인,〔16〕에 기재된 해석 방법.
〔22〕상기 혈중 성분이 바람직하게는 γ-GTP 이고, 상기 핵산이, 바람직하게는 TMEM38A, BTN3A2, NAP1L2, ABCA2, ALPL, SECTM1, C17orf62, GNB2, R3HDM4, LRG1, SBNO2, CD14, MLLT1, NINJ2, 및 LIMD2 로 이루어지는 15 유전자에서 유래하는 15 종의 RNA 에서 선택되는 적어도 1 종이고, 보다 바람직하게는 그 15 종의 RNA 인,〔16〕에 기재된 해석 방법.
〔23〕상기 혈중 성분이 바람직하게는 LDL-콜레스테롤이고, 상기 핵산이, 바람직하게는 THTPA, LOC100506023, ZNF700, TAB3, PLEKHA1, ZNF845, FXC1, CUL4A, NDUFV1, 및 AMZ2 로 이루어지는 10 유전자에서 유래하는 10 종의 RNA 에서 선택되는 적어도 1 종이고, 보다 바람직하게는 그 10 종의 RNA 인,〔16〕에 기재된 해석 방법.
〔24〕피험체의 혈중 성분의 농도의 해석 방법으로서,
〔1〕∼〔10〕중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 조제한 피험체의 핵산으로부터, 혈중 성분 농도와 높은 상관을 갖는 유전자에서 유래하는 RNA 의 발현량을 취득하는 것,
그 혈중 성분 농도와 높은 상관을 갖는 유전자에서 유래하는 RNA 의 발현량에 기초하여, 기계 학습 모델에 의해, 그 피험체의 혈중 성분의 농도를 해석하는 것
을 포함하고,
그 기계 학습 모델이, 인간 집단으로부터 얻은 피부 표상 지질 유래 RNA 에 포함되는 그 혈중 성분 농도와 높은 상관을 갖는 유전자에서 유래하는 RNA 의 발현량 데이터를 설명 변수로 하고, 그 인간 집단으로부터 얻은 그 혈중 성분의 농도 데이터를 목적 변수로 하여 구축된 기계 학습 모델인,
방법.
〔25〕바람직하게는, 상기 혈중 성분이 호르몬, 인슐린, 중성 지방, γ-GTP, 또는 LDL-콜레스테롤이고,
그 호르몬이, 바람직하게는 테스토스테론 또는 코르티솔인,
〔24〕에 기재된 방법.
〔26〕상기 혈중 성분이, 바람직하게는 테스토스테론이고, 상기 혈중 성분 농도와 높은 상관을 갖는 유전자가, 바람직하게는 SCARNA16, PRSS27, RDBP, PSMB10, SBNO1, EMC3, MAR9, C20orf112, C14orf2, 및 CCDC90B 에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부이거나,
상기 혈중 성분이 바람직하게는 인슐린이고, 상기 혈중 성분 농도와 높은 상관을 갖는 유전자가, 바람직하게는 EAPP, SDE2, LYAR, ZNF493, PSMB10, FAM71A, GPANK1, FGD4, MRPL43, 및 CMPK1 에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부이거나,
상기 혈중 성분이 바람직하게는 중성 지방이고, 상기 혈중 성분 농도와 높은 상관을 갖는 유전자가, 바람직하게는 CCDC9, C6orf106, CERK, HSD3B2, SUN2, FNDC4, GRAMD1C, DGAT2, ALPL, HOMER3, MTHFS, ADIPOR1, RBM3, EXOC8, 및 ARHGEF37 에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부이거나,
상기 혈중 성분이 바람직하게는 γ-GTP 이고, 상기 혈중 성분 농도와 높은 상관을 갖는 유전자가, 바람직하게는 TMEM38A, BTN3A2, NAP1L2, ABCA2, ALPL, SECTM1, C17orf62, GNB2, R3HDM4, LRG1, SBNO2, CD14, MLLT1, NINJ2, 및 LIMD2 에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부이거나,
상기 혈중 성분이 바람직하게는 LDL-콜레스테롤이고, 상기 혈중 성분 농도와 높은 상관을 갖는 유전자가, 바람직하게는 THTPA, LOC100506023, ZNF700, TAB3, PLEKHA1, ZNF845, FXC1, CUL4A, NDUFV1, 및 AMZ2 에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부인,
〔25〕에 기재된 방법.
〔27〕혈중 성분의 농도를 해석하기 위한 기계 학습 모델을 구축하기 위한 데이터베이스로서,
인간 집단으로부터 얻은 피부 표상 지질 유래 RNA 에 포함되는, 혈중 성분 농도와 높은 상관을 갖는 유전자에서 유래하는 RNA 의 발현량 데이터, 및
그 인간 집단으로부터 얻은 그 혈중 성분의 농도 데이터
를 포함하고,
그 혈중 성분이, 바람직하게는 테스토스테론이고, 그 혈중 성분 농도와 높은 상관을 갖는 유전자가, 바람직하게는 SCARNA16, PRSS27, RDBP, PSMB10, SBNO1, EMC3, MAR9, C20orf112, C14orf2, 및 CCDC90B 에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부이거나,
그 혈중 성분이 바람직하게는 인슐린이고, 그 혈중 성분 농도와 높은 상관을 갖는 유전자가, 바람직하게는 EAPP, SDE2, LYAR, ZNF493, PSMB10, FAM71A, GPANK1, FGD4, MRPL43, 및 CMPK1 에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부이거나,
그 혈중 성분이 바람직하게는 중성 지방이고, 그 혈중 성분 농도와 높은 상관을 갖는 유전자가, 바람직하게는 CCDC9, C6orf106, CERK, HSD3B2, SUN2, FNDC4, GRAMD1C, DGAT2, ALPL, HOMER3, MTHFS, ADIPOR1, RBM3, EXOC8, 및 ARHGEF37 에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부이거나,
그 혈중 성분이 바람직하게는 γ-GTP 이고, 그 혈중 성분 농도와 높은 상관을 갖는 유전자가, 바람직하게는 TMEM38A, BTN3A2, NAP1L2, ABCA2, ALPL, SECTM1, C17orf62, GNB2, R3HDM4, LRG1, SBNO2, CD14, MLLT1, NINJ2, 및 LIMD2 에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부이거나,
그 혈중 성분이 바람직하게는 LDL-콜레스테롤이고, 그 혈중 성분 농도와 높은 상관을 갖는 유전자가, 바람직하게는 THTPA, LOC100506023, ZNF700, TAB3, PLEKHA1, ZNF845, FXC1, CUL4A, NDUFV1, 및 AMZ2 에서 선택되는 적어도 1 종, 보다 바람직하게는 전부인,
데이터베이스.
〔28〕〔24〕∼〔26〕중 어느 한 항에 기재된 해석 방법을 실시하기 위한 프로그램.
〔29〕〔24〕∼〔26〕중 어느 한 항에 기재된 해석 방법을 실시하기 위한 장치.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다.
시험예 1 SSL 중의 RNA 의 안정성에 대한 보존 온도의 영향
1) SSL 중에 있어서의 RNA 의 안정성
정상인의 전체 얼굴로부터 기름 제거 필름 (5×8 ㎝, 폴리프로필렌제, 3M 사) 을 사용하여 피지를 회수하였다. 그 기름 제거 필름을 유리 바이알에 옮기고, 4 ℃ 에서 수 시간 방치한 후, 그 필름에 포함되는 SSL 중 RNA 를 정제하였다. RNA 정제에서는, 그 기름 제거 필름을 적당한 크기로 절단하고, QIAzol (등록 상표) Lysis 시약 (Qiagen) 를 사용하여, 부속의 프로토콜에 준하여 RNA 를 추출하였다. 추출된 RNA 를 기초로, SuperScript (등록 상표) VILO cDNA 합성 키트 (라이프 테크놀로지즈 재팬 주식회사) 를 사용하여 42 ℃, 30 분간 역전사를 실시하여 cDNA 의 합성을 실시하였다. 역전사 반응의 프라이머에는, 키트에 부속되어 있는 랜덤 프라이머를 사용하였다. 얻어진 cDNA 로부터, 멀티플렉스 PCR 에 의해 20802 유전자에서 유래하는 DNA 를 포함하는 라이브러리를 조제하였다. 멀티플렉스 PCR 은, Ion AmpliSeqTranscriptome 인간 유전자 발현 키트 (라이프 테크놀로지즈 재팬 주식회사) 를 사용하여, [99 ℃, 2 분 → (99 ℃, 15 초 → 60 ℃, 16 분) × 20 사이클 → 4 ℃, Hold] 의 조건에서 실시하였다. 조제한 라이브러리를 TapeStation (애질런트·테크놀로지 주식회사) 과 High Sensitivity D1000 ScreenTape (애질런트·테크놀로지 주식회사) 를 사용하여 측정하였지만, 라이브러리에서 유래하는 피크는 검출되지 않았다. 피크를 검출할 수 없었던 원인은, 피험자의 피지의 회수량이 적었던 것, 및 회수 후 정제 전에 4 ℃ 에서 방치함으로써 분해가 진행되어, 정제된 RNA 가 소량이었던 것에 있는 것으로 생각되었다.
2) 보존 온도의 영향
SSL 중 인간 RNA 에 대한 보존 온도의 영향을 조사하기 위해, 1) 에서 피지를 채취한 기름 제거 필름에 추가로 인간 표피 세포 유래 RNA 용액을, RNA 로서 40 ng 분량 도포한 후, (ⅰ) 실온 (RT), (ⅱ) 4 ℃, (ⅲ) -20 ℃, 또는 (ⅳ) -80 ℃ 에서 4 일간 보존하였다. 또한 인간 표피 세포 유래 RNA 용액으로는, 동결 NHEK (NB) (쿠라보사) 로부터 추출한 RNA 를 50 ％ (v/v) 에탄올 용액에 용해시킨 것을 사용하였다. 보존 후의 기름 제거 필름을 적당한 크기로 절단하고, QIAzol (등록 상표) Lysis 시약 (Qiagen) 를 사용하여, 부속의 프로토콜에 준하여 RNA 를 추출하였다. 추출한 RNA 를 TapeStation (애질런트·테크놀로지 주식회사) 과 High Sensitivity RNA Screen Tape (애질런트·테크놀로지 주식회사) 에 의해 측정하였다.
측정의 결과를 도 1 에 나타낸다. RT 또는 4 ℃ 에서 보존한 SSL 중 RNA 에서는, 인간 유래 RNA (28S 및 18S 리보소말 RNA) 의 피크가 현저하게 저하되어 있고, 다른 RNA 의 피크도 거의 검출되지 않았다. 한편, -20 ℃ 또는 -80 ℃ 에서 보존한 SSL 중 RNA 에서는, 28S 및 18S 리보소말 RNA 의 피크가 검출된 점에서, RNA 가 안정적으로 보존되어 있었던 것이 나타났다. 또한, -80 ℃ 보존과 비교하여 -20 ℃ 보존에서 28S 와 18S 리보소말 RNA 의 피크 면적이 보다 컸던 점에서, SSL 중 RNA 의 보존 온도에는, 종래 일반적인 RNA 의 보존 온도인 -80 ℃ 보다, -20 ℃ 가 보다 적합한 것으로 추정되었다.
시험예 2 멀티플렉스 PCR 에 의한 SSL 유래 RNA 로부터의 핵산 조제
1) 역전사 반응 조건의 최적화
피지량이 적은 정상인의 전체 얼굴로부터 기름 제거 필름 (3M 사) 을 사용하여 피지를 회수하고, 그 기름 제거 필름으로부터, 시험예 1 과 동일한 절차로 RNA 를 추출하였다. 추출한 RNA 를 역전사하여 cDNA 를 합성하였다. 역전사 반응은, SuperScript (등록 상표) VILO cDNA 합성 키트 (Thermo Scientific 사) 를 사용하여 실시하였다. 역전사 반응의 프라이머에는, 키트에 부속되어 있는 랜덤 프라이머를 사용하였다. 역전사의 신장 온도와 시간의 조건은 (ⅰ) 40 ℃, 60 분, (ⅱ) 40 ℃, 90 분, (ⅲ) 42 ℃, 60 분, 또는 (ⅳ) 42 ℃, 90 분으로 하였다 (온도 정밀도 ± 0.25 ℃). 얻어진 cDNA 를 사용하여, 시험예 1 과 동일한 조건에서 멀티플렉스 PCR 을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 Ampure XP (벡크만·쿨터 주식회사) 로 정제하였다. 얻어진 정제물의 용액 중의 PCR 산물의 농도를 TapeStation (애질런트·테크놀로지 주식회사) 과 High Sensitivity D1000 ScreenTape (애질런트·테크놀로지 주식회사) 로 정량하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다. 42 ℃, 90 분으로 역전사를 실시하였을 때에 가장 많은 PCR 산물이 얻어졌다.
[표 1]
Figure pct00001
2) PCR 조건의 최적화
피지량이 적은 정상인의 전체 얼굴로부터 기름 제거 필름 (3M 사) 을 사용하여 피지를 회수하고, 그 기름 제거 필름으로부터 시험예 1 과 동일한 절차로 RNA 를 추출하였다. 추출한 RNA 를 사용하여, 1) 과 동일한 절차로, 단 PCR 에 있어서의 어닐링 및 신장에서의 온도를 변경하여, cDNA 합성 및 멀티플렉스 PCR 을 실시하였다. 역전사의 조건은 42 ℃, 90 분간으로 하였다. 어닐링 및 신장의 온도는, (ⅰ) 60 ℃, (ⅱ) 62 ℃, (ⅲ) 63 ℃, (ⅳ) 64 ℃ 로 하였다 (온도 정밀도 ± 0.25 ℃). 얻어진 PCR 산물을 Ampure XP (벡크만·쿨터 주식회사) 로 정제하고, TapeStation (애질런트·테크놀로지 주식회사) 과 High Sensitivity D1000 ScreenTape (애질런트·테크놀로지 주식회사) 를 사용하여 정량하였다. 결과를 표 2 에 나타낸다. 어닐링 및 신장의 온도가 62 ℃ 일 때에 가장 많은 PCR 산물이 얻어졌다.
[표 2]
Figure pct00002
3) PCR 산물의 정제
피지량이 적은 정상인의 전체 얼굴로부터 기름 제거 필름 (3M 사) 을 사용하여 피지를 회수하고, 그 기름 제거 필름으로부터 시험예 1 과 동일한 절차로 RNA 를 추출하였다. 추출한 RNA 를 사용하여 1) 과 동일한 절차로, cDNA 합성 및 멀티플렉스 PCR 을 실시하였다. 역전사의 조건은 42 ℃, 30 분간으로 하였다. 어닐링 및 신장의 온도는 60 ℃ 로 하였다 (온도 정밀도 ± 0.25 ℃). 얻어진 PCR 산물을 2 개로 나누고, 일방은 Ampure XP (벡크만·쿨터 주식회사) 로 정제하고, 다른 일방은 정제를 실시하지 않았다. 각 샘플 용액과, SuperScript (등록 상표) VILO cDNA 합성 키트에 부속되어 있는 5×VILO RT Reaction Mix, 및 Ion AmpliSeqTranscriptome 인간 유전자 발현 키트 (라이프 테크놀로지즈 재팬 주식회사) 에 부속되어 있는 5×Ion Ampliseq HiFi Mix, 및 Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Core Panel 을 혼합하여 버퍼 조성을 재구성하고, 각 키트 부속의 프로토콜에 따라, 프라이머 서열의 소화, 어댑터 라이게이션과 정제, 증폭을 실시하여, 라이브러리를 조제하였다. 얻어진 라이브러리의 농도를 TapeStation (애질런트·테크놀로지 주식회사) 과 High Sensitivity D1000 ScreenTape (애질런트·테크놀로지 주식회사) 를 사용하여 정량하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다. 정제를 실시하지 않았던 샘플에서는 라이브러리가 검출되지 않았다.
[표 3]
Figure pct00003
상기 1) 및 2) 의 결과로부터, SSL 중 RNA 로부터 핵산 샘플을 조제하는 경우, 역전사 반응의 최적 조건은 대체로 42 ℃, 90 분간이고, 멀티플렉스 PCR 의 어닐링 및 신장 온도의 최적 조건은 대체로 62 ℃ 였다. 이들 조건하에서 멀티플렉스 RT-PCR 을 실시함으로써, SSL 중 RNA 로부터의 핵산 샘플의 수량을 증가시킬 수 있는 것으로 생각되었다. 또 3) 의 결과로부터는, PCR 후에 정제 공정을 추가함으로써 핵산 샘플의 수량이 증가하여, RNA 량이 적은 SSL 로부터도 핵산 샘플 조제가 가능해지는 것이 나타났다. 또한, 시험예 1 에서 나타낸 바와 같이 피험체로부터 채취한 SSL 중 RNA 를 핵산 샘플 조제에 사용할 때까지 -20 ℃ 에서 보존함으로써, RNA 의 변성을 억제하고, 핵산 샘플의 수량을 보다 증가시킬 수 있는 것으로 생각되었다.
또한, 상기 역전사 반응시에 사용한 역전사 효소는 SuperScript (등록 상표) III 역전사 효소, 프라이머는 랜덤 프라이머 (Random Primers) 이고, PCR 실시시에 사용한 효소는 AmpliSeq HiFi Mix Plus, 프라이머는 AmpliSeq Transcriptome Panel Human Gene Expression CORE 이다.
시험예 3 SSL 유래 RNA 를 사용한 아토피성 피부염의 검출
SSL 채취
정상인 (20 ∼ 39 세 남성, BMI 18.5 이상 25.0 미만) 20 명, 및 아토피성 피부염 환자 (AD) (20 ∼ 39 세 남성, BMI 18.5 이상 25.0 미만) 11 명을 피험자로 하였다. 정상인은, 미리 피부과의에 의해 피부에 이상이 없는 것이 확인되어 있고, AD 는, 미리 피부과의에 의해 아토피성 피부염의 진단을 받고 있었다. 전체 얼굴의 사진 촬영을 실시한 후, 기름 제거 필름 (3M 사) 을 사용하여 각 피험자의 전체 얼굴로부터 피지를 회수하였다. 그 기름 제거 필름은 유리 바이알에 옮기고, RNA 추출에 사용할 때까지 -80 ℃ 에서, 약 1 개월간 보존하였다. 또한, 본 시험예를 포함하는 이하의 시험예에서는, 피험체로부터 채취한 SSL 은 RNA 추출에 사용할 때까지 일반적인 보존 조건인 -80 ℃ 에서 보존하였지만, 시험예 1 에서 나타낸 바와 같이 SSL 중 RNA 를 보다 안정적으로 보존할 수 있는 조건 (-20 ℃) 에서 보존하면, RNA 발현 해석 데이터가 보다 안정적으로 얻어지기 때문에, 동일 이상의 해석 결과가 얻어진 것으로 생각된다.
RNA 의 조제, 및 시퀀스 해석
보존한 기름 제거 필름으로부터, 시험예 1 과 동일한 절차로 RNA 를 추출하였다. 추출한 RNA 를, 42 ℃, 90 분간의 조건에서 역전사를 실시하고, 멀티플렉스 PCR 은 62 ℃ 의 어닐링 및 신장 온도에서 실시하였다. 얻어진 PCR 산물은, Ampure XP (벡크만·쿨터 주식회사) 로 정제한 후, 시험예 2, 3) 과 동일한 절차로, 버퍼의 재구성, 프라이머 서열의 소화, 어댑터 라이게이션과 정제, 증폭을 실시하여, 라이브러리를 조제하였다. 조제한 라이브러리를 Ion 540 Chip 에 로딩하고, Ion S5/XL 시스템 (라이프 테크놀로지즈 재팬 주식회사) 을 사용하여 시퀀싱하였다.
RNA 발현 해석
시퀀싱에서 발현이 확인된 SSL 유래 RNA 종에 대해, 정상인과 AD 에게서 그 발현량을 비교하였다. 비교 대상의 RNA 종에는, 19 종의 면역 응답 관련 RNA 및 17 종의 각화 (角化) 관련 RNA 를 사용하였다. 이들 RNA 종은, 문헌 (J Allergy Clin Immunol, 2011, 127 : 954-964) 에서, AD 의 피부 조직의 이환부와 비이환부 사이에서 정상인에 대한 발현량의 비율이 상이한 것이 보고되어 있다.
결과를 도 2 에 나타낸다. 도면 중의 수치는, 각 RNA 에 대한 본 시험예에서 측정된 정상인에 대한 AD 에게서의 발현량의 비율, 그리고 상기 문헌에서 측정된 정상인에 대한 AD 의 이환부, 비이환부에서의 발현량의 비율을 나타낸다. 도면 중, AD 에게서 발현이 상승하고 있던 RNA 는 엷은 회색, 반대로 감소하고 있던 RNA 는 진한 회색으로 나타냈다. 유의차 검정은, Student's t-test 를 실시하였다. SSL 유래 RNA 중의 면역 응답 관련 RNA 의 대부분은, 상기 문헌에서의 보고와 동일하게 정상인과 비교하여 AD 에게서 발현량이 상승하고 있었다. 한편으로, SSL 유래 RNA 중의 각화 관련 RNA 의 대부분은, 상기 문헌에서의 보고와 동일하게 정상인과 비교하여 AD 에게서 발현량이 감소하고 있었다. 본 결과로부터, SSL 유래 RNA 에, 염증 상태의 항진이나 배리어 기능의 감소 등을 반영하는 아토피성 피부염 관련 마커가 포함되어 있는 것, 그것들의 SSL 유래 RNA 중의 마커의 발현에 기초하여 아토피성 피부염 환자를 판정할 수 있는 것이 나타났다.
시험예 4 SSL 유래 RNA 를 사용한 혈중 성분 농도의 예측
피험자
미리 피부과의에 의해 피부에 이상이 없는 것이 확인된 정상 남성 (20 ∼ 59 세, BMI 18.5 이상 25.0 미만) 38 명을 피험자로 하였다.
혈액 채취 및 혈중 성분의 농도 정량
각 피험자의 팔로부터 진공 채혈관을 사용하여 혈액 3 ㎖ 를 채취하고, 혈청을 분리하여 -80 ℃ 에서 보존하였다. 보존한 혈청으로부터, Testosterone ELISA 키트 (Cyman 사) 를 사용하여, 첨부의 프로토콜에 따라 혈청 테스토스테론 농도를 정량하였다. 혈청 중의 인슐린, 중성 지질, γ-GTP 및 LDL-콜레스테롤의 농도에 대해서는, 외부 검사 기관 (주식회사 LSI 메디언스) 에 정량을 위탁하였다.
SSL 유래 RNA 의 조제, 및 시퀀스 해석
전체 얼굴의 사진 촬영을 실시한 후, 기름 제거 필름 (3M 사) 을 사용하여 각 피험자의 전체 얼굴로부터 피지를 회수하였다. 그 기름 제거 필름은 유리 바이알에 옮기고, -80 ℃ 에서 약 1 개월간 보존하였다. 보존한 기름 제거 필름으로부터, 시험예 3 과 동일한 절차로 SSL 중의 RNA 를 추출, 라이브러리 조제를 실시하고, 시퀀싱에 의해 RNA 종을 동정하여, 그것들의 발현량을 측정하였다.
SSL 유래 RNA 를 사용한 혈중 테스토스테론 농도의 예측
상기에서 측정한 피험자로부터의 SSL 유래 RNA 의 발현량의 데이터 (reads per million mapped reads : RPM 값) 를 무작위로 33 명분과 5 명분으로 분할하였다. 그 33 명에 대한 SSL 유래 RNA 발현량 (RPM 값) 과 혈청 테스토스테론 농도를 사용하여, 기계 학습에 의한 혈청 테스토스테론 농도의 예측 모델을 구축하였다. 처음에, RPM 값을 기초로 혈청 테스토스테론 농도와의 상관성이 가장 높은 10 종의 RNA (SCARNA16, PRSS27, RDBP, PSMB10, SBNO1, EMC3, MAR9, C20orf112, C14orf2, 및 CCDC90B 유래의 RNA) 를 선발하였다.
학습 데이터로서 그 33 명분의 전술 선발한 10 종의 RNA 에 대한 SSL 유래 RNA 의 발현량 (RPM 값) 을 설명 변수로 하고, 그 33 명의 혈청 테스토스테론 농도를 목적 변수로서 사용하여, Visual Mining Studio 소프트웨어 (주식회사 NTT 수리 시스템) 에 의해, 최적의 예측 모델의 구축, 선발을 실시하였다.
선발된 예측 모델을 사용하여, 나머지 5 명의 SSL 유래 RNA 발현량으로부터 혈중 테스토스테론 농도의 예측값을 산출하였다. 그 결과, 도 3 에 나타내는 바와 같이, 산출한 예측값은, 혈청 테스토스테론 농도의 실측값과 높은 상관성을 갖고 있었다 (상관 계수 ＝ 0.93). 이러한 점에서, SSL 유래 RNA 가 혈중 테스토스테론 농도를 예측하는 데에 중요한 정보를 갖고 있는 것이 분명해졌다.
SSL 유래 RNA 를 사용한 혈중 인슐린, 중성 지질, γ-GTP 및 LDL-콜레스테롤 농도의 예측
상기에서 측정한 피험자로부터의 SSL 유래 RNA 의 발현량의 데이터 (RPM 값) 를 무작위로 31 명분과 7 명분으로 분할하였다. 그 31 명에 대한 SSL 유래 RNA 발현량 (RPM 값) 과 혈청 중의 인슐린, 중성 지질, γ-GTP 및 LDL-콜레스테롤 농도를 사용하여, 기계 학습에 의한 혈청 중의 인슐린, 중성 지방, γ―GTP 및 LDL-콜레스테롤 농도의 예측 모델을 각각 구축하였다. 처음에, RPM 값을 기초로 1) 인슐린, 2) 중성 지방, 3) γ-GTP, 4) LDL-콜레스테롤 각각의 혈청 중 농도와의 상관성이 가장 높은 RNA 로서 이하에 나타내는 분자에서 유래하는 RNA 를 선발하였다.
1) 인슐린 : EAPP, SDE2, LYAR, ZNF493, PSMB10, FAM71A, GPANK1, FGD4, MRPL43, 및 CMPK1
2) 중성 지방 : CCDC9, C6orf106, CERK, HSD3B2, SUN2, FNDC4, GRAMD1C, DGAT2, ALPL, HOMER3, MTHFS, ADIPOR1, RBM3, EXOC8, 및 ARHGEF37
3) γ-GTP : TMEM38A, BTN3A2, NAP1L2, ABCA2, ALPL, SECTM1, C17orf62, GNB2, R3HDM4, LRG1, SBNO2, CD14, MLLT1, NINJ2, 및 LIMD2
4) LDL-콜레스테롤 : THTPA, LOC100506023, ZNF700, TAB3, PLEKHA1, ZNF845, FXC1, CUL4A, NDUFV1, 및 AMZ2
학습 데이터로서 그 31 명분의 전술 선발한 RNA 각각에 대한 SSL 유래 RNA 의 발현량 (RPM 값) 을 설명 변수로 하고, 그 31 명의 혈중의 인슐린, 중성 지방, γ-GTP 또는 LDL-콜레스테롤 농도를 목적 변수로서 사용하여, Visual Mining Studio 소프트웨어 (주식회사 NTT 수리 시스템) 에 의해, 최적의 예측 모델의 구축, 선발을 실시하였다.
선발된 예측 모델을 사용하여, 나머지 7 명의 SSL 유래 RNA 발현량으로부터 혈중의 인슐린, 중성 지방, γ-GTP 및 LDL-콜레스테롤 농도 예측값을 각각 산출하였다. 그 결과, 도 4 에 나타내는 바와 같이, 산출한 예측값은, 혈청 중의 인슐린, 중성 지방, γ-GTP 및 LDL-콜레스테롤 농도 각각의 실측값과 정 (正) 의 상관성을 갖고 있었다. 이러한 점에서, SSL 유래 RNA 는, 혈중의 인슐린, 중성 지방, γ-GTP 및 LDL-콜레스테롤 농도를 예측하는 데에 유용한 지표인 것이 분명해졌다.
시험예 5 피부 외용제 (세안료) 의 평가
(1) 세안료의 피부에 대한 효과 예측에 사용하는 RNA 종의 동정
피험자 및 SSL 채취
정상 남성 (20 ∼ 39 세) 9 명을 피험자로 하였다. 피험품으로서, 블랙헤드를 분해하여 떨어뜨리는 효과를 갖는 세안료 (비오레 오우치 de 에스테, 카오 주식회사) 를 사용하였다. 피험자는, 피험품을 적당량 (약 1 g) 사용하여, 1 일 2 회 (아침, 밤), 1 주일에 걸쳐서 전체 얼굴의 세안을 실시하였다. 피험품 세안료의 사용 개시 전 (0 일), 및 사용 개시 2 일 후에 있어서, 기름 제거 필름 (3M 사) 을 사용하여 피험자의 전체 얼굴로부터 SSL 을 채취하였다.
SSL 유래 RNA 의 조제, 및 시퀀스 해석
상기에서 채취한 SSL 을 포함하는 기름 제거 필름은 유리 바이알에 옮기고, -80 ℃ 에서 약 1 개월간 보존하였다. 보존한 기름 제거 필름으로부터, 시험예 3 과 동일한 절차로 SSL 중 RNA 를 추출, 라이브러리 조제를 실시하고, 시퀀싱에 의해 RNA 종을 동정하여, 그것들의 발현량을 측정하였다.
데이터 해석
상기에서 측정한 세정료 사용 개시 전, 및 사용 개시 2 일 후의 SSL 유래 RNA 발현량 (RPM 값) 을 기초로, 0 일과 비교하여 사용 개시 2 일 후에 Student's t-test 로 p 값이 0.05 이하 또한 RPM 값이 2 배 이상으로 상승하는 RNA 로서, BNIP3, CALML3, GAL, HSPA5, JUNB, KIF13B, KRT14, KRT17, KRT6A, OVOL1, PPIF, PRDM1, RBM3, RPLP1, RPS4X, SEPT9, SOAT1, SPNS2, UBB, VCP, WIPI2, 및 YPEL3 의 22 종의 분자에서 유래하는 RNA 를 동정하였다 (표 4). 이들 분자 중에는, BNIP3, OVOL1, KRT14, KRT17 과 같은 피부의 종말 각화에 관련되는 분자나, JUNB, PRDM1 등과 같은 항염증 작용에 관련되는 분자가 포함되어 있었다. 이들 분자는, 본 세정료를 사용함으로써 발현량이 상승한 점에서, 피부의 상태의 개선을 나타내는 마커일 가능성이 시사되었다.
[표 4]
Figure pct00004
(2) 세안료의 효과 예측
피험자, 및 피부 상태 데이터와 SSL 채취
정상 남성 (20 ∼ 48 세) 18 명을 피험자로 하였다. 피험품으로서, 블랙헤드를 분해하여 떨어뜨리는 효과를 갖는 세안료 (비오레 오우치 de 에스테, 카오 주식회사) 를 사용하였다. 상기「(1) 세안료의 피부에 대한 효과 예측에 사용하는 RNA 종의 동정」과 동일하게, 피험자는, 피험품을 적당량 (약 1 g) 사용하여, 1 일 2 회 (아침, 밤), 1 주일에 걸쳐서 전체 얼굴의 세안을 실시하였다. 피험품 세안료의 사용 개시 전 (0 일) 및 사용 개시 1 주일 후, 하기와 같이, 피험자에 대한 SSL 의 채취 및 피부 상태의 측정을 실시하였다.
ⅰ) 기름 제거 필름 (3M 사) 을 사용하여, 전체 얼굴로부터 SSL 을 채취.
ⅱ) 세안을 실시한 후, 항온실 (20 ± 5 ℃, 40 ％RH) 에서 15 분간의 순화 (馴化) 를 실시.
ⅲ) 볼부의 확대 화상을 촬영한 후, Corneometer (MPA580, Courage ＋ Khazaka 사, 독일) 를 사용하여, 좌측 볼부에 있어서의 각층 수분량을 1 개 지점 계측.
ⅳ) 피부 상태에 관한 앙케이트를 실시.
SSL 유래 RNA 의 조제, 및 시퀀스 해석
상기에서 채취한 SSL 을 포함하는 기름 제거 필름은 유리 바이알에 옮기고, -80 ℃ 에서 약 1 개월간 보존하였다. 보존한 기름 제거 필름으로부터, 시험예 3 과 동일한 절차로 SSL 중 RNA 를 추출, 라이브러리 조제를 실시하고, 시퀀싱에 의해 RNA 종을 동정하여, 그것들의 발현량을 측정하였다.
데이터 해석
상기「(1) 세안료의 피부에 대한 효과 예측에 사용하는 RNA 종의 동정」에서 선발한 22 종의 RNA 군에 대한 0 일에서의 RPM 값 (표 4) 을 사용하여, Gene Spring (토미 디지털 바이올로지) 소프트웨어의 자기 조직화 맵 (Self-Organizing Map) 에 의해 그 22 종의 RNA 의 발현이 전체적으로 높은 경향이 있는 군 (고치 (高値) 군) 과 낮은 경향이 있는 군 (저치 (低値) 군) 의 2 군으로 군 분류를 실시하였다 (도 5).
Francesco Iorio 등에 의해, 질환 등에 의해 발현이 저하된 RNA 군의 발현을 상승시키는 효과를 갖는 약제 등을 작용시키는 질환 개선 방법으로서, "Signature reversion" 가 보고되어 있다 (Drug Discov Today, 2013, 18 (7-8) : 350-357). 이 방법에 기초하면, 그 저치군은, 본 피험품의 사용에 의해, 고치군과 비교하여 그 22 종의 RNA 군이 보다 현저하게 상승하고, 피부 상태가 개선될 것이 예측되었다. 실제로, 피험품 사용 1 주일 후의 각층 수분량의 변화량 (사용 1 주일 후의 값 － 0 일의 값) 을 비교한 결과를 도 6 에 나타낸다. 각층 수분량에 대해서는, 본 시험의 사용 개시 0 일의 시험일과 비교하여, 사용 개시 1 주일 후 시험일에서는 기온이 크게 저하된 영향으로, 각층 수분량의 변화량이 마이너스의 값이 되어 각층 수분량이 감소하는 경향이 보였다. 그러나, 고치군의 각층 수분량의 감소 폭과 비교하여, 저치군은 그 감소 폭이 작아, 수분량의 감소가 억제되고 있는 경향이 나타났다. 또한 사용 실감에 대한 앙케이트 조사에 있어서도, 저치군은, 고치군과 비교하여 피부의 보습 상태가 개선되었다고 실감하는 사람의 비율이 많이 확인되었다 (도 7).
이들 결과로부터, SSL 유래 RNA 해석 기술을 사용함으로써, 피부 외용제의 효과를 상품의 사용 개시 전에 예측하는 것이 가능해지는 것이 시사되었다. 예를 들어, 어느 피부 외용제의 효과를 향수하기 쉬운 자에게 특징적으로 발현되거나 또는 발현되지 않는 SSL 유래 RNA (예를 들어 본 실시예에서 알아낸 22 종의 RNA) 를 미리 동정하고, 이어서 피험자에게 있어서의 그 SSL 유래 RNA 의 발현량을 조사함으로써, 그 피험자가 그 피부 외용제를 사용하였을 때에 효과가 얻어지는지의 여부를 예측할 수 있다.
시험예 6 SSL 유래 RNA 를 사용한 신규 아토피성 피부염 마커 분자의 검출
피험자
정상인 (20 ∼ 49 세 남성, BMI 18.5 이상 25.0 미만) 55 명, 및 경증 아토피성 피부염 환자 (20 ∼ 39 세 남성, BMI 18.5 이상 25.0 미만) 15 명, 중등증 아토피성 피부염 환자 (20 ∼ 39 세 남성, BMI 18.5 이상 25.0 미만) 25 명을 피험자로 하였다. 정상인은, 미리 피부과의에 의해 피부에 이상이 없는 것이 확인되어 있고, 아토피성 피부염 환자는, 미리 피부과의에 의해 아토피성 피부염의 진단을 받고 있었다.
SSL 유래 RNA 의 조제, 및 시퀀스 해석
기름 제거 필름 (3M 사) 을 사용하여 각 피험자의 전체 얼굴로부터 피지를 회수하였다. 그 기름 제거 필름은 유리 바이알에 옮기고, RNA 추출에 사용할 때까지 약 1 개월간 -80 ℃ 에서 보존하였다. 보존한 기름 제거 필름으로부터, 시험예 3 과 동일한 절차로 SSL 중의 RNA 를 추출, 라이브러리 조제를 실시하고, 시퀀싱에 의해 RNA 종을 동정하여, 그것들의 발현량을 측정하였다.
데이터 해석
SSL 유래 RNA 정보 (RPM 값) 에 기초하여, 밑 2 의 로그값으로 변환시킨 RPM 값을 데이터 해석에 제공하였다. 정상인과 비교하여 아토피성 피부염 환자에게서, 밑 2 의 로그값으로 변환시킨 RPM 값이 2 배 이상 저하되고, 또한 Student's t-test 로 p 값이 0.05 이하가 된 1911 개의 유전자군을 추출하였다 (표 7-1 ∼ 7-24 의 (A)). 이어서 RPM 값을 밑 2 의 로그값으로 변환시킨 값을 사용하고, false discovery rate (FDR) 의 수준을 5 ％ 로 하여, 기보 (旣報) 문헌 (Nature Protoc, 2009, 4 : 44-57 ; Nucleic Acids Res, 2009, 37 : 1-13) 에 따라서, 유전자 온톨로지 (GO) 인리치먼트 해석에 의한 생물학적 프로세스 (biological process, BP) 의 탐색을 실시하였다. 그 결과, 아토피성 피부염 환자에게 있어서 발현 저하된 유전자군과 관련된 19 개의 BP 가 얻어졌는데, 그 중에서도 GO : 0050911 (detection of chemical stimulus involved in sensory perception of smell) 이 가장 관련성이 강한 것이 나타났다 (표 5). GO : 0050911 을 구성하는 RNA 에는, 약 400 종의 후각 수용체 (olfactory receptor, OR) 가 포함되어 있고, 정상인과 비교하여 아토피성 피부염 환자에게 있어서는 370 종의 OR 의 발현이 통계학적으로 유의하게 감소하고 있고, 이것들의 발현 저하가 GO 의 유의성에 기여하고 있었다. 이러한 점에서, SSL 유래 RNA 정보 중에 포함되는 이들 370 종의 OR 의 발현량은, 정상인과 아토피성 피부염 환자를 구별하는 유용한 마커가 될 가능성이 시사되었다. 또한, OR 의 RNA 발현에 대해 정상인과 경증 아토피성 피부염 환자, 및 경증 아토피성 피부염 환자와 중등증 아토피성 피부염 환자를 각각 비교한 결과, 368 종의 OR 이 정상인에 대하여 경증 아토피성 피부염 환자에게 있어서 저하되고, 또한 284 종의 OR 은 경증 아토피성 피부염 환자에 대하여 중등증 아토피성 피부염 환자에게 있어서 저하되어 있었다 (표 7-1 ∼ 7-11 의 (B) ∼ (D)). 이들 결과로부터, SSL 중의 표 7-1 ∼ 7-11 의 (B) ∼ (D) 에 나타내는 OR 의 발현량은, 아토피성 피부염의 증상이 악화됨에 따라 저하되는 것이 분명해지고, 이들 OR 의 발현량을 지표로 함으로써 아토피성 피부염의 중증도를 파악할 수 있을 가능성이 시사되었다.
[표 5]
Figure pct00005
시험예 7 SSL 유래 RNA 를 사용한 신규 민감 피부 마커 분자의 검출
피험자
미리 피부과의에 의해 피부에 이상이 없는 것이 확인된 정상 여성 (20 ∼ 59 세, BMI 18.5 이상 25.0 미만) 42 명을, 피험자의 후보자로 하였다. 이들 후보자에 대하여, 민감 피부의 자각의 유무에 대한 앙케이트 (「신경이 쓰인다」,「그다지 신경이 쓰이지 않는다」,「신경이 쓰이지 않는다」,「전혀 신경이 쓰이지 않는다」의 4 개에서 1 개를 선택) 를 실시하고,「신경이 쓰이지 않는다」또는「전혀 신경이 쓰이지 않는다」를 선택한 10 명을 민감 피부의 자각 증상이 없는 군으로,「신경이 쓰인다」를 선택한 13 명을 민감 피부의 자각 증상이 있는 군으로 나눠 피험자로 하였다.
SSL 유래 RNA 의 조제, 및 시퀀스 해석
기름 제거 필름 (3M 사) 을 사용하여 각 피험자의 전체 얼굴로부터 피지를 회수하였다. 그 기름 제거 필름은 유리 바이알에 옮기고, RNA 추출에 사용할 때까지 약 1 개월간 -80 ℃ 에서 보존하였다. 보존한 기름 제거 필름으로부터, 시험예 3 과 동일한 절차로 SSL 중의 RNA 를 추출, 라이브러리 조제를 실시하고, 시퀀싱에 의해 RNA 종을 동정하여, 그것들의 발현량을 측정하였다.
데이터 해석
SSL 유래 RNA 정보 (RPM 값) 에 기초하여, 밑 2 의 로그값으로 변환시킨 RPM 값 (Log2RPM 값) 을 데이터 해석에 제공하였다. 민감 피부의 자각 증상이 없는 군과 비교하여 민감 피부의 자각 증상이 있는 군에게서, Log2RPM 값이 2 배 이상 저하되고, 또한 Student's t-test 로 p 값이 0.05 이하가 된 693 개의 유전자군을 추출하였다 (표 7-1 ∼ 7-20 의 (E)). 이어서 Log2RPM 값을 사용하고, FDR 의 수준을 5 ％ 로 하여, 상기 기보 문헌에 따라서 유전자 온톨로지 인리치먼트 해석에 의한 BP 의 탐색을 실시하였다. 그 결과, 민감 피부의 자각 증상이 있는 군에게 있어서 발현 저하된 유전자군과 관련된 4 개의 BP 가 얻어지고, GO : 0050911 이 가장 관련성이 강한 것이 나타났다 (표 6). GO : 0050911 에 포함되는 약 400 종의 OR 중, 민감 피부의 자각 증상이 없는 사람과 비교하여, 민감 피부의 자각 증상이 있는 사람은 344 종 (표 7-1 ∼ 7-10 의 (F)) 의 OR 의 발현이 통계학적으로 유의하게 감소하고 있고, 이것들의 발현 저하가 GO 의 유의성에 기여하고 있었다. 이러한 점에서, SSL 유래 RNA 정보 중에 포함되는 이들 OR 의 발현량은, 민감 피부의 자각 증상을 검출하는 유용한 마커가 될 가능성이 시사되었다.
[표 6]
Figure pct00006
시험예 8 SSL 유래 RNA 를 사용한 피지 분비, 수분량, 붉은기 관련 마커 분자의 검출
피험자
미리 피부과의에 의해 피부에 이상이 없는 것이 확인된 정상 남성 (20 ∼ 59 세, BMI 18.5 이상 25.0 미만) 38 명을 피험자로 하였다.
피부 물성의 측정
전체 얼굴의 사진 촬영을 실시한 후, 각 피험자의 이마로부터 세안 전의 캐쥬얼 피지량을, Sebumeter (MPA580, Courage ＋ Khazaka 사, 독일) 를 사용하여 측정하였다. 그 후, 세안을 실시하고, 환경 가변실에서 순화 (온도 20 ℃ (± 2 ℃), 습도 50 ％ (± 5 ％)) 를 15 분간 실시하였다. 순화 종료 후, Corneometer (MPA580, Courage ＋ Khazaka 사, 독일) 를 사용하여 볼부의 수분량을 측정하였다.
SSL 유래 RNA 의 조제, 및 시퀀스 해석
상기 피부 물성의 측정의 캐쥬얼 피지량 측정 후, 기름 제거 필름 (3M 사) 을 사용하여 각 피험자의 전체 얼굴로부터 피지를 회수하였다. 그 기름 제거 필름은 유리 바이알에 옮기고, -80 ℃ 에서 약 1 개월간 보존하였다. 보존한 기름 제거 필름으로부터, 시험예 3 과 동일한 절차로 SSL 중의 RNA 를 추출, 라이브러리 조제를 실시하고, 시퀀싱에 의해 RNA 종을 동정하여, 그것들의 발현량을 측정하였다.
데이터 해석
1) 피지 분비 관련 분자
Sebumeter 를 사용하여 측정한 이마의 캐쥬얼 피지량의 값이 100 미만인 사람을 저치군, 150 이상인 사람을 고치군으로서 군 분류를 실시하였다. 시험예 7 과 동일한 절차로 저치군과 고치군의 2 군 사이에서의 SSL 유래 RNA 의 발현량 (RPM 값) 의 비교를 실시한 결과, 594 종의 RNA 가 통계학적으로 유의하게 발현 변동되는 것이 나타났다 (표 7-1 ∼ 7-17 의 (I)). 그 중에서도, 도 8 에 나타내는 바와 같이, 피지 분비 고치군은 저치군과 비교하여 Basigin (BSG) 의 발현량이 통계학적으로 유의 (Student's t-test, p ＜ 0.05) 하게 상승하는 것이 분명해졌다. BSG 녹아웃 마우스에게서는 피지선과 생물학적, 구조학적으로 유사한 마이봄선에 있어서, 지질의 축적이 감소하여 위축되는 표현형을 나타내는 것이 보고되어 있다 (Cell Death and Disease, 2015, 6 : e1726). 또한 피지 분비 고치군은 저치군과 비교하여, 통계학적으로 유의하게 히드록시카복실산 수용체 (Hydroxycarboxylic acid receptor 2, HCAR2) 의 발현량이 감소하는 것이 분명해졌다. 또 HCAR2 는, 매크로파지에 있어서 지질의 축적을 억제하는 효과를 갖는 것이 보고되어 있다 (J Lipid Res, 2014, 2501-2508). 이들 지견으로부터, SSL 중에 함유되는 RNA 는, 피지의 분비량을 반영하는 유용한 지표인 것이 시사되었다.
2) 수분량 관련 분자
코네오미터의 측정 결과에 기초하여, 각층 수분량이 높은 상위 15 명 (고치군) 과 낮은 하위 15 명 (저치군) 을 선발하였다. 시험예 7 과 동일한 절차로 이들 고치군과 저치군의 2 군 사이에서 SSL 유래 RNA 의 발현량 (RPM 값) 의 비교를 실시한 결과, 553 종의 RNA 가 통계학적으로 유의하게 발현 변동되는 것이 나타났다 (표 7-1 ∼ 7-16 의 (H)). 천연 보습 인자는, 피부의 보습력을 유지하는 데에 있어서 중요한 역할을 나타내는 것이 보고되어 있다 (Dermatol Ther, 17 Suppl, 2004, 1 : 43-48). 천연 보습 인자의 생성에 관련되는 인자의 발현에 대해 검증을 실시한 결과, 도 9 에 나타내는 바와 같이, 고치군과 비교하여 저치군에 있어서 Aspartic peptidase retroviral like 1 (ASPRV1) 이나 Peptidyl arginine deiminase 3 (PADI3) 등의 발현량이 통계학적으로 유의 (Student's t-test, p ＜ 0.05) 하게 감소하는 것이 분명해졌다. ASPRV1 을 결손한 마우스에게서는, 실제로 각층 수분량이 감소하는 것이 보고되어 있다 (EMBO Mol Med, 2011, 3 : 320-333). 한편으로 PADI3 도, 천연 보습 인자의 생성에 중요한 역할을 하고 있는 것이 보고되어 있다 (J Invest Dermatol, 2005, 124 : 384-393). 이들 지견으로부터, SSL 중에 함유되는 RNA 는, 피부의 수분량을 반영하는 유용한 지표인 것이 시사되었다.
3) 붉은기 관련 분자
얼굴 화상을 육안 관찰 평가한 결과에 기초하여, 피부의 붉은기가 강한 사람 8 명 (고치군) 과 약한 사람 6 명 (저치군) 을 선발하였다. 시험예 7 과 동일한 절차로 이들 고치군과 저치군의 2 군 사이에서 SSL 유래 RNA 의 발현량 (RPM 값) 의 비교를 실시한 결과, 703 종의 RNA 가 통계학적으로 유의하게 발현 변동되는 것이 나타났다 (표 7-1 ∼ 7-20 의 (G)). 그 중에서도, 도 10 에 나타내는 바와 같이, 붉은기 고치군은 저치군과 비교하여, Suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3), 및 JunB proto-oncogene (JUNB) 의 발현량이 통계학적으로 유의 (Student's t-test, p ＜ 0.05) 하게 감소하는 것이 분명해졌다. JUNB, 및 SOCS3 의 녹아웃 마우스에게서는 피부에 염증이 야기되는 것이 보고되어 있다 (Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106 : 20423-20428, PLoS One, 2012, 7 : e40343). 또한 통계학적으로 유의한 차는 확인되지 않았지만, 피부에 있어서 염증을 야기하는 것이 알려져 있는 IL-1B 가, 붉은기 고치군에서 저치군과 비교하여 상승 경향이 있는 것이 분명해졌다. 이들 지견으로부터, SSL 중에 함유되는 RNA 는, 피부의 붉은기를 반영하는 유용한 지표인 것이 시사되었다.
[표 7-1]
Figure pct00007
[표 7-2]
Figure pct00008
[표 7-3]
Figure pct00009
[표 7-4]
Figure pct00010
[표 7-5]
Figure pct00011
[표 7-6]
Figure pct00012
[표 7-7]
Figure pct00013
[표 7-8]
Figure pct00014
[표 7-9]
Figure pct00015
[표 7-10]
Figure pct00016
[표 7-11]
Figure pct00017
[표 7-12]
Figure pct00018
[표 7-13]
Figure pct00019
[표 7-14]
Figure pct00020
[표 7-15]
Figure pct00021
[표 7-16]
Figure pct00022
[표 7-17]
Figure pct00023
[표 7-18]
Figure pct00024
[표 7-19]
Figure pct00025
[표 7-20]
Figure pct00026
[표 7-21]
Figure pct00027
[표 7-22]
Figure pct00028
[표 7-23]
Figure pct00029
[표 7-24]
Figure pct00030
시험예 9 SSL 유래 RNA 를 사용한 피부 상태의 예측
피험자
얼굴, 손가락, 상완의 피부에 트러블이 없는 정상 여성 (30 대) 39 명을 피험자로 하였다.
피지의 채취
세안 전의 각 피험자의 전체 얼굴로부터 기름 제거 필름 (5 ㎝ × 8 ㎝, 3M 사) 을 사용하여 피지를 채취하고, SSL 유래 RNA 해석용의 샘플로서 -80 ℃ 에서 약 1 개월간 보존하였다.
피부의 육안 관찰 평가·촉진 평가
피지 채취 후, 피험자는 시판되는 세안료를 사용하여 세안하고, 환경 가변실 (온도 20 ℃ ± 1 ℃, 습도 40 ％ ± 5 ％) 에서 10 분간 순화하였다. 이 순화 동안에 피험자의 얼굴의 피부의 상태에 대해 육안 관찰 평가와 촉진 평가를 실시하였다.
· 육안 관찰 평가 항목 :「깨끗함」,「투명감」,「밝기」,「노란기」,「전체 붉은기」,「기미」,「인설」,「윤기」,「볼 살결 주름」,「다크서클 두드러짐」,「입꼬리 처짐」,「여드름」,「모공 두드러짐 (볼)」,「모공 두드러짐 (코)」
· 촉진 평가 :「까칠함」,「촉촉함」
각 평가 항목에 관하여, 평가 기준 (3 : 매우 있음, 2 : 있음, 1 : 약간 있음, 0 : 없음) 에 기초하여 3 명의 전문 평가자가 스코어를 매기고, 3 명의 평가자의 평균값을 평가값으로 하였다.
피부 물성의 측정
순화 종료 후의 피험자로부터, Corneometer (MPA580, Courage ＋ Khazaka 사, 독일) 및 Skicon (주식회사 야요이) 을 사용하여 각층 수분량을, Tewameter (MPA580, Courage ＋ Khazaka 사, 독일) 를 사용하여 경피 수분 증산량 (TEWL) 을, Sebumeter (MPA580, Courage ＋ Khazaka 사, 독일) 를 사용하여 피지량을, CM26000d (코니카 미놀타 재팬) 를 사용하여 멜라닌량과 홍반량을 측정하였다. 또한, 피지량을 이마부에서 측정한 것 이외에는, 전부 볼부에서 측정하였다.
피지 조성 분석
세안으로부터 1 시간 이상 경과 후의 피험자로부터, 앙와위 (仰臥位) 로, 클로로포름/메탄올 ＝ 1/1 에 의해 탈지 처리한 시가렛 페이퍼 (1.7 ㎝ × 1.7 ㎝, RIZLA 사 : 리즐라·블루·더블) 2 장을 중첩되지 않도록 이마의 한가운데 부근에 늘어놓고, 10 초간 가볍게 대고 눌러 피지를 채취하였다. 피지를 채취한 시가렛 페이퍼는, 스크루관 내에 넣어 즉시 메탄올을 첨가하고, 분석시까지 -80 ℃ 에서 냉동 보관하였다.
그 스크루관으로부터 질소 기류하에서 용매를 증류 제거하고, 이어서 그 스크루관 내에 클로로포름/메탄올 ＝ 1/1 을 1 ㎖ 첨가하였다. 그 스크루관 내의 용매에 시가렛 페이퍼가 충분히 잠겨 있는 것을 확인한 후, 5 분간의 초음파 처리에 의한 지질 추출을 실시하여, 피지 용액을 얻었다. 미량 바이알 내에 100 μ㏖/ℓ 의 다이렉트-MS/MS (Direct-MS/MS) 측정용의 지질 내부 표준 혼합 용액 20 ㎕ 를 건고 (乾固) 시키고, 거기에 상기 절차로 조제한 피지 용액 100 ㎕ 를 첨가하여, 용해 및 혼합함으로써, 내부 표준 함유 피지 시료 용액을 조제하였다. 조제한 시료 용액으로부터, 다이렉트-MS/MS (Direct-MS/MS) 로 피험자마다, 유리 지방산 (FFA), 왁스에스테르 (WE), 콜레스테롤에스테르 (ChE), 스쿠알렌 (SQ), 스쿠알렌에폭사이드 (SQepo), 산화스쿠알렌 (SQOOH), 디아실글리세롤 (DAG), 트리아실글리세롤 (TAG) 의 양을 측정하고, 내부 표준에 기초하여 절대량을 산출하였다.
＜다이렉트-MS/MS 측정 조건＞
문헌 (일본 특허 6482215호) 에 기재된 방법에 따라서, 하기의 조건에서 측정을 실시하였다.
장치 : LC/Agilent 1200 시리즈, 질량 분석계/6460 트리플 사중극 (Agilent 사 제조)
이동상 : 15 m㏖/ℓ 아세트산암모늄 함유 클로로포름/메탄올 ＝ 1/1
유속 : 0.2 ㎖/분
주입량 : 1 ㎕
검출 조건 : 이온화법 ＝ ESI, 건조 가스 온도 ＝ 300 ℃, 건조 가스 유량 ＝ 5 ℓ/분, 네뷸라이저 압력 ＝ 45 psi, 시스 가스 온도 ＝ 250 ℃, 시스 가스 유량 ＝ 11 ℓ/분, 네뷸라이저 전압 ＝ 0 V, 캐필러리 전압 ＝ 3500 V
(질량 분석 장치의 검출 모드)
FFA : 스캔 (Scan) (Negative mode)
WE : 구성 지방산 유래의 프로덕트 이온으로부터 분자를 검출하는 Precursor Ion 스캔
ChE : 콜레스테롤 골격 유래의 프로덕트 이온으로부터 분자를 검출하는 Precursor Ion 스캔
SQ, SQepo, SQOOH : MRM
DAG : 탈리한 수산기로부터 분자를 검출하는 Neutral Loss 스캔
TAG : 중성 분자로서 탈리한 지방산으로부터 분자를 검출하는 Neutral Loss 스캔
SSL 유래 RNA 의 조제, 및 시퀀스 해석
보존한 기름 제거 필름으로부터, 시험예 3 과 동일한 절차로 SSL 중 RNA 를 추출, 라이브러리 조제를 실시하고, 시퀀싱에 의해 RNA 종을 동정하여, 그것들의 발현량을 측정하였다.
기계 학습 모델의 구축
· 사용 데이터
상기에서 측정한 피험자로부터의 SSL 유래 RNA 의 발현량의 데이터 (리드 카운트값) 에 있어서, 리드 카운트가 10 미만인 데이터에 대해서는 결손값으로서 취급하고, 샘플 간의 총 리드수의 차이를 보정한 RPM 값으로 변환시킨 후, 결손값에 대해서는 Singular Value Decomposition (SVD) imputation 으로 보충하였다. 단, 전체 피험자의 80 ％ 이상에게서 결손값이 아닌 발현량 데이터가 얻어지고 있는 유전자만을 이하의 해석에 사용하였다. 기계 학습 모델의 구축에는, 부 (負) 의 이항 분포에 따른 RPM 값을 정규 분포에 근사시키기 위해, 밑 2 의 로그값으로 변환시킨 RPM 값 (Log2RPM 값) 을 사용하였다. 또, 각 예측 대상 항목 (상기 서술한 피부의 육안 관찰 및 촉진 평가, 피부 물성 측정, 피지 조성 분석으로부터의 데이터, 표 8) 에 있어서의 평가값, 측정값은 각 대상 데이터 세트 내에 있어서의 편차값으로 변환시키고, 그 값을 타깃값으로 하였다.
· 데이터 세트 분할
피험자로부터 얻어진 RNA 프로파일 데이터 세트 중, 80 ％ 에 해당되는 31 명분의 RNA 프로파일 데이터를 피부 상태 예측 모델의 훈련 데이터로 하고, 나머지 20 ％ 에 해당되는 8 명분의 RNA 프로파일 데이터를 모델 정밀도의 평가에 사용하는 테스트 데이터로 하였다. 훈련 데이터와 테스트 데이터의 분할에는, 연령의 분포가 균일해지는 분할 방법 (분할 1) 과 예측 대상 항목의 타깃값이 균일해지는 분할 방법 (분할 2) 을 검토하였다.
· 특징량 유전자의 선택
훈련 데이터에 있어서 예측 대상 항목의 타깃값과 Log2RPM 값의 스피어만의 상관 계수 (rho) 의 절대값을 산출하고, 표 8 에 나타내는 상위 10 유전자 (또는 5 유전자) 를 각 예측 대상 항목의 특징량 유전자로서 선택하였다.
· 모델 구축
모델 구축은 통계 해석 환경 R 의 caret 패키지를 사용하여 실시하였다.
·· 훈련 데이터의 SSL 유래 RNA 의 발현량의 데이터 (Log2RPM 값) 를 설명 변수로 하고, 예측 대상 항목 각각의 타깃값을 목적 변수로서 사용하여, 예측 모델의 구축을 실시하였다.
·· 예측 대상 항목마다, 선형 회귀 모델 (Linear model), 라쏘 회귀 (Lasso), 랜덤 포레스트 (Random Forest), 뉴럴 네트워크 (Neural net), 선형 커널의 서포트 벡터 머신 (SVM (linear)), rbf 커널의 서포트 벡터 머신 (SVM (rbf)) 의 6 종의 알고리즘을 사용하여, 10 배 교차 검증을 실시하여 예측 모델을 학습시켰다.
·· 각 알고리즘에 대해, 학습 후의 모델에 테스트 데이터의 SSL 유래 RNA 의 발현량 (Log2RPM 값) 을 입력하여, 각 예측 항목의 타깃 예측값을 계산하였다.
·· 예측 항목마다 예측값과 실측값의 차의 제곱 평균 제곱근 오차 (RMSE) 를 계산하고, 그 값이 가장 작은 모델을 최적의 예측 모델로서 선발하였다.
[표 8]
Figure pct00031
(결과)
표 9 에 각 예측 대상 항목에 대한 최소의 RMSE 를 부여한 데이터 분할 방법, 사용 알고리즘, RMSE 를 나타낸다. 또, 최적의 예측 모델에 있어서의 타깃값의 예측값과 실측값을 플롯한 산포도를 도 11 에 나타낸다. 또한, 도면 중의 R 은 예측값과 실측값의 피어슨의 상관 해석에 있어서의 상관 계수를 나타낸다. 모든 예측 대상 항목에 있어서 정의 상관 계수가 얻어지고, SSL 유래 RNA 의 발현량의 데이터를 사용하여, 피부 상태의 예측이 가능한 것이 나타났다.
[표 9]
Figure pct00032
시험예 10 SSL 유래 RNA 를 사용한 혈중 코르티솔 농도의 예측
피험자
얼굴, 손가락, 상완의 피부에 트러블이 없는 정상 여성 (20 ∼ 50 대) 128 명을 피험자로 하였다.
피지의 채취와 SSL-RNA 의 시퀀싱
세안 전의 각 피험자의 전체 얼굴로부터 기름 제거 필름 (5 ㎝ × 8 ㎝, 3M 사) 을 사용하여 피지를 채취하고, SSL 유래 RNA 해석용의 샘플로서 -80 ℃ 에서 약 1 개월간 보존하였다. 보존한 기름 제거 필름으로부터, 시험예 3 과 동일한 절차로 SSL 중 RNA 를 추출, 라이브러리 조제를 실시하고, 시퀀싱에 의해 RNA 종을 동정하여, 그것들의 발현량을 측정하였다.
혈중 코르티솔 농도의 측정
각 피험자의 팔로부터 진공 채혈관을 사용하여 혈액 15 ㎖ 를 채취하고, 혈청을 분리하여 -80 ℃ 에서 보존하였다. 보존한 혈청 중의 코르티솔 농도를, 외부 검사 기관 (주식회사 LSI 메디언스) 에 위탁하여, 화학 발광 면역 측정법 (CLIA 법) 으로 정량하였다.
기계 학습 모델의 구축
· 사용 데이터
시험예 9 와 동일하게, 피험자로부터의 SSL 유래 RNA 의 발현량의 데이터 (리드 카운트값) 의 리드 카운트가 10 미만인 데이터에 대해서는 결손값으로 하고, 샘플 간의 총 리드수의 차이를 보정한 RPM 값으로 변환시킨 후, SVD imputation 으로 결손값을 보충하였다. 기계 학습 모델의 구축에는, 전체 피험자의 80 ％ 이상에게서 결손값이 아닌 발현량 데이터가 얻어지고 있는 유전자만을 해석에 사용하고, 발현량 데이터로서 Log2RPM 값을 사용하였다.
· 데이터 세트 분할
피험자로부터 얻어진 RNA 프로파일 데이터 세트로부터, 80 ％ 에 해당되는 102 명분의 RNA 프로파일 데이터를 랜덤하게 추출하여, 혈중 코르티솔 농도 예측 모델의 훈련 데이터로 하였다. 나머지 20 ％ 에 해당되는 26 명분의 RNA 프로파일 데이터를 모델 정밀도의 평가에 사용하는 테스트 데이터로 하였다.
· 특징량 유전자의 선택
훈련 데이터에 있어서 혈중 코르티솔 농도와 피어슨의 상관 계수가 큰 1000 유전자를 추출하였다.
· 사용 알고리즘 (하이퍼파라미터 후보값)
서포트 벡터 머신 (Support vector machine) (C : [0.1, 1, 10], kernel : ['linear', 'rbf', 'poly'])
랜덤 포레스트 (Random forest) (max_depth : [1, 2, 3], max_features : [1, 2], n_estimators : [10, 100])
다층 퍼셉트론 (Multilayer perceptron) (solver : ['lbfgs', 'adam'], alpha : [0.1, 1, 10])
· 모델 구축
모델 구축은 Python 의 기계 학습 라이브러리 scikit-learn 을 사용하여 실시하였다.
·· 훈련 데이터의 SSL 유래 RNA 의 발현량의 데이터 (Log2RPM 값) 를 설명 변수로 하고, 혈중 코르티솔 농도를 목적 변수로 하여, 10 배 교차 검증을 실시하여 예측 모델을 학습시켰다.
·· 교차 검증 내에서, 특징량 유전자로서 추출한 1000 유전자의 발현량 데이터를 주성분 분석에 의해 제 1 내지 제 10 주성분으로 압축한 후, 각 알고리즘과 하이퍼파라미터 후보값에 대해 그리드 서치를 실시하면서 모델 학습시켰다.
·· 학습 후의 각 모델에 테스트 데이터의 SSL 유래 RNA 의 발현량 (Log2RPM 값) 을 입력하여 예측값을 계산하고, 실측값과의 차의 RMSE 가 가장 작았던 모델을 최적의 예측 모델로서 선발하였다.
(결과)
최소의 RMSE 가 얻어진 랜덤 포레스트 (max_depth ＝ 2, max_features ＝ 2, n_estimator ＝ 100) 를 사용한 예측 모델에 테스트 데이터의 SSL 유래 RNA 의 발현량 (Log2RPM 값) 을 입력하여 얻어진 혈중 코르티솔 농도의 예측값을, 실측값에 대하여 플롯한 산포도를 도 12 에 나타낸다. 또한, 도면 중에 예측값과 실측값의 피어슨의 상관 해석에 있어서의 상관 계수 (R) 와 RMSE 값을 나타낸다. 도면 중에 나타낸 바와 같이, 정의 상관 계수가 얻어지고, SSL 유래 RNA 의 발현량의 데이터를 사용하여, 혈중 코르티솔 농도의 예측이 가능한 것이 나타났다.
시험예 11 SSL 유래 RNA 를 사용한 누적 자외선 노출 시간의 예측
피험자
얼굴, 손가락, 상완의 피부에 트러블이 없는 정상 여성 (20 ∼ 50 대) 130 명을 피험자로 하였다.
피지의 채취와 SSL-RNA 의 시퀀싱
세안 전의 각 피험자의 전체 얼굴로부터 기름 제거 필름 (5 ㎝ × 8 ㎝, 3M 사) 을 사용하여 피지를 채취하고, SSL 유래 RNA 해석용의 샘플로서 -80 ℃ 에서 약 1 개월간 보존하였다. 보존한 기름 제거 필름으로부터, 시험예 3 과 동일한 절차로 SSL 중 RNA 를 추출, 라이브러리 조제를 실시하고, 시퀀싱에 의해 RNA 종을 동정하여, 그것들의 발현량을 측정하였다.
누적 자외선 노출 시간의 산출
피험자가 일정한 연령 범위에 있어서 태양광에 노출되어 있던 표준적인 시간을, 생활 습관이나 옥외 레저 활동에 관한 앙케이트 조사에 기초하여 예측하고, 실연령을 고려하여 누적 자외선 노출 시간 (hour) 을 계산하였다. 또한, 앙케이트의 질문 항목은 미국 암 센터 공개의 광 노출력에 관한 질문표를 기초로 작성하였다 (Arch. Dermatol. 144, 217-22 (2008)).
기계 학습 모델의 구축
시험예 9 와 동일하게, 피험자로부터의 SSL 유래 RNA 의 발현량의 데이터 (리드 카운트값) 의 리드 카운트가 10 미만인 데이터에 대해서는 결손값으로 하고, 샘플 간의 총 리드수의 차이를 보정한 RPM 값으로 변환시킨 후, SVD imputation 으로 결손값을 보충하였다. 기계 학습 모델의 구축에는, 전체 피험자의 80 ％ 이상에게서 결손값이 아닌 발현량 데이터가 얻어지고 있는 유전자만을 해석에 사용하고, 발현량 데이터로서 Log2RPM 을 사용하였다.
· 데이터 세트 분할
피험자로부터 얻어진 RNA 프로파일 데이터 세트로부터, 80 ％ 에 해당되는 104 명분의 RNA 프로파일 데이터를 랜덤하게 추출하여, 누적 자외선 노출 시간 예측 모델의 훈련 데이터로 하였다. 나머지 20 ％ 에 해당되는 26 명분의 RNA 프로파일 데이터를 모델 정밀도의 평가에 사용하는 테스트 데이터로 하였다.
· 특징량 유전자의 선택
훈련 데이터에 있어서 누적 자외선 노출 시간과 피어슨의 상관 계수가 큰 1000 유전자를 추출하였다. 이들 1000 유전자에 추가하여, 피험자의 연령을 특징량에 추가하였다.
· 사용 알고리즘 (하이퍼파라미터 후보값)
시험예 10 과 동일한 알고리즘을 사용하였다.
· 모델 구축
시험예 10 과 동일하게 10 배 교차 검증을 실시하고, 실측값과의 차의 RMSE 가 가장 작았던 모델을 최적의 예측 모델로서 선발하였다. 단, 특징량으로서 위에서 선택한 1000 유전자에 추가하여, 피험자의 연령을 사용하였다.
(결과)
최소의 RMSE 가 얻어진 서포트 벡터 머신 (C ＝ 10, kernel ＝ 'linear') 을 사용한 예측 모델에 테스트 데이터의 SSL 유래 RNA 의 발현량 (Log2RPM 값) 을 입력하여 얻어진 누적 자외선 노출 시간의 예측값을, 앙케이트에 기초한 산출값에 대하여 플롯한 산포도를 도 13 에 나타낸다. 또한, 도면 중에 예측값과 산출값의 피어슨의 상관 해석에 있어서의 상관 계수 (R) 와 RMSE 값을 나타낸다. 도면 중에 나타낸 바와 같이, 정의 상관 계수가 얻어지고, SSL 유래 RNA 의 발현량의 데이터를 사용함으로써, 앙케이트에 의하지 않고서도 누적 자외선 노출 시간의 예측이 가능한 것이 나타났다.

Claims (14)

  1. 피험체로부터 채취한 RNA 함유 피부 표상 지질을 0 ℃ 이하에서 보존하는 것을 포함하는, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법.
  2. 피험체의 피부 표상 지질에 함유되는 RNA 를 역전사에 의해 cDNA 로 변환시키고, 이어서 그 cDNA 를 멀티플렉스 PCR 에 돌리는 것, 및
    그 PCR 의 반응 산물을 정제하는 것을 포함하는, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 멀티플렉스 PCR 에 있어서의 어닐링 및 신장 반응의 온도가 62 ℃ ± 1 ℃ 인, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 역전사에서의 신장 반응이 42 ℃ ± 1 ℃ 에서 60 분간 이상 실시되는, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험체의 피부 표상 지질에 함유되는 RNA 가, 그 피험체의 피부 표상 지질로부터 RNA 를 분리함으로써 조제되는, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험체의 피부 표상 지질이, 0 ℃ 이하에서 보존되어 있던 것인, 피험체의 피부 세포에서 유래하는 핵산의 조제 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 조제한 핵산을 해석하는 것을 포함하는, 피험체의 피부, 피부 이외의 부위, 또는 전신의 상태의 해석 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 해석이 붉은기, 민감 피부 또는 아토피성 피부염을 갖거나 또는 갖지 않는 피부의 검출이거나, 혹은 피지량 또는 피부 수분량이 많거나 또는 적은 피부의 검출인, 피험체의 피부, 피부 이외의 부위, 또는 전신의 상태의 해석 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 해석이 피부 상태의 예측인, 피험체의 피부, 피부 이외의 부위, 또는 전신의 상태의 해석 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 피부 상태의 예측이, 피부 물성의 예측, 피부의 육안 관찰 또는 촉진 평가의 예측, 또는 피지 조성의 예측인, 피험체의 피부, 피부 이외의 부위, 또는 전신의 상태의 해석 방법.
  11. 제 7 항에 있어서,
    상기 해석이 피부의 누적 자외선 노출 시간의 예측인, 피험체의 피부, 피부 이외의 부위, 또는 전신의 상태의 해석 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 조제한 핵산을 해석하는 것을 포함하는, 피험체에 대한 피부 외용제, 피내 투여제, 첩부제, 경구제 또는 주사제의 효과 또는 효능의 평가 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 조제한 핵산을 해석하는 것을 포함하는, 피험체의 혈중 성분 농도의 해석 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 혈중 성분이 호르몬, 인슐린, 중성 지방, γ-GTP, 또는 LDL-콜레스테롤인, 피험체의 혈중 성분 농도의 해석 방법.
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