JP2022097303A - 疲労マーカー及びそれを用いた疲労の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】バイオマーカーによる疲労の検出。【解決手段】疲労を検出するための疲労マーカー、及び該マーカーを用いた疲労の検出方法。【選択図】なし

Description

本発明は、疲労マーカー及びそれを用いた疲労の検出方法に関する。

疲労は、肉体的及び精神的活動、又は疾病によって生じた独特の不快感と休養の願望を伴う身体の活動能力の減退状態であり、生体が身体の状態や機能を保つための仕組みである。疲労の持続は、思考能力の低下、注意力の低下、作業効率の低下をもたらし、さらには体調不良や疾患の原因となる。

特許文献１～４には、疲労を評価するマーカーとして、翻訳開始因子2α(eIF-2α)リン酸化関連因子（特許文献１）、好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）及び好酸球由来ニューロトキシン（ＥＤＮ）（特許文献２）、ならびに各種遺伝子マーカー（特許文献３、４）が開示されている。特許文献５～７には、慢性疲労症候群を評価するマーカーとして、アクチビンβＢ（特許文献５）、約３０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌ（特許文献６）、ならびに各種遺伝子マーカー（特許文献７）が開示されている。しかしながら、バイオマーカーによる疲労の客観的又は定量的な評価手法は未だ確立されていない。

生体試料中のＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の解析によりヒトの生体内の現在、さらには将来の生理状態を調べる技術が開発されている。生体由来の核酸は、血液等の組織、体液、分泌物などから抽出することができる。特許文献８には、皮膚表上脂質（ＳＳＬ）から被験体の皮膚細胞に由来するＲＮＡ等の核酸を分離し、生体の解析用の試料として用いることが記載されている。

国際公開公報第２０１６／０３１５８１号 特開２０１３－７６６９１号公報 特開２０１３－１５０５５８号公報 特開２０１２－０１９７８４号公報 特表２０１７－５０５４２８号公報 特表２０００－５１６８１８号公報 特開２００７－２２８８７８号公報 国際公開公報第２０１８／００８３１９号

本発明は、バイオマーカーを用いた疲労の検出に関する。本発明は、新規な疲労マーカー、及びそれを用いた疲労の検出方法に関する。

一態様において、本発明は、以下の遺伝子：ＯＰＡ１、ＨＳＰＢＡＰ１、ＴＹＭＰ、ＴＯＸ４、ＦＡＭ１６８Ｂ、ＦＣＨＯ２、ＫＲＴＡＰ１９－１、ＥＩＤ１、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＣＹＢ５Ｂ、ＣＡＭＳＡＰ１、ＮＩＰＢＬ、ＤＰＹＳＬ３、ＳＮＲＰＢ２、ＳＮＨＧ６、ＭＯＢ１Ｂ、ＳＴＡＲＤ５、及びＴＢＣ１Ｄ２３をコードする核酸、及び該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種を含む、疲労マーカーを提供する。
別の一態様において、本発明は、被験体から採取した生体試料における前記疲労マーカーの発現レベルを測定することを含む、被験体の疲労の検出方法を提供する。
別の一態様において、本発明は、試験物質を適用した被験体から採取した生体試料における前記疲労マーカーの発現レベルを測定することを含む、疲労制御剤の評価方法を提供する。
別の一態様において、本発明は、前記疲労の検出方法に用いられる疲労検出用キット又は疲労制御剤の評価用キットを提供する。

本発明は、新規な疲労マーカーを提供する。本発明の疲労マーカーは、疲労の検出を可能にする。また本発明の疲労マーカーは、皮膚表上脂質（ＳＳＬ）から非侵襲的に採取可能であるので、採取の手間や、採取による被験体への負担を低減することができる。

本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。

本明細書中に開示される遺伝子の名称は、ＮＣＢＩ（[www.ncbi.nlm.nih.gov/]）に記載のあるＯｆｆｉｃｉａｌ Ｓｙｍｂｏｌに従う。

本明細書において、「皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺等の外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。

本明細書において、「皮膚」とは、特に限定しない限り、体表の表皮、真皮、毛包、ならびに汗腺、皮脂腺及びその他の腺などの組織を含む領域の総称である。

本明細書において、「疲労」とは、身体的倦怠感、精神的倦怠感、及び認知的倦怠感を含む倦怠感を有する状態を表す。例えば、本明細書における「疲労」の程度は、米国疾病予防管理センター（ＣＤＣ）が疲労の評価に用いることを推奨するチャルダー疲労質問票（ＣＦＳ）のスコアに反映される。ＣＦＳは身体疲労及び精神疲労に関する１４項目の質問から構成されており、身体と精神の双方の疲労を総合的に評価することができる。ＣＦＳスコアが１５点以上、好ましくは１８点以上になると疲労している（疲労度が高い）と判断される（Narumi D., et al. AIJ Journal of Technology and Design 54 (2017):563-566.）。一方、本明細書において、疲労度についての「健常」とは、ＣＦＳのスコアが１５点未満、好ましくは１１点以下である状態をいう。

本明細書において、疲労の「検出」は、検査、測定、判定又は評価支援などの用語で言い換えることもできる。本明細書における疲労の「検出」、「検査」、「測定」、「判定」又は「評価」という用語は、医師による疲労を伴う疾患（例えば慢性疲労症候群）の診断を含むものではない。

（１．疲労マーカー）
従来、疲労は、主に問診やアンケート（例えば、前述のチャルダー疲労質問票）に基づくスコアリングによって評価されている。このような評価法は、客観性や定量性に劣ることがあり、また試験間での評価の比較を困難にする。

本発明者は、被験体の疲労が特定の遺伝子の発現に反映されることを見出した。後述の実施例に示すとおり、チャルダー疲労質問票に基づき判定された、疲労度の特に低いＣＦＳスコアが１１点以下の健常群と疲労度が特に高いＣＦＳスコアが１８点以上の疲労群との間で、発現レベルが異なっている遺伝子が見出された。このような両群の間で異なる発現レベルを示した遺伝子をコードする核酸、及びそれらの遺伝子にコードされるタンパク質は、疲労マーカーとして使用できる。例えば、それらの遺伝子をコードする核酸、又はそれらの遺伝子にコードされるタンパク質の発現レベルを指標に、疲労を検出することができる。

したがって、一態様において本発明は、疲労を検出するための疲労マーカーを提供する。本発明で提供される疲労マーカー（以下、本発明のマーカーともいう）は、該マーカーが由来する個々の被験者の疲労を検出することを可能にする。

本発明のマーカーは、下記表１に示す２２２遺伝子をコードする核酸、及び該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種を含み得る。本発明のマーカーは、下記表１に示す遺伝子をコードする核酸（核酸マーカー）であっても、該遺伝子にコードされるタンパク質（タンパク質マーカー）であっても、それらの組み合わせであってもよいが、好ましくは核酸マーカーである。

一実施形態において、本発明のマーカーは、表２及び表３に示す遺伝子をコードする核酸（以下、それぞれ表２及び表３の核酸マーカーともいう）、及び該遺伝子にコードされるタンパク質（以下、それぞれ表２及び表３のタンパク質マーカーともいう）からなる群より選択される少なくとも１種を含む。表２の核酸マーカーとタンパク質マーカーとを総称して表２のマーカーということがあり、また表３の核酸マーカーとタンパク質マーカーとを総称して表３のマーカーということがある。好ましくは、表２及び表３のマーカーは核酸マーカーである。後述する実施例に示すように、表２に示す３６遺伝子は、被験体の疲労に応じて発現レベルが増加し、表３に示す１７９遺伝子は、被験体の疲労に応じて発現レベルが低下する。したがって、表２のマーカーは、その発現レベルが被験体の疲労に応じて増加する、ポジティブマーカーである。一方、表３のマーカーは、その発現レベルが被験体の疲労に応じて低下する、ネガティブマーカーである。本発明においては、前者のポジティブマーカーと、後者のネガティブマーカーのいずれか一方を使用してもよく、又は両方を組み合わせて使用してもよい。

別の一実施形態において、本発明のマーカーは、表４に示す２３遺伝子をコードする核酸（以下、表４の核酸マーカーともいう）、及び該遺伝子にコードされるタンパク質（以下、表４のタンパク質マーカーともいう）からなる群より選択される少なくとも１種を含む。表４の核酸マーカーとタンパク質マーカーとを総称して表４のマーカーということがある。好ましくは、表４のマーカーは核酸マーカーである。後述する実施例に示すように、表４に示す遺伝子は、被験体におけるその発現レベルのデータを説明変数とし、疲労状態を目的変数として、機械学習アルゴリズムとしてランダムフォレストを用いて、特徴量遺伝子の抽出及び予測モデルの構築を実施した際に抽出された、ジニ係数に基づく変数重要度上位２３に相当する遺伝子である。

別の一実施形態において、本発明のマーカーは、表５に示す９遺伝子をコードする核酸（以下、表５の核酸マーカーともいう）、及び該遺伝子にコードされるタンパク質（以下、表５のタンパク質マーカーともいう）からなる群より選択される少なくとも１種を含む。表５の核酸マーカーとタンパク質マーカーとを総称して表５のマーカーということがある。好ましくは、表５のマーカーは核酸マーカーである。後述する実施例に示すように、表５に示す遺伝子は、機械学習アルゴリズムとしてＢｏｒｕｔａ法を用いた場合に特徴量遺伝子として抽出された遺伝子である。

好ましい一実施形態において、本発明のマーカーは、表６に示す１８遺伝子をコードする核酸（以下、表６の核酸マーカーともいう）、及び該遺伝子にコードされるタンパク質（以下、表６のタンパク質マーカーともいう）からなる群より選択される少なくとも１種を含む。表６の核酸マーカーとタンパク質マーカーとを総称して表６のマーカーということがある。好ましくは、表６のマーカーは核酸マーカーである。表６に示す遺伝子は、表２又は表３と、表４と、表５の全てに共通して含まれる７遺伝子（ＯＰＡ１、ＨＳＰＢＡＰ１、ＴＯＸ４、ＫＲＴＡＰ１９－１、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＣＹＢ５Ｂ、ＣＡＭＳＡＰ１）、表２又は表３と表４に共通して含まれ、表５には含まれない９遺伝子（ＴＹＭＰ、ＦＡＭ１６８Ｂ、ＦＣＨＯ２、ＥＩＤ１、ＮＩＰＢＬ、ＤＰＹＳＬ３、ＳＮＲＰＢ２、ＳＮＨＧ６、ＭＯＢ１Ｂ）、ならびに表２又は表３と表５に共通して含まれ、表４には含まれない２遺伝子（ＳＴＡＲＤ５、ＴＢＣ１Ｄ２３）からなる。

好ましい一実施形態において、本発明のマーカーは、表６のマーカーからなる群より選択される少なくとも１種に加えて、さらに表１のマーカーからなる群より選択される少なくとも１種（ただし表６のマーカー以外のもの）を含んでいてもよい。例えば、本発明のマーカーは、表６のマーカーからなる群より選択される少なくとも１種に加えて、さらに表２のマーカー、表３のマーカー、又は表４のマーカーからなる群より選択される少なくとも１種（ただし表６のマーカー以外のもの）を含んでいてもよい。例えば、本発明のマーカーは、表６の核酸マーカーからなる群より選択される少なくとも１種、好ましくは全部を含み、さらに表２、表３又は表４の核酸マーカーからなる群より選択される少なくとも１種（ただし表６の核酸マーカー以外のもの）を含んでいてもよい。例えば、本発明のマーカーは、表６のタンパク質マーカーからなる群より選択される少なくとも１種、好ましくは全部を含み、さらに表２、表３又は表４のタンパク質マーカーからなる群より選択される少なくとも１種（ただし表６のタンパク質マーカー以外のもの）を含んでいてもよい。上記の場合、表６のマーカーからなる群より選択される少なくとも１種としては、好ましくは、ＯＰＡ１、ＨＳＰＢＡＰ１、ＴＯＸ４、ＫＲＴＡＰ１９－１、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＣＹＢ５Ｂ、及びＣＡＭＳＡＰ１の７遺伝子から選択される１種以上、より好ましくは２種以上、さらに好ましくは７種全てを含み、さらに好ましくは表６の１８種のマーカー全てである。

別の好ましい一実施形態においては、表２もしくは表３の核酸マーカーの全て、又は表２もしくは表３のタンパク質マーカーの全てを組み合わせて本発明のマーカーとして使用する。
別の好ましい一実施形態においては、表２及び表３の核酸マーカーの全て、又は表２及び表３のタンパク質マーカーの全てを組み合わせて本発明のマーカーとして使用する。
別の好ましい一実施形態においては、表４の核酸マーカー又はタンパク質マーカーの全てを組み合わせて本発明のマーカーとして使用する。
別の好ましい一実施形態においては、表５の核酸マーカー又はタンパク質マーカーの全てを組み合わせて本発明のマーカーとして使用する。
別の好ましい一実施形態においては、表６の核酸マーカー又はタンパク質マーカーの全てを組み合わせて本発明のマーカーとして使用する。
別の好ましい一実施形態においては、表１の核マーカー酸又はタンパク質マーカーの全てを組み合わせて本発明のマーカーとして使用する。

本発明のマーカーは、被験体から採取した生体試料、例えば、細胞、角層、組織（生検等）、体液（血液等）、尿、分泌物（唾液、ＳＳＬ等）などから常法に従って調製することができる。例えば、生体試料からの核酸又はタンパク質の調製には、市販のキットを使用することができる。好ましくは、本発明のマーカーは核酸マーカーであり、生体試料から調製される核酸の好ましい例としては、ゲノムＤＮＡ、及びｍＲＮＡ等のＲＮＡなどが挙げられる。

本発明のマーカーを含む生体試料を採取される被験体の例としては、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物が挙げられる。好ましくは、該被験体は、疲労の状態の検出を必要とするヒト及び非ヒト哺乳動物、又は疲労の状態の検出を希望するヒトである。より好ましくは、該被験体はヒトである。

より好ましくは、本発明のマーカーは、被験者のＳＳＬから調製される核酸又はタンパク質、さらに好ましくはｍＲＮＡである。ＳＳＬが採取される皮膚の部位としては、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚が挙げられ、皮脂の分泌が多い部位、例えば顔の皮膚が好ましい。

被験体の皮膚からのＳＳＬの採取には、皮膚からのＳＳＬの回収又は除去に用いられているあらゆる手段を採用することができる。好ましくは、後述するＳＳＬ吸収性素材、ＳＳＬ接着性素材、又は皮膚からＳＳＬをこすり落とす器具を使用することができる。ＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材としては、ＳＳＬに親和性を有する素材であれば特に限定されず、例えばポリプロピレン、パルプ等が挙げられる。皮膚からのＳＳＬの採取手順のより詳細な例としては、あぶら取り紙、あぶら取りフィルム等のシート状素材へＳＳＬを吸収させる方法、ガラス板、テープ等へＳＳＬを接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等によりＳＳＬをこすり落として回収する方法、などが挙げられる。ＳＳＬの吸着性を向上させるため、脂溶性の高い溶媒を予め含ませたＳＳＬ吸収性素材を用いてもよい。一方、ＳＳＬ吸収性素材は、水溶性の高い溶媒や水分を含んでいるとＳＳＬの吸着が阻害されるため、水溶性の高い溶媒や水分の含有量が少ないことが好ましい。ＳＳＬ吸収性素材は、乾燥した状態で用いることが好ましい。

採取されたＳＳＬは、直ちに後述の核酸又はタンパク質の抽出工程に用いられてもよいが、該核酸又はタンパク質抽出工程に用いるまで保存されてもよい。保存する場合、ＳＳＬは、好ましくは低温条件で保存される。ＳＳＬの保存の温度条件は、好ましくは１０℃以下、より好ましくは５℃以下、さらに好ましくは０℃以下、さらに好ましくは－２０±２０℃～－８０±２０℃、さらに好ましくは－２０±１０℃～－８０±１０℃、さらに好ましくは－２０±５℃～－８０±５℃である。ＳＳＬの保存の期間は、特に限定されないが、好ましくは１２か月以下、例えば６時間以上１２ヶ月以下、より好ましくは６ヶ月以下、例えば１日間以上６ヶ月以下、さらに好ましくは３ヶ月以下、例えば３日間以上３ヶ月以下である。

採取したＳＳＬからの核酸又はタンパク質の抽出には、生体試料からの核酸又はタンパク質の抽出又は精製に通常使用される方法を使用することができる。核酸の抽出又は精製方法の例としては、フェノール/クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はＴＲＩｚｏｌ（登録商標）、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）などのカラムを用いた方法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、ＩＳＯＧＥＮ等の市販のＲＮＡ抽出試薬による抽出、などが挙げられる。タンパク質の抽出又は精製には、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）等の市販のタンパク質抽出試薬を用いることができる。

（２．疲労の検出方法）
（２．１．マーカーの発現レベルに基づく疲労の検出）
別の一態様において、本発明は、本発明の疲労マーカーを用いた被験体の疲労の検出方法を提供する。該方法では、被験体における本発明のマーカーの発現レベルに基づいて該被験体の疲労を検出する。本発明による疲労の検出方法が適用される被験体は、上述した本発明の疲労マーカーを含む生体試料を採取される被験体と同様である。

好ましい実施形態において、本発明による疲労の検出方法は、被験体から採取した生体試料における本発明のマーカーの発現レベルを測定することを含む。該生体試料の種類は、上述したとおりであり、好ましくはＳＳＬである。一実施形態において、本発明の方法は、該被験体のＳＳＬを採取することをさらに含んでいてもよい。ＳＳＬの採取手順、及びＳＳＬからのマーカーの抽出手順は、上述したとおりである。

本発明のマーカーの発現レベルは、当該分野で通常用いられる核酸又はタンパク質の定量法に従って、測定することができる。例えば、核酸マーカーの発現レベルは、当該分野で通常用いられる遺伝子発現解析の手順に従って測定すればよい。遺伝子発現解析の手法の例としては、リアルタイムＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、マイクロアレイ、シーケンシング、クロマトグラフィーなどによりＤＮＡ又はその増幅産物を定量する方法が挙げられる。核酸がＲＮＡの場合は、ＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、上記方法で定量することができる。タンパク質マーカーの発現レベルは、当該分野で通常用いられるタンパク質定量法、例えばＥＬＩＳＡ、免疫染色、蛍光法、電気泳動、クロマトグラフィー、質量分析などを用いて測定することができる。算出されるマーカーの発現レベルは、生体試料中の該標的マーカーの絶対量に基づく発現レベルであっても、他の標準遺伝子や、全核酸又はタンパク質の発現レベルに対する相対発現レベルであってもよい。

好ましくは、本発明による疲労の検出方法で使用される本発明のマーカーは、ＳＳＬ由来ｍＲＮＡである。好ましくは、ＳＳＬから抽出したＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに変換した後、該ｃＤＮＡ又はその増幅産物を上記の手法で定量することで、該ＳＳＬ由来ＲＮＡの発現レベルが測定される。該逆転写には、解析したい特定のＲＮＡを標的としたプライマーを用いてもよいが、より包括的な核酸の保存及び解析のためにはランダムプライマーを用いることが好ましい。該逆転写には、一般的な逆転写酵素又は逆転写試薬キットを使用することができる。好適には、正確性及び効率性の高い逆転写酵素又は逆転写試薬キットが用いられ、その例としては、Ｍ－ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは市販の逆転写酵素又は逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられる。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）などが好ましく用いられる。得られたｃＤＮＡのＰＣＲでは、解析したい特定のＤＮＡを標的としたプライマーペアを用いて該特定のＤＮＡのみを増幅してもよいが、複数のプライマーペアを用いて複数のＤＮＡを増幅してもよい。好ましくは、該ＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲである。マルチプレックスＰＣＲは、ＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。マルチプレックスＰＣＲは、市販のキット（例えば、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズジャパン株式会社等）を用いて実施することができる。

当該逆転写及びＰＣＲの反応条件を調整することで、ＰＣＲ反応産物の収率がより向上し、ひいてはそれを用いた解析の精度がより向上する。好適には、該逆転写での伸長反応において、温度を好ましくは４２℃±１℃、より好ましくは４２℃±０．５℃、さらに好ましくは４２℃±０．２５℃に調整し、一方、反応時間を好ましくは６０分間以上、より好ましくは８０～１２０分間に調整する。また好適には、該ＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長反応の温度は、好ましくは６２℃±１℃、より好ましくは６２℃±０．５℃、さらに好ましくは６２℃±０．２５℃である。したがって、該ＰＣＲでは、好ましくはアニーリング及び伸長反応が１ステップで行われる。該アニーリング及び伸長反応のステップの時間は、増幅すべきＤＮＡのサイズ等に依存して調整され得るが、好ましくは１４～１８分間である。該ＰＣＲにおける変性反応の条件は、増幅すべきＤＮＡに依存して調整され得るが、好ましくは９５～９９℃で１０～６０秒間である。上記のような温度及び時間での逆転写及びＰＣＲは、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラーを用いて実行することができる。

当該ＰＣＲで得られた反応産物の精製は、反応産物のサイズ分離によって行われることが好ましい。サイズ分離により、目的のＰＣＲ反応産物を、ＰＣＲ反応液中に含まれるプライマーやその他の不純物から分離することができる。ＤＮＡのサイズ分離は、例えば、サイズ分離カラムや、サイズ分離チップ、サイズ分離に利用可能な磁気ビーズなどによって行うことができる。サイズ分離に利用可能な磁気ビーズの好ましい例としては、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ等のＳｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）磁性ビーズが挙げられる。

精製したＰＣＲ反応産物に対して、その後の定量解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、ＤＮＡのシーケンシングのために、精製したＰＣＲ反応産物を、適切なバッファー溶液へと調製したり、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡに含まれるＰＣＲプライマー領域を切断したり、増幅されたＤＮＡにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、精製したＰＣＲ反応産物をバッファー溶液へと調製し、増幅ＤＮＡに対してＰＣＲプライマー配列の除去及びアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、定量解析のためのライブラリーを調製することができる。これらの操作は、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×ＶＩＬＯ ＲＴ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ ＨｉＦｉ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｒｅ Ｐａｎｅｌを用いて、各キット付属のプロトコルに従って行うことができる。シーケンシングには、好ましくは次世代シーケンサー（例えばＩｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が用いられる。シーケンシングで作成されたリードの数（リードカウント）に基づいて、ＲＮＡ発現レベルを定量することができる。

本発明による疲労の検出方法の一実施形態においては、被験体における本発明のマーカーの発現レベル（好ましくは、該被験体から採取した生体試料中に含まれる本発明のマーカーの発現レベル）を指標に、被験体の疲労を検出する。

上述したように、表２の核酸マーカー及びタンパク質マーカーは、その発現レベルが被験体の疲労に応じて増加するポジティブマーカーであり、一方、被験体における表３の核酸マーカー及びタンパク質マーカーは、その発現レベルが被験体の疲労に応じて低下するネガティブマーカーである。したがって、該ポジティブマーカーの発現レベルが増加した場合、被験体は疲労しているとして検出され、そうでない場合、被験体は疲労していないと検出される。あるいは、該ネガティブマーカーの発現レベルが低下した場合、被験体は疲労しているとして検出され、そうでない場合、被験体は疲労していないと検出される。あるいは、本発明による疲労の検出方法においては、該ポジティブマーカーと該ネガティブマーカーを組み合わせて使用してもよい。

一実施形態においては、被験体から測定された本発明のマーカーの発現レベルを、基準値と比べることで、該被験体の疲労を検出することができる。あるいは、一被験体から本発明のマーカーの発現レベルを定期的に（例えば毎月）測定し、その発現レベルの変動を追跡することで、該被験体の疲労を検出することができる。該基準値には、予め決定した値、例えば、本発明のマーカーの発現レベルの統計値（例えば平均値）を用いることができる。該基準値は、被験体ごとに設定されてもよい。例えば、同じ被験体から複数回測定したマーカーの発現レベルの統計値から該基準値を算出してもよい。あるいは、該基準値は、参照集団（疲労度が任意である個体からなる群）、又は健常群（疲労度が正常範囲［例えば前述したＣＦＳのスコアが１５点未満］である個体からなる群）から測定した本発明のマーカーの発現レベルの統計値（例えば平均値など）に基づいて決定することができる。本発明のマーカーとして複数種の核酸又はタンパク質を用いる場合は、各々の核酸又はタンパク質について基準値を求めることが好ましい。

例えば、本発明のマーカーがポジティブマーカーの場合、該マーカーの発現レベルが基準値よりも高い場合、被験体は疲労している（すなわち被験体の疲労度は高い）として検出され得、そうでない場合、被験体は疲労していない（すなわち被験体の疲労度は健常）と検出され得る。例えば、被験体におけるポジティブマーカーの発現レベルが基準値と比べて統計学的に有意に高ければ、該被験体は疲労しているとして検出され得、そうでない場合、被験体は疲労していないと検出され得る。また例えば、被験体におけるポジティブマーカーの発現レベルが基準値に対して、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１２０％以上、さらに好ましくは１５０％以上であれば、該被験体は疲労しているとして検出され得、そうでない場合、被験体は疲労していないと検出され得る。

一方、本発明のマーカーがネガティブマーカーの場合、該マーカーの発現レベルが基準値よりも低い場合、被験体は疲労しているとして検出され得、そうでない場合、被験体は疲労していないと検出され得る。例えば、被験体におけるネガティブマーカーの発現レベルが基準値と比べて統計学的に有意に低ければ、該被験体は疲労しているとして検出され得、そうでない場合、被験体は疲労していないと検出され得る。また例えば、被験体におけるネガティブマーカーの発現レベルが基準値に対して、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７５％以下であれば、該被験体は疲労しているとして検出され得、そうでない場合、被験体は疲労していないと検出され得る。

あるいは、複数の核酸又はタンパク質を組み合わせてマーカーとして用いる場合には、それらの核酸又はタンパク質の一定割合、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは１００％が上述した発現レベルの基準を満たすか否かに基づいて、被験体の疲労を検出することができる。

（２．２．予測モデルに基づく疲労の検出）
本発明による疲労の検出方法の別の一実施形態においては、本発明のマーカー（該被験体から採取した生体試料中に含まれる本発明のマーカー）の発現レベルについてのデータ（以下、発現プロファイルと呼ぶ）を用いて構築した予測モデルに基づいて、被験体の疲労状態を検出する。発現プロファイルの例としては、シーケンシングリード数等の発現レベルに関するデータが挙げられる。

例えば、教師サンプル集団（例えば、健常群及び疲労群を含む集団）の各個体から取得した１つ以上のマーカー（核酸又はタンパク質）の各々についての発現プロファイルを説明変数とし、該集団の各個体における疲労状態（例えば、健常又は疲労）についてのデータを目的変数とした機械学習により、任意の被験体における疲労状態を判別するための予測モデル（例えば判別式）を構築することができる。

本明細書において、「特徴量」とは、機械学習における「説明変数」と同義である。本明細書において、その発現プロファイルが機械学習の説明変数（特徴量）として使用されるマーカーを「特徴量マーカー（群）」と称することがある。また特徴量マーカーが核酸マーカーの場合、特徴量遺伝子と称することがある。

本実施形態で用いられる特徴量マーカー（群）は、表１の核酸マーカー及びタンパク質マーカーからなる群より選択される少なくとも１種であればよい。特徴量マーカーの発現プロファイルは、絶対値であっても相対値であってもよく、あるいは正規化処理されていてもよい。特徴量マーカー群として複数のマーカーを使用する場合、例えば、本発明のマーカーの中から疲労状態との相関が高いものを複数選択し、それらの発現プロファイルの各々を説明変数として用いることができる。

好ましい実施形態においては、表２及び表３の核酸マーカーの全て、又は表２及び表３のタンパク質マーカーの全てを組み合わせて、特徴量マーカー群として使用する。別の好ましい実施形態においては、表４の核酸マーカー又はタンパク質マーカーの全てを組み合わせて特徴量マーカー群として使用する。別の好ましい実施形態においては、表５の核酸マーカー又はタンパク質マーカーの全てを組み合わせて特徴量マーカー群として使用する。別の好ましい実施形態においては、表６の核酸マーカー又はタンパク質マーカーの全てを組み合わせて特徴量マーカー群として使用する。別の好ましい実施形態においては、表６の核酸マーカー又はタンパク質マーカーの全てと、表２、表３又は表４のいずれかの核酸マーカー又はタンパク質マーカーのいずれか１つ以上、好ましくは全て（ただし表６のマーカー以外のもの）とを組み合わせて特徴量マーカー群として使用する。別の好ましい実施形態においては、表１の核酸又はタンパク質マーカーの全てを組み合わせて特徴量マーカー群として使用する。

好ましい実施形態においては、機械学習のための教師サンプルとして、疲労度の低い個体（健常群）及び疲労度の高い個体（疲労群）における特徴量マーカー（群）の発現プロファイルを用いる。該教師サンプルを用いて、個体を健常群と疲労群に分けるための判別式（予測モデル）を構築する。判別式の構築に用いる説明変数としては、特徴量マーカー（群）の発現プロファイルを用いることができる。目的変数としては、例えば、特徴量マーカー（群）が由来する個体が健常群か疲労群かを表す変数を用いることができる。構築した判別式に基づいて、健常群と疲労群を判別するためのカットオフ値を求めることができる。次いで、疲労状態を調べたい被験体由来の該特徴量マーカー（群）の発現プロファイルを測定し、得られた測定値を当該判別式に代入し、該判別式から得られた結果を該カットオフ値と比較することによって、該被験体が健常群か疲労群かを判別する。

例えば、判別すべき２群間（健常群及び疲労群）の統計学的に有意な差異、例えば、発現プロファイルが２群間で有意に変動するマーカーを特徴量マーカー（群）とし、その発現プロファイルを説明変数として用いることができる。あるいは、特徴量マーカー（群）は、機械学習アルゴリズムなどの公知のアルゴリズムを利用して抽出することができる。例えば、下記実施例に示すように、ランダムフォレストにおける変数重要度の高さや、Ｒ言語の“Ｂｏｒｕｔａ”パッケージなどを用いて、特徴量マーカー（群）を抽出することができる。

あるいは、予測モデルの構築に複数のマーカーの発現プロファイルを使用する場合、必要に応じて、次元削減によってデータを圧縮してから予測モデルの構築を行ってもよい。例えば、表１に示す遺伝子群をコードする核酸マーカーの中から複数のマーカーを抽出する。次いで、該抽出したマーカーの発現プロファイルについて主成分分析を実施する。該主成分分析で算出された１つ以上の主成分を説明変数とし、該説明変数が由来する個体が健常群か疲労群かを表す変数を目的変数とした機械学習により、被験体が健常群か疲労群かを判別するための予測モデルを構築することができる。

予測モデルの構築におけるアルゴリズムは、機械学習に用いるアルゴリズムなどの公知のものを利用することができる。機械学習アルゴリズムの例としては、限定ではないが、線形回帰モデル（Linear model）、ラッソ回帰（Lasso）、ランダムフォレスト（Random Forest）、ニューラルネットワーク（Neural net）、線形カーネルのサポートベクターマシン（SVM (linear)）、ｒｂｆカーネルのサポートベクターマシン（SVM (rbf)）などのアルゴリズムが挙げられる。本発明で用いるアルゴリズムとしては、ランダムフォレストが好ましい。

構築した予測モデルに検証用のデータを入力して予測値を算出し、該予測値が実測値と最も適合するモデル、例えば、該予測値の実測値に対する正解率（Ａｃｃｕｒａｃｙ）が最も大きいモデル、又は該予測値と実測値の差の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）が最も小さいモデルを、最適モデルとして選択することができる。構築した予測モデルに対して被験体から実測した特徴量マーカー（群）の発現プロファイルを入力することによって、該被験体の疲労を検出することができる。

（３．疲労制御剤の評価方法）
さらなる一態様において、本発明は、本発明の疲労マーカーを用いた疲労制御剤の評価方法を提供する。該方法は、本発明のマーカーの発現レベルに基づいて疲労制御剤を評価する。好ましくは、該方法は、試験物質を適用した被験体から採取した生体試料における本発明のマーカーの発現レベルを測定することを含む。該方法において、用いられる生体試料の種類は、上述したとおりである。好ましくは、該生体試料はＳＳＬであり、本発明のマーカーは、ＳＳＬ由来ｍＲＮＡである。一実施形態において、該方法は、被験体のＳＳＬを採取することをさらに含んでいてもよい。本発明で評価される疲労制御剤としては、疲労改善剤又は疲労亢進剤が挙げられ、好ましくは、疲労改善剤である。

生体試料を採取される被験体は、ヒト又は非ヒト哺乳動物である。評価される疲労制御剤に応じて適宜適切な被験体を選択することができる。該被験体としては、疲労改善剤を評価する場合は、好ましくは疲労度が高いヒト又は非ヒト哺乳動物が用いられ、疲労亢進剤を評価する場合は、好ましくは疲労度が健常なヒト又は非ヒト哺乳動物が用いられる。好ましくは、該被験体はヒトである。

本発明の評価方法に用いられる試験物質は、疲労制御剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物もしくは混合物であってもよい。試験物質の形態は、特に制限されず、固形、半固形、ゲル、液体、気体等いずれの形態であってもよいが、ゲル又は液体が好ましい。また試験物質は、光照射、温熱、マッサージなどの物理刺激であってもよい。被験体に試験物質を適用する手法としては、経口投与、及び注射、塗布、噴霧、散布、滴下、貼付、照射等の非経口投与が挙げられ、特に限定されない。被験体へ適用する試験物質の用量及び適用期間は、試験物質の種類や投与形態に応じて適宜設定することができる。

被験体からの生体試料の採取、採取した生体試料からのマーカーの抽出、マーカーの発現レベルの測定の手順は、上述したとおりである。

抽出した該被験体由来の本発明のマーカーの発現レベルは、該被験体の疲労に応じてポジティブマーカーであれば増加し、ネガティブマーカーであれば低下している。試験物質による該マーカーの発現レベルの変化に基づいて、該試験物質が疲労制御剤であるか否かを評価することができる。より詳細には、ポジティブマーカーの発現レベルを低下させる試験物質、又はネガティブマーカーの発現レベルを増加させる試験物質は、疲労改善剤と判断される。反対に、ポジティブマーカーの発現レベルを増加させる試験物質、又はネガティブマーカーの発現レベルを低下させる試験物質は、疲労亢進剤と判断される。

一実施形態においては、該被験体由来の本発明のマーカーの発現レベルを対照と比較することで、該試験物質の疲労に対する効果を評価する。より詳細には、試験物質の適用下での本発明のマーカーの発現レベルが対照と比べて変化しているかを調べる。対照としては、試験物質の非適用下での本発明のマーカーの発現レベル、上述した疲労の評価のための基準値などが挙げられる。

一例において、試験物質の適用下でのポジティブマーカーの発現レベルが対照と比べて低下する場合、該試験物質は疲労改善剤と判断され得る。より詳細には、試験物質を適用した被験体又は被験体群でのポジティブマーカーの発現レベルが対照と比較して統計学的に有意に低下していれば、該試験物質は疲労改善剤と判断され得る。あるいは、試験物質を適用した被験体又は被験体群でのポジティブマーカーの発現レベルが対照に対して好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７５％以下に低下していれば、該試験物質は疲労改善剤と判断され得る。

別の例において、試験物質の適用下でのポジティブマーカーの発現レベルが対照と比べて増加する場合、該試験物質は疲労亢進剤と判断され得る。より詳細には、試験物質を適用した被験体又は被験体群でのポジティブマーカーの発現レベルが対照と比較して統計学的に有意に増加していれば、該試験物質は疲労亢進剤と判断され得る。あるいは、試験物質を適用した被験体又は被験体群でのネガティブマーカーの発現レベルが対照に対して好ましくは１１０％以上、より好ましくは１２０％以上、さらに好ましくは１５０％以上に増加していれば、該試験物質は疲労亢進剤と判断され得る。

さらに別の例において、試験物質の適用下でのネガティブマーカーの発現レベルが対照と比べて増加する場合、該試験物質は疲労改善剤と判断され得る。より詳細には、試験物質を適用した被験体又は被験体群でのネガティブマーカーの発現レベルが対照と比較して統計学的に有意に増加していれば、該試験物質は疲労改善剤と判断され得る。あるいは、試験物質を適用した被験体又は被験体群でのネガティブマーカーの発現レベルが対照に対して好ましくは１１０％以上、より好ましくは１２０％以上、さらに好ましくは１５０％以上に増加していれば、該試験物質は疲労改善剤と判断され得る。

さらに別の例において、試験物質の適用下でのネガティブマーカーの発現レベルが対照と比べて低下する場合、該試験物質は疲労亢進剤と判断され得る。より詳細には、試験物質を適用した被験体又は被験体群でのネガティブマーカーの発現レベルが対照と比較して統計学的に有意に低下していれば、該試験物質は疲労亢進剤と判断され得る。あるいは、試験物質を適用した被験体又は被験体群でのポジティブマーカーの発現レベルが対照に対して好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７５％以下に低下していれば、該試験物質は疲労亢進剤と判断され得る。

（４．疲労検出用キット及び疲労制御剤の評価用キット）
さらなる一態様において、本発明による疲労の検出方法に従って被験体の疲労を検出するための疲労検出用キット、及び本発明による疲労制御剤の評価方法に従って疲労制御剤を評価するするための疲労制御剤の評価用キットを提供する。一実施形態において、本発明のキットは、上述した本発明の疲労マーカーの発現レベルを測定するための試薬又は器具を備える。例えば、本発明のキットは、本発明の核酸マーカーを増幅又は定量するための試薬（例えば、逆転写酵素、ＰＣＲ用試薬、プライマー、プローブ、シーケンシング用アダプター配列等）、又は本発明のタンパク質マーカーを定量するための試薬（例えば、免疫学的測定のための試薬、抗体など）を備え得る。好ましくは、本発明のキットは、本発明の核酸マーカーと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ用のプライマー、又はプローブ）、あるいは、本発明のタンパク質マーカーを認識する抗体を含有する。好ましくは、本発明のキットは、本発明のマーカーの発現レベルを検出するための指標又はガイダンスを備える。例えば、本発明のキットは、各マーカーの発現レベルの増減と疲労との関係を説明するガイダンス、又は疲労の検出のための各マーカーの発現レベルの基準値を説明するガイダンスを備え得る。また本発明のキットは、生体試料採取デバイス（例えば、上記のＳＳＬ吸収性素材又はＳＳＬ接着性素材）、生体試料から本発明のマーカーを抽出するための試薬（例えば核酸精製用試薬）、生体試料採取後の試料採取デバイスの保存剤や保存用容器などをさらに備えていてもよい。

本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。

〔１〕以下の遺伝子：ＯＰＡ１、ＨＳＰＢＡＰ１、ＴＹＭＰ、ＴＯＸ４、ＦＡＭ１６８Ｂ、ＦＣＨＯ２、ＫＲＴＡＰ１９－１、ＥＩＤ１、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＣＹＢ５Ｂ、ＣＡＭＳＡＰ１、ＮＩＰＢＬ、ＤＰＹＳＬ３、ＳＮＲＰＢ２、ＳＮＨＧ６、ＭＯＢ１Ｂ、ＳＴＡＲＤ５、及びＴＢＣ１Ｄ２３をコードする核酸、及び該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種を含む、疲労マーカー。
〔２〕好ましくは、以下の遺伝子：ＯＰＡ１、ＨＳＰＢＡＰ１、ＴＹＭＰ、ＴＯＸ４、ＦＡＭ１６８Ｂ、ＦＣＨＯ２、ＫＲＴＡＰ１９－１、ＥＩＤ１、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＣＹＢ５Ｂ、ＣＡＭＳＡＰ１、ＮＩＰＢＬ、ＤＰＹＳＬ３、ＳＮＲＰＢ２、ＳＮＨＧ６、ＭＯＢ１Ｂ、ＳＴＡＲＤ５、及びＴＢＣ１Ｄ２３のそれぞれをコードする核酸の全部、又は該遺伝子のそれぞれにコードされるタンパク質の全部を含む、〔１〕記載の疲労マーカー。
〔３〕好ましくは、さらに、前記表１に示す遺伝子をコードする核酸、ならびに該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種を含む、〔１〕又は〔２〕記載の疲労マーカー。
〔４〕好ましくは、さらに、前記表２及び表３に示す遺伝子をコードする核酸、ならびに該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種を含む、〔１〕又は〔２〕記載の疲労マーカー。
〔５〕好ましくは、前記表２に示す遺伝子をコードする核酸、ならびに該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種を含む、〔４〕記載の疲労マーカー。
〔６〕好ましくは、前記表３に示す遺伝子をコードする核酸、ならびに該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種を含む、〔４〕記載の疲労マーカー。
〔７〕好ましくは、さらに、前記表４に示す遺伝子をコードする核酸、ならびに該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種を含む、〔１〕又は〔２〕記載の疲労マーカー。
〔８〕好ましくは疲労の検出のためのマーカーである、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の疲労マーカー。
〔９〕好ましくは核酸マーカーである、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の疲労マーカー。
〔１０〕好ましくは、前記核酸が皮膚表上脂質から採取されたｍＲＮＡである、〔９〕記載の疲労マーカー。

〔１１〕被験体から採取した生体試料における〔１〕～〔１０〕のいずれか１項記載の疲労マーカーの発現レベルを測定することを含む、被験体の疲労の検出方法。
〔１２〕好ましくは疲労度の高い被験体を検出するための方法である、〔１１〕記載の方法。
〔１３〕前記疲労マーカーの発現レベルに基づいて前記被験体の疲労を検出することをさらに含む、〔１１〕又は〔１２〕記載の方法。
〔１４〕前記疲労状態マーカーが、
好ましくは、前記表２に示す遺伝子をコードする核酸、及び該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、前記表２に示す遺伝子をコードする皮膚表上脂質由来ｍＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種であり、
かつ、該方法が、
好ましくは、該疲労マーカーの発現レベルが増加した場合に、前記被験体を疲労しているとして検出することを含み、
より好ましくは、該疲労マーカーの発現レベルが基準値より高い場合に、前記被験体を疲労しているとして検出することを含む、
〔１３〕記載の方法。
〔１５〕前記疲労状態マーカーが、
好ましくは、前記表３に示す遺伝子をコードする核酸、及び該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、前記表３に示す遺伝子をコードする皮膚表上脂質由来のｍＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種であり、
かつ、該方法が、
好ましくは、該疲労マーカーの発現レベルが低下した場合に、前記被験体を疲労しているとして検出することをさらに含み、
より好ましくは、該疲労マーカーの発現レベルが基準値より低い場合に、前記被験体を疲労しているとして検出することを含む、
〔１３〕記載の方法。
〔１６〕好ましくは、前記疲労状態マーカーの発現レベルについてのデータを用いて構築した予測モデルに基づいて、前記被験体の疲労を検出することを含む、〔１３〕記載の方法。
〔１７〕好ましくは、前記予測モデルが、健常群と疲労群とを含む集団の各個体から取得した前記疲労マーカーの発現レベルについてのデータを説明変数とし、該集団の各個体の疲労状態を目的変数とした機械学習により構築される、〔１６〕記載の方法。

〔１８〕試験物質を適用した被験体から採取した生体試料における〔１〕～〔１０〕のいずれか１項記載の疲労マーカーの発現レベルを測定することを含む、疲労制御剤の評価方法。
〔１９〕好ましくは前記疲労制御剤が疲労改善剤又は疲労亢進剤であり、より好ましくは疲労改善剤である、〔１８〕記載の方法。
〔２０〕好ましくは、前記試験物質による前記マーカーの発現レベルの変化に基づいて、該試験物質が疲労制御剤であるか否かを評価することをさらに含む、〔１８〕又は〔１９〕記載の方法。
〔２１〕前記疲労マーカーが、
好ましくは、前記表２に示す遺伝子をコードする核酸、及び該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、前記表２に示す遺伝子をコードする皮膚表上脂質由来ｍＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種であり、
かつ、該方法が、
好ましくは、前記試験物質の適用下での該疲労マーカーの発現レベルが対照と比べて低下する場合、該試験物質を疲労改善剤と判断し、前記試験物質の適用下での該疲労マーカーの発現レベルが対照と比べて増加する場合、該試験物質を疲労亢進剤と判断することを含む、
〔２０〕記載の方法。
〔２２〕前記疲労マーカーが、
好ましくは、前記表３に示す遺伝子をコードする核酸、及び該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、前記表３に示す遺伝子をコードする皮膚表上脂質由来ｍＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種であり、
かつ、該方法が、
好ましくは、前記試験物質の適用下での該疲労マーカーの発現レベルが対照と比べて増加する場合、該試験物質を疲労改善剤と判断し、前記試験物質の適用下での該疲労マーカーの発現レベルが対照と比べて低下する場合、該試験物質を疲労亢進剤と判断することを含む、
〔２０〕記載の方法。

〔２３〕〔１〕～〔１０〕のいずれか１項記載の疲労マーカーである核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は〔１〕～〔１０〕のいずれか１項記載の疲労マーカーであるタンパク質を認識する抗体を含有する、〔１１〕～〔１７〕のいずれか１項記載の方法に用いられる疲労検出用キット又は〔１８〕～〔２２〕のいずれか１項記載の方法に用いられる疲労制御剤の評価用キット。

以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１ 発現変動遺伝子を用いた疲労状態判別モデルの構築

１）被験者の選抜及びＳＳＬ採取
２０～６０歳代の健常な男女１７５名の方に、チャルダー疲労質問票に回答させ、そのスコアが１８点以上の上位２５％（４８名）の疲労度の高い方々を疲労群の被験者として選抜し、１１点以下の下位２５％（４２名）の疲労度の低い方々を健常群の被験者として選抜した。各被験者の全顔からあぶら取りフィルム（５ｃｍ×８ｃｍ、ポリプロピレン製、３Ｍ社）を用いて皮脂を回収した。該あぶら取りフィルムはガラスバイアルに移し、ＲＮＡ抽出に使用するまで－８０℃で保存した。

２）ＲＮＡ調製及びシーケンシング
上記１）のあぶら取りフィルムを適当な大きさに切断し、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写し、ｃＤＮＡを合成した。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、及び増幅を行い、ライブラリーを調製した。調製したライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるｈｇ１９ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ＥＲＣＣ ｖ１を用いて遺伝子マッピングすることで各リード配列の由来する遺伝子を決定した。

３）データ解析
上記２）における被験者のＳＳＬ由来ＲＮＡのシーケンシングで得られた各リードのリードカウントを、各ＲＮＡの発現レベルのデータとした。サンプル間の総リードカウントの違いを補正するため、各リードカウントをＲＰＭ（Ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）値に変換した。但し、リードカウントが１０未満のリードは欠損値として扱った。９０％以上の被験者で欠損値ではない発現レベルデータが得られた３９１８種の遺伝子について、その発現情報に基づいて群間（健常群及び疲労群）でＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔを行い、ｐ＜０．０５となる遺伝子を抽出した。表７及び表８に示す、群間で統計学的に有意に発現レベルが変動する２１５種の遺伝子が得られた。表７の３６遺伝子は、疲労群で発現レベルがより高かったことから、疲労群でその発現レベルが高いマーカー（ポジティブマーカー）であった。表８の１７９遺伝子は、疲労群で発現レベルがより低かったことから、疲労群でその発現レベルが低いマーカー（ネガティブマーカー）であった。これらの遺伝子を以下の予測モデル構築に用いる特徴量遺伝子として選択した。

４）モデル構築
３）で選択した特徴量遺伝子の発現レベルデータを、負の二項分布に従うＲＰＭ値から正規分布に近似するため、整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）に変換した。得られた２１５の特徴量遺伝子の発現レベルデータのＬｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、疲労状態（健常群か疲労群か）を目的変数として用いて、健常群と疲労群を判別する予測モデルを構築した。Ｒ言語の“ｃａｒｅｔ”パッケージにおいてランダムフォレストのアルゴリズムをメソッドとして指定し、１回の決定木の構築に用いる変数の数（ｍｔｒｙ値）の最適値をチューニングした。チューニングによって決定したｍｔｒｙ値を用いて、ランダムフォレストのアルゴリズムを実行し、推定誤答率（ＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅを算出した。その結果、２１５遺伝子全ての発現量データを変数に用いた場合のモデルではＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅは３２．２％であり、表７及び表８に示す遺伝子を、疲労を検出するためのマーカーとして使用できることが示された。

実施例２ ランダムフォレスト変数重要度の高い遺伝子を用いた疲労状態判別モデルの構築
１）使用データ
実施例１の３）で取得した９０％以上の被験者で欠損値ではない発現レベルデータが得られた３９１８種の遺伝子を以下の解析に使用した。遺伝子の発現レベルデータを、負の二項分布に従うＲＰＭ値から正規分布に近似するため、整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）に変換した。

２）特徴量遺伝子の選択
ランダムフォレストのアルゴリズムを用いて、予測モデル構築に用いる特徴量遺伝子の選択を行った。１）で得られた３９１８遺伝子の発現レベルデータのＬｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、疲労状態（健常群か疲労群か）を目的変数として用いて、疲労状態を判別する予測モデルを構築した。Ｒ言語の“ｃａｒｅｔ”パッケージにおいてランダムフォレストのアルゴリズムをメソッドとして指定し、１回の決定木の構築に用いる変数の数（ｍｔｒｙ値）の最適値をチューニングした。チューニングによって決定したｍｔｒｙ値を用いて、ランダムフォレストのアルゴリズムを実行し、ジニ係数に基づく変数重要度の上位２３遺伝子を算出した（表９）。これら２３遺伝子を予測モデル構築に用いる特徴量遺伝子として選択した。

３）モデル構築
２）で選択した２３の特徴量遺伝子の発現レベルデータのＬｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、疲労状態（健常群か疲労群か）を目的変数として用いて、疲労状態を判別する予測モデルを構築した。Ｒ言語の“ｃａｒｅｔ”パッケージにおいてランダムフォレストのアルゴリズムをメソッドとして指定し、１回の決定木の構築に用いる変数の数（ｍｔｒｙ値）の最適値をチューニングした。チューニングによって決定したｍｔｒｙ値を用いて、ランダムフォレストのアルゴリズムを実行し、推定誤答率（ＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）を算出した。その結果、２３遺伝子の発現レベルデータを変数に用いた場合のモデルではＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅは１４．４％であり、表９に示す遺伝子を、疲労を検出するためのマーカーとして使用できることが示された。

実施例３ Ｂｏｒｕｔａ法により抽出した特徴量遺伝子を用いた疲労状態判別モデルの構築
１）使用データ
実施例１の６）で取得した９０％以上の被験者で欠損値ではない発現レベルデータが得られた３９１８種の遺伝子を以下の解析に使用した。遺伝子の発現レベルデータを、負の二項分布に従うＲＰＭ値から正規分布に近似するため、整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値）に変換した。

２）特徴量遺伝子の選択
１）で得られた３９１８遺伝子の発現レベルデータのＬｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、疲労状態（健常群か疲労群か）を目的変数として用いて、Ｒ言語の“Ｂｏｒｕｔａ”パッケージのアルゴリズムを実行し、疲労状態を判別する予測モデルを構築した。最大試行回数を１０００回とし、ｐ値が０．０１未満である９遺伝子（ＯＰＡ１、ＨＳＰＢＡＰ１、ＴＯＸ４、ＫＲＴＡＰ１９－１、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＣＹＢ５Ｂ、ＣＡＭＳＡＰ１、ＳＴＡＲＤ５及びＴＢＣ１Ｄ２３）を算出した。これら９遺伝子を予測モデル構築に用いる特徴量遺伝子として選択した。

３）モデル構築
２）で選択した９つの特徴量遺伝子の発現レベルデータのＬｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、疲労状態（健常群か疲労群か）を目的変数として用いて、疲労状態を判別する予測モデルを構築した。Ｒ言語の“ｃａｒｅｔ”パッケージにおいてランダムフォレストのアルゴリズムをメソッドとして指定し、１回の決定木の構築に用いる変数の数（ｍｔｒｙ値）の最適値をチューニングした。チューニングによって決定したｍｔｒｙ値を用いて、ランダムフォレストのアルゴリズムを実行し、推定誤答率（ＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）を算出した。その結果、９遺伝子の発現レベルデータを変数に用いた場合のモデルではＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅは２１．１％であり、上記９遺伝子を、疲労を検出するためのマーカーとして使用できることが示された。

実施例４ 実施例１～３で重複して用いられた特徴量遺伝子に基づく疲労状態判別モデルの構築
１）特徴量遺伝子の選択
実施例１～３で用いられた特徴量遺伝子のうち、いずれか２つ以上の実施例間で重複して用いられた遺伝子は、ＯＰＡ１、ＨＳＰＢＡＰ１、ＴＹＭＰ、ＴＯＸ４、ＦＡＭ１６８Ｂ、ＦＣＨＯ２、ＫＲＴＡＰ１９－１、ＥＩＤ１、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＣＹＢ５Ｂ、ＣＡＭＳＡＰ１、ＮＩＰＢＬ、ＤＰＹＳＬ３、ＳＮＲＰＢ２、ＳＮＨＧ６、ＭＯＢ１Ｂ、ＳＴＡＲＤ５及びＴＢＣ１Ｄ２３の計１８遺伝子であった。これら１８遺伝子を予測モデル構築に用いる特徴量遺伝子として選択した。

２）モデル構築
１）で選択した１８の特徴量遺伝子の発現レベルデータのＬｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、疲労状態（健常群か疲労群か）を目的変数として用いて、疲労状態を判別する予測モデルを構築した。Ｒ言語の“ｃａｒｅｔ”パッケージにおいてランダムフォレストのアルゴリズムをメソッドとして指定し、１回の決定木の構築に用いる変数の数（ｍｔｒｙ値）の最適値をチューニングした。チューニングによって決定したｍｔｒｙ値を用いて、ランダムフォレストのアルゴリズムを実行し、推定誤答率（ＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）を算出した。その結果、１８遺伝子の発現レベルデータを変数に用いた場合のモデルではＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅは１７．８％であり、上記１８遺伝子を、疲労を検出するためのマーカーとして使用できることが示された。

実施例５ 実施例１～３で用いられた全ての特徴量遺伝子に基づく疲労状態判別モデルの構築
１）特徴量遺伝子の選択
実施例１～３のいずれかで用いられた特徴量遺伝子の全て（表１に示された計２２２種の遺伝子）を予測モデル構築に用いる特徴量遺伝子として選択した。

２）モデル構築
１）で選択した２２２の特徴量遺伝子の発現レベルデータのＬｏｇ₂（ＲＰＭ＋１）値を説明変数とし、疲労状態（健常群か疲労群か）を目的変数として用いて、疲労状態を判別する予測モデルを構築した。Ｒ言語の“ｃａｒｅｔ”パッケージにおいてランダムフォレストのアルゴリズムをメソッドとして指定し、１回の決定木の構築に用いる変数の数（ｍｔｒｙ値）の最適値をチューニングした。チューニングによって決定したｍｔｒｙ値を用いて、ランダムフォレストのアルゴリズムを実行し、推定誤答率（ＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ）を算出した。その結果、２２２遺伝子の発現レベルデータを変数に用いた場合のモデルではＯＯＢ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅは３１．１％であり、表１の２２２遺伝子を、疲労を検出するためのマーカーとして使用できることが示された。

Claims (13)

1. 被験体から採取した生体試料における、以下の遺伝子：ＯＰＡ１、ＨＳＰＢＡＰ１、ＴＹＭＰ、ＴＯＸ４、ＦＡＭ１６８Ｂ、ＦＣＨＯ２、ＫＲＴＡＰ１９－１、ＥＩＤ１、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＣＹＢ５Ｂ、ＣＡＭＳＡＰ１、ＮＩＰＢＬ、ＤＰＹＳＬ３、ＳＮＲＰＢ２、ＳＮＨＧ６、ＭＯＢ１Ｂ、ＳＴＡＲＤ５、及びＴＢＣ１Ｄ２３をコードする核酸、及び該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種の発現レベルを測定することを含む、被験体の疲労の検出方法。
2. さらに、下記表１及び表２に示す遺伝子をコードする核酸、及び該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種の発現レベルを測定することを含む、請求項１記載の方法。
   

   

   
3. さらに、下記表３に示す遺伝子をコードする核酸、及び該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種の発現レベルを測定することを含む、請求項１記載の方法。
   

   
4. さらに、下記表４に示す遺伝子をコードする核酸、及び該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種の発現レベルを測定することを含む、請求項１記載の方法。
   

   
5. 前記核酸が皮膚表上脂質から採取されたｍＲＮＡである、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
6. 前記核酸又はタンパク質の発現レベルに基づいて前記被験体の疲労を検出することをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
7. 前記表１に示す遺伝子をコードする核酸、及び該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種の発現レベルが増加した場合に、前記被験体を疲労しているとして検出することを含む、請求項６記載の方法。
8. 前記表２に示す遺伝子をコードする核酸、及び該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種の発現レベルが低下した場合に、前記被験体を疲労しているとして検出することを含む、請求項６記載の方法。
9. 前記核酸又はタンパク質の発現レベルについてのデータを用いて構築した予測モデルに基づいて、前記被験体の疲労を検出することを含む、請求項６記載の方法。
10. 試験物質を適用した被験体から採取した生体試料における、以下の遺伝子：ＯＰＡ１、ＨＳＰＢＡＰ１、ＴＹＭＰ、ＴＯＸ４、ＦＡＭ１６８Ｂ、ＦＣＨＯ２、ＫＲＴＡＰ１９－１、ＥＩＤ１、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＣＹＢ５Ｂ、ＣＡＭＳＡＰ１、ＮＩＰＢＬ、ＤＰＹＳＬ３、ＳＮＲＰＢ２、ＳＮＨＧ６、ＭＯＢ１Ｂ、ＳＴＡＲＤ５、及びＴＢＣ１Ｄ２３をコードする核酸、ならびに該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種の発現レベルを測定することを含む、疲労制御剤の評価方法。
11. 前記疲労制御剤が疲労改善剤である、請求項１０記載の方法。
12. 以下の遺伝子：ＯＰＡ１、ＨＳＰＢＡＰ１、ＴＹＭＰ、ＴＯＸ４、ＦＡＭ１６８Ｂ、ＦＣＨＯ２、ＫＲＴＡＰ１９－１、ＥＩＤ１、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＣＹＢ５Ｂ、ＣＡＭＳＡＰ１、ＮＩＰＢＬ、ＤＰＹＳＬ３、ＳＮＲＰＢ２、ＳＮＨＧ６、ＭＯＢ１Ｂ、ＳＴＡＲＤ５、及びＴＢＣ１Ｄ２３をコードする核酸、ならびに該遺伝子にコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種を含む、疲労マーカー。
13. 請求項１２記載の疲労マーカーである核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は請求項１２記載の疲労マーカーであるタンパク質を認識する抗体を含有する、請求項１～１１のいずれか１項記載の方法に用いられる疲労検出用キット又は疲労制御剤の評価用キット。