JP2010528672A5 - - Google Patents
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Claims (33)
- 脳におけるmRNA編集(該mRNA編集はADAR依存性A−to−I mRNA編集である)の病理的変化を評価するための方法であって、細胞を含有する末梢組織からなる生体サンプルの群から選択される単一の生体サンプルまたは2種類の異なる生体サンプルが用いられ、
前記の細胞を含有する末梢組織が、白血球(blood white cells)を含有する血液サンプルおよび、任意で、皮膚サンプル、からなる群から選択される哺乳類生体組織であり、
脳におけるmRNA編集の病理学的変更の評価が、
−白血球を含有する血液サンプルで発現されるADARの性質または/および量、ならびに、任意で
−皮膚サンプルにおける該mRNAの編集率またはその編集形態のプロフィール
により決定される、方法。 - 前記mRNA編集を有する該mRNAが5HTR2C mRNAであり、
前記方法が、患者が5HTR2CのmRNA編集の機構の変更に関連する病状を呈するかどうか、または該病状を発症するリスクがあるかどうかをin vitroにおいて特定するための方法であり、
a)被験患者から、血液細胞を含有する生体サンプルおよび、任意で、皮膚細胞を含有する生体サンプル、を得る工程;
b)前記血液細胞サンプルで発現されたADARの性質または/および量を決定し、任意で、さらに、前記皮膚細胞サンプルにおける前記5HTR2C mRNAの少なくとも1つの編集形態または非編集形態の編集率を決定する工程;
c)工程b)で得られた前記血液細胞サンプルで発現されたADARの性質または/および量、ならびに、任意で、前記皮膚細胞サンプルにおける前記5HTR2C mRNAのこの編集形態または非編集形態に関して工程b)で得られた編集率を、正常患者もしくはこのmRNA編集の機構の変更に関連する病状を示す患者から得られた特徴的な発現ADARプロフィールおよび、任意で、5HTR2C mRNAの対照編集率と比較することにより、患者がこのような病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかを特定する工程
を含む、請求項1に記載の方法。 - 該病状が、精神病、統合失調症、鬱病、鬱性自殺または異常な摂食挙動からなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
- in vitroにおいて、患者により示される病状が5HTR2CのmRNA編集の機構の変更に関連するかどうかを決定するための請求項1に記載の方法であって、
a)該病状を示す患者から、血液細胞および、任意で皮膚細胞、を含有する生体サンプルを得る工程;
b)前記血液細胞サンプルで発現されたADARの性質または/および量を決定し、任意で、さらに、前記皮膚細胞サンプルにおける前記5HTR2C mRNAの少なくとも1つの編集形態または非編集形態の編集率を決定する工程;
c)工程b)で得られた前記血液細胞サンプルで発現されたADARの性質または/および量、ならびに、任意で、前記皮膚細胞サンプルにおける前記5HTR2C mRNAのこの編集形態または非編集形態に関して工程b)で得られた編集率を、正常患者もしくはこのmRNA編集の機構の変更に関連しないことが知られている病状を示す患者から得られた特徴的な発現ADARプロフィールおよび、任意で、5HTR2C mRNAの対照編集率と比較することにより、患者がこのような病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかを特定する工程
を含む、方法。 - 哺乳類においてin vivoで5HTR2C mRNAの編集を調節する薬剤をin vitroで特定するための、請求項1に記載の方法であって、
a)該哺乳類に5HTR2C mRNA編集の候補モジュレーターを投与する工程;
b)該哺乳類から、血液細胞および、任意で皮膚細胞、を含有する生体サンプルを得る工程;
あるいは
a)哺乳類血液細胞および、任意で皮膚細胞(これらの細胞は組換え細胞であり得る)を含有する生体サンプルを得る工程;
b)前記5HTR2C mRNA編集の候補モジュレーターの存在下で該生体サンプルを接触させる工程;
および
c)該モジュレーターの、
−前記血液細胞で発現されたADARの性質または/および量に対する効果;および、任意で
−前記皮膚細胞サンプルにおける前記5HTR2C mRNAの少なくとも1つの編集形態または非編集形態の編集率に対する効果
を、
工程b)において生体サンプルから得られた発現ADARの性質または/および量、ならびに、任意で、この編集形態または非編集形態の編集率を、該哺乳類の対照血液細胞サンプルおよび、任意で皮膚細胞サンプル、から得られた発現ADARの性質または/および量、ならびに、任意で編集率、と比較することにより決定する工程
を含む、方法。 - 5HTR2CのmRNA編集の機構の変更に関連する病状の予防または治療のために用いられる薬剤の有効性を患者においてin vitroで決定するための、請求項1に記載の方法であって、
a)−被験患者から、血液細胞を含有する生体サンプルおよび、任意で、皮膚細胞を含有する生体サンプル、を得る工程、および
−前記血液細胞サンプルで発現されたADARの性質または/および量を決定し、任意で、さらに、前記皮膚細胞サンプルにおける前記5HTR2C mRNAの少なくとも1つの編集形態または非編集形態の編集率を決定する工程;
b)該患者に病状の予防または治療を意図した薬剤を投与する工程;
c)処置中または/および処置後に該患者から血液細胞および、任意で皮膚細胞、を含有する新たな生体サンプルを得、血液細胞サンプルで発現されたADARの性質または/および量を決定し、任意で、さらに、皮膚細胞サンプルにおける前記5HTR2C mRNAの少なくとも1つの編集形態または非編集形態の編集率を決定する工程;および
d)該薬剤の有効性を、工程a)の生体サンプルから得られた発現ADARの性質または/および量、ならびに、任意で編集率、を、工程c)で得られたものと比較することにより決定する工程(正常患者で見られるものに近いまたは等しい発現ADARの性質または/および量、ならびに、任意で編集率、をもたらす発現ADARの性質または/および量、ならびに、任意で編集率、の調節が処置の有効性に重要である)
を含む、方法。 - 患者または哺乳類がヒト、マウスまたはラット、好ましくはヒトである、請求項1に記載の方法。
- 皮膚細胞がケラチノサイト、メラノサイト、繊維芽細胞、ランゲルハンス細胞およびメルケル細胞からなる群から選択され、皮膚組織が表皮および真皮からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- ケラチノサイトがHaCaT細胞などのヒト不死化細胞に由来し、あるいはメラノサイトがヒト不死化細胞または黒色腫に由来する、請求項8に記載の方法。
- ケラチノサイトが新生児の皮膚、真皮または毛包に由来し、メラノサイトが表皮または毛包に由来し、繊維芽細胞が真皮または乳頭毛包に由来する、請求項9に記載の方法。
- 皮膚細胞、培養皮膚由来細胞または皮膚組織がまぶたまたは耳の皮膚に由来する、請求項8に記載の方法。
- 編集率が該5HTR2C mRNAの編集および非編集形態総てに関して決定される、請求項1に記載の方法。
- 該5HTR2C mRNAの各編集および非編集形態の編集率が、
A)皮膚細胞系統、培養皮膚由来細胞または皮膚組織の全RNAを抽出し、その後、適当であればそのmRNAを生成する工程;
B)工程A)で抽出されたRNAを逆転写する工程;および
C)工程B)で得られたcDNAを、編集され得る編集部位を含有する5HTR2C mRNAフラグメントに特異的な少なくとも1対のプライマー(このプライマー対はRNA抽出物中に存在する可能性のある総ての編集形態および非編集形態を増幅し得るように選択される)を用いてPCR増幅する工程
を含む方法により決定される、請求項1に記載の方法。 - 該5HTR2C mRNAの各編集および非編集形態の編集率が、
A)皮膚細胞系統、培養皮膚由来細胞または皮膚組織の全RNAを抽出し、その後、適当であればそのmRNAを生成する工程;
B)工程A)で抽出されたRNAを逆転写する工程;および
C)工程B)で得られたcDNAを、編集され得る編集部位を含有する5HTR2C mRNAフラグメントに特異的な少なくとも1対のプライマー(このプライマー対はRNA抽出物中に存在する可能性のある総ての編集形態および非編集形態を増幅し得るように選択される)を用いてPCR増幅する工程
(ここで、工程Bの逆転写は5HTR2C遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いることで行われる)
を含む方法により決定される、請求項1に記載の方法。 - 工程B)において、5HTR2C遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーが配列5’-TTCGTCCCTCAGTCCAATCAC-3’(配列番号34)を有する、請求項13または14に記載の方法。
- 工程C)において、PCR増幅工程が2回のPCRを含むネステッドPCRであり、ここで、1回目のPCRが200bp〜300bpの間の長さを有するPCR核酸産物をもたらすプライマーセットにより行われ、2回目のPCRが90bp〜160bpの間の長さを有する最終PCR核酸産物をもたらすプライマーセットにより行われる、請求項13または14に記載の方法。
- 工程C)において、PCR増幅工程が2回のPCRを含むネステッドPCRであり、1回目のPCRが次のプライマーセット:
マウスまたはラットでは、
フォワード:5’-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3’、配列番号35;
リバース:5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3’、配列番号36;
ヒトでは、
フォワード:5’-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3’、配列番号35;
リバース:5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3’、配列番号36、
により行われ、および
2回目のPCRが以下のプライマーセット:
マウスまたはラットでは、
フォワード:5’-TTTGTGCCCCGTCTGGAT-3’、配列番号39;
リバース:5’-GCCTTAGTCCGCGAATTG-3’、配列番号40;および
ヒトでは、
フォワード:5’-ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC-3’、配列番号37;
リバース:5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTA-3’、配列番号38
により行われる、請求項13〜16のいずれか一項に記載の方法。 - 該5HTR2C mRNAの各編集および非編集形態の編集率が、該mRNAの編集および非編集型の個々の形態それぞれの編集プロフィールを提供し得るSSCP法により決定され、該SSCP法が工程A)、B)およびC)の後に
D)適当であれば、工程C)で得られたPCR産物を精製する工程;
E)適当であれば、工程D)で得られたPCR産物を定量する工程;
F)特に加熱した後に急冷することにより、二本鎖DNAを一本鎖DNAへ解離させる工程;
G)キャピラリー電気泳動により一本鎖DNAを分離する工程;および
H)蛍光を読み取り、適当であれば、蛍光リーダーに関連づけた取り込み系の手段によりプロフィールデータを取得することにより編集プロフィールを得る工程
を含む、請求項17に記載の方法。 - 患者が脳におけるmRNA編集(該mRNA編集はA−to−I編集ADARに依存する)の機構の変更に関連する病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかをin vitroで特定するための、請求項1に記載の方法であって、
a)被験患者から細胞を含有する血液サンプルを得る工程;
b)血液サンプル細胞に含まれるRNA発現産物に作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を決定する工程;および
c)該患者がこのような病状を呈するかどうか、または病状を発症するリスクがあるかどうかを、被験患者で得られた発現ADARの量および/または質を、正常患者またはこのmRNA編集の機構の変更に関連する病状を示す患者の血液サンプルで得られた発現ADARの量および/または質と比較することにより特定する工程
を含む、方法。 - 該編集mRNAが、AMPA型グルタミン酸受容体、Gタンパク質共役セロトニン受容体およびPDEA8をコードするmRNAからなる群から選択されるmRNAである、請求項1または19に記載の方法。
- 該編集mRNAが5HTR2C、好ましくは、ヒト5HTR2CをコードするmRNAである、請求項1または19に記載の方法。
- ADARを発現する血液サンプル細胞が白血球(blood white cells)、白血球(leucocytes)またはバッフィーコート由来細胞である、請求項1または19に記載の方法。
- ADAR発現産物がADAR1、イソ型150および/または110であり、ADAR2遺伝子発現産物が好ましくは、DAR1、イソ型150kDおよび/または110kDタンパク質、およびADAR2タンパク質をコードするヒト遺伝子の発現産物である、請求項1または19に記載の方法。
- ADAR発現産物がADAR mRNAである、請求項1または19に記載の方法。
- ADAR mRNAの決定が、
A)該血液サンプル細胞の全RNAを抽出し、その後、適当であれば、mRNAを精製する工程;
B)工程A)で抽出されたRNAを逆転写させる工程;および
C)工程B)で得られたcDNAを、定量および/または定性分析される各ADAR mRNAに特異的な、少なくとも1対のプライマーを用いてPCR増幅する工程
を含む方法により行われる、請求項1または24に記載の方法。 - 工程C)において、ADAR mRNA PCR増幅に特異的なプライマー対が、
ヒトADAR1−150イソ型mRNAの増幅には:
EX1A 34pフォワード:5’-GCCTCGCGGGCGCAATGAATCC-3’(配列番号41)、
EX2 578mリバース:5’-CTTGCCCTTCTTTGCCAGGGAG-3’(配列番号42);
ヒトADAR1−110イソ型mRNAの増幅には:
EX1B 534pフォワード:5’-CGAGCCATCATGGAGATGCCCTCC-3’(配列番号43)、EX2 804mリバース:5’-CATAGCTGCATCCTGCTTGGCCAC-3’(配列番号44);
ヒトADAR2 mRNAの増幅には:
ADAR2 1274pフォワード:5’-GCTGCGCAGTCTGCCCTGGCCGC-3’(配列番号45)、
ADAR2 1486mリバース:5’-GTCATGACGACTCCAGCCAGCAC-3’(配列番号46);
マウスADAR1−150イソ型mRNAの増幅には:
EX1A 19pフォワード:5’-GTCTCAAGGGTTCAGGGGACCC-3’(配列番号47)、
EX2 646mリバース:5’-CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC-3’(配列番号48);
マウスADAR1−110イソ型mRNAの増幅には:
EX1B 72pフォワード:5’-TCACGAGTGGGCAGCGTCCGAGG-3’(配列番号49)、
EX2 646mリバース:5’-CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC-3’(配列番号48);および
マウスADAR2 mRNAの増幅には:
EX7 1281pフォワード:5’-GCTGCACAGTCTGCCTTGGCTAC-3’(配列番号50)、EX9 1622mリバース:5’-GCATAAAGAAACCTGAGCAGGGAC-3’(配列番号51)
からなる群から選択される、請求項25に記載の方法。 - ADAR発現産物がADARタンパク質である、請求項1または19に記載の方法。
- 工程b)において、ADARタンパク質の決定が、
A)所望により、血液サンプル細胞に含まれる全タンパク質を抽出した後、適当であれば、タンパク質の精製工程を行う工程;および
B)血液サンプル細胞に含まれる各ADARタンパク質の存在および/または濃度を、該ADARタンパク質を特異的に認識することができる抗体、好ましくは標識された抗体の実現により決定する工程
を含む方法により行われる、請求項27に記載の方法。 - 配列ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC(配列番号37)を含む、もしくは有するか;または
配列番号37のフラグメントnt5〜nt14を含む、
単離された核酸。 - プライマーまたはプローブとしての請求項29に記載の核酸の使用。
- ヒト編集および非編集5HTR2C mRNAのイソ型を増幅するための2回目のネステッドPCRプライマーセット:
フォワード:5’-ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC-3’(配列番号37)、
リバース:5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTA-3’(配列番号38)。 - ネステッドPCRによりヒト編集および非編集ヒト5HTR2C mRNAの総てのイソ型を増幅するためのプライマーセット:
1回目:
フォワード:5’-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-3’(配列番号35);
リバース:5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-3’(配列番号36);
および2回目:
フォワード:5’-ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC-3’(配列番号37);
リバース:5’-GCAATCTTCATGATGGCCTTA-3’(配列番号38)。 - 請求項29に記載の核酸、または請求項31もしくは32に記載のプライマーセットを含む、哺乳類5HTR2C mRNA編集率またはプロフィールの決定のためのキット。
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