KR101756478B1 - 피부 샘플에서 ｍｃ1ｒ 변이체 및 미토콘드리아 마커를 분석하기 위한 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부 상태 및 피부 질환을 예측, 진단 및 모니터링하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 이상 및 멜라노코르틴 1 수용체 (MC1R) 변이체를 결정하기 위한 하나 이상의 분석법과 비침습성 피부 수집 기술의 사용을 조합하며, 그로 인해 광노화, 자외선 복사(UVR) 손상 또는 피부 질환을 동정, 예측 및/또는 모니터링하기 위한 포괄적인 수단을 제공한다. 또한 본 발명의 방법은 새로운 치료제, 피부 관리 제품 및 처치 섭생에 대한 스크리닝에 효과적일 수 있으며, 또한 예방적 또는 치료적 처치에 대한 대상의 반응을 모니터링하는데 유용할 수 있다.

Description

피부 샘플에서 ＭＣ1Ｒ 변이체 및 미토콘드리아 마커를 분석하기 위한 방법{Method for assaying MC1R variants and mitochondrial markers in skin samples}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 이의 전체 내용이 본원에 원용에 의해 포함된, 2007년 10월 11일자로 출원된 PCT 출원 PCT/CA2007/001790 및 2007년 10월 15일자로 출원된 미국출원 제60/999,074호에 대한 우선권을 주장한다.

기술분야

본 발명은 피부 상태 및 피부 질환을 예측, 진단 및 모니터링하기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 질환, 광노화 및 자외선 복사(UVR) 손상을 예측 및 모니터링하기 위한 포괄적인 수단으로서 사용하기 위한, 미토콘드리아 돌연변이 및 멜라노코르틴 1 수용체(MC1R) 변이체를 결정하기 위한 분석법과 비침습성 피부 샘플링 기술을 연결하는 방법에 관한 것이다. 또한 상기 방법은 치료제, 피부 관리 제품 및 처치(treatment) 섭생의 유효성 및 그에 대한 반응을 평가하는데 유용하다.

피부 질환은 오늘날 세계에서 주요 건강 관리 도전을 대표한다. 미국(국립암연구소, www.cancer.gov)에서 해마다 새로이 진단되는 백만 건 이상의 피부암과 더불어, 피부 질환을 예측 및 진단하는 것은 그것의 관리 측면에서 중요하다. 현재의 진단 방법은 시각적인 관찰 및 생검에 주로 의존한다. 그러나, 시각적인 관찰에 의존하는 검출 방법은 피부 상태 또는 질환을 진단하는데 반드시 효과적인 것은 아니며, 임상적인 징후가 나타날 때까지는 위험(risk) 또는 질환을 검출하지 못한다. 게다가, 생검과 같은 침습성 방법은 시험 대상에 대한 외상뿐만 아니라, 감염의 가능성도 증가시킨다. 또한 상기 방법은 안전하게 실시되기 위해서 의사에 의해 수행되어야 하며, 일반적으로 반응에 관여하는 세포인 피부 표면에 있는 풍부한 세포 샘플을 보통 제공하지 않는다.

따라서 피부 상태 및 질환을 진단 및 모니터링하는 비침습성 방법은 환자의 관리를 위한, 그리고 기존 및 새로운 치료제, 피부 관리 제품 및 피부 관리 섭생의 효능을 평가하기 위한 중요한 수단을 나타낸다. 게다가, 상기 방법은 피부 질환의 발생에 대한 시험 대상의 유전적 소인뿐만 아니라, 시험 대상의 피부 상태를 기초로 하는 특이적인 유전적 변화에 관하여 중요한 정보를 제공할 수 있다. 상기 유전적 변화를 동정하는 것은 잠재적인 약물 타겟 및 예방적 조치를 동정하고 특정 치료제, 피부 관리 제품 또는 섭생에 대해 사람이 실제적으로 반응을 하는지를 결정하는데 중요할 수 있다. 뿐만 아니라, 검출 및 진단 방법은 그러한 치료, 제품 및 조치의 안전성을 평가하는데 중요하다.

자외선 복사( UVR ) 손상

공지되지 않았거나 또는 불충분하게 정량가능한 인자는 종종 자외선 복사(UVR)의 결과로서 피부 손상의 한 원인이 된다. 그 중에서도 공지된 인자는 피부색, 자외선 복사 노출의 빈도 및 심각성, 멜라닌 생성, 페오멜라닌에 대한 유멜라닌의 비율, 및 자외선 차단제의 사용을 포함한다. 행동 인자는 자외선 복사 유래 피부 손상의 심각성 및 수준에서 큰 역할을 하지만, 자기보고의 정확성 및 환자의 태양 생활 습관의 결함이 있는 의식에 의존하기 때문에, 임상적으로 평가하는 것은 극히 어렵다. 또한 자외선 차단제를 규칙적으로 사용하는 많은 개인들은 충분한 양의 자외선 차단제를 적용하지 못하거나 또는 권고된 시간 간격에 재적용하지 못하면서, 자외선 복사에 대한 노출 증가를 야기할 수 있는 보호의 잘못된 인식을 만들면서 자외선 차단제를 부적절하게 사용한다.

그 중에서도 상기 인자는 증가하는 피부암 위험에 대한 너무 이른 광노화로부터의 스펙트럼에서 결과를 가지고, 피부에 대한 자외선 복사 손상을 막기 위해 권고된, 예방적 조치 및 치료의 성공 및 적절성을 면밀히 모니터링하기 위한 도구의 유용성을 필요하게 한다. 개인의 피부 상태를 완전하게 평가하기 위한 노력에서, 그리고 광노화 및 피부암의 위험 결과로서, 건강 관리 전문의는 환자의 위험 인자를 이해하고 전달하는데 가능한 많은 통찰력이 반드시 갖추어져야 한다. 따라서, 개인의 특정한 태양 생활 습관과 연관된 위험 인자의 동정뿐만 아니라 자외선 복사의 손상 효과에 대한 개인의 유전적 소인을 평가하기 위한 진단 방법을 가지는 것은 바람직할 수 있다.

상기 방법은 멜라닌형성의 조절에 관여하는 변이체를 동정하기 위한 MC1R 제노타이핑뿐만 아니라, 자외선 복사 손상을 나타내는 미토콘드리아 바이오마커의 정량을 위한 개인 피부의 표피 또는 진피층으로부터 DNA 샘플의 수집을 포함할 수 있다. 연계된 두 가지 시험의 조합된 사용은 광노화 또는 암에 대한 환자의 유전적 소인, 및 자외선 복사에 대한 환자의 계속 진행중인 노출 결과를 고려함으로써 건강 관리 제공자에게 환자를 모니터링, 조언, 및 처치를 하기 위한 포괄적인 수단을 제공한다.

자외선 복사와 연관된 미토콘드리아의 결손

인간 피부 조직은 매우 복잡하며, 수많은 세포 유형을 포함한다. 따라서, 인간 피부 세포 바이오마커의 동정은 특히 중요하다. 인간 피부에서 누적된 자외선 복사 노출의 신뢰할 수 있는 마커를 결정하기 위해, 본 발명자 및 다른 연구자들은 자외선-유도 DNA 손상의 바이오마커로서 핵 DNA 보다 오히려 미토콘드리아 DNA (mtDNA)를 사용하는 새로운 발상을 조사하였다(Pang et al., 1994; Berneburg et al., 1997; Birch-Machin et al., 1998; Birch-Machin, 2000).

인간 피부에서 누적된 태양-노출(exposure)에 대한 바이오마커로서 mtDNA 손상의 사용은 비교적 새로운 분야의 연구이며, 이전의 연구에서는 태양-보호(protected) 및 태양-노출(exposed) 피부 사이를 구별하기 위해 단순히 mtDNA 손상을 비교하였다(Pang et al., 1994; Berneburg et al., 1997; Birch-Machin et al., 1998). 비-흑색종 피부암 (NMSC)이 야외에서 태양에 "가끔(occasionally)" 노출된 부위와는 대조적으로 태양에 "일상적으로(usually)" 노출된 신체 부위에서 우세하게 형성되기 때문에 상기 접근은 제한적이다(Armstrong, 2004).

공개공보 WO/06/111029 (이의 내용이 원용에 의해 본원에 포함됨)를 가지는 본 출원인의 동시계류중인(co-pending) PCT 출원에서, 인간 미토콘드리아 DNA(mtDNA)에서 3895 bp 결손은 자외선-유도 DNA 손상의 바이오마커로서 동정되었다. 상기 결손은 뉴클레오티드 547-4443 에 걸친 열호(minor arc)에서 동정되었다. 상기 결손은 컨스 세이어 증후군(Kearns Sayre Syndrome) 및 만성진행성외안근마비(Chronic Progressive External Opthalmoplegia)와 연관된 것으로 알려져 있다(Moraes et al., 1995).

PCT 공개공보 WO/06/111029의 실시예는 태양에 "일상적으로" 대(versus) "가끔" 노출된 신체 부위 사이에 3895 bp mtDNA 결손의 발생 빈도가 현저하게 다르다는 것을 증명한다. 게다가, 상기 실시예는 UVA+UVB 광원의 반복적인 아치사량(sub-lethal doses)으로 시험관내(in vitro) 3895 bp 결손을 유도함으로써, 3895 bp 결손의 병인론 및 일광의 자외선 복사 구성요소 사이에 관련성을 증명하였다.

중요하게도, WO/06/111029 에서 분석된 피부 샘플은 태양 손상에 대한 개인의 유전적 소인 및 피부암에 대한 위험과 관련하여 평가되지 않았다. 게다가, 상기 샘플은 당업계에서 이전에 공지된 피부 수집의 고통스런 방법에 의해 획득되었다.

멜라노코르틴 1 수용체( MC1R ) 제노타이핑

멜라노코르틴-1 수용체 유전자(MC1R)는 멜라닌 합성에 있어서 중요한 막-결합(membrane-bound) 수용체 단백질을 암호화한다. MC1R의 코딩 영역은 매우 다형성이며 흑색종 및 비-흑색종 피부암에 대한 색소형성 표현형 및 위험을 가진 변이체의 연관성이 보고되었다(Rees, Pigment Cell Research, Vol. 13(3), 135-140(6), June 2000; Kanetsky et al. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention Vol. 13, 808-819, May 2004). 흑색종의 발생률은 흰-피부의, 태양 민감성 개인에서 가장 높았는데, 이는 멜라닌의 합성 증가에 의한 자외선 노출에 반응하는 능력은 흑색종 방어에서 중요한 인자라는 것을 제안한다. 흰 피부 및 붉은 머리카락의 개인은 두 개의 MC1R 대립유전자에서 기능적으로 현저한 변화를 갖는다는 것을 패밀리 연구는 보여주었다. 상기 대립유전자 D84E, R142H, R151C, R160H 및 D294H는 붉은 머리카락 및 흰 피부에 대한 높은 침투도(penetrance)를 가진다. 또한 2개의 더 낮은 침투도 대립유전자(V60L, V92M)는 흑색종 위험에서 공통의 인자이다.

따라서, MC1R은 태양 민감도의 주요 결정요인 및 피부암에 대한 유전적 위험 인자이다. 태양 민감도의 증가, DNA 손상에 대한 감수성 및 피부암 위험의 증가와 연관된 임의의 변이체가 존재하는지를 동정하기 위해, 멜라노코르틴 1 수용체(MC1R) 유전자의 DNA 또는 아미노산 서열을 평가하는 것은 더 적극적인 모니터링 및 처치 조치가 필요한, 더 큰 위험을 가진 환자를 동정하기 위한 귀중한 수단을 제공한다. 단지 태양 민감도 하나와 연관된 표현형적 특성의 평가는 상기 위험의 증가를 설명할 수 없었다.

피부 샘플링

피부암과 같은 질환의 진단 또는 특성규명에 사용되는 피부 샘플의 수집을 위한 본원의 방법은 시험받는 개인에게 실질적인 불쾌감을 야기할 수 있는 침습성 또는 고통스런 방법을 포함한다. 피부 샘플의 수집에 대한 본원 방법의 실시예는 펀치 생검(punch biopsy), 테이프리프트 및 외과적 절제를 포함한다. 피부 수집에 대한 본원의 방법에 의해 야기되는 불쾌감 외에, 상기 방법은 또한 안전하게 실시되기 위해 의사에 의해 수행되어야 한다.

상기 침습성 기술은 감염의 위험, 샘플 수집의 불편함, 및 수집된 샘플이 손실되거나 오인될 가능성을 포함하는 다른 단점들을 가진다. 감염 및 불편함은 자외선 복사 노출 모니터링 섭생 및 장기적인 치료의 평가와 같은, 빈번하거나 규칙적인 샘플 수집이 요구되는 상황에서 확대된다. 뿐만 아니라, 상기 침습성 시험 방법과 연관된 시간 및 비용은 개인의 큰 집단에 대한 DNA 손상을 신속하게 제노타이핑하고, 평가하는 것을 어렵게 한다. 따라서 가정, 임상 또는 화장품 세팅에서 쉽고 빠르게 실시될 수 있는 비침습성 또는 최소한의 침습성 피부 수집 방법을 제공하는 것은 바람직하다.

상기 배경 정보는 본 발명에 대해 관련된 출원인에 의해 신뢰하는 공지된 정보를 만들 목적으로 제공되었다. 임의의 선행 정보가 본 발명에 대해 선행 기술을 구성한다는 어떤 인정도 반드시 의도되지 않으며, 해석되어서도 안 된다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 피부 샘플에서 MC1R 변이체 및 미토콘드리아 마커를 분석하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 양태에 따라, 하기 단계를 포함하는, 자외선 복사 손상에 대한 대상의 피부 상태 및 유전적 소인을 결정하기 위한 진단 방법이 제공된다:

(a) 대상으로부터 조직 샘플을 수집하는 단계;

(b) 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 이상(aberration)에 대해 첫 번째 조직 샘플을 분석하는 단계;

(c) 하나 이상의 멜라노코르틴 1 수용체(MC1R) 변이체에 대해 두 번째 조직 샘플을 분석하는 단계; 및

(d) 상기 피부 샘플에서 mtDNA 이상 및 MC1R 변이체(들)의 검출에 기초하여 자외선 복사 손상에 대한 상기 대상의 피부 상태 및 유전적 소인을 결정하는 단계.

본 발명의 또 다른 양태에 따라, 광노화, 자외선 복사 손상 또는 피부 질환을 예측하기 위한 본 발명의 방법의 용도가 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따라, 광노화, 자외선 복사 손상 또는 피부암을 예방 또는 개선하기 위한 예방적 또는 치료적 처치를 결정하기 위한 본 발명의 방법의 용도가 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따라, 하기 단계를 포함하는, 광노화, 자외선 복사 손상 또는 피부 질환을 모니터링하기 위한 비침습성 방법이 제공된다:

(a) 비침습성 피부 샘플링 기술을 이용하여 대상으로부터 피부 샘플을 수집하는 단계;

(b) 지정된 기간에 걸쳐 규칙적인 간격으로 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 이상에 대해 상기 피부 샘플을 분석하는 단계; 및

(c) 지정된 기간에 걸쳐 동정된 mtDNA 이상에서 임의의 변화를 결정하는 단계.

본 발명의 또 다른 양태에 따라, 하기 단계를 포함하는, 광노화, 자외선 복사 손상 또는 피부 질환에 대한 예방적 또는 치료적 처치에 대한 대상의 반응을 모니터링하기 위한 방법이 제공된다:

(a) 대상으로부터 첫 번째 피부 샘플을 수집하는 단계;

(b) 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 이상에 대해 상기 첫 번째 피부 샘플을 분석하는 단계;

(c) 하나 이상의 멜라노코르틴 1 수용체(MC1R) 변이체에 대해 상기 첫 번째 피부 샘플을 분석하는 단계;

(d) 상기 첫 번째 피부 샘플에서 상기 mtDNA 이상 및 MC1R 변이체(들)의 검출에 기초하여 자외선 복사 손상에 대한 상기 대상의 피부 상태 및 유전적 소인을 결정하는 단계;

(e) 광노화, 자외선 복사 손상 또는 피부 질환에 대해 예방적 또는 치료적 처치를 제공하는 단계;

(f) 대상으로부터 두 번째 피부 샘플을 수집하는 단계;

(g) 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 이상에 대해 상기 두 번째 피부 샘플을 분석하는 단계;

(h) 지정된 기간에 걸쳐 규칙적인 간격으로 상기 (f) 및 (g) 단계를 반복하는 단계; 및

(i) mtDNA 이상에서 변화를 검출하기 위해 규칙적인 간격으로 얻어진 상기 첫 번째 피부 샘플 및 피부 샘플 사이에 mtDNA 이상의 수준을 비교하고, 그로 인한 상기 처치의 유효성을 모니터링하는 단계; 및

(j) 선택적으로, 상기 대상의 유전적 소인 및 mtDNA 이상에서 검출된 변화에 기초하여 상기 처치를 조절하는 단계.

본 발명의 또 다른 양태에 따라, 하기 단계를 포함하는, 광노화, 자외선 복사 손상 또는 피부 질환의 처치를 위한 효과적인 치료제 또는 약용화장품(cosmeceutic agent)에 대한 스크리닝 방법이 제공된다;

(a) 대상으로부터 첫 번째 피부 샘플을 수집하는 단계;

(b) 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 이상에 대해 상기 첫 번째 피부 샘플을 분석하는 단계;

(c) 상기 치료제 또는 약용화장품으로 상기 대상을 처치하는 단계;

(d) 지정된 기간 후 대상으로부터 두 번째 피부 샘플을 수집하는 단계;

(e) 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 이상에 대해 상기 두 번째 피부 샘플을 분석하는 단계; 및

(f) 상기 치료제 또는 약용화장품의 유효성을 결정하기 위해 대조군에 대한 상기 첫 번째 피부 샘플 및 두 번째 피부 샘플 사이에 mtDNA 이상의 수준을 비교하는 단계.

본 발명의 또 다른 양태에 따라, 하기 단계를 포함하는, 대상의 광손상의 수준을 결정하기 위한 방법이 제공된다:

(a) 대상으로부터 피부 샘플을 수집하는 단계;

(b) 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 결손에 대해 상기 피부 샘플을 분석하는 단계;

(c) 연령-코호트에 따라 분류된 mtDNA 결손의 집단에 대해 상기 피부 샘플의 mtDNA 결손 수준을 비교하고, 상기 대상에 대한 광나이(photoage)를 할당하는 단계; 및

(d) 상기 할당된 광나이에 대한 상기 대상의 실제 나이를 비교함으로써 상기 대상의 광손상의 수준을 결정하는 단계.

본 발명의 또 다른 양태에 따라, 하기를 포함하는, 자외선 복사 손상에 대한 대상의 피부 상태 및 유전적 소인을 결정하기 위한 진단 키트가 제공된다:

(a) 조직 샘플을 수집하기 위한 재료; 및

(b) MC1R 제노타이핑 및 mtDNA 이상의 검출을 수행하기 위한 적절한 프라이머, 프로브 및 시약.

도 1은 본 발명의 방법을 사용하여 코 및 발뒤꿈치로부터 수집된 피부 샘플에서 3895 bp mtDNA 결손 수준과 관련된 실시간 PCR 데이타를 보여준다.
도 2는 본 발명의 방법을 사용하여 다양한 신체 부위로부터 수집된 피부 세포에서 3895 bp mtDNA 결손 수준과 관련된 실시간 PCR 데이타를 보여준다.
도 3은 본 발명의 방법을 사용하여 다양한 신체 부위로부터 수집된 피부 세포에서 3895 bp mtDNA 결손 수준과 관련된 실시간 PCR 데이타를 보여준다.
도 4는 다양한 비침습성 피부 수집 방법으로부터 수집된 샘플에 존재하는 증폭 산물의 존재를 보여주는 겔이다.
도 5는 다양한 비침습성 피부 수집 방법으로부터 수집된 샘플에 존재하는 증폭 산물의 존재를 보여주는 겔이다.
도 6 내지 11은 대립유전자 변이체에 대해 시험된 대상에 대한 제노타이핑 결과를 보여준다.
도 12는 R160H 대립유전자 변이체에 대한 분석 시험의 결과를 제공하는 겔을 보여준다.
도 13은 연령 코호트로 분류된 집단의 3895 bp mtDNA 결손 수준을 나타내는 그래프를 보여준다.

본 발명은 피부 상태 및 피부 질환을 예측, 진단 및 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 미토콘드리아 돌연변이 및 멜라노코르틴 1 수용체(MC1R) 변이체를 결정하는 분석법과 비침습성 피부 샘플링 기술을 연결하는 것을 포함한다. 이점과 관련하여, 상기 방법은 질환, 노화 및 자외선 복사(UVR) 손상과 연관된 유전적 소인 및 위험 인자를 평가하기 위한 포괄적인 수단을 제공한다. 또한, 상기 방법은 치료제, 피부 관리 제품 및 처치 섭생(treatment regime)에 대한 환자 반응의 평가를 허용한다.

정의

다르게 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 발명이 속한 당업계에 통상의 기술을 가진자에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.

본원에 사용된, 용어 "약"은 서술된 수치로부터 대략 +/-10% 변동을 말한다. 특별히 언급되거나 되지 않든 간에, 상기 변동은 본원에 제공된 임의의 주어진 수치에 항상 포함된다는 것을 이해해야 한다.

본원에 사용된, "대립유전자"는 염색체의 특정한 위치를 차지하는 주어진 DNA 서열의 몇몇 대안 형태 중 하나를 의미한다.

본원에 사용된, "주기 역치"(C_T)는 형광신호와 같은 신호에 의해 보여지는 바와 같이, 핵산 서열의 타겟 증폭이 백그라운드 위로 상승하는 지점이다. 상기 주기 역치는 조사되고 있는 상기 서열의 양과 역관계에 있다.

본원에 사용된, "진단의" 또는 "진단"은 질환 진단 또는 관리에서의 인자로서 돌연변이 또는 돌연변이 조합의 존재 또는 부재를 사용하는 것을 의미한다. 상기 돌연변이(들)의 검출은 질환의 진단에서 하나의 단계일 수 있다.

본원에 사용된, "결손"은 핵산의 인접 서열로부터 DNA 또는 mtDNA 영역의 제거를 의미한다. 결손은 하나의 염기에서부터 수 천개의 염기 또는 그 이상까지의 크기에 이를 수 있다.

본원에 사용된, "미토콘드리아 DNA" 또는 "mtDNA"는 미토콘드리아에 존재하는 DNA이다.

본원에 사용된, "돌연변이"는 점돌연변이, 전이, 삽입, 염기전환, 전위, 결손, 역위, 복제, 재조합 또는 이의 조합을 제한 없이 포함하여, 야생형 서열 유래의 핵 또는 미토콘드리아 DNA 에서 임의의 변이 또는 변화를 포함한다. 상기 서열의 변이 또는 변화는 단 하나의 염기 변화에서부터 전체 DNA 절편의 부가 또는 제거까지 포함할 수 있다.

용어 "샘플"은 대상의 피부 유래의 임의의 제조물을 말한다. 예를 들면, 본원에 기재된 비침습성 방법을 사용하여 얻은 세포의 샘플은 본 발명의 방법을 위해 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 미토콘드리아 DNA를 분리하는데 사용될 수 있다. 본 발명을 위한 샘플은 일반적으로 피부의 진피 또는 표피로부터 얻는다. 상기 샘플은 본원에 논의된 비침습성 또는 최소한의 침습성 피부 샘플링 방법을 사용하여 바람직하게는 피부 표면으로부터 얻는다.

용어 "피부"는 진피 및 표피로 구성되는, 신체의 외부 보호용 덮개를 말하며, 모낭 구조뿐만 아니라 한선 및 피지선도 포함하는 것으로 이해된다. 일 구현예에서, 상기 피부는 포유류의 피부이며, 바람직하게는 인간이다.

본원에 사용된 용어 "피부 상태"는 태양 노출, 일광욕용 침대 또는 자외선 복사 관련 질환 등 때문에 축적된 자외선 복사 손상의 양에 대한 피부의 상태를 말한다.

본원에 상호교환하여 사용된 용어 "치료" 및 "처치(treatment)"는 대상의 상태를 향상시킬 의도로 수행된 중재를 말한다. 상기 향상은 주관적 또는 객관적일 수 있으며 피부 질환, 피부 장애 또는 피부 상태의 발생 예방 또는 병리 변화와 연관된 증상의 개선과 관련이 있다. 따라서, 상기 용어 치료 및 처치는 가장 넓은 의미로 사용되며, 다양한 단계에서 질환, 장애 또는 상태의 예방(질병예방), 절제, 감소, 및 치유를 포함한다. 대상의 상태 악화를 막는 것은 상기 용어에 또한 포함된다. 따라서 치료/처치를 필요로 하는 대상은 상기 질환, 장애 또는 상태를 가지기 쉬운 사람 또는 상기 질환, 장애 또는 상태가 발생할 위험이 있는 사람 및 상기 질환, 장애 또는 상태가 예방되어야 하는 사람뿐만 아니라 상기 질환, 장애 또는 상태를 이미 갖고 있는 사람도 포함한다.

피부 상태 결정 및 피부 질환에 대한 유전적 소인 평가를 위한 분석법

본 발명의 방법은 피부 질환에 대한 개인의 유전적 소인 및 자외선 복사 노출과 연관된 위험 인자를 동정하는데 효과적인 분석법과 비침습성 피부 샘플링 기술의 연결을 포함한다. 상기 분석법은 단독으로 또는 서로 조합하여 실시될 수 있다. 상기 분석법의 조합된 사용은 유전적 위험 인자 및 태양 생활 습관을 동시에 평가하는 유일한 능력을 제공하며, 그로 인해 광노화, 자외선 복사 손상 또는 피부 질환을 얻기 쉽거나 고생하는 환자에게 더 좋은 모니터링, 조언 및 처치를 하기 위한 진단의 수단을 건강 관리 전문가에게 제공한다.

미토콘드리아 돌연변이의 검출을 위한 분석법

미토콘드리아 DNA (mtDNA) 역학은 중요한 진단의 수단이다. mtDNA 에 있는 돌연변이는 종종 질환 발생의 예비 지표이며 질환 시작과 연관된 위험 인자를 나타내는 바이오마커로서 작용할 수 있다. 뿐만 아니라, 핵 DNA에 비해 미토콘드리아 DNA의 세포당 더 높은 복제수의 결과 때문에, 상기 미토콘드리아 DNA는 핵산의 극히 작은 양에 의존하는 분석법에 대한 더 강력한 타겟이다. 따라서 본 발명의 방법은 인간 미토콘드리아 게놈에서 돌연변이를 검출하기 위한 분석법과 피부 샘플 수집을 위한 비침습성 기술을 연결한다.

본원에 논의된, 피부 샘플에서 미토콘드리아 DNA 이상 수준을 측정하는 것은 누적된 태양 노출 및 자외선 복사 손상에 대한 환자의 피부 상태를 확인할 수 있다. 게다가, 격주 또는 매월과 같은 규칙적인 간격으로 mtDNA의 측정은 자외선 복사에 의해 야기된 피부 손상을 막는데 있어서 상기 방법의 유효성을 결정하기 위해, 처치 권고에 대해 비교하는 실시간, 정량적 모니터링 수단을 건강 관리 전문가에게 제공할 수 있다.

따라서 본 발명은 미토콘드리아 이상을 검출하기 위한 분석법과 비침습성 피부 수집 기술을 조합하는 것을 포함하는, 누적된 자외선 복사 손상에 대한 환자의 피부 상태를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 미토콘드리아 돌연변이는 결손, 치환, 및 삽입으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 상기 돌연변이는 mtDNA 결손이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 상기 돌연변이는 PCT 출원 WO/06/111029에서 동정된 3895 bp mtDNA 결손이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 상기 돌연변이는 서열번호 1로 표시되는 3895 bp 결손이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 상기 mtDNA 돌연변이는 서열번호 2로 표시되는 서열에 해당한다.

피부 샘플의 비침습적 수집 및 미토콘드리아 돌연변이의 분석을 위한 전형적 방법은 실시예 섹션에 제공된다. 샘플로부터 mtDNA의 추출은 임의의 적절한 공지의 방법을 사용하여 실시될 수 있다. mtDNA 추출에 이어서 미토콘드리아 게놈의 전체 또는 일부 영역이 증폭되며, 당업계에 공지 및 예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2007)에 기재된 바와 같이, 상기 미토콘드리아 게놈의 시퀀싱을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 상기 mtDNA에서 돌연변이의 존재를 검출하기 위한 방법은 당업자에게 공지된 적절한 기술로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, mtDNA를 분석하는 것은 mtDNA 시퀀싱, PCR에 의한 mtDNA 증폭, 서던, 노던, 웨스턴 사우스-웨스턴 블롯 혼성화, 변성(denaturing) HPLC, 마이크로어레이에 대한 혼성화, 바이오칩 또는 유전자 칩, 분자 마커 분석, 바이오센서, 융점 프로파일링 또는 상기 기술의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

미토콘드리아 DNA를 시퀀싱하기 위한 임의의 적절한 수단이 사용될 수 있다. 바람직하게는, mtDNA는 시퀀싱에 앞서 PCR에 의해 증폭된다. 상기 PCR 방법은 당업계에 주지되어 있으며, [Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155: 335] 에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. PCR 산물은 직접적으로 시퀀싱되거나 또는 이어서 세균 숙주 내로 위치되는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. DNA 시퀀싱 방법의 예는 [Brumley, R. L. Jr. and Smith, L.M., 1991, Rapid DNA sequencing by horizontal ultrathin gel electrophoresis, Nucleic Acids Res. 19:4121-4126] 및 [Luckey, J.A., et al, 1993, High speed DNA sequencing by capillary gel electrophoresis, Methods Enzymol. 218: 154-172]에 기재된다. PCR 및 mtDNA 시퀀싱의 조합된 사용은 [Hopgood, R., et al, 1992, Strategies for automated sequencing of human mtDNA directly from PCR products, Biotechniques 13:82-92] 및 [Tanaka, M. et al, 1996, Automated sequencing of mtDNA, Methods Enzymol. 264: 407-421]에 기재된다.

멜라노코르틴 1 수용체( MC1R ) 제노타이핑

멜라노코르틴 1 수용체는 멜라닌형성에서 중요한 조절 요소이며 피부에서 색소 축적의 양을 결정한다. 피부 색소가 발암성 자외선 복사에 대한 개인의 자연적 보호의 정도를 결정하는 것이 알려져 있으므로, MC1R 제노타이핑은 자외선 복사 노출에 의해 야기된 DNA 손상에 대한 감수성을 결정할 수 있으며, 피부암과 연관된 위험 인자를 평가할 수 있다. 상기와 같이, 증가된 태양 민감도 및 자외선 복사 손상에 대한 감수성과 연관된 임의의 변이체를 동정하기 위해, 상기 멜라노코르틴 1 수용체(MC1R) 유전자의 DNA 또는 아미노산 서열을 평가하는 것은, 더 적극적인 모니터링 및 처치 조치를 필요로 하는 질환에 대한 더 큰 위험이 있는 개인을 동정하기 위한 귀중한 수단을 제공한다.

본 발명의 방법은 MC1R 제노타이핑에 대한 분석법과 비침습성 피부 수집 기술을 연결한다. 피부 샘플로부터 추출된 DNA 또는 RNA는 하나 이상의 MC1R 변이체 대립유전자를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 흑색종 위험의 증가와 연관된 7개의 대립유전자 변이체 D84E, R142H, R151C, R160H, D294H, V60L, 및 V92M 은 동시에 시험될 수 있다. 대안으로, 피부암 위험의 증가와 가장 흔히 연관된 5개의 대립유전자 변이체, 즉 D84E, R151C, D294H, V60L, 및 V92M 에 대한 MC1R 제노타이핑이 수행될 수 있다. 변이체를 포함하는 상기 MC1R 유전자는 서열번호 3으로 표시된다. 게다가, 상기 MC1R RNA 서열은 서열번호 4로 표시된다.

따라서, 본 발명은 피부 샘플에서 하나 이상의 MC1R 변이체의 존재를 동정하기 위한 분석법과 비침습성 피부 수집 기술을 조합하는 것을 포함하는, 피부 손상 또는 암에 대한 개인의 유전적 소인을 결정하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 일 구현예에 따라, 시험된 상기 MC1R 변이체는 대립유전자 변이체인 D84E, R142H, R151C, R160H, D294H, V60L, 및 V92M 로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 시험된 상기 MC1R 변이체는 D84E, R151C, D294H, V60L, 및 V92M 로 구성되는 군으로부터 선택된다.

피부 샘플의 비침습성 수집 및 MC1R 제노타이핑의 수행을 위한 전형적 방법은 실시예 섹션에 제공된다. 자외선 복사 노출 패턴의 결과로서, 개인의 일생에 걸쳐 변동할 수 있는 mtDNA 돌연변이의 검출과는 달리, MC1R 제노타이핑의 결과가 개인의 삶 내내 변하지 않을 것이라는 점은 당업자가 인식할 것이다. 따라서, MC1R 은 원한다면 환자의 일생동안 단지 한 번만 시험될 수 있다.

상기 MC1R 변이체를 평가하기 위해 사용되는 방법과 같은 제노타이핑 분석법은, 신체 조직이 MC1R 유전자의 서열이 유전되며 일생동안 변하지 않는 샘플인가와는 상관없이, 개인에서 동일한 결과를 보여줄 것이다. 상기 샘플은 피부에 대한 비침습성 수집 방법으로부터 획득될 수 있지만, 또한 동일한 유전자형을 얻기 위한 임의의 다른 신체 조직으로부터 수집될 수도 있다는 것을 당업계에 통상의 지식을 가진자는 인식할 것이다. 본 발명의 방법에서 사용되기 위한 적절한 조직의 수집은 당업계에 주지되어 있으며, 구강 조직, 근육 조직, 신경 조직 등과 같은 제한이 없는 예를 포함할 수 있다. 동일한 것은 조직-특이적 체세포 돌연변이인 상기 미토콘드리아 분석법에 대해서는 사실이 아니다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에 따라, 조직 샘플이 피부 샘플과 다른 것인, 대상으로부터 조직 샘플을 수집하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 조직이 구강 샘플인, 대상으로부터 조직을 수집하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.

샘플로부터 DNA 또는 RNA의 추출은 임의의 적절한 공지의 방법을 사용하여 실시될 수 있다. 특이 대립유전자의 검출은 ABI의 qPCR Taqman SNP 제노타이핑 분석법(https :// products . appliedbiosystems . com / ab / en / US / direct /)과 같은 당업계의 공인된 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 마찬가지로, 주문제작 프라이머 및 프로브를 제조하는 방법은 당업계에 주지되어 있다(예를 들면, Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY 을 참고).

대안으로, 대립유전자 변이체 평가는 MC1R 유전자의 아미노산 서열을 평가하는 것에 기초할 수 있다. 아미노산 분석을 실시하기 위한 기술은 당업계에 주지되어 있으며, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 포함할 수 있다.

피부형 및 피부암의 위험 결정

본 발명의 방법은 대립유전자 변이체의 존재에 대해 개인을 평가하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 개인의 Fitzpatrick 포토타입(phototype)의 근사치인 피부형을 결정하는 데에도 이용될 수 있다. 이점과 관련하여, MC1R 제노타이핑의 결과는 암과 연관된 위험에 의해 규명된 특이 피부형으로 개인의 그룹화를 부가적으로 가능케 한다.

상기 피부형은 하기와 같이 정의된다:

피부형 1은 개인이 피부암의 위험과 가장 많이 연관된 4개의 대립유전자 변이체 중 2개 이상을 가지는 특징을 가진다.

피부형 2는 개인이 피부암의 위험과 가장 많이 연관된 4개의 대립유전자 변이체 중 하나를 가지는 특징을 가진다.

피부형 3 또는 그 이상은 개인이 피부암의 위험과 가장 많이 연관된 4개의 대립유전자 변이체 중 하나도 가지지 않는 특징을 가진다.

따라서, 일 구현예에 따라, MC1R 제노타이핑에 근거한 개인의 피부형 및 피부암 위험 인자를 동정하는 방법이 제공된다.

피부 조직 수집의 비침습성 방법

본 발명은 제노타이핑 또는 진단 시험을 위한 피부 샘플 수집의 비침습성 또는 최소한의 침습성 기술을 제공한다. 본 발명의 내용에서, "최소한의 침습성"은 출혈은 거의 없이 또는 전혀 없이, 하나 이상의 피부층의 관통을 야기하는 기술을 말한다. 피부 조직의 미세-중심(micro-core)을 수집하기 위해서, 피부 샘플의 수집에 사용된 비침습성 또는 최소한의-침습성 기술의 비제한적인 예는 외과용 테이프를 이용하는 테이프리프트, 8% 만델산으로 적신 멸균 탈지면, 증류수로 적신 멸균 탈지면, 왁스 스트립, 면봉(cotton tip swap), 멸균 외과용 칼날을 이용한 피부의 스크랩핑, 나무 스크랩퍼를 이용한 피부의 스크랩핑, 접착성 패드(CapSure™ Clean-up Pad, Arcturus)의 끈적끈적한 표면, LCM MacroCap™ (Arcturus)의 필름, LCM MacroCap™ (Arcturus)의 열처리 필름 및 작은 게이지 주사 바늘(예를 들면, 28 게이지)의 이용을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

상기 샘플은 피부의 진피 또는 표피층으로부터 수집될 수 있으며 예를 들어 발뒤꿈치, 코, 안쪽 팔, 귀, 입, 두피, 흉부, 어깨, 엉덩이, 등, 얼굴, 목의 뒤쪽, 손 및/또는 머리와 같은 신체 부위로부터 유래될 수 있다. 상기 샘플은 상기 소스로부터 얻어진 대로 직접 사용되거나 샘플의 특성을 변형하기 위한 전처리 다음에 사용될 수 있다. 따라서, 상기 피부 샘플은 사용하기 전에 예를 들어 방부제, 시약 등으로 전처리될 수 있다.

당업자는 1개 이상의 샘플링 기술이 한번에 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 게다가, 수집 과정이 요구되는 곳, 예를 들면, 시간에 따라 피부 상태의 모니터링을 위한 곳에서, 동일하거나 다른 기술은 시험기간에 걸쳐 단독으로 또는 함께 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 피부 수집은 단 한번, 또는 격주나 매월과 같은 규칙적인 간격으로 실시될 수 있다.

또한, 당업자는 임의의 수집 방법이 핵 DNA 타겟팅 분석법에 대해 유용하지 않는 극히 낮은 수준(대략 0.1ng)의 핵산을 생산하나; 훨씬 더 많은 양(대략 1000 배 더 많은)을 가지는 미토콘드리아 DNA 타겟은 상기 극히 낮은 생산량을 가지는 수집 방법에 대해 유일하게 적합할 것이라는 것을 인식할 것이다. 하기 실시예는 본 발명의 비침습성 방법을 통해 수집된 피부 세포가 이전에 사용된 피부 수집 방법을 통해 얻어진 mtDNA 와 비슷한 결과를 얻기 위한 충분한 mtDNA를 제공한다는 것을 보여준다.

본 발명의 특정 방법과 관련하여, 일 구현예에서 구강 세포의 수집에서 사용된 것과 같은 멸균 탈지면 또는 면봉(cotton-tip swab)의 사용을 포함하는 비침습성 수집 기술이 제공된다. 상기 멸균 탈지면은 포장재로부터 제거되어 관심대상의 피부 부위에 문질러진다. 바람직하게는, 상기 부위는 제노타이핑 또는 진단 목적으로 충분한 수의 피부 세포가 수집되는 것을 보장하기 위해서 대략 15번 문질러진다. 비록 본 발명은 특정 실시예에 대해 하기에 기재되어 있지만, 상기 방법은 질환, 노화, 또는 자외선 복사에 대한 노출의 진단 또는 규명, 및 상기와 연관된 돌연변이의 동정을 위한 피부 샘플을 수집하기 위해서도 또한 사용될 수 있다.

상기 피부 문지르기 후, 상기 탈지면은 멸균 튜브내에 두었다. 본원에 포함된 유전 물질(즉, DNA)의 완전성을 유지하기 위해서 필요한 만큼 완충액이 튜브에 첨가될 수 있다. 상기 DNA는 그 후 당업계에 주지된 방법을 이용하여 추출된다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 매우 작은 게이지 주사 바늘(28 또는 29 게이지)을 이용하는 최소한의 침습성 기술은 유전적 조사의 목적으로 피부 세포를 수집하기 위해 사용된다. 상기 구현예에서, 피부 세포는 천막 모양의(tented) 피부층을 뚫음으로써 출혈이 거의 없이 대상의 진피 및 표피로부터 수집되지만, 미세한 양의 진피 및 표피 조직은 상기 주사 바늘의 내부 중심에 부착된다. 상기 피부는 예를 들어 손가락, 핀셋, 또는 다른 형태의 클램프를 사용하여 피부를 들어올림으로써 천막 모양이 될 수 있다. 상기 피부 재료는 그 다음 과정(즉, DNA 추출)을 위해 추출될 때까지 상기 주사 바늘에 포함된다. 상기 주사 바늘로부터 상기 피부 샘플을 빼내기 위해, 인산염 완충액이 상기 주사 바늘의 컬럼내로 주입되고 그 후 플런저를 이용하여 멸균 튜브내로 밀쳐진다. DNA는 당업계에 주지된 방법을 이용하여 추출된다. 하기 실시예에 예시된 바와 같이, 피부 샘플의 수집을 위한 상기 최소한의 침습성 방법은 예를 들어 자외선 복사에 의해 야기된 DNA 또는 mtDNA 손상의 평가를 위해 충분한 DNA 또는 mtDNA를 생산한다. 상기 구현예와 같이, 피부 샘플을 얻는 상기 방법은 안전하고 통증이 없다. 게다가, 하기에 예시된 바와 같이, 정확한 분석법을 실시하기 위해 수집되어야 할 충분한 DNA 또는 mtDNA 를 가능케 한다.

피부 상태의 진단 및 모니터링 그리고 질환과 연관된 유전적 위험 인자의 검출

본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 분석법은 예를 들면, 피부 상태 또는 유전적 위험을 평가하기 위해 단독으로 또는, 피부 질환에 대한 유전적 소인 및 개인의 특정한 생활방식과 연관된 위험 인자의 동정을 평가하기 위해 조합하여 사용될 수 있다. 하기에 논의된 바와 같이, 자외선 복사 손상, 광노화 및 피부 질환에 대한 효과적인 예방 및 처치 조치의 결정에 있어서 상기 인자의 동정 및 모니터링은 중요하다.

피부 상태의 진단 및 모니터링

자외선 차단제 및 자외선 방지 크림과 같은 피부 관리 제품을 규칙적으로 사용하는 많은 개인들은 충분한 양으로 도포하지 못하거나 권고된 시간 간격에 재도포하지 못하면서, 자외선 복사에 대한 노출 증가를 야기할 수 있는 보호의 잘못된 인식을 만들면서, 상기 제품을 부적절하게 사용한다. 게다가, 보다 최근까지, 태양 노출 동안에 개인에 의해 규칙적으로 도포된 자외선 차단제 및 자외선 방지 크림은 일반적으로 UVB의 돌연변이 유발 효과에 대해서는 보호하였지만, UVA 복사의 유해한 효과를 이끄는 물질을 함유하지는 못했다.

그 중에서도 상기 인자는 자외선 복사 손상에 대한 초기의 피부 상태를 결정하고, 연구 과정을 통한, 피부에 대한 더 이상의 자외선 복사 손상을 막기 위해 권고되는 예방 조치 및 치료의 성공 및 적절성을 모니터링하는 수단의 유용성을 필요로 한다. 격주 또는 매월(또는 임의의 다른 적절한 간격)과 같은 규칙적인 간격으로 피부 샘플을 비침습적으로 수집함으로써 환자의 피부에서 미토콘드리아 DNA 결손의 수준을 측정하는 것은 건강 관리 전문가에게 자외선 복사에 의해 야기된 피부 손상을 막는데 있어서 상기 방법의 유효성을 결정하기 위해 처치 권고에 대해 비교하는 실시간, 정량적 모니터링 수단을 제공할 수 있다. 상기 수집 방법은 임의의 부작용 또는 불쾌감 없이 규칙적인 샘플링을 허용하며, 원한다면 집에서도 수행될 수 있다. 놀랍게도, 문지르기(swabbing)에 의해 제공된 DNA의 극히 낮은 생산량은 상기 분석의 실시를 위해 충분하므로, 문지르기와 같은 피부 샘플을 수집하기 위한 기술은 mtDNA 돌연변이의 검출에 유일하게 적합하다.

이제 실시예로 돌아가면, 본 발명의 일 구현예에서 상기 방법은 자외선 복사에 의해 야기된 손상과 연관된 바이오마커의 정량을 위해 피부 세포를 수집하는데 사용된다(실시예 1 참고). 구체적으로, 본 발명의 방법은 인간 미토콘드리아 게놈에서의 결손 즉, 상기 기재된 3895 bp mtDNA 결손에 대한 시험을 위해 피부 샘플을 수집하는데 사용되었다. 상기 실시예는 본 발명의 비침습성 방법을 통해 수집된 피부 세포가 이전의 피부 수집 방법을 통해 얻어진 mtDNA와 필적할만한 결과를 얻기 위한 충분한 mtDNA를 제공한다는 것을 보여준다.

당업자는 미토콘드리아 DNA 타겟의 정량을 위한 인간 피부의 표피층 또는 진피층으로부터 DNA 샘플의 비침습성 수집은, 광노화 및 피부암과 같은 결과를 막기 위한 의도로 자외선 복사와 관련된 피부 및 DNA 손상의 예방을 위한 처치 섭생 및 생활방식 권고의 유효성을 모니터링하기 위한 수단을 건강 관리 연구자에게 제공한다는 것을 이해할 것이다.

또한 당업자는 좋지 않은 태양 습관 또는 비효과적인 보호 방법을 동정하는데 있어서 건강 관리 제공자에 의한 사용에 대해 mtDNA 분석의 효용을 인정할 것이다. 상기 효용은 본 발명의 일 구현예에 따라, 자외선 차단제 사용 결과가 태양 보호 섭생의 유효성을 평가하기 위해 유사한 나이 및 피부 색조를 가진 2명의 개인에 대해 분석된 실시예 6에서 증명된다.

광나이의 결정

미토콘드리아 마커의 동정과 연결된 최소한의 침습성 샘플링 절차를 사용하는 본 발명의 부가적인 진단 방법은 광나이의 결정이다. 실시예 부분에 기재된 바와 같이, 상기 방법의 목적은 최소한의 침습성 피부 수집 기술을 사용하여 개인의 얼굴 또는 머리 피부 조직을 샘플링하고, mtDNA 결손과 같은 자외선 복사 손상과 연관된 미토콘드리아 타겟의 양을 측정함으로써, 개인의 자외선 복사 노출을 평가하는 것이다. 그 다음에 상기 결과는 동일한 방법에 의해 얻어진 결과의 데이타베이스에 대해 비교되고, 상기 개인은 검출된 mtDNA 결손의 수준에 기초하여 나이 코호트로 분류된다. 광나이의 할당을 위해, 개인의 mtDNA 분석 결과는 그들의 나이 군에서 상기 개인이 다른 개인보다 더 높거나 또는 더 낮은 광손상을 가지는 가를 결정하기 위해 상기 개인의 실제 연령에 대해 비교된다.

따라서, 미토콘드리아 DNA 마커의 분석을 위한 피부 조직의 미세-중심을 수집하기 위해 최소한의 침습성 기술을 이용함으로써, 건강 관리 제공자는 개인의 광노이를 동정하고, 상기 개인의 광나이가 상기 개인의 실제 연령과 일치하는지 않는지를 결정할 수 있다. 그로 인해, 광나이의 결정은 광노화, 자외선 복사 손상 또는 피부 질환을 방지하기 위한 예방 및 처치 조치를 더 적절하게 처방하기 위해 건강 관리 전문가를 위한 수단을 제공한다.

질환에 대한 유전적 소인 결정

광노화 및 피부암의 개인의 위험을 완전히 평가하기 위해, 환자의 위험 인자를 이해하고 소통하기 위한 가능한 많은 정보를 건강 관리 제공자는 제공받아야 한다. MC1R 제노타이핑의 이용은 자외선 복사 노출 및 피부암 발생의 위험에 의해 야기되는 DNA 손상에 대한 개인의 감수성에 기여할 뿐만 아니라, 잠재적으로 더 적극적인 모니터링 및 처치 조치를 필요로 하는 더 큰 위험을 가지는 환자를 동정하기 위한 귀중한 수단을 제공한다.

따라서 본 발명은 MC1R 제노타이핑에 대한 DNA 샘플의 수집을 위한 비침습성 방법을 제공한다. 본 발명의 일 구현예에 따라, 본 발명의 방법에 의해 수집된 세포로부터 추출된 DNA는 흑색종 위험의 증가와 연관된 하나 이상의 대립유전자 변이체를 동정하는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 상기 변이체의 존재에 대해 개인을 평가하는데 사용될 수 있으며, 부가적으로 개인의 피부형을 결정하는데 사용될 수도 있다. 따라서 MC1R 제노타이핑의 결과는 암과 연관된 위험에 의해 규명된 특정 피부형으로 개인의 그룹화를 허용한다.

연결된 분석

MC1R 제노타이핑 및 mtDNA 분석의 조합된 사용은 유전적 소인 및 환자의 태양 생활 습관의 최종 결과를 고려함으로써 환자를 모니터링, 조언 및 더 좋은 처치를 하기 위한 수단을 건강 관리 전문가에게 제공한다. 상기 조합된 분석법의 이용은 결과뿐만 아니라 위험 인자를 동시에 평가하는 유일한 능력을 제공한다. 중요게도 상기 MC1R 시험은 mtDNA 시험에 대한 비침습성 수집을 이용하는 반복된 시험으로부터 일시적으로 제거될 수 있으며, 여전히 연계해서 사용될 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, 미토콘드리아 DNA 결손을 측정함으로써 설명되는 상기 DNA 손상 수준이 자외선 복사 노출 패턴의 결과로서 변동할지라도, MC1R 시험으로부터 얻어진 정보가 개인의 삶 내내 변하지 않을 것이기 때문에 상기 방법은 가능하다.

자외선 복사에 의해 야기된 피부 손상이 다인성 과정이라는 사실은 주목할 만한 것이다. 따라서, MC1R 변이체를 가진 개인이 그렇지않은 개인보다 더 많은 손상을 항상 가질 것이라고 가정될 수는 없으며, 규칙적인 자외선 차단제 사용을 보고한 개인이 자외선 차단제를 사용하지 않는다고 보고한 개인보다 반드시 더 작은 손상을 가지는 것 또한 아니다. 따라서, mtDNA 분석과 MC1R 제노타이핑의 연결은 건강 관리 연구자에게 그들의 관리하에 있는 사람에 대해 더 많은 정보가 있는 추천을 요구하는 유일한 통찰력을 제공한다.

치료제 및 피부 관리 제품의 평가

또한 본 발명의 방법은 의학 및 약용화장품 목적을 위한 광범위한 피부 스크리닝을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 제노타이핑을 위해 및/또는 피부암(비-흑색종 피부암 및 흑색종)과 연관된 다양한 바이오마커를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 임의의 시점 및 임의의 외부 해부학적 위치 유래의 개인의 피부에서 자외선 복사에 기인한 DNA 손상의 수준을 평가하는 능력은 피부 건강에 대한 유일하고 유용한 스크리닝 시험의 토대를 제공하며 기존 및 새로운 치료제, 피부 관리 제품 및 피부 관리 섭생의 안전성 및 효능을 평가하기 위한 토대를 제공한다. 게다가, 대상의 피부 질환 또는 상태를 기초로 하는 특이 유전적 변화를 동정함으로써, 환자가 특정한 치료제, 피부 관리 제품 또는 섭생에 반응을 보이는지 및 어느 정도까지 반응을 보일 것인지 쉽게 결정될 수 있다.

키트

본 발명의 방법에서 사용된 수집 재료는, 원하는 도포에 따라, 임상적 환경에 사용되는 소비자용 키트 또는 의학용 키트에 포장될 수 있다. 상기 키트는 멸균 탈지면, 면봉(cotton tip swab) 또는 주사 바늘과 같은 하나 이상의 샘플링 수단뿐만 아니라, 제노타이핑 및/또는 mtDNA 돌연변이의 동정을 위해 필요한 다른 재료도 포함할 수 있다.

상기 키트는 완충액, 염, 검출 시약 등과 같은 진단 분석법을 실시하기 위해 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 시험 샘플의 분리 및/또는 처치를 위한 완충액 및 용액과 같은 다른 구성성분이 또한 키트에 포함될 수 있다. 상기 키트의 하나 이상의 구성성분은 동결건조될 수 있고, 상기 키트는 상기 동결건조된 구성성분의 재구성에 적절한 시약을 더 포함할 수도 있다.

또한 상기 키트는, 적절한 곳에, 시험 샘플의 제조를 용이하게 하는 반응 용기, 혼합 용기 및 다른 구성성분을 포함할 수 있다. 또한 상기 키트는 종이 형태 또는 디스크, CD, DVD 등과 같은 컴퓨터로 판독가능한 형태로 제공될 수 있는 사용 설명서를 선택적으로 포함할 수 있다.

본원에 기재된 본 발명의 더 좋은 이해를 얻기 위해, 하기 실시예가 기재된다. 하기 실시예는 본 발명의 예시적인 구현예를 설명하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 한정하기 위한 것은 아니라는 것을 이해할 것이다.

실시예

실시예 1: 3895 bp 인간 mtDNA 결손의 분석

본 발명의 방법은 PCT 출원 no.WO/06/111029 에서 동정된 3895 bp mtDNA 결손을 분석하기 위해 사용되었다. 상기 mtDNA의 수집 및 추출은 하기에 제공된 바와 같이 실시되었다.

1. 피부 샘플은 멸균 탈지면으로 피부 부위를 대략 15번 문지르기 함으로써 수집되었다. 피부 샘플은 발뒤꿈치 (n= 41), 코 (n= 43), 안쪽 팔 (n= 20), 귀 (n= 5), 어깨 (n= 5), 엉덩이 (n= 5), 및 등 (n= 5)으로부터 수집되었다.

2. mtDNA는 상업적으로 이용가능한 키트 (QiaAMP™ DNA Micro Kit, product no. 56304, Qiagen, Maryland USA)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 추출되었다.

3. 이중 가닥 DNA는 Qubit™ 형광계 (product no. Q32857, Invitrogen, California USA)에서 HS-DNA Quant-it™ dsDNA HS 분석 키트 (product no. Q32851, Invitrogen, California USA)를 이용하여 정량되었다.

4. 그 후 상기 3895 bp 결손의 수준은 iQ Sybr Green Supermix™ (product no. 170-8882, Bio - Rad, California USA) 및 하기 프라이머를 사용하여 실시간 PCR (rt-PCR)에 의해 정량되었다:

정방향 5'-ctgctaaccccataccccgaaaatgttg-3' (서열번호 5);

역방향 5'-gaaggattatggatgcggttgcttgcgtgag -3' (서열번호 6).

본 실시예에서, 증폭 프라이머의 쌍은 상기 3895 bp 결손의 존재를 나타내는 타겟 영역을 증폭하기 위해 사용되었다. 상기 정방향 프라이머는 상기 3895 bp 서열의 결손이 발생한 후(즉, mtDNA 게놈의 547 및 4443 사이의 위치에서 스플라이스), mtDNA의 스플라이싱된 영역과 겹친다. 따라서, 올바른 크기의 증폭 산물을 만들기 위한 상기 겹쳐진 프라이머의 신장은 상기 3895 bp 부분이 결손 되면 단지 발생할 수 있다.

상기 3895 bp 결손을 정량하는 단계에서, RT-PCR 반응은 하기와 같이 실시되었다:

12.5ul의 iQ Sybr Green Supermix™;

350nmol 정방향 프라이머 (서열번호 5);

350nmol 역방향 프라이머 (서열번호 6);

5ul의 주형 (대략 0.5ng dsDNA);

증류수로 최종 25ul;

사이클링 파라미터:

단계 1. 95℃에서 3분;

단계 2. 95℃에서 30초;

단계 3. 67.5℃에서 30초;

단계 4. 72℃에서 30초;

단계 5. 플레이트 판독

단계 2-5의 45 사이클

55 내지 110℃의 용융 곡선을 1℃ 간격으로 3초 마다 판독

10℃에서 10분 동안 반응 중지.

상기 분석 결과는 도 1 내지 3에서 보여주며, 일광/자외선 복사에 거의 노출되지 않는 부위(즉, 발뒤꿈치 및 엉덩이)로부터 수집된 피부 채취물과 일반적으로 노출되는 부위(즉, 코 및 귀)로부터 수집된 피부 채취물 사이에 분명한 차이를 나타낸다. 상기 3895 bp 결손의 수준은 발뒤꿈치 및 엉덩이와 같은 자외선 복사로부터 일반적으로 보호된 부위에 비해, 코 및 어깨와 같은 더 높은 수준의 자외선 복사를 받는 부위에서 현저하게 증가하였다.

도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 상기 3895 bp 결손에 대한 실시간 PCR 사이클 역치(C_T)는 자외선 복사에 거의 노출되지 않는 피부 부위(발뒤꿈치 또는 엉덩이)에 비해, 일반적으로(코 또는 귀) 또는 때때로(어깨 또는 등) 노출된 피부 부위에서 상기 결손의 더 높은 발생이 있는 것을 나타낸다.

도 3은 자외선 복사에 일반적으로 노출되는 부위(예를 들면, 코 또는 귀)에서 얻어진 피부 세포로부터 수집된 mtDNA는 자외선 복사에 거의 노출되지 않는 부위(예를 들면, 발뒤꿈치 또는 안쪽 팔)에서 얻어진 피부 세포로부터 수집된 mtDNA 보다 상기 3895 bp 결손 마커의 수준이 증가하는 특징이 있다는 것을 나타낸다.

또한 상기 결과는 상기 분석법을 실시하는데 충분한 mtDNA를 얻기 위해서, 본 발명에 따라 피부 샘플 수집의 유효성을 보여준다. 상기와 같이, 본 발명의 비침습성 피부 수집 방법은 분석을 위한 mtDNA를 수득하는데 있어서 침습성 방법, 예를 들면, 상기 출원인의 PCT 공개문헌 no.WO/06/111029에 사용된 방법처럼 유사하게 효과적이다.

실시예 2: 피부 수집 방법의 비교

5 가지의 다른 비침습성 피부 수집 방법은, 만약 있다면, 정량적 실시간 PCR과 같은 분자 분석을 위한 핵산의 충분한 양 및 질을 생산하는 지를 동정하기 위해 시험 되었다. 상기 5 가지의 시험 방법은 하기와 같다:

● 외과용 테이프를 이용하는 테이프리프트;

● Biore® 접착 스트립;

● 8% 만델산으로 적신 멸균 탈지면;

● 증류수로 적신 멸균 탈지면; 및

● 왁스 스트립.

상기 테이프리프트, Biore 스트립 및 왁스 스트립은 상기 부위를 멸균하기 위해 70% 이소프로판올의 도포 후, 피부 표면에 도포되었다. 강한 압력이 적용된 후, 상기 테이프 또는 스트립은 재빨리 제거되었다. 상기 탈지면은 8% 만델산 또는 증류수의 멸균용액에 먼저 넣어두었고, 그 다음 상기 피부가 70% 이소프로판올로 세척된 후 관심대상의 피부 부위에 강하게 문질러졌다.

3명의 개인으로부터 피부 세포의 수집 후, 각 수집 배지는 200ul 인산염 완충액(PBS)에 넣어 두었고 56℃에서 밤새 배양되었다.

그 다음에 상기 모든 샘플은 Qiagen의 QiaAMP™ DNA Mini Kit, 구강 swab 프로토콜(product no. 51304)을 사용하여 핵산이 추출되었다. 상기 정제된 샘플은 상기 추출 절차가 성공적이었는지를 결정하기 위해 NanoDrop™ ND-1000 분광광도계를 사용하여 정량되었다.

5가지 비침습성 방법에 의해 수집된 피부로부터 추출된 DNA의 양 결정

샘플 ID	DNA 농도 ng / uL	A260nm	DNA 순도 260:280 비
1 biore	-0.42	-0.008	0.48
1 증류수로 적신 탈지면	5.03	0.101	1.6
1 만델산으로 적신 탈지면	5.05	0.101	1.74
1 외과용 테이프	2.22	0.044	4.4
1 왁스	3.52	0.07	1.69
2 biore	-0.02	0	-0.09
2 증류수로 적신 탈지면	2.74	0.055	1.97
2 만델산으로 적신 탈지면	4.9	0.098	1.82
2 외과용 테이프	2.99	0.06	1.78
2 왁스	2.17	0.043	1.84
3 biore	-0.26	-0.005	0.24
3 증류수로 적신 탈지면	3.26	0.065	3.15
3 만델산으로 적신 탈지면	2.71	0.054	12.1
3 외과용 테이프	2.45	0.049	4.26
3 왁스	2.67	0.053	4.25

샘플의 순도뿐만 아니라 핵산 농도도 고려하면, 가장 일관된 결과는 습윤제로서의 증류수 또는 만델산, 또는 왁스 샘플을 사용한 탈지면 샘플에서 획득되었다.

다음으로, 증폭 억제제가 존재하는지 또는 상기 샘플의 현저한 분해가 처리과정 동안 발생하는 지를 결정하기 위해 PCR이 모든 샘플에서 수행되었다. 샘플은 하기 조건에 따라 증폭되었다:

샘플 증폭을 위한 PCR 조건

시약	반응에서 최종 농도
10X 반응 완충액	1X
dNTPs	각각 0.4 mM
BSA	1X
12s 프라이머 (정방향)	0.4 uM
12s 프라이머 (역방향)	0.4 uM
Taq LA (Takara p/n RR002B	1.25 유닛
주형	5 ul (농도 이상의)
증류수	최종 25ul

사용된 프라이머는 하기에 제공된 서열을 가지는 미토콘드리아 DNA 프라이머였다:

12s 프라이머 서열 정방향 5'-CGTTCCAGTGAGTTCACCCTC-3' (서열번호 7)

12s 프라이머 서열 역방향 R 5'-CACTCTTTACGCCGGCTTCTATT-3' (서열번호 8)

상기 증폭 반응은 하기 프로토콜에 따라 DNA Engine Tetrad (Bio-Rad)에서 수행되었다:

1. 94℃에서 2분

2. 94℃에서 30초

3. 64℃에서 30 초

4. 72℃에서 30 초

5. 단계 2 내지 4를 39번 반복

6. 4℃에서 반응 중지

그 다음 증폭 산물은 2% 아가로스 겔에서 전기영동되었고, 에티디움 브로미드로 염색되었다. 상기 증폭 결과는 도 4에 나타내었고, 상기 겔의 상단 절반은 하기를 포함한다:

레인 1 500ng 100bp GeneRuler SM0323 (Fermentas)

레인 2 개인 1 유래의 Biore

레인 3 개인 1 유래의 증류수로 적신 탈지면

레인 4 개인 1 유래의 만델산으로 적신 탈지면

레인 5 개인 1 유래의 외과용 테이프

레인 6 개인 1 유래의 왁스

레인 7 개인 2 유래의 Biore

레인 8 개인 2 유래의 증류수로 적신 탈지면

레인 9 개인 2 유래의 만델산으로 적신 탈지면

레인 10 개인 2 유래의 외과용 테이프

레인 11 개인 2 유래의 왁스

레인 12 빈 레인

레인 13 음성 증폭 대조군

레인 14 양성 증폭 대조군

레인 15 내지 18 빈 레인

그리고 상기 겔의 하단 절반은 하기를 포함한다:

레인 1 개인 3 유래의 Biore

레인 2 개인 3 유래의 증류수로 적신 탈지면

레인 3 개인 3 유래의 만델산으로 적신 탈지면

레인 4 개인 3 유래의 외과용 테이프

레인 5 개인 3 유래의 왁스

레인 6 500ng 100bp GeneRuler SM0323 (Fermentas)

레인 7 Biore 추출 음성 대조군

레인 8 증류수로 적신 탈지면 추출 음성 대조군

레인 9 만델산으로 적신 탈지면 추출 음성 대조군

레인 10 외과용 테이프 추출 음성 대조군

레인 11 왁스 추출 음성 대조군

레인 12 빈 레인

레인 13 음성 증폭 대조군 (상기 레인 13의 중복 로딩)

레인 14 양성 증폭 대조군 (상기 레인 14의 중복 로딩)

레인 15-18 빈 레인

결과

상기 Biore 스트립을 사용하여 수확된 피부 세포에서 수집된 mtDNA로부터 증폭된 mtDNA는 없었다. 상기 증류수로 적신 탈지면에서 더 선명하게 증폭되긴 했지만, 상기 증류수 및 만델산으로 적신 탈지면 모두에서 증폭되었다. 상기 외과용 테이프는 산발적으로 증폭되었다. 상기 왁스는 선명하게 증폭되었지만, 상기 겔 하단 절반의 레인 11의 추출 음성 대조군은 비-멸균 성질 또는 상기 왁스와 연관된 다루기 어려움의 결과로서 오염되었던 것으로 예상된다.

모든 인자를 고려하면, 상기 실시예는 멸균 탈지면의 사용이 비침습성 피부 샘플 수집의 바람직한 방법이라는 것을 증명하였다. 상기 탈지면은 샘플의 수집 또는 완충 역할을 용이하게 하기 위해 건조되거나 또는 다양한 액체에 적셔질 수 있다.

실시예 3: 부가적인 피부 수집 방법의 비교

본 실시예에서 피부 샘플의 비침습성 수집에 대한 5 가지의 부가적인 방법이, 만약 있다면, 정량적 실시간 PCR과 같은 분자 분석을 위한 핵산의 충분한 양 및 질을 생산하는 지를 동정하기 위해 시험 되었다.

1명의 개인으로부터, 피부 샘플은 하기 방법을 사용하여 2번 수집되었다:

● 멸균 외과용 칼날을 이용한 피부의 스크랩핑(scraping)

● 나무 스크랩퍼를 이용한 피부의 스크랩핑

● 접착성 패드(CapSure™ Clean-up Pad, Arcturus)의 끈적끈적한 표면

● LCM MacroCap™ (Arcturus)의 필름

● LCM MacroCap™ (Arcturus)의 열처리 필름

상기 피부는 70% 이소프로판올 와이프(wipe)로 세척함으로써 먼저 제조되었다. 상기 나무 스크랩퍼 및 외과용 칼날은 피부 세포를 제거하기 위해 상기 피부 표면 위로 강하게 통과된 후, 원심분리용 튜브내에 넣어 두었다. 상기 접착성 패드 및 필름은 피부 세포를 수집하기 위해 문지르기 없이 상기 피부에 대해 강하게 밀착되었다.

상기 다중 수집은 두 가지 다른 핵산 추출 방법을 사용하여 처리되었다. 첫 번째 세트는 당업계에 주지된 바와 같이 프로테이나제 K 분해를 사용하여 추출된 반면, 두 번째 세트는 QiaAMP DNA Mini Kit (Qiagen 51304)를 사용하여 추출되었다.

그 다음에 상기 Qiagen 키트로 처리된 샘플은 NanoDrop ND-1000 분광광도계를 이용하여 정량되었다. 상기 PK 분해 세트의 핵산은 상기 유형의 정량을 용이하게 할 정도로 충분히 씻겨지지 않았기 때문에 존재하지 않았다.

추가의 수집 방법(Qiagen 추출 DNA)에 의해 수집된 피부로부터 추출된 DNA의 양 결정

샘플 ID	DNA 농도 ng / uL	A260nm	DNA 순도 260:280 비
AE 완충액	-1.09	-0.022	1.6
나무 스크랩프	2.06	0.041	0.95
Capsure	5.59	0.112	1.29
칼날	2.32	0.046	1.41
칼날 -ve 대조군	1.19	0.024	0.8
Capsure -ve 대조군	2.47	0.049	1.2
나무 스크랩프 -ve 대조군	2.92	0.058	1.35
QIaGEN 키트 -ve 대조군	2.4	0.048	1.83

샘플은 실시예 2에 기재된 프로토콜에 따라 증폭되었다.

그 다음에 증폭 산물은 2% 아가로스 겔에 전기영동되었고 에티디움 브로미드로 염색되었다. 결과는 도 5에 나타내었고, 상기 겔은 하기를 포함한다:

레인 1 500ng 의 100bp GeneRuler (SM0323)

레인 2 음성 증폭 대조군

레인 3 양성 증폭 대조군

레인 4 PK 완충액 나무 스크랩프(scrape)

레인 5 PK 완충액 외과용 칼날 스크랩프

레인 6 PK 완충액 CapSure 패드

레인 7 PK 완충액 MacroCap

레인 8 PK 완충액 열처리 MacroCap

레인 9 PK 완충액 나무 스크랩프 음성 추출 대조군

레인 10 PK 완충액 외과용 칼날 스크랩프 음성 추출 대조군

레인 11 PK 완충액 CapSure 음성 추출 대조군

레인 12 PK 완충액 MacroCap 음성 추출 대조군

레인 13 PK 완충액 열처리 MacroCap 음성 추출 대조군

레인 14 QiaAMP 외과용 칼날 스크랩프

레인 15 QiaAMP CapSure 패드

레인 16 QiaAMP 나무 스크랩프

레인 17 QiaAMP 외과용 칼날 스크랩프 음성 추출 대조군

레인 18 QiaAMP CapSure 패드 음성 추출 대조군

레인 19 QiaAMP 나무 스크랩프 음성 추출 대조군

레인 20 QiaAMP 시약 음성 대조군

상기 외과용 칼날 스크랩프 및 MacroCap™ 은 PK 완충액을 사용하여 증폭된 반면, 상기 CapSure™ 패드는 QiaAMP™ 키트를 사용하여 잘 증폭되었다. 피부 문지르기와 비교시, 본 실시예에서 시험된 방법을 사용하여 수집된 mtDNA의 양 및 얻어진 증폭 산물의 양은 효과적인 것으로 나타나지 않았다.

실시예 4: 주사 바늘을 이용한 피부 샘플의 수집

주사 바늘은 9명 개인의 5가지 다른 신체 부위로부터 피부 샘플을 수집하기 위해 사용되었다. 상기 신체 부위는 눈썹, 귓볼, 목의 뒤쪽, 손, 및 발뒤꿈치를 포함하였다.

상기에 기재된 바와 같은 주사 바늘을 사용하여, 상기 피부는 샘플 수집가 손의 엄지 및 검지 사이에 꼬집어지거나 텐트화 되었다. 상기 주사 바늘은 출혈은 거의 없이 또는 전혀 없이 상기 피부를 통과하였다. 상기 주사 바늘의 컬럼내에 인산염 완충액을 넣어주고 그 후, 플런저를 이용하여 주사 바늘로부터 상기 샘플을 멸균 튜브내로 밀쳐냄으로써, 상기 피부 샘플은 주사 바늘로부터 추출되었다. 그 다음에 DNA는 QiaAMP™ DNA Mini Kit™ (Qiagen product no. 51304)를 사용하여 상기 피부 조직을 포함하는 상기 볼륨으로부터 추출되었다.

그 후 상기 샘플은 3895bp mtDNA 결손을 동정하기 위해 증폭되었다. 본 실시예에 대한 반응 조건 및 사이클 파라미터는 상기 기재된 실시예 1과 동일하였다. 상기 결과는 표 3에 나타내었다.

주사 바늘을 통해 수집된 피부 샘플에 대한 결과

샘플	사이클 역치 C(t)	샘플	사이클 역치 C(t)
대상 1 왼쪽 눈썹	25.82	대상 6 왼쪽 눈썹	22.15
대상 1 왼쪽 귓볼	25.98	대상 6 왼쪽 귓볼	19.87
대상 1 목	26.26	대상 6 목	25.87
대상 1 오른손	26.73	대상 6 오른손	27.91
대상 1 오른쪽 발뒤꿈치	27.93	대상 7 왼쪽 눈썹	29.89
대상 2 왼쪽 눈썹	30.85	대상 7 왼쪽 귓볼	19.18
대상 2 왼쪽 귓볼	25.6	대상 7 목	25.49
대상 2 목	23.92	대상 7 오른손	23.41
대상 2 오른손	27.01	대상 7 오른쪽 발뒤꿈치	27.05
대상 2 오른쪽 발뒤꿈치	35.55	대상 8 왼쪽 눈썹	21.82
대상 3 왼쪽 눈썹	29.64	대상 8 왼쪽 귓볼	21.32
대상 3 왼쪽 귓볼	23.51	대상 8 목	23.51
대상 3 목	24.52	대상 8 오른손	16.35
대상 3 오른손	22.47	대상 8 오른쪽 발뒤꿈치	20.57
대상 4 왼쪽 눈썹	24.23	대상 9 왼쪽 눈썹	25.09
대상 4 왼쪽 귓볼	23.64	대상 9 왼쪽 귓볼	26.76
대상 4 목	24.96	대상 9 목	27.74
대상 4 오른손	25.93	대상 9 오른손	25.24
대상 4 오른쪽 발뒤꿈치	23.58	대상 9 오른쪽 발뒤꿈치	22.39
대상 5 왼쪽 눈썹	22.35
대상 5 왼쪽 귓볼	24.39
대상 5 목	22.06
대상 5 오른손	22.04
대상 5 오른쪽 발뒤꿈치	22.6

상기 수집 방법을 통해 얻어진 재료는 실시간 PCR과 같은 분자 분석을 위해 충분하다는 것은 분명하다. 특히, 상기 3895 bp mtDNA 결손을 나타내는 상기 증폭 산물은 표 3에 의해 입증된 바와 같이 검출되고 정량되었다. 따라서, 상기 주사 바늘 수집 방법을 통한 피부 샘플의 수집은 상기 종류의 분석법에 사용하기에 충분한 DNA를 생산한다.

실시예 5: MC1R 변이체의 검출

구강 샘플은 3명의 대상으로부터 수집되었다. 각각의 대상은 그들의 입을 수돗물 또는 병물로 헹궈내었고, 물을 뱉어내었다. 면봉(cotton swab)을 그것의 보호 포장재로부터 제거하여 손잡이를 움켜잡았다. 상기 면봉의 손잡이를 잡고 있는 동안, 상기 면봉 끝은 대상의 입안에 위치되었고, 상기 면봉 끝은 30초 동안 뺨의 안쪽에 문질러졌다. 상기 면봉은 멸균 튜브에 위치되었고 추가 처리를 위해 밀봉되었다.

특정 대립유전자의 검출은 ABI의 qPCR Taqman SNP 제노타이핑 분석법를 이용하여 결정되었다. 각각의 대상은 7개의 대립유전자 변이체 D84E, R142H, R151C, R160H, D294H, V60L, 및 V92M 에 대해 시험되었다.

D84E, R142H, R151C, V60L, 및 V92M 에 대한 유전자형은 하기의 ABI 분석법 (https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/direct/)을 사용하여 동정되었다:

V60L-분석법 #C751905410

D84E-분석법 #C751905520

V92M-분석법 #C203340520

R142H-분석법 #C2754163410

R151C-분석법 #C203340420

하기에 열거된 주문제작 프라이머 및 프로브는 D294H 대립유전자 변이체의 검출에 사용되었다.

정방향 프라이머 MC1R-294: CGCCCTCATCATCTGCAATG 서열번호 9;

역방향 프라이머 MC1R-294: GGCTGTGGAAGGCGTAGAT 서열번호 10;

프로브 1 MC1R-294V1 VIC: CCATCATCGACCCCCT 서열번호 11;

프로브 2 MC1R-294M1 FAM: CCATCATCCACCCCCT 서열번호 12.

모든 분석에 사용된 반응 조건은 Custom Taqman™ SNP 제노타이핑 분석 프로토콜에 요약되었다.

상기 R160H 대립유전자 변이체는 Sac II 절단을 이용하여 시험 되었다. 프라이머는 상기 MC1R 유전자에서 DNA의 타겟 영역을 증폭하기 위해 사용되었다. 그 후 상기 증폭 산물은 Sac II 절단시켰다. 겔의 레인 1 내지 4 (도 12 참고)는 3명의 시험 대상 및 대조군 샘플에 대한 결과를 보여준다. 상기 샘플 중 4개 모두는 동형접합체 야생형이었다. 상기 대립유전자 부위에 대한 동형접합체 야생형을 나타내는 상기 증폭 산물의 크기는 436 bp 이며, 이는 SAC II 절단 후 327 bp의 산물을 생산한다. 동형접합체 변이체에서는 절단이 발생하지 않으며, 모든 PCR 증폭 산물은 436 bp의 크기로 계속 남아있는다.

상기 시험의 결과는 도 6 내지 12에 보여준다. 2가지 시험이 각 개인에 대해 실시되었으며, 또한 대조군 샘플은 2번 시험 되었다. 상기 대조군 샘플 유전자형은 V60L에 대한 이형접합체, V92M에 대한 동형접합체 변이체 및 상기 남아있는 대립유전자에 대한 야생형이었다. 첫 번째로 시험된 개인은 3형 피부(MC1R 변이체 발견되지 않음)를 가지는 것으로 결정되었다. 두 번째로 시험된 개인은 3형 피부(MC1R 변이체 발견되지 않음)를 가지는 것으로 결정되었다. 세 번째로 시험된 개인은 2형 피부(변이체 V60L 및 R151C에 대한 동형접합체 및 R142H에 대한 이형접합체)를 가지는 것으로 결정되었다.

상기 수집 방법을 통해 얻어진 재료가 MC1R 제노타이핑에 충분하다는 것은 분명하다. 특히, 상기 구강 면봉 수집 방법을 통한 DNA 샘플의 수집은 상기 종류의 분석법에서 사용을 위한 충분한 DNA를 생산한다.

실시예 6: 자외선 차단제 섭생의 유효성 분석

백그라운드:

UVB는 자외선에 대한 과다노출이 발생하였다는 시각적인 신호인 홍반(햇빛에 의한 화상)을 야기하는 자외선 복사의 스펙트럼이다. 홍반의 빈도 및 심각성은 종종 개인의 태양 보호 습관의 성공 척도로서 사용된다. 그러나, UVA가 피부 및 DNA 손상의 원인이 된다는 것은 현재 알려져 있지만, 자외선 차단제 및 자외선 방지 크림이 UVA를 막도록 하는 제제를 포함한 것은 최근의 일이었다. 따라서 자외선 차단제를 사용하는 개인은 UVB의 홍반 유발 효과에 대해 자신을 보호하고 있었지만, 아마도 UVA의 돌연변이 유발 영향에 대해 상기 개인이 가졌을 것이라 생각하는 것보다 훨씬 더 장기간의 노출을 겪었을 것이라는 시나리오가 생성된다. 상기 상황에서 개인은 자외선 차단제를 사용한다는 자가보고를 할 것이며, 건강 관리 제공자는 상기 환자가 사실은 UVA로부터 보호되고 있지 않을 때, UVR 손상을 막기 위해 조치를 취하는 잘못된 평가를 할 것이며, 결국 위험은 여전히 매우 높을 수 있다.

실시예 1에서 수행된 바와 같이, 격주 또는 매월과 같은 규칙적인 간격으로 면봉을 이용하여 수집된 표피에서, 상기 3895bp 미토콘드리아 DNA 결손의 수준을 평가하는 것은 자외선 복사에 의해 야기된 피부 손상을 막는데 있어서 상기 방법의 유효성을 결정하기 위해 처치 권고에 대해 비교하는 실시간, 정량적 모니터링 수단을 건강 관리 제공자에게 제공할 수 있다.

상기 수집 방법은 임의의 부작용 또는 불쾌감 없이 규칙적인 샘플링을 허용한다. 상기 면봉은 핵 DNA를 타겟팅하는 분석법에 대해 유용하지 않은 극히 낮은 수준의 핵산(대략 0.1ng)을 생산하지만, 상기 3895bp 결손과 같은 미토콘드리아 DNA 타겟은 훨씬 더 많은 양(대략 1000배 더 많은)이 존재하며 상기 극히 낮은 생산량을 가지는 수집 방법에 유일하게 적합하다.

연구:

좋지않은 태양 습관 또는 비효과적 보호 방법을 동정하는데 mtDNA 결손 분석의 유용성은 유사한 연령 및 피부 색조를 가진 2명의 개인의 결과에 의해 증명되었다. 환자 202는 자외선 차단제를 전혀 사용하지 않은 반면 환자 225는 자외선 차단제를 효과적으로 사용하였다. 상기 개인의 손상 수준은 환자 225 보다 자외선 복사 노출 유래 DNA 손상의 높은 수준을 나타내면서 대략 10배 더 많은 3895bp 결손의 양을 가지는 환자 202 와 함께 상기 행동을 반영한다(3 CT 차이가 타겟 양에 있어서 10배 차이와 동등한 곳). 비록 상기 2명의 개인의 표현형이 자외선 복사 연관 피부 손상에 대한 위험이 유사하거나 동등하다는 것을 나타낸다 할지라도, 상기 비침습성 면봉 수집과 연결된 3895 결손은 환자 202가 더 큰 위험에 있고, 이는 아마도 자외선 차단제 사용과 같은 행동의 차이 때문이라는 것을 증명할 수 있다.

자외선 복사 손상에 대한 환자 프로파일 및 위험 인자

환자	CT (3895 bp 결손)	연령	성별	머리카락	피부	효과적인 자외선 차 단제 사용
202	23.16	25	남성	흑색	어두운 갈 색	없음
225	26.06	28	여성	갈색	밝은 베이 지색	있음

실시예 7: 태양 관리 섭생의 유효성을 예측하기 위한 MC1R 변이체 및 mtDNA 결손의 분석

MC1R 변이체 상태의 결정뿐만 아니라 태양 관리 섭생의 유효성을 평가하기 위한 대용물로서 상기 자외선 복사 연관 3895 바이오마커와 DNA 손상에 대한 모니터링의 조합된 유용성은 유사한 연령, 피부색, 및 자외선 차단제 사용을 가지는 2명의 환자가 아마도 다른 MC1R 유전자형의 부산물로서 DNA 손상의 다른 수준을 가지는 하기에 증명되었다. 환자 300은 피부에서 자외선 복사의 손상 효과에 대한 감수성 증가와 연관된 변이체를 가지지 않는 반면, 환자 303은 아미노산 위치 92에서 하나의 변이체를 가진다. 비록 표현형적으로 상기 환자가 매우 유사하며 Fitzpatrick 포토타입 크기(3형)에서 유사한 점수를 받게 된다 할지라도, 상기 감수성 증가는 상기 MC1R 변이체를 가지지 않는 환자보다 가지는 환자에서 3배 더 높은 수준의 DNA 손상이 반영되었다(1 CT 차이는 타겟 양에 있어서 대략 3배 차이인 곳).

2명의 환자에 대한 MC1R 변이 및 mtDNA 결손의 비교 분석

		MC1R 변이체 (아미노산 위치)
환자	3895bp 결손의 CT	60	84	92	142	151	160	294	연령	성별	머리 카락	피부 색조	자외선 차 단제의 효 과적 사용
303	26.1	0	0	1	0	0	0	0	42	여성	흑색	올리 브색	있음
300	27.11	0	0	0	0	0	0	0	45	여성	갈색	올리 브색	있음

이전에 논의된 바와 같이, 자외선 복사에 의해 야기된 피부 손상은 다인성 과정이며, 따라서, MC1R 변이체를 가진 개인이 가지지 않은 개인보다 항상 더 많은 손상을 가질 것이라는 것은 가정될 수 없으며, 규칙적인 자외선 차단제 사용을 보고한 개인이 자외선 차단제 사용을 보고하지 않은 개인보다 반드시 더 적은 손상을 가질 것이라는 것 또한 마찬가지이다. 상기 2가지 시험을 조합하는 것은 그들의 관리하에 있는 사람에 대해 더 많은 정보가 있는 권고를 만들 필요가 있다는 통찰력을 건강 관리 제공자에게 제공한다.

하기 2개의 표는 변이체를 가진 개인 및 가지지 않은 개인이 일반적으로 DNA 손상 스펙트럼에 걸쳐서 동일하게 표시되는 사항을 예시한다.

위험 표현형과 전형적으로 연관되지 않은 유일한 변이체를 고려하였을 때, 예외는 다음 2개의 표에서 관찰된다. 아미노산 위치 60 및 92에서 상기 변이체는 아마도 MC1R 변이체의 결과로서 손상에 대한 감수성의 상기 변이체의 유일한 조합이 흰 피부 또는 빨간 머리카락과 같은 시각적 신호의 결핍과 연결된다는 것을 나타내는 낮은 손상 집단에서 낮게 표시되는데, 이는 위험 증가가 캐리어에서 손상의 일관성있는 더 높은 수준을 초래한다는 것을 나타낸다.

실시예 8: 광나이의 결정을 위한 주사 바늘 샘플링

자외선 복사 노출을 평가할 목적으로 미토콘드리아 마커와 연결된 최소한의 침습성 샘플링 절차를 이용하는 부가적 수단은 귓볼 또는 이마 융기 근처와 같은 얼굴 또는 머리에 대한 피부 조직을 작은 게이지 주사 바늘 (28 게이지)을 이용하여 샘플링하고, 미세-중심을 용액내로 방출하며, 핵산 추출을 수행하여, 상기 3895bp 결손과 같은 자외선 복사 손상과 연관된 미토콘드리아 타겟의 양을 측정함으로써 제공된다(실시예 1 참고). 그 다음에 상기 결과는 결과의 데이타베이스에 대해 비교되었고, 3895bp 결손의 수준에 기초한 연령 코호트로 분류되었다. 상기 데이타베이스는 0세부터 80세까지 5년 간격으로 다수의 개인에서 3895bp 결손 수준을 측정하여, 각 간격에 대한 클러스터 또는 평균을 찾고, 집 밖에서 자는 사람은 제거하며, 그리고 연령 범위와 3895bp 결손 수준의 범위의 상관관계를 보여줌으로써 생성되었다. 예를 들면, 21.5 내지 23.5의 CT 수치는 45 내지 65세의 연령 범위와 상관관계에 있을 수 있다. 상기 개인의 시험 결과는 상기 개인이 그들의 연령군에서 다른 개인보다 더 높거나 또는 더 낮은 광손상을 가지는 지를 결정하기 위해 그들의 실제 연령과 비교되었으며 상기 개인의 결과에 기초하여 광나이에 그들을 할당하였다.

상기 데이타베이스를 만들기 위해, 미세중심은 289명의 개인의 귓볼 및 이마 융기로부터 수집되었다. 도 13에 나타낸 바와 같이, DNA 추출 및 3895bp 결손 수준의 정량 후, 상기 데이타베이스는 상기에 기재된 바와 같이 그룹 사이에 유의차(p<0.01)를 가지는 3개의 그룹으로 나뉘는 연령 코호트로 구축되었다.

비록 본 발명이 특정 구현예와 관련하여 기재되었다 할지라도, 이의 다양한 변형은 본 발명의 정신 및 범위에서 벗어남 없이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게 명백할 것 같은 모든 변형은 하기의 청구 범위내에 포함되어 진다.

<110> Genesis Genomics Inc. <120> Methods For Assaying MC1R Variants And Mitochondrial Markers In Skin Samples <130> 102222/00047 <140> - <141> 2008-10-14 <150> PCT/CA2007/001790 <151> 2007-10-11 <150> US 60/999,074 <151> 2007-10-15 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12674 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gatcacaggt ctatcaccct attaaccact cacgggagct ctccatgcat ttggtatttt 60 cgtctggggg gtatgcacgc gatagcattg cgagacgctg gagccggagc accctatgtc 120 gcagtatctg tctttgattc ctgcctcatc ctattattta tcgcacctac gttcaatatt 180 acaggcgaac atacttacta aagtgtgtta attaattaat gcttgtagga cataataata 240 acaattgaat gtctgcacag ccactttcca cacagacatc ataacaaaaa atttccacca 300 aaccccccct cccccgcttc tggccacagc acttaaacac atctctgcca aaccccaaaa 360 acaaagaacc ctaacaccag cctaaccaga tttcaaattt tatcttttgg cggtatgcac 420 ttttaacagt caccccccaa ctaacacatt attttcccct cccactccca tactactaat 480 ctcatcaata caacccccgc ccatcctacc cagcacacac acaccgctgc taaccccata 540 ccccgaaaat gttggttata cccttcccgt actaattaat cccctggccc aacccgtcat 600 ctactctacc atctttgcag gcacactcat cacagcgcta agctcgcact gattttttac 660 ctgagtaggc ctagaaataa acatgctagc ttttattcca gttctaacca aaaaaataaa 720 ccctcgttcc acagaagctg ccatcaagta tttcctcacg caagcaaccg catccataat 780 ccttctaata gctatcctct tcaacaatat actctccgga caatgaacca taaccaatac 840 taccaatcaa tactcatcat taataatcat aatagctata gcaataaaac taggaatagc 900 cccctttcac ttctgagtcc cagaggttac ccaaggcacc cctctgacat ccggcctgct 960 tcttctcaca tgacaaaaac tagcccccat ctcaatcata taccaaatct ctccctcact 1020 aaacgtaagc cttctcctca ctctctcaat cttatccatc atagcaggca gttgaggtgg 1080 attaaaccaa acccagctac gcaaaatctt agcatactcc tcaattaccc acataggatg 1140 aataatagca gttctaccgt acaaccctaa cataaccatt cttaatttaa ctatttatat 1200 tatcctaact actaccgcat tcctactact caacttaaac tccagcacca cgaccctact 1260 actatctcgc acctgaaaca agctaacatg actaacaccc ttaattccat ccaccctcct 1320 ctccctagga ggcctgcccc cgctaaccgg ctttttgccc aaatgggcca ttatcgaaga 1380 attcacaaaa aacaatagcc tcatcatccc caccatcata gccaccatca 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gtgcccccga 2280 tatggcgttt ccccgcataa acaacataag cttctgactc ttacctccct ctctcctact 2340 cctgctcgca tctgctatag tggaggccgg agcaggaaca ggttgaacag tctaccctcc 2400 cttagcaggg aactactccc accctggagc ctccgtagac ctaaccatct tctccttaca 2460 cctagcaggt gtctcctcta tcttaggggc catcaatttc atcacaacaa ttatcaatat 2520 aaaaccccct gccataaccc aataccaaac gcccctcttc gtctgatccg tcctaatcac 2580 agcagtccta cttctcctat ctctcccagt cctagctgct ggcatcacta tactactaac 2640 agaccgcaac ctcaacacca ccttcttcga ccccgccgga ggaggagacc ccattctata 2700 ccaacaccta ttctgatttt tcggtcaccc tgaagtttat attcttatcc taccaggctt 2760 cggaataatc tcccatattg taacttacta ctccggaaaa aaagaaccat ttggatacat 2820 aggtatggtc tgagctatga tatcaattgg cttcctaggg tttatcgtgt gagcacacca 2880 tatatttaca gtaggaatag acgtagacac acgagcatat ttcacctccg ctaccataat 2940 catcgctatc cccaccggcg tcaaagtatt tagctgactc gccacactcc acggaagcaa 3000 tatgaaatga tctgctgcag tgctctgagc cctaggattc atctttcttt tcaccgtagg 3060 tggcctgact ggcattgtat tagcaaactc atcactagac atcgtactac 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cctatgagtg 6480 actacaaaaa ggattagact gaaccgaatt ggtatatagt ttaaacaaaa cgaatgattt 6540 cgactcatta aattatgata atcatattta ccaaatgccc ctcatttaca taaatattat 6600 actagcattt accatctcac ttctaggaat actagtatat cgctcacacc tcatatcctc 6660 cctactatgc ctagaaggaa taatactatc gctgttcatt atagctactc tcataaccct 6720 caacacccac tccctcttag ccaatattgt gcctattgcc atactagtct ttgccgcctg 6780 cgaagcagcg gtgggcctag ccctactagt ctcaatctcc aacacatatg gcctagacta 6840 cgtacataac ctaaacctac tccaatgcta aaactaatcg tcccaacaat tatattacta 6900 ccactgacat gactttccaa aaaacacata atttgaatca acacaaccac ccacagccta 6960 attattagca tcatccctct actatttttt aaccaaatca acaacaacct atttagctgt 7020 tccccaacct tttcctccga ccccctaaca acccccctcc taatactaac tacctgactc 7080 ctacccctca caatcatggc aagccaacgc cacttatcca gtgaaccact atcacgaaaa 7140 aaactctacc tctctatact aatctcccta caaatctcct taattataac attcacagcc 7200 acagaactaa tcatatttta tatcttcttc gaaaccacac ttatccccac cttggctatc 7260 atcacccgat gaggcaacca gccagaacgc ctgaacgcag gcacatactt 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ctcgccttag 9000 catgatttat cctacactcc aactcatgag acccacaaca aatagccctt ctaaacgcta 9060 atccaagcct caccccacta ctaggcctcc tcctagcagc agcaggcaaa tcagcccaat 9120 taggtctcca cccctgactc ccctcagcca tagaaggccc caccccagtc tcagccctac 9180 tccactcaag cactatagtt gtagcaggaa tcttcttact catccgcttc caccccctag 9240 cagaaaatag cccactaatc caaactctaa cactatgctt aggcgctatc accactctgt 9300 tcgcagcagt ctgcgccctt acacaaaatg acatcaaaaa aatcgtagcc ttctccactt 9360 caagtcaact aggactcata atagttacaa tcggcatcaa ccaaccacac ctagcattcc 9420 tgcacatctg tacccacgcc ttcttcaaag ccatactatt tatgtgctcc gggtccatca 9480 tccacaacct taacaatgaa caagatattc gaaaaatagg aggactactc aaaaccatac 9540 ctctcacttc aacctccctc accattggca gcctagcatt agcaggaata cctttcctca 9600 caggtttcta ctccaaagac cacatcatcg aaaccgcaaa catatcatac acaaacgcct 9660 gagccctatc tattactctc atcgctacct ccctgacaag cgcctatagc actcgaataa 9720 ttcttctcac cctaacaggt caacctcgct tccccaccct tactaacatt aacgaaaata 9780 accccaccct actaaacccc attaaacgcc tggcagccgg aagcctattc gcaggatttc 9840 tcattactaa caacatttcc cccgcatccc ccttccaaac aacaatcccc ctctacctaa 9900 aactcacagc cctcgctgtc actttcctag gacttctaac agccctagac ctcaactacc 9960 taaccaacaa acttaaaata aaatccccac tatgcacatt ttatttctcc aacatactcg 10020 gattctaccc tagcatcaca caccgcacaa tcccctatct aggccttctt acgagccaaa 10080 acctgcccct actcctccta gacctaacct gactagaaaa gctattacct aaaacaattt 10140 cacagcacca aatctccacc tccatcatca cctcaaccca aaaaggcata attaaacttt 10200 acttcctctc tttcttcttc ccactcatcc taaccctact cctaatcaca taacctattc 10260 ccccgagcaa tctcaattac aatatataca ccaacaaaca atgttcaacc agtaactact 10320 actaatcaac gcccataatc atacaaagcc cccgcaccaa taggatcctc ccgaatcaac 10380 cctgacccct ctccttcata aattattcag cttcctacac tattaaagtt taccacaacc 10440 accaccccat catactcttt cacccacagc accaatccta cctccatcgc taaccccact 10500 aaaacactca ccaagacctc aacccctgac ccccatgcct caggatactc ctcaatagcc 10560 atcgctgtag tatatccaaa gacaaccatc attcccccta aataaattaa aaaaactatt 10620 aaacccatat aacctccccc aaaattcaga ataataacac acccgaccac accgctaaca 10680 atcaatacta aacccccata aataggagaa ggcttagaag aaaaccccac aaaccccatt 10740 actaaaccca cactcaacag aaacaaagca tacatcatta ttctcgcacg gactacaacc 10800 acgaccaatg atatgaaaaa ccatcgttgt atttcaacta caagaacacc aatgacccca 10860 atacgcaaaa ctaaccccct aataaaatta attaaccact cattcatcga cctccccacc 10920 ccatccaaca tctccgcatg atgaaacttc ggctcactcc ttggcgcctg cctgatcctc 10980 caaatcacca caggactatt cctagccatg cactactcac cagacgcctc aaccgccttt 11040 tcatcaatcg cccacatcac tcgagacgta aattatggct gaatcatccg ctaccttcac 11100 gccaatggcg cctcaatatt ctttatctgc ctcttcctac acatcgggcg aggcctatat 11160 tacggatcat ttctctactc agaaacctga aacatcggca ttatcctcct gcttgcaact 11220 atagcaacag ccttcatagg ctatgtcctc ccgtgaggcc aaatatcatt ctgaggggcc 11280 acagtaatta caaacttact atccgccatc ccatacattg ggacagacct agttcaatga 11340 atctgaggag gctactcagt agacagtccc accctcacac gattctttac ctttcacttc 11400 atcttgccct tcattattgc agccctagca acactccacc tcctattctt gcacgaaacg 11460 ggatcaaaca accccctagg aatcacctcc cattccgata aaatcacctt ccacccttac 11520 tacacaatca aagacgccct cggcttactt ctcttccttc tctccttaat gacattaaca 11580 ctattctcac cagacctcct aggcgaccca gacaattata ccctagccaa ccccttaaac 11640 acccctcccc acatcaagcc cgaatgatat ttcctattcg cctacacaat tctccgatcc 11700 gtccctaaca aactaggagg cgtccttgcc ctattactat ccatcctcat cctagcaata 11760 atccccatcc tccatatatc caaacaacaa agcataatat ttcgcccact aagccaatca 11820 ctttattgac tcctagccgc agacctcctc attctaacct gaatcggagg acaaccagta 11880 agctaccctt ttaccatcat tggacaagta gcatccgtac tatacttcac aacaatccta 11940 atcctaatac caactatctc cctaattgaa aacaaaatac tcaaatgggc ctgtccttgt 12000 agtataaact aatacaccag tcttgtaaac cggagatgaa aacctttttc caaggacaaa 12060 tcagagaaaa agtctttaac tccaccatta gcacccaaag ctaagattct aatttaaact 12120 attctctgtt ctttcatggg gaagcagatt tgggtaccac ccaagtattg actcacccat 12180 caacaaccgc tatgtatttc gtacattact gccagccacc atgaatattg tacggtacca 12240 taaatacttg accacctgta gtacataaaa acccaatcca catcaaaacc ccctccccat 12300 gcttacaagc aagtacagca atcaaccctc aactatcaca catcaactgc aactccaaag 12360 ccacccctca cccactagga taccaacaaa cctacccacc cttaacagta catagtacat 12420 aaagccattt accgtacata gcacattaca gtcaaatccc ttctcgtccc catggatgac 12480 ccccctcaga taggggtccc ttgaccacca tcctccgtga aatcaatatc ccgcacaaga 12540 gtgctactct cctcgctccg ggcccataac acttgggggt agctaaagtg aactgtatcc 12600 gacatctggt tcctacttca gggtcataaa gcctaaatag cccacacgtt ccccttaaat 12660 aagacatcac gatg 12674 <210> 2 <211> 3895 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (2560)..(2560) <223> N represents a gap <400> 2 ccaaccaaac cccaaagaca ccccccacag tttatgtagc ttacctcctc aaagcaatac 60 actgaaaatg tttagacggg ctcacatcac cccataaaca aataggtttg gtcctagcct 120 ttctattagc tcttagtaag attacacatg caagcatccc cgttccagtg agttcaccct 180 ctaaatcacc acgatcaaaa ggaacaagca tcaagcacgc agcaatgcag ctcaaaacgc 240 ttagcctagc cacaccccca cgggaaacag cagtgattaa cctttagcaa taaacgaaag 300 tttaactaag ctatactaac cccagggttg gtcaatttcg tgccagccac cgcggtcaca 360 cgattaaccc aagtcaatag aagccggcgt aaagagtgtt ttagatcacc ccctccccaa 420 taaagctaaa actcacctga gttgtaaaaa actccagttg acacaaaata gactacgaaa 480 gtggctttaa catatctgaa cacacaatag ctaagaccca aactgggatt agatacccca 540 ctatgcttag ccctaaacct caacagttaa atcaacaaaa ctgctcgcca gaacactacg 600 agccacagct taaaactcaa aggacctggc ggtgcttcat atccctctag aggagcctgt 660 tctgtaatcg ataaaccccg atcaacctca ccacctcttg ctcagcctat ataccgccat 720 cttcagcaaa ccctgatgaa ggctacaaag taagcgcaag tacccacgta aagacgttag 780 gtcaaggtgt agcccatgag gtggcaagaa atgggctaca ttttctaccc cagaaaacta 840 cgatagccct tatgaaactt aagggtcgaa ggtggattta gcagtaaact aagagtagag 900 tgcttagttg aacagggccc tgaagcgcgt acacaccgcc cgtcaccctc ctcaagtata 960 cttcaaagga catttaacta aaacccctac gcatttatat agaggagaca agtcgtaaca 1020 tggtaagtgt actggaaagt gcacttggac gaaccagagt gtagcttaac acaaagcacc 1080 caacttacac ttaggagatt tcaacttaac ttgaccgctc tgagctaaac ctagccccaa 1140 acccactcca ccttactacc agacaacctt agccaaacca tttacccaaa taaagtatag 1200 gcgatagaaa ttgaaacctg gcgcaataga tatagtaccg caagggaaag atgaaaaatt 1260 ataaccaagc ataatatagc aaggactaac ccctatacct tctgcataat gaattaacta 1320 gaaataactt tgcaaggaga gccaaagcta agacccccga aaccagacga gctacctaag 1380 aacagctaaa agagcacacc cgtctatgta gcaaaatagt gggaagattt ataggtagag 1440 gcgacaaacc taccgagcct ggtgatagct ggttgtccaa gatagaatct tagttcaact 1500 ttaaatttgc ccacagaacc ctctaaatcc ccttgtaaat ttaactgtta gtccaaagag 1560 gaacagctct ttggacacta ggaaaaaacc ttgtagagag agtaaaaaat ttaacaccca 1620 tagtaggcct aaaagcagcc accaattaag aaagcgttca agctcaacac ccactaccta 1680 aaaaatccca aacatataac tgaactcctc acacccaatt ggaccaatct atcaccctat 1740 agaagaacta atgttagtat aagtaacatg aaaacattct cctccgcata agcctgcgtc 1800 agattaaaac actgaactga caattaacag cccaatatct acaatcaacc aacaagtcat 1860 tattaccctc actgtcaacc caacacaggc atgctcataa ggaaaggtta aaaaaagtaa 1920 aaggaactcg gcaaatctta ccccgcctgt ttaccaaaaa catcacctct agcatcacca 1980 gtattagagg caccgcctgc ccagtgacac atgtttaacg gccgcggtac cctaaccgtg 2040 caaaggtagc ataatcactt gttccttaaa tagggacctg tatgaatggc tccacgaggg 2100 ttcagctgtc tcttactttt aaccagtgaa attgacctgc ccgtgaagag gcgggcataa 2160 cacagcaaga cgagaagacc ctatggagct ttaatttatt aatgcaaaca gtacctaaca 2220 aacccacagg tcctaaacta ccaaacctgc attaaaaatt tcggttgggg cgacctcgga 2280 gcagaaccca acctccgagc agtacatgct aagacttcac cagtcaaagc gaactactat 2340 actcaattga tccaataact tgaccaacgg aacaagttac cctagggata acagcgcaat 2400 cctattctag agtccatatc aacaataggg tttacgacct cgatgttgga tcaggacatc 2460 ccgatggtgc agccgctatt aaaggttcgt ttgttcaacg attaaagtcc tacgtgatct 2520 gagttcagac cggagtaatc caggtcggtt tctatctacN ttcaaattcc tccctgtacg 2580 aaaggacaag agaaataagg cctacttcac aaagcgcctt cccccgtaaa tgatatcatc 2640 tcaacttagt attataccca cacccaccca agaacagggt ttgttaagat ggcagagccc 2700 ggtaatcgca taaaacttaa aactttacag tcagaggttc aattcctctt cttaacaaca 2760 tacccatggc caacctccta ctcctcattg tacccattct aatcgcaatg gcattcctaa 2820 tgcttaccga acgaaaaatt ctaggctata tacaactacg caaaggcccc aacgttgtag 2880 gcccctacgg gctactacaa cccttcgctg acgccataaa actcttcacc aaagagcccc 2940 taaaacccgc cacatctacc atcaccctct acatcaccgc cccgacctta gctctcacca 3000 tcgctcttct actatgaacc cccctcccca tacccaaccc cctggtcaac ctcaacctag 3060 gcctcctatt tattctagcc acctctagcc tagccgttta ctcaatcctc tgatcagggt 3120 gagcatcaaa ctcaaactac gccctgatcg gcgcactgcg agcagtagcc caaacaatct 3180 catatgaagt caccctagcc atcattctac tatcaacatt actaataagt ggctccttta 3240 acctctccac ccttatcaca acacaagaac acctctgatt actcctgcca tcatgaccct 3300 tggccataat atgatttatc tccacactag cagagaccaa ccgaaccccc ttcgaccttg 3360 ccgaagggga gtccgaacta gtctcaggct tcaacatcga atacgccgca ggccccttcg 3420 ccctattctt catagccgaa tacacaaaca ttattataat aaacaccctc accactacaa 3480 tcttcctagg aacaacatat gacgcactct cccctgaact ctacacaaca tattttgtca 3540 ccaagaccct acttctaacc tccctgttct tatgaattcg aacagcatac ccccgattcc 3600 gctacgacca actcatacac ctcctatgaa aaaacttcct accactcacc ctagcattac 3660 ttatatgata tgtctccata cccattacaa tctccagcat tccccctcaa acctaagaaa 3720 tatgtctgat aaaagagtta ctttgataga gtaaataata ggagcttaaa cccccttatt 3780 tctaggacta tgagaatcga acccatccct gagaatccaa aattctccgt gccacctatc 3840 acaccccatc ctaaagtaag gtcagctaaa taagctatcg ggcccatacc ccgaa 3895 <210> 3 <211> 2360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gagagggcag gtcccgggga agctccggac tcctagaggg gcggccaggt gggggccctg 60 gtgaccagga cagactgtgg tgttttttaa cgtaaaggag atccgcggtg tgagggaccc 120 cctgggtcct gcacgccgcc tggtggcagg ccgggccatg gtgggtgctc acgcccccgg 180 catgtggccg ccctcagtgg gaggggctct gagaacgact ttttaaaacg cagagaaaag 240 ctccattctt cccaggacct cagcgcagcc ctggcccagg aaggcaggag acagaggcca 300 ggacggtcca gaggtgtcga aatgtcctgg ggacctgagc agcagccacc agggaagagg 360 cagggaggga gctgaggacc aggcttggtt gtgagaatcc ctgagcccag gcggtagatg 420 ccaggaggtg tctggactgg ctgggccatg cctgggctga cctgtccagc cagggagagg 480 gtgtgagggc agatctgggg gtgcccagat ggaaggaggc aggcatgggg gacacccaag 540 gccccctggc agcaccatga actaagcagg acacctggag gggaagaact gtggggacct 600 ggaggcctcc aacgactcct tcctgcttcc tggacaggac tatggctgtg cagggatccc 660 agagaagact tctgggctcc ctcaactcca cccccacagc catcccccag ctggggctgg 720 ctgccaacca gacaggagcc cggtgcctgg aggtgtccat ctctgacggg ctcttcctca 780 gcctggggct ggtgagcttg gtggagaacg cgctggtggt ggccaccatc gccaagaacc 840 ggaacctgca ctcacccatg tactgcttca tctgctgcct ggccttgtcg gacctgctgg 900 tgagcgggag caacgtgctg gagacggccg tcatcctcct gctggaggcc ggtgcactgg 960 tggcccgggc tgcggtgctg cagcagctgg acaatgtcat tgacgtgatc acctgcagct 1020 ccatgctgtc cagcctctgc ttcctgggcg ccatcgccgt ggaccgctac atctccatct 1080 tctacgcact gcgctaccac agcatcgtga ccctgccgcg ggcgcggcga gccgttgcgg 1140 ccatctgggt ggccagtgtc gtcttcagca cgctcttcat cgcctactac gaccacgtgg 1200 ccgtcctgct gtgcctcgtg gtcttcttcc tggctatgct ggtgctcatg gccgtgctgt 1260 acgtccacat gctggcccgg gcctgccagc acgcccaggg catcgcccgg ctccacaaga 1320 ggcagcgccc ggtccaccag ggctttggcc ttaaaggcgc tgtcaccctc accatcctgc 1380 tgggcatttt cttcctctgc tggggcccct tcttcctgca tctcacactc atcgtcctct 1440 gccccgagca ccccacgtgc ggctgcatct tcaagaactt caacctcttt ctcgccctca 1500 tcatctgcaa tgccatcatc gaccccctca tctacgcctt ccacagccag gagctccgca 1560 ggacgctcaa ggaggtgctg acatgctcct ggtgagcgcg gtgcacgcgg ctttaagtgt 1620 gctgggcaga gggaggtggt gatattgtgt ggtctggttc ctgtgtgacc ctgggcagtt 1680 ccttacctcc ctggtccccg tttgtcaaag aggatggact aaatgatctc tgaaagtgtt 1740 gaagcgcgga cccttctggg tccagggagg ggtccctgca aaactccagg caggacttct 1800 caccagcagt cgtggggaac ggaggaggac atggggaggt tgtggggcct caggctccgg 1860 gcaccagggg ccaacctcag gctcctaaag agacattttc cgcccactcc tgggacactc 1920 cgtctgctcc aatgactgag cagcatccac cccaccccat ctttgctgcc agctctcagg 1980 accgtgccct cgtcagctgg gatgtgaagt ctctgggtgg aagtgtgtgc caagagctac 2040 tcccacagca gccccaggag aaggggcttt gtgaccagaa agcttcatcc acagccttgc 2100 agcggctcct gcaaaaggag gtgaaatccc tgcctcaggc caagggacca ggtttgcagg 2160 agccccccta gtggtatggg gctgagccct cctgagggcc ggttctaagg ctcagactgg 2220 gcactggggc ctcagcctgc tttcctgcag cagtcgccca agcagacagc cctggcaaat 2280 gcctgactca gtgaccagtg cctgtgagca tggggccagg aaagtctggt aataaatgtg 2340 actcagcatc 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ggggcccugg ugaccaggac agacuguggu guuuuuuaac guaaaggaga 840 uccgcggugu gagggacccc cuggguccug cacgccgccu gguggcaggc cgggccaugg 900 ugggugcuca cgcccccggc auguggccgc ccucaguggg aggggcucug agaacgacuu 960 uuuaaaacgc agagaaaagc uccauucuuc ccaggaccuc agcgcagccc uggcccagga 1020 aggcaggaga cagaggccag gacgguccag aggugucgaa auguccuggg gaccugagca 1080 gcagccacca gggaagaggc agggagggag cugaggacca ggcuugguug ugagaauccc 1140 ugagcccagg cgguagaugc caggaggugu cuggacuggc ugggccaugc cugggcugac 1200 cuguccagcc agggagaggg ugugagggca gaucuggggg ugcccagaug gaaggaggca 1260 ggcauggggg acacccaagg cccccuggca gcaccaugaa cuaagcagga caccuggagg 1320 ggaagaacug uggggaccug gaggccucca acgacuccuu ccugcuuccu ggacaggacu 1380 auggcugugc agggauccca gagaagacuu cugggcuccc ucaacuccac ccccacagcc 1440 aucccccagc uggggcuggc ugccaaccag acaggagccc ggugccugga gguguccauc 1500 ucugacgggc ucuuccucag ccuggggcug gugagcuugg uggagaacgc gcugguggug 1560 gccaccaucg ccaagaaccg gaaccugcac ucacccaugu acugcuucau cugcugccug 1620 gccuugucgg accugcuggu gagcgggagc aacgugcugg agacggccgu cauccuccug 1680 cuggaggccg gugcacuggu ggcccgggcu gcggugcugc agcagcugga caaugucauu 1740 gacgugauca ccugcagcuc caugcugucc agccucugcu uccugggcgc caucgccgug 1800 gaccgcuaca ucuccaucuu cuacgcacug cgcuaccaca gcaucgugac ccugccgcgg 1860 gcgcggcgag ccguugcggc caucugggug gccagugucg ucuucagcac gcucuucauc 1920 gccuacuacg accacguggc cguccugcug ugccucgugg ucuucuuccu ggcuaugcug 1980 gugcucaugg ccgugcugua cguccacaug cuggcccggg ccugccagca cgcccagggc 2040 aucgcccggc uccacaagag gcagcgcccg guccaccagg gcuuuggccu uaaaggcgcu 2100 gucacccuca ccauccugcu gggcauuuuc uuccucugcu ggggccccuu cuuccugcau 2160 cucacacuca ucguccucug ccccgagcac cccacgugcg gcugcaucuu caagaacuuc 2220 aaccucuuuc ucgcccucau caucugcaau gccaucaucg acccccucau cuacgccuuc 2280 cacagccagg agcuccgcag gacgcucaag gaggugcuga caugcuccug gugagcgcgg 2340 ugcacgcggc uuuaagugug cugggcagag ggagguggug auauugugug gucugguucc 2400 ugugugaccc ugggcaguuc cuuaccuccc ugguccccgu uugucaaaga ggauggacua 2460 aaugaucucu gaaaguguug aagcgcggac ccuucugggu ccagggaggg gucccugcaa 2520 aacuccaggc aggacuucuc accagcaguc guggggaacg gaggaggaca uggggagguu 2580 guggggccuc aggcuccggg caccaggggc caaccucagg cuccuaaaga gacauuuucc 2640 gcccacuccu gggacacucc gucugcucca augacugagc agcauccacc ccaccccauc 2700 uuugcugcca gcucucagga ccgugcccuc gucagcuggg augugaaguc ucugggugga 2760 agugugugcc aagagcuacu cccacagcag ccccaggaga aggggcuuug ugaccagaaa 2820 gcuucaucca cagccuugca gcggcuccug caaaaggagg ugaaaucccu gccucaggcc 2880 aagggaccag guuugcagga gccccccuag ugguaugggg cugagcccuc cugagggccg 2940 guucuaaggc ucagacuggg cacuggggcc ucagccugcu uuccugcagc agucgcccaa 3000 gcagacagcc cuggcaaaug ccugacucag ugaccagugc cugugagcau ggggccagga 3060 aagucuggua auaaauguga cucagcauca cccaccuuaa aaaaaaaaaa aaaaa 3115 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3895 mtDNA deletion forward primer <400> 5 ctgctaaccc cataccccga aaatgttg 28 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3895 mtDNA deletion reverse primer <400> 6 gaaggattat ggatgcggtt gcttgcgtga g 31 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mtDNA genome forward primer <400> 7 cgttccagtg agttcaccct c 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mtDNA genome reverse primer <400> 8 cactctttac gccggcttct att 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MC1R-294 forward primer <400> 9 cgccctcatc atctgcaatg 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MC1R-294 reverse primer <400> 10 ggctgtggaa ggcgtagat 19 <210> 11 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MC1R-294V1 VIC probe <400> 11 ccatcatcga ccccct 16 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MC1R-294M1 FAM probe <400> 12 ccatcatcca ccccct 16

Claims (31)

1. 피부 샘플을 수집하기 위한 재료;
   미토콘드리아 DNA(mtDNA) 이상(aberration) 및 하나 이상의 멜라노코르틴 1 수용체 (MC1R) 변이체의 검출을 수행하기 위한 프라이머 또는 프로브; 및
   mtDNA 이상 및 하나 이상의 MC1R 변이체의 검출을 수행하기 위한 시약을 포함하고,
   상기 mtDNA 이상이 서열번호 1의 mtDNA 게놈의 뉴클레오티드 547 내지 4443 사이의 3895 bp mtDNA 결손이고,
   상기 하나 이상의 MC1R 변이체가 D84E, R142H, R151C, R160H, D294H, V60L, 및 V92M으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 자외선 복사(UVR) 손상에 대한 대상의 피부 상태 및 유전적 소인을 결정하기 위한 키트.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, mtDNA 이상의 검출을 수행하기 위한 프라이머 또는 프로브 중 적어도 하나는 3895 bp 결손의 제거 후 스플라이싱된 영역과 중복되는 것인 키트.
4. 제1항에 있어서, mtDNA 이상의 검출을 수행하기 위한 프라이머 중 적어도 하나는 서열 번호 5 또는 서열 번호 6인 것인 키트.
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, MC1R 변이체의 검출을 수행하기 위한 프라이머 중 적어도 하나는 서열 번호 9 또는 서열 번호 10인 것인 키트.
7. 제1항에 있어서, MC1R 변이체의 검출을 수행하기 위한 프로브 중 적어도 하나는 서열 번호 11 또는 서열 번호 12인 것인 키트.
8. 제1항에 있어서, 피부 샘플을 수집하기 위한 재료는 비침습성 또는 최소 침습성 피부 수집 기술을 이용하여 피부 조직을 수득하기 위한 재료인 것인 키트.
9. 제8항에 있어서, 상기 재료는 멸균 탈지면, 면봉(cotton tip swap), 작은 게이지 주사 바늘 또는 이들의 조합인 것인 키트.
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11. 제8항에 있어서, 상기 비침습성 피부 수집 기술은 0.1 ng까지의 DNA를 수득하는 것인 키트.
12. 제1항에 있어서, 피부 샘플을 수집하기 위한 재료는 대상의 진피 또는 상피 층으로부터 피부 조직을 수득하기 위한 재료인 것인 키트.
13. 제12항에 있어서, 피부는 발뒤꿈치, 코, 안쪽 팔, 귀, 입, 두피, 흉부, 어깨, 엉덩이, 등, 얼굴, 목의 뒤쪽, 손, 머리, 또는 이의 조합으로부터 유래된 것인 키트.
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24. 하기 단계를 포함하는, UVR 손상을 모니터링하기 위한 비침습성 방법:
    (a) 적어도 하나의 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 이상에 대해 대상으로부터의 첫번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 mtDNA 이상은 서열번호 1의 mtDNA 게놈의 염기 547 내지 4443 사이의 3895 bp mtDNA 결손인 단계;
    (b) 하나 이상의 멜라노코르틴 1 수용체(MC1R) 변이체에 대해 첫번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 하나 이상의 MC1R 변이체는 D84E, R142H, R151C, R160H, D294H, V60L, V92M 또는 이들의 조합인 단계;
    (c) 첫번째 피부 샘플에서 mtDNA 이상 및 MC1R 변이체(들)의 검출에 기초하여 UVR 손상에 대한 대상의 피부 상태 및 유전적 소인을 결정하는 단계;
    (d) 상기 mtDNA 이상에 대해 대상으로부터의 두번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 두번째 피부 샘플은 첫번째 피부 샘플 후에 그리고 광노화, UVR 손상 또는 피부 질환에 대한 예방적 또는 치료적 처리에 이어 수득된 것인 단계; 및
    (e) 첫번째 피부 샘플과 두번째 피부 샘플 사이의 상기 mtDNA 이상 수준을 비교하여 mtDNA 이상 수준의 변화를 검출하는 단계.
25. 하기 단계를 포함하는, 피부 질환을 모니터링하기 위한 비침습성 방법:
    (a) 적어도 하나의 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 이상에 대해 대상으로부터의 첫번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 mtDNA 이상은 서열번호 1의 mtDNA 게놈의 염기 547 내지 4443 사이의 3895 bp mtDNA 결손인 단계;
    (b) 하나 이상의 멜라노코르틴 1 수용체(MC1R) 변이체에 대해 첫번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 하나 이상의 MC1R 변이체는 D84E, R142H, R151C, R160H, D294H, V60L, V92M 또는 이들의 조합인 단계;
    (c) 첫번째 피부 샘플에서 mtDNA 이상 및 MC1R 변이체(들)의 검출에 기초하여 UVR 손상에 대한 대상의 피부 상태 및 유전적 소인을 결정하는 단계;
    (d) 상기 mtDNA 이상에 대해 대상으로부터의 두번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 두번째 피부 샘플은 첫번째 피부 샘플 후에 그리고 광노화, UVR 손상 또는 피부 질환에 대한 예방적 또는 치료적 처리에 이어 수득된 것인 단계; 및
    (e) 첫번째 피부 샘플과 두번째 피부 샘플 사이의 상기 mtDNA 이상 수준을 비교하여 mtDNA 이상 수준의 변화를 검출하는 단계.
26. 하기 단계를 포함하는, UVR 손상을 위한 예방적 또는 치료적 처리에 대한 대상의 반응을 모니터링하는 방법:
    (a) 적어도 하나의 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 이상에 대해 대상으로부터의 첫번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 mtDNA 이상은 서열번호 1의 mtDNA 게놈의 염기 547 내지 4443 사이의 3895 bp mtDNA 결손인 단계;
    (b) 하나 이상의 멜라노코르틴 1 수용체(MC1R) 변이체에 대해 첫번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 하나 이상의 MC1R 변이체는 D84E, R142H, R151C, R160H, D294H, V60L, V92M 또는 이들의 조합인 단계;
    (c) 첫번째 피부 샘플에서 mtDNA 이상 및 MC1R 변이체(들)의 검출에 기초하여 UVR 손상에 대한 대상의 피부 상태 및 유전적 소인을 결정하는 단계;
    (d) 상기 mtDNA 이상에 대해 대상으로부터의 두번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 두번째 피부 샘플은 첫번째 피부 샘플 후에 그리고 광노화, UVR 손상 또는 피부 질환에 대한 예방적 또는 치료적 처리에 이어 수득된 것인 단계; 및
    (e) 첫번째 피부 샘플과 두번째 피부 샘플 사이의 상기 mtDNA 이상 수준을 비교하여 mtDNA 이상 수준의 변화를 검출하는 단계.
27. 하기 단계를 포함하는, 자외선 복사(UVR) 손상에 대한 대상의 피부 상태 및 유전적 소인을 결정하기 위한 진단을 위한 정보 제공 방법:
    (a) 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 이상에 대해 대상으로부터의 첫번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 mtDNA 이상은 서열번호 1의 mtDNA 게놈의 뉴클레오티드 547 내지 4443 사이의 3895 bp mtDNA 결손인 단계;
    (b) 하나 이상의 멜라노코르틴 1 수용체(MC1R) 변이체에 대해 대상으로부터의 두번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 하나 이상의 MC1R 변이체는 D84E, R142H, R151C, R160H, D294H, V60L, V92M 또는 이들의 조합인 단계; 및
    (c) 피부 샘플에서 mtDNA 이상 및 MC1R 변이체(들)의 검출에 기초하여 UVR 손상에 대한 대상의 피부 상태 및 유전적 소인을 결정하는 단계.
28. 하기 단계를 포함하는, 광노화를 모니터링하기 위한 비침습성 방법:
    (a) 적어도 하나의 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 이상에 대해 대상으로부터의 첫번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 mtDNA 이상은 서열번호 1의 mtDNA 게놈의 뉴클레오티드 547 내지 4443 사이의 3895 bp mtDNA 결손인 단계;
    (b) 하나 이상의 멜라노코르틴 1 수용체(MC1R) 변이체에 대해 첫번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 하나 이상의 MC1R 변이체는 D84E, R142H, R151C, R160H, D294H, V60L, V92M 또는 이들의 조합인 단계;
    (c) 첫번째 피부 샘플에서 mtDNA 이상 및 MC1R 변이체(들)의 검출에 기초하여 UVR 손상에 대한 대상의 피부 상태 및 유전적 소인을 결정하는 단계;
    (d) 상기 mtDNA 이상에 대해 대상으로부터의 두번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 두번째 피부 샘플은 첫번째 피부 샘플 후에 그리고 광노화, UVR 손상 또는 피부 질환에 대한 예방적 또는 치료적 처리에 이어 수득된 것인 단계; 및
    (e) 첫번째 피부 샘플과 두번째 피부 샘플 사이의 상기 mtDNA 이상 수준을 비교하여 mtDNA 이상 수준의 변화를 검출하는 단계.
29. 하기 단계를 포함하는, 광노화를 위한 예방적 또는 치료적 처리에 대한 대상의 반응을 모니터링하는 방법:
    (a) 적어도 하나의 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 이상에 대해 대상으로부터의 첫번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 mtDNA 이상은 서열번호 1의 mtDNA 게놈의 뉴클레오티드 547 내지 4443 사이의 3895 bp mtDNA 결손인 단계;
    (b) 하나 이상의 멜라노코르틴 1 수용체(MC1R) 변이체에 대해 첫번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 하나 이상의 MC1R 변이체는 D84E, R142H, R151C, R160H, D294H, V60L, V92M 또는 이들의 조합인 단계;
    (c) 첫번째 피부 샘플에서 mtDNA 이상 및 MC1R 변이체(들)의 검출에 기초하여 UVR 손상에 대한 대상의 피부 상태 및 유전적 소인을 결정하는 단계;
    (d) 상기 mtDNA 이상에 대해 대상으로부터의 두번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 두번째 피부 샘플은 첫번째 피부 샘플 후에 그리고 광노화, UVR 손상 또는 피부 질환에 대한 예방적 또는 치료적 처리에 이어 수득된 것인 단계; 및
    (e) 첫번째 피부 샘플과 두번째 피부 샘플 사이의 상기 mtDNA 이상 수준을 비교하여 mtDNA 이상 수준의 변화를 검출하는 단계.
30. 하기 단계를 포함하는, 피부 질환을 위한 예방적 또는 치료적 처리에 대한 대상의 반응을 모니터링하는 방법:
    (a) 적어도 하나의 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 이상에 대해 대상으로부터의 첫번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 mtDNA 이상은 서열번호 1의 mtDNA 게놈의 염기 547 내지 4443 사이의 3895 bp mtDNA 결손인 단계;
    (b) 하나 이상의 멜라노코르틴 1 수용체(MC1R) 변이체에 대해 첫번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 하나 이상의 MC1R 변이체는 D84E, R142H, R151C, R160H, D294H, V60L, V92M 또는 이들의 조합인 단계;
    (c) 첫번째 피부 샘플에서 mtDNA 이상 및 MC1R 변이체(들)의 검출에 기초하여 UVR 손상에 대한 대상의 피부 상태 및 유전적 소인을 결정하는 단계;
    (d) 상기 mtDNA 이상에 대해 대상으로부터의 두번째 피부 샘플을 분석하며, 여기서 두번째 피부 샘플은 첫번째 피부 샘플 후에 그리고 광노화, UVR 손상 또는 피부 질환에 대한 예방적 또는 치료적 처리에 이어 수득된 것인 단계; 및
    (e) 첫번째 피부 샘플과 두번째 피부 샘플 사이의 상기 mtDNA 이상 수준을 비교하여 mtDNA 이상 수준의 변화를 검출하는 단계.
31. 제24항 내지 제26항 및 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 정해진 기간 동안 규칙적인 간격으로 단계 (d)와 (e)를 반복하여 치료의 효과를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.

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