JP5646998B2 - 皮膚試料におけるmc1rバリアントおよびミトコンドリアマーカーをアッセイする方法 - Google Patents
皮膚試料におけるmc1rバリアントおよびミトコンドリアマーカーをアッセイする方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、PCT特許出願第PCT/CA2007/001790号(出願日:2007年10月11日)および米国特許出願第60/999,074号(出願日:2007年10月15日)に基づいて優先権を主張するものである。これらの特許出願の内容の全体が、参照によって本明細書に援用される。
皮膚疾患は、現代の世界における保健医療の主要な問題を代表している。皮膚がんと診断される新患者が米国において年に百万人を超えており(米国国立がん研究所、www.cancer.gov)、皮膚疾患の予測および診断は、皮膚疾患を管理する重要な側面である。現在の診断方法は、主に視覚的な観察および生検に依存している。しかし、視覚的な観察に依存する検出方法は、皮膚の状態または皮膚疾患の診断にとって必ずしも有効ではなく、臨床的な症状が現れるまで危険性または疾患を検出できない。さらに、侵襲的な方法、例えば生検は、試験される対象に外傷を与えるたけでなく、感染の可能性を増大させる。また、上記侵襲的な方法は、安全に実施されるために、医師によってなされなければならない。また、典型的に反応にとって一般に必要とされる細胞である、皮膚の表面における細胞を多く含む試料は、侵襲的な方法によって得られない。
紫外線照射(UVR)によって生じる皮膚の損傷には、未知の要因または十分に定量化できない要因がしばしば寄与する。既知の要因としては、種々のものが挙げられるが、とりわけ皮膚の色、UVRばくろの頻度および強度、メラニン生成、フェオメラニンに対するユーメラニンの割合、ならびに日焼け止めの使用などが挙げられる。行動性の要因は、UVRによる皮膚への損傷の重症度および度合いに大きな役割を果たしているが、当該要因が自己申告の正確さ、および患者の日光に関する生活習慣の誤認識にしばしば依存するので、当該要因は、臨床的に評価することが極めて困難である。また、日焼け止めを日常的に使用する多くの人は、十分な量を塗布するか、または推奨される使用間隔の間にふたたび塗布することを怠り、UVRへのばくろの増加を導き得る誤った認識をもたらして、日焼け止めを不適切に使用している。
ヒトの皮膚組織は非常に複雑であり、多くの細胞種を含んでいる。したがって、ヒトの皮膚細胞のバイオマーカーの同定は、特に重要である。ヒトの皮膚おける、UVRへの蓄積するばくろに対する信頼性の高いマーカーを決定するために、発明者らは、UVによって誘導されるDNA損傷のバイオマーカーとして、核内DNAではなく、ミトコンドリアDNA(mtDNA)を利用する新規な着想を検討している(Pang et al., 1994、Berneburg et al., 1997、Birch−Machin et al., 1998、およびBirch−Machin, 2000)。
メラノコルチン−1受容体遺伝子(MC1R)は、メラニン合成の要になる膜結合型受容体タンパク質をコードしている。MC1Rのコード領域は高い多形性を有し、色素沈着の表現型を有するバリアントとの関連、ならびに黒色腫および非黒色腫皮膚がんに対する危険性が報告されている(Rees, Pigment Cell Research, Vol. 13(3), 135〜140(6), 2000年6月、およびKanetsky et al. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention Vol. 13, 808〜819, 2004年5月)。黒色腫の発生率は、日光に感受性の高い白い肌の人において最も高い。このことは、メラニンの合成が増大することによってUVばくろに応答する能力が、黒色腫の予防における重要な要因であることを示唆している。同種の研究によって、白い肌の赤毛の人が、MC1Rの対立遺伝子の両方に機能的に重要な変化を有していることが示された。対立遺伝子であるD84E、R142H、R151C、R160H、およびD294Hは、赤毛および白い肌に対して高い浸透度を有している。また、浸透度のより低い2つの対立遺伝子(V60L、V92M)も、黒色腫の危険性についての一般的な要因である。
本発明の目的は、皮膚試料中のMC1Rのバリアントおよびミトコンドリアマーカーをアッセイする方法を提供することである。本発明の一態様によれば、UVRによる損傷に対する対象の皮膚の状態および遺伝的な素因を決定する診断の方法であって、
(a)対象から組織試料を回収する工程;
(b)ミトコンドリアDNA(mtDNA)の異常に関して、第1の皮膚試料をアッセイする工程;
(c)メラノコルチン1受容体(MC1R)のバリアントの1つ以上に関して、第2の皮膚試料をアッセイする工程;および
(d)皮膚試料におけるmtDNAの異常およびMC1Rのバリアントの検出に基づいて、UVRによる損傷に対する上記対象の皮膚の状態および遺伝的な素因を判定する工程を包含している、方法が提供される。
(a)非侵襲的な皮膚試料の回収手法を用いて、対象から皮膚試料を回収する工程;
(b)所定の期間にわたって一定の間隔をおいて、ミトコンドリアDNA(mtDNA)の異常に関して上記皮膚試料をアッセイする工程;
(c)上記所定の期間にわたって、同定されたmtDNAの異常における任意の変化を決定する工程を包含している、方法が提供される。
(a)対象から第1の皮膚試料を回収する工程;
(b)ミトコンドリアDNA(mtDNA)の異常に関して、第1の皮膚試料をアッセイする工程;
(c)メラノコルチン1受容体(MC1R)のバリアントの1つ以上に関して、第1の皮膚試料をアッセイする工程;
(d)第1の皮膚試料におけるmtDNAの異常およびMC1Rのバリアントの検出に基づいて、UVRによる損傷に対する、上記対象の皮膚の状態および遺伝的な素因を決定する工程;
(e)光老化、UVRによる損傷または皮膚疾患に関する予防処置または治療処置を施す工程;
(f)対象から第2の皮膚試料を回収する工程;
(g)ミトコンドリアDNA(mtDNA)の異常に関して、上記第2の皮膚試料をアッセイする工程;
(h)所定の期間にわたって一定の間隔をおいて、工程(f)および(g)を繰り返す工程;および
(i)上記第1の皮膚試料と、mtDNAの異常における変化を検出するために一定の間隔をおいて取られた皮膚試料との間における、mtDNAの異常のレベルを比較して、上記処置の有効性を監視する工程;ならびに
(j)必要に応じて、上記対象の遺伝的な素因、および検出されたmtDNA異常における変化に基づいて、上記処置を調節する工程を包含している、方法が提供される。
(a)対象から第1の皮膚試料を回収する工程;
(b)ミトコンドリアDNA(mtDNA)の異常に関して、上記第1の皮膚試料をアッセイする工程;
(c)上記治療剤または美容剤を用いて上記対象を処置する工程;
(d)所定の期間の後に対象から第2の皮膚試料を回収する工程;
(e)ミトコンドリアDNA(mtDNA)の異常に関して、上記第2の皮膚試料をアッセイする工程;ならびに
(f)上記第1の皮膚試料と第2の皮膚試料との間の、対照に対するmtDNAの異常のレベルを比較して、上記治療剤または美容剤の有効性を決定する工程を包含している、方法が提供される。
(a)対象から皮膚試料を回収する工程;
(b)ミトコンドリアDNA(mtDNA)の欠失に関して、上記皮膚試料をアッセイする工程;
(c)上記皮膚試料のmtDNAの欠失のレベルを、年齢コホートにしたがって分類されるmtDNAの欠失の集団に対して比較し、上記対象に光老化度を割り当てる工程;および
(d)割り当てられた光老化度と対象の実年齢を比較することによって、上記対象の光損傷のレベルを決定する工程を包含している、方法が提供される。
(a)組織試料を回収するための器具;ならびに
(b)MC1Rの遺伝子型の同定およびmtDNA異常の検出の実施に適したプライマー、プローブ、および試薬を備えている、キットが提供される。
本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面を参照してなされる以下の詳細な説明においてより明確になる。
本発明は、皮膚の状態および皮膚疾患を予測し、診断し、監視する方法を提供する。上記方法は、ミトコンドリアの変異およびメラノコルチン1受容体(MC1R)のバリアントを決定するアッセイと、非侵襲的な皮膚試料の回収手法を組み合わせることを包含している。この点において、上記方法は、疾患、加齢、および紫外線照射(UVR)損傷と関連した遺伝的な素因および危険因子を評価する、包括的なツールを提供する。また、上記方法は、治療剤、スキンケア製品、および処置計画に対する患者の反応の評価も可能にする。
本発明の方法は、個体の、皮膚疾患に対する遺伝的な素因、およびUVRに対するばくろに関連した危険因子の同定に有効なアッセイと、非侵襲的な皮膚の回収方法を組み合わせることを包含している。上記アッセイは、単独に実施され得るか、または他のアッセイと組み合わせて実施され得る。複数のアッセイを組み合わせて使用することによって、遺伝的な危険因子および日光に関する生活習慣を同時に評価する独自の能力が提供されて、光老化、UVRによる損傷、または皮膚疾患になりやすいか、またはなっている患者を良好に監視し、患者に良好に助言し、患者を良好に処置する診断ツールを保健医療の専門家に提供する。
ミトコンドリアDNA(mtDNA)の動態は、重要な診断ツールである。mtDNAにおける変異は、しばしば、かかっている疾患の初期の指標であり、発病に関連する危険因子の指標になるバイオマーカーとして機能し得る。また、核内DNAと比べてミトコンドリアDNAの細胞当たりのコピー数が多いことから、ミトコンドリアDNAは、極めて微量の核酸に頼るアッセイにとってより強力な標的である。したがって、本発明の方法は、ヒトのミトコンドリアのゲノムにおいて変異を検出するアッセイと、皮膚試料を回収する非侵襲的技術を組み合わせる。
上記メラノコルチン1受容体は、メラニン形成における重要な制御点であり、皮膚における色素の蓄積量を決定する。皮膚の色素が、発がん性のUVRに対する個体の自然保護の程度を決定することを考えれば、MC1Rの遺伝子型を同定することによって、UVRに対するばくろに起因するDNA損傷受けやすさが決定され得、皮膚がんに関する危険因子が評価され得る。したがって、メラノコルチン1受容体(MC1R)遺伝子のDNAまたはアミノ酸配列を評価して、特定のバリアントが、日光に対する感受性およびUVRによる損傷の受けやすさの増大と関連するか否かを特定することによって、疾患にかかる危険性が非常に高い個体であり、より積極的な監視および処置の手法を必要とし得る個体を特定するための、有益なツールが提供される。
本発明の方法は、対立遺伝子のバリアントの存在について個体を評価するために使用され得るだけでなく、個体のフィッツパトリックの光反応性の分類(Fitzpatrick phototype)が近い皮膚の分類を決定するために使用され得る。この点において、MC1Rの遺伝子型の同定の結果によって、がんについての関連する危険性によって特徴付けられる特定の皮膚の分類に、さらに分けることが可能になる。
皮膚の分類1は、個体が、皮膚がんの危険性と関連が最も高い4つの対立遺伝子のバリアントのうちの2つ以上を有していることを特徴とする。
皮膚の分類2は、個体が、皮膚がんの危険性と関連が最も高い4つの対立遺伝子のバリアントのうちの1つを有していることを特徴とする。
皮膚の分類3または4以上は、個体が、皮膚がんの危険性と関連が最も高い4つの対立遺伝子のバリアントを1つも有していないことを特徴とする。
本明細書に記載のように、本発明のアッセイは、例えば、皮膚の状態もしくは遺伝的な危険性を評価するために単独にか、または皮膚疾患に対する遺伝的な素因および個体の特定の生活様式と関連する因子の同定の両方を評価するために、組み合わせて使用され得る。以下に説明するように、これらの要因の同定および監視は、UVRによる損傷、光老化、および皮膚疾患に対する有効な予防手段および処置手段の決定に重要である。
スキンケア製品(例えば日焼け止めおよび日焼け止めクリーム(sunblock))を日常的に使用する多くの個体は、製品を不適切に使用している。すなわち、多くの個体は、十分な量の製品を塗布すること、または推奨される使用間隔の間にふたたび塗布することを怠り、UVRへのばくろの増加を導き得る誤った認識をもたらしている。さらに、最近まで、日光にさらされるときに個体によって日常的に塗布される日焼け止めおよび日焼け止めクリームには、UVBの変異生成作用を一般に保護するが、UVA照射の有害作用に関する薬剤が含まれていなかった。
ミトコンドリアマーカーの同定と組み合わせられた低侵襲的な試料の回収手順を利用する、本発明の付加的な診断方法は、光老化の決定である。実施例の項に記載のように、この方法の目的は、個体の顔もしくは頭部の皮膚組織を低侵襲的な皮膚の回収手法を用いて試料を回収すること、およびUVRによる損傷(例えばmtDNAの欠失)と関連するミトコンドリアの標的の量を測定することによって、当該個体のUVRに対するばくろを評価することである。それから、この結果は、同じ方法によって得られた結果のデータベースに照して比較され、上記個体は検出されたmtDNAの欠失のレベルに基づいて年齢コホートに分類される。光老化度を割り当てるために、個体のmtDNAの分析結果がその個体の実年齢と比較されて、当該個体が、同年齢のグループの他の個体より、高い光損傷または低い光損傷を有するか否かを決定する。
光老化および皮膚がんの、個体の危険性を十分に評価するためには、患者の危険因子を理解し、伝えるために、できるだけ多くの情報を保健医療提供者に提供するが必須である。MC1Rの遺伝子型の同定を利用することによって、UVRに対するばくろに起因する個体のDNA損傷の受けやすさ、および皮膚がんになる危険性の高まりやすさに寄与するだけではなく、より積極的な監視および処置手段を潜在的に必要とする、非常に高い危険性を有する患者を特定するための有用なツールが提供される。
MC1Rの遺伝子型の同定およびmtDNA分析を組み合わせた使用は、遺伝的な素因および日光に関する生活習慣の最終的な結果の両方を考慮して、患者を監視し、患者に助言し、よりよく患者を処置するためのツールを、保健医療の専門家に提供する。複数のアッセイの組合せのこの使用によって、危険因子および結果を同時に評価する特有の能力を提供する。重要なことに、MC1Rの試験は、mtDNA試験のための非侵襲的な回収を用いた繰返し試験から一時的に除外され得、タンデムに(in tamdem)使用され得る。上述のように、これが可能であるのは、MC1R試験から得られる情報が個体の生涯を通して変化しないが、ミトコンドリアDNAの欠失の測定によって解明されるDNAの損傷のレベルは、UVRに対するばくろ傾向の結果として変化するためである。
本発明の方法は、さらに医薬および美容薬の両方の目的について広範な皮膚のスクリーニングに使用され得る。本発明の方法は、遺伝子型の同定、および/または皮膚がん(非黒色腫皮膚がんおよび黒色腫の両方)と関連する種々のバイオマーカーの測定のために使用され得る。任意の時点において、任意の解剖学的な外部の部位に由来する、個体の皮膚におけるUV照射に起因するのDNA損傷のレベルを評価する能力は、皮膚の健康に関する特有の有益なスクリーニング試験のための基礎であって、既存および新規の治療剤、スキンケア製品およびスキンケア手順の安全性および有効性を評価するための基礎を提供する。さらに、対象の皮膚疾患または皮膚の状態の背景にある、特定の遺伝的な変化を同定することによって、特定の治療剤、スキンケア製品、または手順に患者が反応するか否か、または反応する程度を容易に決定し得る。
本発明の方法に使用される回収器具は、消費者用または医療用のキットの中に、所望の用途に応じて梱包されて、臨床的環境において使用され得る。該キットは、1つ以上の試料回収手段(例えば、滅菌の消毒綿、コットンチップスワップまたは針)だけでなく、遺伝子型の同定および/またはmtDNAの変異の同定に必要な他の材料を備え得る。
(実施例1:3895bpのヒトmtDNAの欠失の分析)
本発明の方法を用いて、PCT特許出願第WO/06/111029号に示されている3895bpのmtDNAの欠失を分析した。mtDNAの回収および抽出は、以下のように実施した。
1.皮膚試料は、滅菌の消毒綿を用いて皮膚の部位をおよそ15回にわたって拭き取ることによって回収された。皮膚試料は、踵(n=41)、鼻(n=43)、腕の内側(n=20)、耳(n=5)、肩部(n=5)、殿部(n=5)および背中(n=5)から回収された。
2.mtDNAは、市販のキット(QiaAMP(登録商標) DNA Micro Kit、製品番号56304、Qiagen、Maryland USA)を用いて、製造業者のプロトコルにしたがって抽出された。
3.二本鎖DNAは、Qubit(登録商標)蛍光光度計(製品番号Q32857)、Invitrogen、California USA)に対して、HS−DNA Quant−it(登録商標) dsDNA HS Assay Kit (製品番号Q32851、Invitrogen、California USA)を用いて定量化された。
4.それから、3895bpの欠失レベルは、iQ Sybr Green Supermix(登録商標)(製品番号170−8882、Bio−Rad、California USA)、および以下のプライマーを用いて、リアルタイムPCR(rt−PCR)によって定量化した。
フォワード 5’−CTGCTAACCCCATACCCCGAAAATGTTG−3’(配列番号5);
リバース 5’−GAAGGATTATGGATGCGGTTGCTTGCGTGAG −3’(配列番号6)。
12.5ulのiQ Sybr Green Supermix(登録商標);
350nmolのフォワードプライマー(配列番号5);
350nmolのリバースプライマー(配列番号6);
5ulの鋳型(およそ0.5ngのdsDNA);
水(25ulになるまで);
サイクルに関するパラメータ:
ステップ1.95℃において3分間
ステップ2.95℃において30秒間
ステップ3.67.5℃において30秒間
ステップ4.72℃において30秒間
ステップ5.プレートの読み取り
ステップ2〜ステップ5を45サイクル
55〜110℃の融解曲線において3秒ごとに1℃単位の読み取り
10℃において10分間にわたって維持する。
5つの異なる非侵襲的皮膚の回収方法が、定量的リアルタイムPCRといった分子分析の実施に充分な量および質の核酸をもたらすことを(もしそうであれば)確認するために、試験された。試験された5つの方法は、:
・外科用テープを使ったテープリフト;
・ビオレ(登録商標)粘着性のストリップ;
・8%マンデル酸を含ませた滅菌の消毒綿;
・蒸留水を含ませた無菌スワブ;および
・ワックスストリップ
であった。
12sプライマー配列、フォワード 5’−CGTTCCAGTGAGTTCACCCTC−3’(配列番号7)
12sプライマー配列、リバース R5’−CACTCTTTACGCCGGCTTCTATT−3’(配列番号8)
を有するミトコンドリアDNAプライマーであった。
1.2分間にわたって94℃
2.30秒間にわたって94℃
3.30秒間にわたって64℃
4.30秒間にわたって72℃
5.ステップ2〜4を39回にわたって繰り返す
6.4℃に維持
にしたがって、DNA Engine Tetrad(Bio−Rad)において繰り返された。
レーン1 500ngの、100bpのGeneRuler SM0323(Fermentas)
レーン2 個体1由来のビオレ
レーン3 個体1由来の、水を用いたスワブ
レーン4 個体1由来の、マンデル酸を用いたスワブ
レーン5 個体1由来の外科用テープ
レーン6 個体1由来のワックス
レーン7 個体2由来のビオレ
レーン8 個体2由来の、水を用いたスワブ
レーン9 個体2由来の、マンデル酸を用いたスワブ
レーン10 個体2由来の外科用テープ
レーン11 個体2由来のワックス
レーン12 空
レーン13 増幅の陰性対照
レーン14 増幅の陽性対照
レーン15〜18 空
を含んでいる。
そして、ゲルの下半分は以下のもの:
レーン1 個体3由来のビオレ
レーン2 個体3由来の水を用いたスワブ
レーン3 個体3由来のマンデル酸を用いたスワブ
レーン4 個体3由来の外科用テープ
レーン5 個体3由来のワックス
レーン6 500ngの、100bpのGeneRuler SM0323(Fermentas)
レーン7 ビオレの抽出物の陰性対照
レーン8 水を用いたスワブの抽出物の陰性対照
レーン9 マンデル酸を用いたスワブの抽出物の陰性対照
レーン10 外科用テープの抽出物の陰性対照
レーン11 ワックスの抽出物の陰性対照
レーン12 空
レーン13 増幅の陰性対照
レーン14 増幅の陽性対照
レーン15〜18 空
を含んでいる。
上記ビオレストリップを用いて回収された皮膚細胞から回収されたmtDNAからは、mtDNAが増幅されなかった。水およびマンデル酸の両方に関するスワブは、増幅したが、水のスワブはより明らかに増幅した。外科用テープは散発的に増幅した。ワックスは明らかに増幅したが、ゲルの下半分のレーン11の抽出物の陰性対照には狭雑物が混入しており、これはワックスに関連する非滅菌性または取り扱い困難さから生じたと思われる。
本実施例では、皮膚試料を非侵襲的に回収する付加的な5つの方法が、定量的リアルタイムPCRといった分子分析を実施に充分な量および質の核酸をもたらすことを(もしそうであれば)確認するために、試験された。
滅菌したメスを用いた皮膚を掻き取り
木製のスクレーパを用いた皮膚の掻き取り
粘着パッドの粘着面(CapSure(商標) Clean−up Pad、Arcturus)
LCM MacroCap(商標)(Arcturus)のフィルム・LCM MacroCap(商標)(Arcturus)の加熱フィルム
を用いて、皮膚の試料は、単一の個体から2回にわたって回収された。
レーン1 500ngの、100bpのGeneRuler(SM0323)
レーン2 増幅の陰性対照
レーン3 正の増幅制御増幅の陽性対照
レーン4 PKバッファ、木を用いた掻き取り
レーン5 PKバッファ、メスを用いた掻き取り
レーン6 PKバッファ、CapSureパッド
レーン7 PKバッファ、MacroCap
レーン8 PKバッファ、加熱したMacroCap
レーン9 PKバッファ、木を用いて掻き取り、抽出の陰性対照
レーン10 PKバッファ、メスを用いて掻き取り、抽出の陰性対照
レーン11 PKバッファ、CapSure、抽出の陰性対照
レーン12 PKバッファ、MacroCap、抽出の陰性対照
レーン13 PKバッファ、加熱したMacroCap、抽出の陰性対照
レーン14 QiaAMP、メスを用いて掻き取り
レーン15 QiaAMP、CapSureパッド
レーン16 QiaAMP、木を用いて掻き取り
レーン17 QiaAMP、メスを用いて掻き取り、抽出の陰性対照
レーン18 QiaAMP、CapSureパッド、抽出の陰性対照
レーン19 QiaAMP、木を用いて掻き取り、抽出の陰性対照
レーン20 QiaAMP、試薬の陰性対照
を含んでいる。
針を用いて、9人の個体の5箇所の異なる部位から皮膚試料を回収した。当該部位は、眉、耳朶、うなじ、手、および踵を含む。
頬側の試料を、3人の対象から回収した。対象のそれぞれは、水道水または瓶詰めの水を用いて口を漱ぎ、水を吐き出した。消毒綿を保護包装から取り出して、その柄を掴んだ。消毒綿の柄を掴んだまま、綿製の先端を対象の口内に入れて、綿製の先端によって頬の内側を30秒間にわたって擦った。消毒綿を滅菌チューブに入れて、さらに処理をするために密閉した。
V60L−アッセイ法#C751905410
D84E−アッセイ法#C751905520
V92M−アッセイ法#C203340520
R142H−アッセイ法#C2754163410
R151C−アッセイ法#C203340420。
フォワードプライマー MC1R−294:CGCCCTCATCATCTGCAATG 配列番号9;
リバースプライマー MC1R−294:GGCTGTGGAAGGCGTAGAT 配列番号10;
プローブ1 MC1R−294V1 VIC:CCATCATCGACCCCCT 配列番号11;
プローブ2 MC1R−294M1 FAM:CCATCATCCACCCCCT 配列番号12
が、D294Hの対立遺伝子のバリアントの検出に使用された。
背景:
UVBは、UVへの過剰なばくろの発生を示す視覚的な手がかりである紅斑(日焼け)を引き起こす、UVRのスペクトルである。紅斑の頻度および重症度は、日光から保護する個体の習慣の成果の指標としてしばしば使用される。しかし、現在、UVAが皮膚損傷およびDNA損傷にの原因になることが知られているが、日焼け止めおよび日焼け止めクリームにUVAを遮断するための薬剤が含められたのは、最近のことである。したがって、日焼け止めを使っている個体は、紅斑を誘導するUVBの作用から自身を保護しているが、個体が他の方法を有するときよりも、UVAの変異誘発作用に対してはるかに長くばくろを受けているのであろう、という状況が考えられる。この状態の個体は、日焼け止めを使用していることを自己申告するだろうし、保健医療の提供者は、その患者がUVAから実際に保護されておらず、根本的な危険性が依然として非常に高くあり得る場合に、UVRによる損傷を防止するための対策が取られたと誤って評価するだろう。
日光に関する望ましくない習慣、または有効ではない保護方法を特定における、mtDNAの欠失の分析の有用性が、年齢および肌の色の近い2人の個体の結果によって示される。患者202は日焼け止めを全く使用しなかった。一方で、患者225は、日焼け止めを効果的に使用した。2人の損傷のレベルはこの行動を反映しており、患者202は、患者225と比べて3895bpの欠失がおよそ10倍の量であり、UVRへのばくろによる高いレベルのDNA損傷を示している(CTの3の差は、標的の量における10倍の差に等しい)。これらの2人の個体の表現型は、UVRに関連する皮膚損傷に対する危険性が同等であるか、または等しいことを示しているが、3895bpの欠失を非侵襲的な消毒綿による回収と組み合わせると、行動の差(例えば日焼け止めの使用)におそらく起因する、患者202がより大きな危険性を有していることを実証できる。
日光の保護計画の有効性を評価する代理物としてUVRと関連する3895バイオマーカー用いたDNA損傷の監視、およびMC1Rのバリアントの状態の決定の監視を組み合わせた有用性を以下に示す。以下に示されているのは、同様に日焼け止めを使用している、年齢および肌の色の近い2人の患者が、おそらく異なるMC1R遺伝子型の副産物として、異なるレベルのDNA損傷を受けている場合である。患者300は、UVRの皮膚への損傷作用の受けやすさの増大に関連するバリアントを有していない。一方、患者303は、92位アミノ酸に1つのバリアントを有している。これらの患者は表現の上では非常に近く、フィッツパトリックの光反応性の分類の段階について同程度を記録する(分類3)が、増大した作用の受け易さが、MC1Rのバリアントを有している患者において、MC1Rのバリアントを有していない患者と比べて、DNAの損傷レベルが3倍になって反映されている(CTの1の差は、標的の量においておよそ3倍である)。
UVRに対するばくろを評価するためのミトコンドリアマーカーと組み合わせた低侵襲的な試料の回収手順を利用する、付加的なツールが提供される。当該ツールは、顔または頭(例えば、眉隆線の周辺または耳朶)の皮膚組織を小さな内径の針(28ゲージ)を用いて回収すること、微小核を溶液中に排出させること、核酸の抽出を実施すること、およびUVRによる損傷(例えば3895bpの欠失)と関連するミトコンドリア標的の量を測定することによって提供される(実施例1を参照)。それから、この結果は、複数の結果のデータベースと比較され、3895bpの欠失レベルに基づいて年齢コホートに分類される。データベースは、0歳から80歳までを5年の区間に分けた複数の個体において、3895bpの欠失レベルを測定すること、各間隔に対するクラスタまたは平均値を見出だすこと、異常値を除去すること、および3895bpの欠失レベルの範囲を年齢の範囲に関連付けることによって作製される。例えば、21.5〜23.5のCT値は、45歳〜65歳の年齢の範囲に関連し得る。それから、個体の試験の結果は、実年齢と比較されて、当該結果がそれらの年齢の範囲における他の個体より高い光損傷または低い光損傷を有するか否かを決定し、それらの結果に基づいて光老化度を試験の結果に割り当てる。
Claims (8)
- UVRによる損傷に対する対象の皮膚の状態および遺伝的な素因を決定するための方法であって、
(a)ミトコンドリアDNA(mtDNA)の異常を検出する工程;および
(b)メラノコルチン1受容体(MC1R)のバリアントの1つ以上を検出する工程を包含しており、
上記異常は、mtDNAゲノムの546〜4444ヌクレオチドに広がる3895塩基対(bp)の欠失であり、
上記バリアントの1つ以上は、D84E、R142H、R151C、R160H、D294H、V60L、またはV92Mであり、
上記mtDNAの異常およびメラノコルチン1受容体(MC1R)のバリアントの1つ以上は、対象からの皮膚試料において検出され、
上記mtDNAの異常およびメラノコルチン1受容体(MC1R)のバリアントの1つ以上の両方が検出された場合に、上記対象の皮膚状態は悪化しており、かつ対象のUVR損傷の遺伝的な素因は高いと判断される、方法。 - 上記皮膚試料が、非侵襲的または低侵襲的な皮膚の回収手法から得られている、請求項1に記載の方法。
- 上記皮膚試料が、消毒綿、コットンチップスワップ、皮膚組織の微小核を回収するための小さな内径の針、またはこれらの組合せを含んでいる皮膚の回収手法から得られている、請求項2に記載の方法。
- 上記皮膚試料が、上記対象の真皮または上皮の層から得られている、請求項3に記載の方法。
- 上記皮膚試料が、踵、鼻、内腕、耳、口、頭皮、胸部、肩部、殿部、背中、顔面、首の項部、手、頭部またはこれらの組合せから得られている、請求項4に記載の方法。
- (a)ミトコンドリアDNA(mtDNA)の異常を検出し;かつ
(b)メラノコルチン1受容体(MC1R)のバリアントの1つ以上を検出する診断用のキットであって、
上記異常は、mtDNAゲノムの546〜4444ヌクレオチドに広がる3895塩基対(bp)の欠失であり、
上記バリアントの1つ以上は、D84E、R142H、R151C、R160H、D294H、V60L、またはV92Mであり、
上記mtDNAの異常およびメラノコルチン1受容体(MC1R)のバリアントの1つ以上は、対象からの皮膚試料において検出され、
上記mtDNAの異常およびメラノコルチン1受容体(MC1R)のバリアントの1つ以上の両方が検出された場合に、上記対象の皮膚状態は悪化しており、かつ対象のUVR損傷の遺伝的な素因は高いと判断され、
上記キットは、
(i)組織試料を回収するための器具;ならびに
(ii)mtDNAの異常およびMC1Rのバリアントの検出の実施に適したプライマー、プローブ、および試薬を備えている、診断用のキット。 - mtDNA検出用の上記プライマーが、配列番号5および配列番号6から選択される配列によって示される、請求項6に記載の診断用のキット。
- MC1Rのバリアント検出用の上記プライマーが、配列番号9および配列番号10から選択される配列によって示される、請求項6に記載の診断用のキット。
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