ES2952748T3 - Muestra de tejido periférico que contiene células que expresan el 5HTR2C y/o las ADAR como marcadores de la alteración del mecanismo de edición del ARNm de 5HTR2C y sus aplicaciones - Google Patents
Muestra de tejido periférico que contiene células que expresan el 5HTR2C y/o las ADAR como marcadores de la alteración del mecanismo de edición del ARNm de 5HTR2C y sus aplicaciones Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a un método in vitro para predecir una patología relacionada con una alteración del mecanismo de edición de ARNm de ADAR dependiente de la edición de ARNm A a I, particularmente el receptor de serotonina 2C (5HTR2C), en un paciente a partir de una muestra de tejido periférico. que contiene células que expresan dicho ARNm, como el ARNm de 5HTR2C, y/o adenosina desaminasas que actúan sobre el ARN (ADAR), como una muestra de tejido de piel y/o sangre. La presente invención comprende además un método para identificar si un agente es capaz de modificar in vivo la edición del ARNm de 5HTR2C en el tejido cerebral o de controlar la eficacia de un fármaco destinado a prevenir o tratar una patología relacionada con una alteración del mecanismo. del ARNm de 5HTR2C que edita tejido cerebral, comprendiendo estos métodos la implementación de dichos marcadores de tejido periféricos. En un aspecto particular, la presente invención se refiere a métodos en los que la tasa o perfil de edición del ARNm de 5HTR2C, cuando es necesario, se determina mediante un método de polimorfismo de conformación monocatenario (SSCP) después de la amplificación mediante una PCR, preferiblemente mediante una PCR anidada. del fragmento de ARNm específico que contiene los sitios de edición, permitiendo, en determinadas condiciones analíticas, obtener la velocidad de edición y/o el perfil de este ARNm de 5HTR2C editado a partir de dicho tejido periférico. Finalmente, la invención se refiere a cebadores de ácido nucleico particulares implementados en dicha PCR anidada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Muestra de tejido periférico que contiene células que expresan el 5htr2c y/o las adar como marcadores de la alteración del mecanismo de edición del arnm de 5htr2c y sus aplicaciones
La presente invención se refiere a un método in vitro para predecir una patología relacionada con una alteración del mecanismo de edición de ARNm de A a I dependiente de ADAR, particularmente el receptor de serotonina 2C (5HTR2C), en un paciente a partir de una muestra de tejido periférico que contiene células que expresan dicho ARNm, tal como el ARNm de 5HTR2C, y/o adenosina desaminasas que actúan sobre el ARN (ADAR, siglas del inglés adenosine deaminases acting on RNA), tal como una muestra de tejido de piel y/o sangre. La presente invención comprende además un método para identificar si un agente es capaz de modificar in vivo la edición del ARNm de 5HTR2C en tejido cerebral o de controlar la eficacia de un fármaco destinado a prevenir o tratar una patología relacionada con una alteración del mecanismo de edición del ARNm de 5HTR2C en tejido cerebral, comprendiendo estos métodos la implementación de dichos marcadores de tejido periférico. En un aspecto particular, la presente invención se refiere a dichos métodos en donde la velocidad o el perfil de edición del ARNm de 5HTR2C, cuando es necesario, se determina mediante un método de polimorfismo de conformación de cadena sencilla (SSCP, single strand conformation polymorphism) después de la amplificación mediante una PCR, preferiblemente mediante una PCR anidada, del fragmento de ARNm específico que contiene los sitios de edición, lo que permite, en determinadas condiciones analíticas, obtener la velocidad y/o el perfil de edición de este ARNm de 5HTR2C editado a partir de dicho tejido periférico. Finalmente, la invención se refiere a cebadores de ácido nucleico particulares implementados en dicha PCR anidada.
Estudios de asociación genética, análisis realizados en ratones con genes inactivados (knockout) y en autopsias, han sugerido la implicación del receptor de serotonina 2C (5HTR2C) en trastornos neuropsiquiátricos. En primer lugar, un polimorfismo alélico funcional (Cys23Ser) de 5HTR2C está asociado a depresión y trastorno bipolar (Lerer et al., 2001, Mol. Psychiatry, 6:579-585). En segundo lugar, los ratones que carecen del receptor de serotonina 5HT2C presentan convulsiones espontáneas, deterioro cognitivo y control anómalo del comportamiento alimentario (Tecott et al., 1995, Nature, 374:542-546). Estos animales también son hipersensibles al estrés repetido (Chougreen et al., 2003, Physiol. Behav., 79:217-226). En tercer lugar, en cerebros cadavéricos de pacientes afectados por trastorno bipolar o esquizofrenia, la expresión de ARN del receptor de serotonina 5-HT2C está regulada negativamente (Iwamoto et al., 2004, MoI. Psychiatry, 9:406-416; Castensson et al., 2003, Biol. Psychiatry, 54:1212-1221).
También se cree que la edición de ARN de 5HTR2C está implicada en la fisiopatología de los trastornos mentales y la acción de los antidepresivos (Seeburg, 2002, Neuron, 35:17-20). Se editan cinco residuos de adenosina en una región que codifica el segundo bucle intracelular de 5HTR2C y pueden dar lugar a sustituciones de aminoácidos en tres posiciones diferentes de la secuencia del receptor. La sustitución combinatoria de estos residuos amino genera hasta 24 isoformas de proteína 5HTR2C diferentes con diferentes eficiencias de acoplamiento G (Price et al, 2001, J. Biol. Chem., 276:44663-44668). En ratones, en comparación con las cepas endogámicas C57BL/6 y 129sv, la cepa BALB/c presenta un patrón de edición de pre-ARNm de 5HTR2C neocortical del prosencéfalo basal diferente que puede ser la base de su diferencia en la reactividad al estrés. Además, los ratones BALB/c presentan cambios inducidos por estrés en la edición de pre-ARNm de 5HTR2C que se asemejan a los detectados en cerebros de víctimas de suicidio por depresión (Englander et al., 2005, J. Neurosci., 25:648-651). En realidad, en cerebros cadavéricos, se ha informado de la edición alterada del ARN de 5HTR2C en pacientes con esquizofrenia, depresión y en los que se suicidaron (Niswender et al., 2001, Neuropsychopharmacology, 24:478-491; Sodhi et al., 2001, Mol. Psychiatry, 6:373-379; Gurevich et al., 2002, Neuron, 34:349-356). Además, el interferón se usa en el tratamiento de la hepatitis C, pero los síntomas de depresión a menudo aparecen como un efecto secundario de esta molécula en los pacientes y Yang et al. han demostrado que esta molécula altera fuertemente la edición de 5HTR2C (véase la ref. en Tohda et al., 2006, J. Pharmacol. Sci., 100, 427-432).
Estudios previos han demostrado que el 5HTR2C se expresa principalmente en el cerebro, particularmente en el plexo coroideo, la corteza prefrontal, las áreas límbicas, los ganglios basales y el hipotálamo (Tohda et al., 1996, Neurosci. Res., 24:189-193; Julius et al., 1988, 241 :558-564; Pasqualetti et al., 1999, Neuroscience, 92:601-611). Este patrón de expresión específico del cerebro limita las investigaciones de las posibles relaciones existentes entre la edición del ARN de 5HTR2C y el estado psiquiátrico, a estudios de autopsia. En busca de tejidos adquiribles más fácilmente, que posiblemente reflejen el estado de edición de HTR2C en el SNC y permitan el análisis cuantitativo en pacientes con diferentes estados psiquiátricos, Marazziti y colaboradores han detectado la presencia de ARNm de 5HTR2C en linfocitos en reposo (Marazziti et al., 2001, Neuropsychobiology, 43:123-126). Por desgracia, en estas células, el nivel de expresión de 5HTR2C, según lo revelado por RT-PCR / transferencia de Southern, es demasiado bajo para un análisis de edición de ARN cuantitativo adicional.
Recientemente, Slominski y colaboradores han demostrado que la piel humana y las células derivadas de piel cultivadas tienen la capacidad de transformar el L-triptófano en serotonina y metabolizar la serotonina en N-acetil-serotonina y melatonina (Slominski et al, 2002, FASEB J., 16:896-898). Además, han probado mediante RT-PCR anidada la expresión de genes que codifican los receptores de esta ruta metabólica serotoninérgica/melatoninérgica cutánea. La piel humana completa y las células de piel cultivadas normales y patológicas expresan predominantemente genes que codifican las isoformas 5-HT2B y 5HT7 del receptor de serotonina. La expresión de otras isoformas de receptores de serotonina es menos prevalente y rara vez se detecta 5HTR2C (Slominski et al., 2003, J. Cell. Phys., 196:144-153).
También se pueden citar los siguientes documentos:
el documento WO2006032859 (A2) (Bruinvels Anne T et al.) describe métodos para determinar si un paciente diagnosticado con esquizofrenia, o que padece comportamiento suicida o deterioro cognitivo leve, es adecuado para el tratamiento con un antagonista del receptor 5-HT2C, y los usos asociados de antagonistas del receptor 5-HT2C.
El documento WO2006134128 (A2) (Pohlner Johannes et al.) describe una desregulación del gen ADARB2 y sus productos proteicos en pacientes con enfermedad de Alzheimer. Describe métodos para diagnosticar y pronosticar la enfermedad de Alzheimer en un sujeto, y para determinar si un sujeto tiene un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer.
El documento WO2005087949 (A1) (Levanon Erez et al.) describe un método para detectar un sitio de edición de ARN y métodos de uso y ensayos del mismo. Se describe que la edición de ARN por miembros de la familia ADAR específica de ARN bicatenario conduce a la conversión específica de sitio de adenosina en inosina (A a I) en los ARN mensajeros precursores1. Se cree que la edición mediante las ADAR se produce en todos los metazoos y que es esencial para el desarrollo de los mamíferos y la cuantificación de la inosina en el ARN total sugiere que la edición afecta a una fracción mucho mayor del transcriptoma de los mamíferos.
Weidong Yang et al; (Brain Res Mol Brain Res. 29 de abril de 2004;124(1):70-8., describen que miembros de la familia de genes ADAR están implicados en un tipo de edición de ARN que convierte residuos de adenosina en inosina. También se describe que la edición de ARN puede desempeñar un papel en varios procesos farmacológicos y de comportamiento en los que la plasticidad serotoninérgica está mediada por 5-HT(2C)R. Los autores examinaron los efectos del IFN-alfa en la edición del ARN en líneas celulares de glioblastoma humano, que expresan ARNm de 5-HT(2C)R, apoyando la hipótesis de que la edición del ARNm de 5-HT(2C)R tiene una relevancia causal en la fisiopatología de la depresión asociada a la terapia con citocinas.
Olga A Sergeeva et al; (Cell Mol Neurobiol. agosto de 2007;27(5):669-80) describen que la edición de pre-ARNm de los receptores (R) de serotonina 2C (5-HT2c) y glutamato (Glu) influye en funciones cerebrales superiores y estados patológicos tales como la epilepsia, la esclerosis lateral amiotrófica y la depresión. Los autores describen que el ARNm de 5-HT2cR siempre se editó en A, en la mayoría de las células en los sitios B y se editó de forma variable en los sitios E, C y D. Se encontró una correlación negativa entre la edición de los sitios C y D. Indican que otros factores/enzimas además de ADAR deben controlar o influir en 5-HT2cR y que estos factores varían entre individuos y podrían ser predictores de enfermedades psiquiátricas.
Claudia Schmauss (Neuroscientist. octubre de 2003;9(5):419) describe que los transcritos del gen que codifica el receptor de serotonina 2C se modifican mediante la edición del ARN, y que los estudios en ratones revelaron que la edición del pre-ARNm de 5-HT2C está regulada de manera dependiente de la serotonina, y en estudios de autopsia de tejidos cerebrales de pacientes con esquizofrenia y depresión mayor, se descubrieron distintas alteraciones específicas de sitio de esta edición en la corteza prefrontal. El autor describe que las alteraciones más complejas en la edición de pre-ARNm de 5-HT2C se encontraron en cerebros de víctimas de suicidio por depresión. En estos cerebros, las isoformas del receptor 5-HT2C con función reducida se expresan a niveles significativamente mayores, lo que sugiere que la regulación de la edición por parte de la serotonina sináptica es defectuosa.
Shin Kwak et al. (J Mol Med (Berl). febrero de 2005;83(2):110-20), describe que una hipótesis plausible para la muerte neuronal selectiva en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) esporádica es la excitotoxicidad mediada por receptores de alfaamino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropionato (AMPA), que son un subtipo de receptores de glutamato ionotrópicos cuyas propiedades (GluR2) se generan postranscripcionalmente mediante la edición del ARN en el sitio Q/R. Los autores indican que es probable que el mecanismo molecular subyacente a la deficiencia en la edición del ARN sea una reducción de la actividad de ADAR2, y que la restauración de esta actividad enzimática en las neuronas motoras de la ELA puede abrir la nueva estrategia para la terapia específica de la ELA.
Determinados miembros de la familia de genes ADAR (adenosina desaminasas que actúan sobre el ARN) están involucrados en un tipo de edición de ARN que convierte los residuos de adenosina en inosina. El proceso de edición de ARN es un fenómeno generalizado en eucariotas que conduce a cambios postranscripcionales de bases en el ARNm. En los mamíferos, se ha identificado un número creciente de genes que experimentan un tipo de edición de ARN que se caracteriza por la modificación selectiva de sitio de adenosina a inosina.
Entre los sustratos de edición A a I se encuentran los transcritos específicos de cerebro que codifican los receptores de glutamato tipo AMPA (tales como GluR2 y GluR4) y los receptores de serotonina acoplados a proteína G (tales como 5HTR2C). En la subunidad B de GIuR (GIuR-B), una única posición de edición (el sitio Q/R) controla la permeabilidad al Ca2+ del canal iónico, mientras que otra posición (el sitio R/G) regula la cinética de desensibilización del receptor. Esta propiedad de los receptores AMPA es fundamental para el funcionamiento normal del cerebro. Debido a la importancia de la edición precisa del ARN para la función cerebral normal, la desregulación de la actividad de edición puede influir en la progresión de procesos fisiopatológicos tales como las enfermedades neurodegenerativas o la tumorigénesis (epilepsia cognitiva, tumores, sueño, vigilia, trastornos del estado de ánimo, trastornos de la alimentación (Maas S et al. (1996) J. Biol. Chem 271, 12221 -26; Sergeeva OA et al. (2007) Cell MoI Neurobiol. 27:669-680.
Otro sustrato de edición A a I de ADAR que se ha identificado a nivel de células T como una isoenzima de fosfodiesterasas es la fosfodiesterasa 8Al. Se han identificado de 6 a 7 sitios de edición que podrían estar modulados en estado patológico (lupus eritematoso) y después de la acción del fármaco (interferón alfa).
Es importante señalar que esta isoenzima está presente en el cerebro (OrIowski RJ et al, 8A1 gene transcripts of systemic lupus erythematosus T lymphocytes. Immunology 2008 en prensa; Wang P et al., phosphodiesterase 8 A (PDEA8) splice variants: cloning, gene organization and tissue distribution. (2001) Gene 280183-194).
Entre estos sustratos específicos de cerebro de ADAR, la edición A a I del ARNm de 5HTR2C conduce al reemplazo de tres residuos de aminoácidos ubicados dentro del dominio del bucle II intracelular, lo que tiene como resultado alteraciones drásticas en las funciones de acoplamiento de la proteína G del receptor (Yang W et al., Brain Res MoI Brain Res. 2004, 124(l):70-78). Se han clonado a partir de mamíferos cuatro enzimas de edición de ARN de A a I, denominadas ADAR1, ADAR2, ADAR3 y ADAT1. Las isoformas de ADAR1 y ADAR2 se expresan ampliamente en una diversidad de células y tejidos con la expresión más alta en el cerebro y el bazo y son los ADAR esenciales involucrados en la edición del ARNm de 5HTR2C (ADAR 3 se identificó únicamente en el cerebro y su actividad desaminasa aún no se ha establecido y ADATI se dirige al ARNt). El ARNm de 5HTR2C se edita en cinco residuos de adenosina poco separados (denominados sitios de edición A, B, C, D y E), lo que permite la generación de 32 variantes de ARNm diferentes y 24 isoformas de proteína diferentes del receptor que varían desde Ilel56-Asnl58-Ilel6O (INI) sin editar a la isoforma Vall56-Glyl58-Vall60 (VGV) completamente editada. Se sabe que la isoforma ADAR1 está involucrada en los sitios de edición A y B, tanto ADAR1 como ADAR2 en los sitios de edición E y C, y ADAR2 sola en el sitio de edición D (Dracheva et al., Molecular Psychiatry, 2007, 1 -10).
Se sabe que el interferón-alfa (IFN-alfa) a menudo causa depresión severa en pacientes tratados por hepatitis viral crónica y ciertos tumores malignos. Se han observado los efectos del IFN-alfa sobre la edición del ARN en líneas celulares de glioblastoma humano (Yang et al., Beyond the Identification of Transcribed Sequences: Functional, Evolutionary and Expression Analysis, 12th International Workshop, 25-28 de octubre, 2002, Washington, DC, Intracellular Trafficking of A Few Inflammation-Inducible ADAR1 Isoform). También se ha observado, in vivo en el ratón Balb/c, que la administración de interferón alfa, que se conoce que es un potente activador de la expresión de ADAR1 150 in vitro en líneas celulares de glioblastoma humano (Yang W. et al., 2004 ), induce también cambios posteriores en el perfil de edición del 5HTR2C en la corteza prefrontal dorsal.
Para facilitar parámetros predictivos rápidos y validados de modificaciones generales del proceso de edición, sigue siendo deseable:
- proporcionar un método que permita extrapolar alteraciones de la velocidad o perfil de edición de estos sustratos de ADAR, particularmente los receptores de glutamato tipo AMPA o el ARNm de 5HTR2C, en tejido cerebral humano a partir de una muestra biológica que puede obtenerse fácilmente del paciente a analizar, y en donde se preferirá que la velocidad o perfil de edición de estos sustratos de ADAR determinados en esta muestra biológica pueda correlacionarse con los obtenidos a partir de la muestra biológica de cerebro; y/o
- identificar un marcador presente en una muestra biológica que se puede obtener fácilmente del paciente a analizar, en donde el análisis cualitativo y/o cuantitativo de dicho marcador en dicha muestra se puede correlacionar con una alteración de la velocidad o perfil de edición de estos sustratos de ADAR en el tejido cerebral, pudiendo usarse dicha muestra biológica y el marcador asociado como un indicador de la edición del receptor observada en el SNC (sistema nervioso central).
Este es justamente el objeto de la presente invención.
La presente invención describe el uso de o un método que implementa una sola muestra biológica o dos muestras biológicas diferentes seleccionadas del grupo de muestras biológicas que consisten en tejidos periféricos que contienen células para evaluar la alteración patológica de una edición de ARNm en el cerebro y en donde dicha edición de ARNm es una edición de ARNm de A a I dependiente de ADAR.
La presente invención también describe el uso o la implementación de un método como una muestra indicadora única o asociada para evaluar la alteración patológica de dicha edición de ARNm en el cerebro, de:
- un primer tejido periférico que contiene células, tal como una muestra de piel de un mamífero; o/y
- un segundo tejido periférico que contiene células, tal como una muestra de sangre de un mamífero.
En una realización preferida, dicho ARNm editado cuya edición es una edición de ARNm de A a I dependiente de ADAR, es un ARNm seleccionado del grupo que consiste en el ARNm que codifica un receptor de glutamato de tipo AMPA, un receptor de serotonina acoplado a proteína G y la PDEA8.
En una realización preferida, la evaluación de la alteración patológica de la edición del ARNm en el cerebro se determina por:
- la o las velocidades de edición o el perfil de las formas editadas de dicho ARNm en dicha muestra biológica periférica; y/o
- la naturaleza y/o la cantidad de las ADAR expresadas en dicha muestra biológica periférica.
En una realización más preferida, dicho ARNm que tiene una edición de ARNm de A a I dependiente de ADAR es el ARNm de 5HTR2C.
Los inventores han descubierto que la medida de los cambios en la expresión de ADAR en la periferia (tal como en la sangre) podría predecir una alteración importante de la edición en el cerebro.
Los inventores han demostrado, por ejemplo, que la determinación de la edición del ARNm de 5HTR2C y/o la determinación de las actividades de ADAR expresadas en tejido periférico que contiene células que expresan 5HTR2C y/o ADAR, tal como muestras de piel y/o tejido sanguíneo, pueden utilizarse como marcadores indicadores de la alteración del mecanismo de edición del ARNm de 5HTR2C en el tejido cerebral y, por tanto, para evaluar la alteración patológica de la ruta metabólica de múltiples etapas del sistema serotoninérgico expresado en el SNC.
Los inventores han demostrado, por ejemplo, que las ADAR esenciales responsables de la edición del 5HTR2C de mamífero, que son las dos isoformas de ADAR1 (denominadas en lo sucesivo “ADAR1-150” y “ADAR1-110” para la proteína ADAR1 de 150 kD y ADAR1 de 110 kD) y ADAR2, se expresan en cantidad suficiente en dicho tejido periférico que contiene células, particularmente en los glóbulos blancos de muestras de sangre, para ser analizadas cualitativa y/o cuantitativamente y para utilizar este tejido periférico que contiene células y las ADAR como muestra indicadora y marcador para evaluar la alteración patológica de la ruta metabólica de múltiples etapas del sistema serotoninérgico que se expresa en el SNC.
También han demostrado que, contrariamente a lo que se ha indicado en la técnica anterior para muestras de piel (Slominski et al, 2003, J. Cell Phy., 196, 144-153), ciertas células que contienen tejidos periféricos, tales como las células de muestras de piel, expresan suficiente ARNm de 5HTR2C como para ser detectado y analizado para evaluar la velocidad o perfil de edición del ARNm de 5HTR2C y, opcionalmente, la naturaleza y/o la cantidad de ADAR contenidas.
En consecuencia, la determinación de una expresión alterada o normal (en naturaleza y/o en cantidad) de las enzimas ADAR, en particular las isoformas ADAR1 (en particular las “ADAR1-150” y “ADAR1-110” ) y ADAR2, en tejido periférico que contiene células que expresan estas ADAR, tales como muestras de piel y/o tejido sanguíneo que contienen células; y/o la determinación de la tasa de edición del ARNm de 5HTR2C o el perfil de las formas editadas del ARNm de 5HTR2C en tejido periférico que contiene células que expresan el ARNm de 5HTR2C, tal como en muestras de piel y/o tejido sanguíneo que contienen células, pueden usarse como marcadores indicadores de la alteración del mecanismo de edición del ARNm de 5HTR2C en el tejido cerebral y, por lo tanto, para evaluar la alteración patológica de la ruta metabólica de múltiples etapas del sistema serotoninérgico expresado en el SNC de un paciente.
Finalmente, la determinación de una expresión alterada o normal de las enzimas ADAR, sola o en asociación con la determinación de la tasa de edición del ARNm de 5HTR2C o el perfil de las formas editadas del ARNm de 5HTR2C, en una o más muestras de tejido periférico que contienen células, tal como en muestras de piel y/o tejido sanguíneo que contienen células, se pueden utilizar como muestra(s) indicadoras y marcadores:
- para identificar in vitro si un paciente presenta una patología o está en riesgo de desarrollar una patología relacionada con una alteración del mecanismo de edición del mRNA del receptor de serotonina 2C (5HTR2C);
- para determinar in vitro si una patología que presenta un paciente está relacionada con una alteración del mecanismo de edición del mRNA del 5HTR2C;
- para seleccionar un compuesto capaz de modular la edición del ARNm de 5HTR2C en el tejido cerebral, preferiblemente un compuesto capaz de restaurar la edición normal del ARNm de 5HTR2C en el tejido cerebral de un paciente que lo necesite; o
- para determinar in vitro en un mamífero la eficacia de un fármaco utilizado para la prevención o para el tratamiento de una patología relacionada con una alteración del mecanismo de edición del mRNA del 5HTR2C.
En el presente documento, por “tejido periférico” que contiene células, se entiende que se refiere a un tejido que no es tejido cerebral y que es preferiblemente fácil de extraer, tal como en general una biopsia de un órgano o tejido fácil de extraer, una muestra de piel, una muestra de sangre entera, una muestra de orina, una muestra de saliva, una muestra de tejido interno de la mejilla, una citología exfoliativa o un frotis de la vagina o del interior de la mejilla. La muestra de piel y/o sangre que contiene células es la muestra de tejido periférico preferida que se implementa en la presente invención.
Mediante la asociación de estos dos marcadores (ADAR y edición de ARNm de 5HTR2C), se pretende que la expresión de ADAR se pueda analizar en el mismo tipo de células que las células utilizadas para la determinación de la edición de ARNm
de 5HTR2C, por ejemplo, en muestras de células de la piel, o que la expresión de ADAR se pueda analizar en un tipo de células, por ejemplo, en una muestra de células sanguíneas, y la determinación de la edición del ARNm de 5HTR2C se realiza en otro tipo de células, por ejemplo, en una muestra de células de la piel.
Cada marcador también se puede usar solo si la determinación de este marcador es suficiente para correlacionar su expresión en muestras de tejido periférico que contienen células, tal como en muestras de piel y/o tejido sanguíneo que contienen células, con la tasa o perfil de edición del ARNm de 5HTR2C en tejido cerebral.
Por ejemplo, la determinación de una expresión alterada o normal de las ADAR en células de muestra de tejido sanguíneo, tales como los glóbulos blancos, puede usarse sola como marcador indicador de la alteración del mecanismo de edición del ARNm de 5HTR2C en el tejido cerebral si la correlación obtenida es suficiente con un solo marcador.
Como otro ejemplo, la determinación de la tasa de edición del ARNm de 5HTR2C o el perfil de las formas editadas del ARNm de 5HTR2C o la determinación de una expresión alterada o normal de las ADAR en una muestra de tejido de piel que contiene células que expresan el ARNm de 5HTR2C y las ADAR, también puede ser solo un marcador indicador de la alteración del mecanismo de edición del ARNm de 5HTR2C en el cerebro si la correlación obtenida es suficiente con el único marcador utilizado.
Con respecto al método para seleccionar compuestos capaces de modular la edición del ARNm de 5HTR2C, las células del tejido periférico que expresan el ARNm de 5HTR2C y/o las ADAR para evaluar y seleccionar dichos compuestos, pueden ser líneas celulares o líneas celulares recombinantes en donde la expresión del ARNm de 5HTR2C y/o las ADAR se han alterado para, por ejemplo, imitar la expresión patológica de este ARNm de 5HTR2C y/o las ADAR. Para este aspecto, pueden utilizarse particularmente células o líneas celulares recombinantes de la piel o la sangre.
La presente invención comprende un método que implementa una sola muestra biológica seleccionada del grupo de muestras biológicas que consisten en tejidos periféricos que contienen células para evaluar la alteración patológica de una edición de ARNm en el cerebro y en donde dicha edición de ARNm es una edición de ARNm de A a I dependiente de ADAR; - en donde dicho tejido periférico que contiene células se selecciona del grupo que consiste en muestra de sangre entera o muestra de sangre que contiene capa leucoplaquetaria;
- en donde dicho ARNm editado es ARNm de 5HTR2C;
- para evaluar la alteración patológica de la edición del mRNA de 5HTR2C en el cerebro mediante la determinación de los productos de expresión de ADAR, las isoformas 150 y/o 110 de ADAR1, y los productos de expresión del gen ADAR2 expresados en dicha muestra.
La presente invención también comprende un método para identificar in vitro si un paciente presenta una patología o está en riesgo de desarrollar una patología relacionada con una alteración del mecanismo de edición del mRNA del 5HTR2C, en donde este método comprende las siguientes etapas de:
a) determinar los productos de expresión de ADAR, las isoformas 150 y/o 110 de ADAR1, y los productos de expresión del gen ADAR2 en una muestra biológica que contiene células sanguíneas obtenidas del paciente a analizar; b) identificar si dicho paciente presenta o está en riesgo de desarrollar dicha patología comparando la cantidad de las ADAR expresadas en dicha muestra con el perfil de las ADAR expresadas obtenido para pacientes normales o para pacientes que presentan patologías relacionadas con una alteración del mecanismo de esta edición de ARNm.
En una realización preferida, dicha patología se selecciona del grupo que consiste en trastornos mentales, esquizofrenia, depresión, suicidio por depresión o comportamiento alimentario anómalo.
En una realización preferida, dicha patología se selecciona del grupo que consiste en depresión y comportamiento suicida por depresión.
La presente invención también comprende un método para determinar in vitro si una patología que presenta un paciente está relacionada con una alteración del mecanismo de edición del mRNA de 5HTR2C, en donde este método comprende las siguientes etapas de:
a) determinar la cantidad de las ADAR expresadas en una muestra biológica que contiene células sanguíneas obtenidas del paciente;
b) identificar si dicho paciente presenta o está en riesgo de desarrollar dicha patología comparando la cantidad de las ADAR expresadas en dicha muestra con el perfil de las ADAR expresadas obtenido a partir de pacientes normales o a partir de pacientes que presentan patologías que se conoce que no están relacionadas con una alteración del mecanismo de esta edición de ARNm.
La presente invención también comprende un método para identificar in vitro un agente que modula in vivo la edición del ARNm de 5HTR2C en un mamífero, que comprende la siguiente etapa de:
- comparar los productos de expresión de ADAR, las isoformas 150 y/o 110 de ADAR1, y los productos de expresión del gen ADAR2 en una muestra biológica que contiene células sanguíneas obtenidas del mamífero después del tratamiento con dicho agente con los productos de expresión de ADAR obtenidos a partir de la muestra de sangre de control obtenida de dicho mamífero.
La presente invención también comprende un método para identificar in vitro un agente que modula la edición del ARNm de 5HTR2C en un mamífero, que comprende las siguientes etapas de:
a) poner en contacto una muestra biológica que contiene una línea de células sanguíneas de mamífero en presencia de un modulador candidato de dicha edición de ARNm de 5HTR2C; y
b) determinar los efectos de dicho modulador sobre los productos de expresión de ADAR, las isoformas 150 y/o 110 de ADAR1, y los productos de expresión del gen ADAR2 expresados en dicha muestra de células sanguíneas, comparando la cantidad de las ADAR expresadas obtenidas a partir de la muestra biológica de la etapa a) con la cantidad de las ADAR expresadas obtenidas a partir de una muestra de tejido de control de células sanguíneas de dicho mamífero.
La presente invención también comprende un método para determinar in vitro en un paciente la eficacia de un fármaco utilizado para la prevención o para el tratamiento de una patología relacionada con una alteración del mecanismo de edición del mRNA del 5HTR2C, que comprende las siguientes etapas de:
a) determinar los productos de expresión de ADAR, las isoformas 150 y/o 110 de ADAR1, y los productos de expresión del gen ADAR2 en una muestra de sangre que contiene células sanguíneas obtenidas del paciente; y b) determinar la eficacia de dicho fármaco comparando los productos de expresión de ADAR, las isoformas 150 y/o 110 de ADAR1, y los productos de expresión del gen ADAR2 obtenidos en la etapa a) con los productos de expresión de ADAR obtenidos del paciente durante y/o después del tratamiento con dicho fármaco,
en donde una modulación de los productos de expresión de ADAR expresados que dé lugar a productos de expresión de ADAR expresados parecidos o iguales a los observados en pacientes normales, es significativa de la eficacia del tratamiento. La presente invención también comprende un método para determinar si un paciente responde o no a un tratamiento de una patología resultante o provocada por la alteración del mecanismo de edición del mRNA del 5HTR2C, que comprende las siguientes etapas de:
a) determinar los productos de expresión de ADAR, las isoformas 150 y/o 110 de ADAR1, y los productos de expresión del gen ADAR2 en una muestra de sangre que contiene células sanguíneas obtenidas del paciente antes de iniciar el tratamiento;
b) determinar si el paciente responde o no responde al tratamiento observando la modificación de los productos de expresión de ADAR después de un periodo de tratamiento por comparación con la cantidad de productos de expresión de las ADAR obtenidos en la etapa a) antes del inicio del tratamiento.
Este método permite evitar la prolongación innecesaria del período de tratamiento con un fármaco, posibilitando así determinar rápidamente que el paciente no responde a ese fármaco o continuar el tratamiento si el paciente responde a ese fármaco.
La edición es el mecanismo mediante el cual la información contenida en el gen se modifica después de la transcripción. La expresión general “edición de ARNm” incluye la modificación de la secuencia de estos ARNm que da como resultado un cambio, en términos de naturaleza o número, en los aminoácidos incorporados en la proteína durante la traducción, ya no siendo posible deducir la secuencia de la proteína a partir del gen que dirige su síntesis. El pre-ARN mensajero de 5HTR2C puede sufrir una modificación enzimática específica de determinadas adenosinas (A), en la porción de lo que será el ARNm definitivo que dirige la incorporación de los aminoácidos situados en el segundo bucle intracelular de 5HTR2C. De hecho, la parte distal del quinto exón y la parte proximal del quinto intrón del transcrito primario, son capaces de formar una estructura en tallo-bucle posiblemente reconocida por dos enzimas, ADAR1 y ADAR2 (adenosina desaminasa dependiente de ARN bicatenario), que permiten editar el ARN premensajero antes de su corte y empalme. Esta edición se produce por desaminación de As, que luego se convierte en inosina (I). Una vez completado el corte y empalme, la parte del ARNm que contenía las A, que se sometió a la edición, ahora contiene las I. Cuando se traduce el ARNm de 5HTR2C, se cree que las I se leen como G. De hecho, durante la síntesis in vitro del ADNc a partir del ARNm de 5HTR2C que experimentó la desaminación de A a I, la transcriptasa inversa incorpora dC frente a las I, en lugar de las dT que normalmente deberían haberse incorporado frente a las A. En consecuencia, durante la síntesis de la segunda cadena que da como resultado la formación del ADNc bicatenario, se introduce una dG frente a cada dC incorporada en la primera cadena. La secuenciación del ADNc bicatenario así obtenido permite observar la sustitución de las dA por las dG, debido a la desaminación inicial de las A a I en el ARNm que sufre la edición. En consecuencia, la edición del ARNm da como resultado una modificación del
significado de los codones en los que las A se reemplazan por I, por lo que se cree que se leen como G (más específicamente, con respecto a la edición de 5HTR2C humano, véase Fitzgerald et al., Neuropsychopharmacology, 1999, 21 (2S), 82S-90S).
Así, la determinación de una alteración del mecanismo de edición del ARNm del 5HTR2C mediante el control de la velocidad de edición en muestras de piel es también significativa de una alteración de la ruta metabólica de múltiples etapas del sistema serotoninérgico expresado en la piel y que podría utilizarse como indicador del sistema serotoninérgico expresado en el cerebro.
La expresión “ARN editado” pretende indicar, en la presente descripción, cualquier secuencia de ARN en la que al menos una adenosina se ha desaminado a inosina por una adenosina desaminasa.
Por “velocidad de edición” , se pretende designar el porcentaje de cada una de las formas editadas y no editadas del ARNm que puede comprender al menos un sitio de edición, en relación con la cantidad total de las formas editadas o no editadas del ARNm presentes en dicha misma muestra.
* El sitio de edición “ E” también se denomina “C”
En una realización preferida de los métodos según la invención, las células de la piel se seleccionan del grupo formado por queratinocitos, melanocitos, fibroblastos, células de Langerhans y células de Merkel, y el tejido cutáneo se selecciona del grupo formado por epidermis y dermis.
También se describe un kit para la determinación de la velocidad o perfil de edición del ARNm de 5HTR2C de un mamífero, preferiblemente en seres humanos, en ratas o en ratones, más preferiblemente en seres humanos, en donde dicho kit contiene un ácido nucleico según la invención. En una realización preferida de los métodos de la presente, las células que se seleccionan para determinar, solas o en asociación, la naturaleza y/o la cantidad de las ADAR expresadas, son glóbulos blancos o leucocitos o proceden de la capa leucoplaquetaria de una muestra de sangre entera obtenida después de la centrifugación.
En una realización preferida, en la etapa b) de los métodos de la presente invención, los productos de expresión de ADAR son las isoformas 150 y/o 110 de ADAR1, y los productos de expresión del gen ADAR2, preferiblemente los productos de expresión del gen de ratón, rata o humano que codifica las isoformas 150 kD y/o 110 kD de la proteína ADAR1, y la proteína ADAR2. El ser humano es el más preferido.
La secuencia de ácido nucleico de ARNm que codifica las isoformas 150 kD y 110 kD de la proteína ADAR1, y la secuencia de ácido nucleico de ARNm de ADAR2 que codifica la proteína ADAR2 y su secuencia de aminoácidos, son bien conocidas por los expertos en la materia en seres humanos, ratones o ratas.
Por ejemplo, se pueden citar particularmente las siguientes secuencias representadas en el Genbank con el número de registro:
para ADAR1:
- para ser humano: NM_00l111.3; NM_001025107.1,
- para ratón: NM_019655.2; NM_001038587.2,
para ADAR2:
- para ser humano: NM_001112.2; NM_015833.2; NM_015834.2 y NM_001033049.1,
- para ratón: NM_130895.2; NM_00102483.7; NM_001024838.1; NM_001024840.1 y NM_001024839.1.
En una realización más preferida, en la etapa b), los productos de expresión de ADAR son los ARNm de ADAR.
En una realización preferida, en el método de la presente invención, en la etapa b), la determinación del ARNm de ADAR se realiza mediante un método que comprende las siguientes etapas:
A) extracción de los ARN totales de dichas células de la muestra de sangre, seguida, en su caso, de purificación de los ARNm;
B) transcripción inversa de los RNA extraídos en la etapa A) mediante un cebador oligo dT; y
C) amplificación por PCR de los ADNc obtenidos en la etapa B) utilizando al menos un par de cebadores específicos para cada uno de los ARNm de ADAR a cuantificar y/o analizar cualitativamente.
En una realización preferida, el par de cebadores específicos para la amplificación por PCR del ARNm de ADAR se selecciona del grupo que consiste en:
- - para la amplificación del ARNm de la isoforma 150 de ADAR1 humana:
EXlA 34p Directo: 5 '-GCCTCGCGGGCGCAATGAATCC-S ' (Id. de sec. n.2: 41), EX2
578 m Inverso: 5 '-CTT GCCCTTCTTT GCCAGGGAG-3 ' (Id. de sec. n.2: 42);
- para la amplificación del ARNm de la isoforma 110 de ADAR1 humana:
EXlB 534p Directo: 5 '-CGAGCCATCATGGAGATGCCCTCC-S ' (Id. de sec. n.2: 43),
EX2804 m Inverso: 5 '-CATAGCTGCATCCTGCTTGGCCAC-S ' (Id. de sec. n.2: 44);
- para la amplificación de ARNm de ADAR2 humano:
ADAR21274p Directo: 5 '-GCTGCGCAGTCTGCCCTGGCCGC-S ' (Id. de sec. n.2: 45),
ADAR21486 m Inverso: 5 '-GTCATGACGACTCCAGCCAGCAC-S ' (Id. de sec. n.2: 46);
- - para la amplificación del ARNm de la isoforma 150 de ADAR1 de ratón:
EX1A 19p Directo: 5 '-GTCTCAAGGGTTCAGGGGACCC-S ' (Id. de sec. n.2: 47), EX2
646 m Inverso: 5 '-CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC-S ' (Id. de sec. n.2: 48);
- para la amplificación del ARNm de la isoforma 110 de ADAR1 de ratón: EXlB 72p Directo: 5 '-TCACGAGTGGGCAGCGTCCGAGG-S ' (Id. de sec. n.2: 49), EX2646 m Inverso: 5 '-CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC-S ' (Id. de sec. n.°: 48); y
- para la amplificación de ARNm de ADAR2 de ratón:
EX7 128 Ip Directo: 5 '-GCTGCACAGTCTGCCTTGGCTAC-S ' (Id. de sec. n.2: 50), EX9 1622 m Inverso: 5 '-GCATAAAGAAACCTGAGCAGGGAC-S ' (Id. de sec. n.2: 51);
En una realización preferida, en el método según la presente invención, en la etapa b), los productos de expresión de ADAR son las proteínas ADAR.
Por lo tanto, en una realización preferida de este método, la determinación de las proteínas ADAR se realiza mediante un método que comprende las siguientes etapas:
A) opcionalmente, la extracción de las proteínas totales contenidas en dichas células de la muestra de sangre, seguida, en su caso, de una etapa de purificación de proteínas; y
B) la determinación de la presencia, naturaleza y/o concentración de cada proteína ADAR contenida en dichas células de la muestra de sangre mediante la implementación de anticuerpos capaces de reconocer específicamente dichas proteínas ADAR.
Se puede citar el anticuerpo marcado.
Entre estos anticuerpos que pueden utilizarse para esta detección y/o cuantificación, se pueden citar, aunque no de forma limitativa, los siguientes anticuerpos:
anticuerpo policlonal anti-ADAR1 (H-176) sc-33179 (Santa-Cruz); o
anticuerpo policlonal anti-ADAR2 (H-90) sc-33180 (Santa-Cruz).
Se puede utilizar el método de transferencia de Western o Elisa para analizar o cuantificar la expresión de proteínas específicas en muestras biológicas. Dichos métodos son bien conocidos por los expertos en la materia.
Las transferencias se pueden detectar usando anticuerpos dirigidos específicamente contra diferentes regiones específicas o epítopos de ADAR1-150 o ADAR1-110 y proteína ADAR2 de ratón, ser humano o rata. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales y están marcados si es necesario. Dichos anticuerpos pueden desarrollarse en el laboratorio usando proteína ADAR recombinante o un fragmento de la misma como inmunógeno.
Los siguientes ejemplos, así como las figuras y las leyendas siguientes, se han elegido para proporcionar a los expertos en la materia una descripción completa para poder implementar y utilizar la presente invención.
Leyendas de las figuras
Figura 1: Media (línea negra) de las señales electroforéticas SSCP calculadas a partir de cada señal individual de la corteza cingulada anterior de un grupo de control de sujetos humanos (datos experimentales). También se presenta la curva correspondiente a la media SEM de estas señales (línea verde). Las abscisas representan la base de tiempo de 10000 puntos (6,2 puntos/segundo) y las ordenadas se proporcionan en unidades arbitrarias de fluorescencia después de la normalización de la señal total. La señal presentada corresponde a las cadenas marcadas con FAM (parte izquierda) y VIC (parte derecha). Algunos ejemplos típicos de señales de electroforesis obtenidas con estándares individuales se presentan como negativos en su correspondiente marcaje con FAM y VIC. En las partes izquierda y derecha de la figura, las tablas presentan, aplicadas a un tiempo base único, las posiciones de los diferentes picos de electroforesis principales (máximo) de cada cadena sencilla estándar de una isoforma editada particular marcada con sondas de FAM (izquierda) o VIC (derecha). Se podrían separar dos máximos de picos identificados cuando su intervalo fuera > 15 puntos del tiempo base definido anteriormente. Debe tenerse en cuenta que algunos picos no resueltos del patrón electroforético de una cadena marcada se resuelven a partir de la otra (estos casos se identifican con el mismo color).
Figuras 2A y 2B: Identificación de transcritos de 5-HT2cR en piel humana y de ratón. (A) Se amplificaron ADNc preparados a partir de a Rn poliA+ de párpados humanos (carriles 1-3) mediante una PCR de primera ronda utilizando los dos cebadores específicos PCR9 y PCR10. Luego se realizó una PCR anidada en estos primeros productos con los cebadores PCR1 8 y PCR2 (carriles 6-8). Los productos resultantes se resolvieron en un gel de agarosa al 2 %. Los tamaños esperados de los productos de amplificación son de 250 pb y 127 pb para la primera y la segunda PCR, respectivamente. Se muestran controles negativos (carriles 4 y 9) y positivos (carriles 5 y 10) para cada conjunto de cebadores. M indica un Ladder/marcador de ADN de 100 pb. (B) Se amplificaron ADNc preparados a partir de ARN poliA+ de piel de ratón Balb/c mediante una PCR de primera ronda utilizando los dos cebadores específicos de genes PCR9 y PCR10 (carriles 1-6). Luego se realizó una segunda PCR en estas primeras amplificaciones con los cebadores PCR1 y PCR4 (carriles 9-14). Se muestran controles negativos (carriles 7 y 15) y positivos (carriles 8 y 16) para cada conjunto de cebadores. Los productos resultantes se resolvieron en un gel de agarosa al 2 %. Los tamaños esperados de los productos de amplificación son de 250 pb y 138 pb de longitud para la primera y la segunda PCR, respectivamente. M representa el Ladder/marcador de ADN de 100 pb. Figuras 3A y 3B: Los ARNm de las isoenzimas de las ADAR se identifican claramente en sangre y piel de ratón Balb/c. (A) Se amplificó ADNc preparado a partir de ARN de sangre entera (carril 4) y ARN de piel (carriles 1-3, correspondientes a 3 tiempos diferentes de transcripción inversa, es decir, 30 min, 2 h y 4 h respectivamente) mediante PCR con cebadores específicos de las formas constitutiva (pi 10) e inducible de ADAR1 (μl50). Los productos de amplificación resultantes resueltos en un gel de agarosa al 2 % tienen una longitud de 674 pb (isoforma μl50) y 683 pb (isoforma pi 10), respectivamente. Se muestran los controles negativos (carril 5) y el Ladder/marcador de ADN de 100 pb (M). El contraste potenciado permite la detección de una banda tenue correspondiente a la forma constitutiva de ADAR1 transcrita en células de sangre entera (carril 4, pi 10). (B) Igual que en (A), pero se presentan las amplificaciones de PCR correspondientes a los
transcritos de ADAR2 en piel y sangre entera. Los productos de PCR tienen una longitud de 366 pb. De nuevo, se observa una banda muy tenue correspondiente a la forma constitutiva de ADAR1 en sangre entera (carril 4, pi 10).
Figuras 4A y 4B: Identificación de transcritos inducibles de ADAR1 en leucocitos humanos. (A) Se amplificaron ADNc preparados a partir de ARN total de leucocitos de sangre periférica humana (carril 10) y de bibliotecas normalizadas de fracciones de sangre humana (carriles 1-9) mediante PCR con cebadores específicos para la forma inducible de ADAR1 (pi 50). Los productos resultantes se resolvieron en un gel de agarosa al 2 %. El tamaño esperado del producto de amplificación es de 544 pb. Los carriles 1 y 6; 2 y 7; 3 y 8 corresponden a células mononucleares en reposo y activadas, células CD4+ en reposo y activadas, y células CD8+ en reposo y activadas, respectivamente. Carril 4 y 5: células CD14+ y CD19+ en reposo. Carril 9: células CD19+ activadas. Carril 11: ADNc de placenta humana usado como control. M indica el Ladder/marcador de ADN de 100 pb. Se muestran los controles positivo para PCR (cebadores G3PDH con ADNc de placenta humana, carril 13) y negativos para PCR (carril 12). (B) Duplicado de (A). Los carriles 1-9 son equivalentes a los carriles 1-9 de (A). Carril 10: ADNc de placenta humana.
Figuras 5A y 5B: Identificación de transcritos de ADAR1 pi 10, ADAR1 pi 50 y ADAR2 en la corteza prefrontal dorsal humana, piel y células sanguíneas CD4+ y CD8+.
(A) ADNc de bibliotecas normalizadas de fracciones de sangre CD4+ y CD8+ humanas (carriles 1 y 2); preparadas a partir de ARN total de DPFC (carriles 3 y 4) y de ARN poliA+ de párpado humano (carril 5) se amplificaron mediante PCR utilizando los dos conjuntos específicos de cebadores EXlB 534p/EX2804 m y EXlA 34p/EX2 578 m para ADAR1 pi 10 y ADAR1 pl50 respectivamente. Los productos resultantes se resolvieron en un gel de agarosa al 1,75 %. Los tamaños esperados de los productos de amplificación son 270 pb (ADAR1 pi 10) y 566 pb (ADAR1 p 150). Se muestran controles negativos (carril 6) y positivos (carril 7, ADNc de placenta humana) para cada conjunto de cebadores. M indica un Ladder/marcador de ADN de 100 pb.
(B) Se amplificaron los mismos ADNc que en A) mediante PCR utilizando el conjunto de cebadores específicos de dos genes ADAR21274p/ADAR2 1486 m y G3PDH-FG3PDH-R para ADAR2 y
G3PDH (control positivo) respectivamente. Los productos resultantes se resolvieron en un gel de agarosa al 1,75 % negativo. El tamaño esperado para ADAR2 es de 212 pb.
Figuras 6A-6C: Evolución de la concentración de ADAR1, un ARNm específico medido por QPCR en una muestra de corteza prefrontal (figura 6A), piel (figura 6B) y sangre (figura 6C) después de una inyección IP única de interferón alfa2a de ratón a t cero (20000 UI). El efecto se expresa como el factor de aumento del valor de control normalizado a 1. * p≤0,05. EJEMPLO 1: Estrategia implementada
La validación de tal estrategia ha implicado:
1) La identificación de una alteración significativa del proceso de edición en cerebro humano en una determinada patología y la validación de su implicación patógena en la patología mediante observaciones de autopsia realizadas en modelos patológicos convergentes obtenidos en ratón y/o rata.
2) La identificación de tejidos periféricos o líneas celulares fácilmente accesibles a nivel no invasivo que puedan ser utilizados para el ajuste diagnóstico y terapéutico.
En la presente invención la validación de esta estrategia se obtuvo mediante:
A - la medición de marcadores adecuados del proceso de edición en toda o parte de la regulación de la edición implicada: perfiles de edición de ARNm de 5-HT2cR, marcadores de la expresión de las diferentes isoformas de las enzimas de edición: ADARI-150, ADARI-110, ADAR2.
Como ejemplo de los resultados obtenidos para validar la presente invención, la tabla I precisa el conjunto de marcadores que se proponen después de su identificación en las fuentes propuestas de sujetos humanos y animales de experimentación o líneas celulares:
Tabla 1 : Nivel de expresión de 5HT2cR y enzimas de edición. Observamos que en las muestras de sangre se puede determinar fácilmente el nivel de expresión de las enzimas de edición. En muestras de piel el 5-HT2cR se expresa y se somete a la actividad de edición de las ADAR 1 y 2 y puede completar la investigación del estado general de regulación de la edición de este receptor en las muestras de cerebro.
Para cada marcador, las muestras se extraen rápidamente con especial cuidado para permitir la posibilidad de ejecutar la determinación de los niveles de expresión de ARNm, los perfiles de edición y la determinación de marcadores de proteínas por transferencia de Western a partir de la misma muestra de tejido o célula.
La tabla 2 resume los procesos preferidos utilizados para la determinación del nivel de expresión de los biomarcadores utilizados.
Tabla 2
Los siguientes ejemplos ilustran el procedimiento y los resultados típicos.
EJEMPLO 2: Obtención del perfil de edición completo a partir de una muestra de tejido cerebral (figura 1)
Se extrajo ARN total y se purificó a partir de extractos de tejidos o células, según las especificaciones del fabricante (Qiagen RNeasy, Mini Kit). La cantidad y la pureza del ARN extraído se evaluaron midiendo tanto la absorbancia a 260 nm como la relación 260/280 nm con un espectrofotómetro GeneQuant (PharmaciaBiotech). A continuación, para eliminar la posible contaminación por ADN genómico, se trataron 8 μl de cada ARN (entre 88 ng y 1,3 μg) con 1 unidad de ADNasa I (Invitrogen) durante 15 min a temperatura ambiente en un volumen final de 10 μl. La reacción se interrumpió añadiendo 1 μl de EDTA 25 mM y luego se calentó durante 10 min a 65 °C. La transcripción inversa de los ARN tratados con ADNasa I (10 μl) se realizó utilizando 15 unidades de transcriptasa inversa ThermoScript (ThermoScript RT-PCR System, Invitrogen) y cebadores Oligo(dT) a una concentración final de 2,5 μM.
A continuación, se llevó a cabo una primera reacción de PCR (volumen final 25 μl) que dio como resultado un fragmento de 250 pb en 1 μl de los productos de transcripción inversa con 0,2 unidades de ADN polimerasa Platinum Taq (ThermoScript RT-PCR system, Invitrogen) y cebadores específicos (cebador directo: 5 '-TGTCCCTAGCCATTGCTGATATGC-S ' (Id. de sec. n.°: 35) y cebador inverso: 5 '-GCAATCTTCATGATGGCCTTAGTC-S ' (Id. de sec. n.°: 36); concentración final de cada uno de ellos 0,2 μM) ubicado en el exón IV y el exón V del ADNc de 5-HT2cR humano, respectivamente. Después de una etapa de desnaturalización a 95 °C durante 3 min, la PCR se llevó a su punto final después de 35 ciclos (15s a 95 0C; 30s a 600 qC; 20s a 72 °C), y una etapa final de elongación de 2 min a 72 °C. Se usaron alícuotas de los productos de amplificación para verificar el producto en un gel analítico de agarosa al 2 %.
Segunda PCR y separación de fragmentos de ADNc monocatenario mediante electroforesis capilar (CE)
Se usó 1 μl de una dilución 1/50 de los primeros productos de RT-PCR, o el ADNc de 250 pb amplificado a partir de plásmidos que albergan las treinta y dos isoformas estándar de 5-HT2cR humano (o 5HT2CR), como molde para un aditivo de PCR-anidado. Estos 32 estándares, corresponden a las isoformas no editadas (NE) y editadas de 5-HT2cR humano. Las amplificaciones se realizaron en un volumen final de 20 μl con cebadores fluorescentes purificados por HPLC (cebador directo: FAM-ATGTGCTATTTTCAACAGCGTCCATC-3' (Id. de sec. n.°: 37); cebador inverso: VIC-GC AATCTTCATGATGGCCTT A-3 ' (Id. de sec. n.°: 38); concentración final de cada uno 0,2 μM) y 0,2 unidades de ADN polimerasa Platinum Pfx (Invitrogen).
El cebador inverso marcado con VIC se hibrida con una secuencia complementaria del receptor de 5-HT2c idéntica en seres humanos, ratones y ratas. Por otra parte, aunque se utilizó con muestras humanas, la secuencia del cebador directo marcado con FAM se diseñó para ser lo más parecida posible a la del ratón. Más precisamente, los restos T en las posiciones 5 y 6 de la secuencia del oligonucleótido humano (posiciones 1133 y 1134 de la referencia humana U49516) se cambiaron a G y C, respectivamente.
Las simulaciones de las rutas de plegamiento estocásticas de las dos cadenas del producto de PCR obtenido con los dos cebadores descritos anteriormente se llevaron a cabo con el servidor Kinefold (kinefold.curie.fr). Demostraron que las estructuras de energía libre más bajas obtenidas para cadenas directas e inversas, la región editada incrustada en el bucle de una estructura de tallo-bucle, y capaz de hibridar con una secuencia complementaria ubicada en otra parte de la estructura completa después del plegamiento del tallo, fueron muy similares a las calculadas para un producto de PCR anidada de ratón utilizado con éxito para muestras de ratón. Se demostró que este conjunto de cebadores es óptimo para el análisis conformacional de la edición del ARNm de 5HTR2C humano mediante polimorfismo conformacional de cadena sencilla acoplado a electroforesis capilar (CE-SSCP, capillary electrophoresis-single strand conformation polymorphism).
El fragmento amplificado tiene una longitud de 127 pb. En cuanto a la RT-PCR, después de una etapa inicial de desnaturalización de 5 min a 94 qC, se finalizó la reacción de amplificación con 35 ciclos (15s a 94 qC; 30s a 55 qC; 20s a 68 qC) y una etapa final de elongación de 2 min a 68 qC. De nuevo, la calidad de los fragmentos amplificados de 127 pb de longitud se evaluó en un gel de agarosa al 2 % antes del análisis posterior en un 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystem).
Se añadieron productos de PCR fluorescentes correspondientes a isoformas estándar (1 μl de una dilución 1/100 en agua tratada con DEPC) y muestras (1 μl de una dilución 1/30) diluidas en 11 μl de formamida desionizada a una mezcla de estándares de migración etiquetados con ROX (MWG-BIOTECH, AG) (0,5 μl cada uno) que cubre todo el intervalo de tiempos de retención del electroforegrama. Estos estándares ROX se utilizaron para la calibración de CE y, posteriormente, para obtener la superposición correcta de los estándares y los picos de las muestras. Después de desnaturalizar durante 2 min a 95 qC, las muestras se enfriaron inmediatamente en hielo. La CE no desnaturalizante se llevó a cabo en un ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) a través de capilares de 80 cm de largo rellenos con 7 % de “ POP Conformational Analysis Polymer” (Applied Biosystems), IX TBE y sin glicerol. Después de una ejecución previa realizada a 15 kV durante 3 min, las muestras se inyectaron durante 15 s a 2 kV y se realizó la electroforesis durante 105 min a 15 kV a una temperatura controlada de 200 qC. En estas condiciones, cada una de las treinta y dos isoformas posibles se resolvió claramente como resultado de la conformación de ADNmc (ADN monocatenario) única obtenida con la cadena marcada con FAM o con VIC. Los diferentes tiempos de retención se utilizaron para la identificación inequívoca de las isoformas.
Identificación y cuantificación relativa de cada isoforma en cada muestra de cerebro
A continuación, la señal electroforética se procesó utilizando un software interno. En primer lugar, se ajustó la base de tiempo de los perfiles electroforéticos de cada muestra usando las cadenas marcadas con ROX de los estándares de migración. Esto permitió que las cadenas marcadas con FAM y VIC desconvolucionaran con precisión las señales de patrones y muestras en una base de tiempo única. Luego se ajustó y restó el efecto de fondo y posteriormente se normalizó el área total debajo de cada señal.
La proporción relativa de cada isoforma se procesó mediante un mejor ajuste de cada señal analítica desconvolucionada y normalizada de las muestras de cerebro. Se realizó mediante el ajuste iterativo de la señal integrada representada por las 32 señales analíticas estándar igualmente desconvolucionadas y normalizadas. El cálculo se basó en
La hipótesis de que la señal SSCP S(t) = Ig ¡R¡(t) en donde R¡(t), siendo i E { 1 N}, son las señales estándar y g ¡ el % de cada una de ellas en la señal. El mejor ajuste minimizó la suma de cuadrados debido al error (SSE) SSE= J[S(t)-ZgiRi(t)j 2 y se controló por el análisis estadístico de mínimos cuadrados.
El resultado de este mejor ajuste se evaluó estadísticamente después del cálculo del valor de y2, tal como r 2=1 - SSE/SSM en donde SSM es la suma de cuadrados alrededor de la media, tal como SSM =Z (S(t) - S)2 (S(t) - S). El mejor ajuste teórico máximo daría un r 2= 1.
Todos los experimentos se llevaron a cabo en condiciones de enmascaramiento y todas las muestras se analizaron en el mismo lote para reacciones de RT-PCR y segunda PCR. Los mejores resultados de ajuste arrojaron un perfil de edición específico para cada muestra individual, que se determinó por el porcentaje de cada forma editada y no editada de la señal analítica total. Estos valores iniciales se utilizaron para análisis estadísticos.
Este método proporciona la proporción de cada isoforma de ARNm expresada, expresada como el porcentaje del total del receptor de 5-HT2c presente en el extracto.
Como ejemplo, se proporciona aquí la tabla de identificación de las 32 isoformas humanas en las que cada cadena marcada con FAM y VIC proporciona un conjunto de tiempos de retención (véase la figura 1). Es fácil darse cuenta de que el uso de las dos cadenas puede resolver la identificación total de las 32 isoformas estándar.
La principal ventaja de este procesamiento es proporcionar una estimación cuantitativa completa de la distribución de las isoformas de SHT2cR expresadas (perfil de edición) en una concentración determinada de ARNm de SHT2cR. Esto se obtiene a partir de un único ensayo y permite determinar fácilmente las características de este perfil en una situación dada. Con esta técnica se ha podido demostrar en un grupo de 6 pacientes deprimidos que se habían suicidado una firma específica que caracterizaba al grupo de pacientes deprimidos. Esta firma brinda información interesante sobre la desregulación del proceso de edición que tiene lugar en las regiones prefrontales dorsales del cerebro y apoya firmemente el interés de explorar el estado estable de las enzimas de edición en muestras de piel y sangre de pacientes deprimidos. EJEMPLO 3: Expresión de SHT2CR en piel humana y de ratón
La piel, debido a la presencia dérmica de receptores de 5-HT2c y enzimas de edición podría ser una fuente interesante para medir en la periferia tanto la edición de 5-HT2cR como el nivel de expresión de las enzimas de edición.
La figura 2 representa un control típico de RTPCR realizado después de la extracción de ARN poliA de muestras de piel humana (A) o de ratón (B).
La aplicación de la separación por electroforesis capilar de los productos SSCP de los productos de la segunda PCR anidada condujo a la demostración de que, en piel humana y de ratón, las enzimas de edición ADAR1 y ADAR2 estaban activas y que ciertos estados patológicos o fisiopatológicos podían modificar en este tejido periférico la regulación de la edición de 5-HT2cR.
EJEMPLO 4: Ubicación y naturaleza de la expresión de las isoformas de ADAR1 y ADAR2. Tal como predijeron los experimentos de validación anteriores, se observó que existía expresión de las isoformas de ADAR1 y ADAR2 en las muestras de piel de ratón y piel humana.
La figura 3 muestra un ejemplo de control de la identificación por RT/PCR de ADAR1-150, ADAR1-110 y ADAR2 en experimentos realizados después de la extracción de ARN total de sangre o piel de ratón.
En el ser humano también fue posible identificar y cuantificar fácilmente el nivel de expresión de las enzimas de edición después de la recolección de un pequeño volumen de sangre.
Con un rendimiento típico de 1-2 x 106 leucocitos por ml de sangre recién extraída, un volumen de 5 ml permite aislar suficiente ARN total para reacciones de transcripción inversa. Las muestras de sangre (5 ml) se recogen en tubos heparinizados. Las siguientes etapas del protocolo deben llevarse a cabo inmediatamente en condiciones estériles. Diluir el material de muestra anticoagulada con un volumen igual de solución estéril de NaCl al 0,9 %, solución estéril de PBS IX o medio de cultivo estéril RPMI 1640. El medio de separación (p. ej., Ficoll-Paque Plus, GE Healthcare Bio-Sciences AB, ref.: 17-1440-02 o 17-1440-03) debe calentarse a temperatura ambiente justo antes de su uso y protegerse de la luz. Llenar un tubo LeucoSep de 15 ml (Greiner Bio-One, ref : 163289 o 163290) con 3 ml de medio de separación. Centrifugar durante 30 s a 1000 g y a temperatura ambiente (el medio de separación se encuentra entonces por debajo de la barrera porosa del tubo). Cuando se utilizan tubos LeucoSep precargados con medio de separación, se pueden cancelar las etapas mencionadas anteriormente (ref: 163288 o 227288). Calentar simplemente los tubos a temperatura ambiente. Verter con cuidado la muestra de material anticoagulada diluida (1:2 en solución salina equilibrada o RPMI 1640, véase más arriba) en el tubo LeucoSep de 15 ml. Centrifugar 10 minutos a 1000 g y a temperatura ambiente, o 15 minutos a 800 g y a temperatura ambiente en un rotor de cubeta oscilante. Apagar los frenos de la centrífuga
Después de la centrifugación, recolectar la fracción celular enriquecida (linfocitos/PBMC = anillo blanco) por medio de una pipeta Pasteur. Lavar la fracción celular enriquecida con 10 ml de solución estéril PBS IX, posteriormente centrifugar 10 minutos a 250 g. Repetir la etapa de lavado dos veces. Para la última centrifugación, los sedimentos deben recogerse en tubos de microcentrífuga (tubos Eppendorf de 1,5 ml) mediante resuspensión en 1 ml de solución estéril PBS IX. Después de la última centrifugación (10 minutos a 250 g y a temperatura ambiente), desechar el sobrenadante y cubrir rápidamente los sedimentos “secos” de las fracciones celulares enriquecidas con el reactivo de estabilización de ARN RNAlater (Qiagen, ref: 76104 o 76106). Si los sedimentos sumergidos se almacenan a 2-8 °C, el perfil de expresión génica de linfocitos/PBMC se puede estabilizar hasta 4 semanas a esta temperatura. Si las muestras se transportan en el reactivo RNAlater, asegurarse de que los sedimentos permanecen siempre sumergidos en el reactivo. Mantener los tubos en posición vertical durante el transporte o llenar los tubos completamente con la solución de estabilización. Durante el transporte, los tubos se pueden guardar en una caja de poliestireno llena de bolsas de hielo azul. Una mejor solución podría ser lisar directamente los sedimentos de la fracción celular enriquecida en 1 ml de Reactivo TRIzol (Invitrogen, ref: 15596-026), conservado y enviado a temperatura ambiente. Dado que este reactivo de lisis contiene fenol, los tubos de muestra deben estar bien cerrados. En realidad, tal y como describe el proveedor (Invitrogen), el lisado de leucocitos en el reactivo TRIzol (véase anteriormente) permite extracciones posteriores tanto de ARN total (fase acuosa) como de proteínas (fase orgánica). Los tubos se pueden enviar a temperatura ambiente o en hielo seco.
En la figura 4 se proporciona un ejemplo de validación en el que se presenta el control de los productos de RTPCR de enzimas de edición en muestras de cerebro humano, piel y células sanguíneas CD4 y CD8.
Por lo tanto, es posible, en seres humanos, analizar correctamente la expresión de las enzimas de edición en muestras de cerebro (estudios post mortem), piel y sangre (estudios de diagnóstico), como se ilustra en el experimento de control presentado en la figura 5.
Una vez verificados todos los elementos de la tabla 2, es posible esclarecer las condiciones precisas y los límites del análisis de la expresión de enzimas de edición en sangre y piel y el perfil de edición de 5-HT2/C en la piel como biomarcadores en el diagnóstico y tratamiento de varios estados patológicos en seres humanos con una profunda validación procedente de modelos fisiopatológicos o farmacopatológicos adecuados.
EJEMPLO 5: Análisis de las isoformas del receptor de 5-HT2c en muestras de cerebro de pacientes suicidas deprimidos post mortem en comparación con muestras de controles de pacientes
El proceso analítico ilustrado en la figura 1 permite el análisis de todas las isoformas del receptor de 5-HT2c en muestras de cerebro post mortem. Un estudio de 6 controles de pacientes y pacientes con depresión suicida cuidadosamente seleccionados mostró que: (1) regiones específicas del cerebro muestran un patrón específico de distribución de las isoformas de 5-HT2CR editadas y no editadas y (2) este patrón de distribución está significativamente alterado en la corteza cingulada anterior y la corteza prefrontal dorsal humanas, que están involucradas en la fisiopatología de la depresión mayor. Estos cambios en la firma de isoformas se ilustran en la tabla 3, que muestra los efectos observados en la corteza cingulada anterior. Es importante destacar que esta técnica puede medir los cambios dinámicos en la prevalencia de isoformas en ambas direcciones: aumentos o disminuciones en comparación con los controles, lo que brinda información sobre la disfunción enzimática potencial que subyace a los cambios. Aquí, por ejemplo, la actividad de ADAR1 (que edita específicamente los sitios A y B y, con menos especificidad, el sitio C) está regulada positivamente.
Tabla 3: Perfiles de edición obtenidos en controles y pacientes suicidas deprimidos. Se midió el perfil de edición total en pacientes de ambos grupos (n=6 en cada uno). Los resultados representan la prevalencia de isoformas como un porcentaje de todas las isoformas y se presentan como la media ± SEM. Los dos aspectos de la firma, la distribución de todas las isoformas y la distribución según los sitios de edición individuales, fueron analizados por ANOVA II.
Tabla 3
EJEMPLO 6: El tratamiento con interferón alfa2 en ratones induce un aumento significativo en la expresión de ADAR1 en sangre. Este efecto periférico también se identifica en la piel y en el cerebro.
Este experimento se realizó en ratones Balb/cJ. Se inyectó una dosis de 20.000 Ul de interferón alfa de ratón por vía IP y los grupos de ratones (n=8) se sacrificaron a las 3, 6 y 8 horas después de la inyección. El grupo de control (n=8) se sacrificó en el tiempo cero. La sangre, la piel y el cerebro se procesaron rápidamente para evitar la degradación del ARN. Se extrajo el ARN total de cada muestra de tejido y se cuantificó el ARNm específico que codifica la ADAR1 inducible mediante QPCR utilizando el gen endógeno de GAPDH como referencia. Los resultados se resumen en la figura 6. Muestran claramente que cuando se observa un aumento significativo en la expresión de ADAR1 en muestras de sangre de ratones tratados con interferón, también se observa una respuesta amplificada en muestras de piel y en la corteza prefrontal.
Además, el perfil de edición del 5-HT2cR se determinó según los métodos descritos previamente (véase el ejemplo 2) en el área prefrontal de ratones de control y tratados con interferón sacrificados a las 8 horas. En la tabla 4 es fácil ver que: 1) Después de la inducción de la expresión de ADAR1 que se produce rápidamente en el cerebro, en estas condiciones experimentales, se observa una alteración temprana significativa del proceso de edición del 5-HT2cR a las 8 horas. Se encontró que un grupo de 12 isoformas editadas, incluidas las isoformas ABCD y ACD, aumentó significativamente. Representan más del 30 % del ARNm total de 5-HT2cR.
2) El análisis de las proporciones de los sitios editados en este grupo muestra claramente un aumento significativo en las proporciones de los sitios A, B y C encontrados editados. Pueden interpretarse como resultado principalmente de una mayor actividad de ADAR1. Esto se confirma cuando se restringe el análisis a las isoformas de este grupo que se deben exclusivamente a la actividad de ADAR1.
Tabla 4: Análisis de la alteración del perfil de edición del ARNm de 5-HT2cR después del tratamiento con interferón. En cada individuo, el perfil total de edición se midió como la proporción de cada isoforma editada en el ARNm específico total del receptor. Los resultados presentados son la media ± SEM de controles y ratones tratados con interferón sacrificados 8 horas después de la inyección. Los valores de p se calcularon a partir de la prueba de Student. Se presentan así: la suma de las isoformas editadas que se encontraron aumentadas en el grupo tratado con interferón, la proporción de los sitios A, B, C, D y E que se encontraron editados en este grupo de isoformas y la proporción relativa de ARNm representada por las isoformas de este grupo que es exclusivamente el resultado de una acción específica de ADAR1.
Finalmente, resulta razonable proponer que la medida de los cambios en la expresión de las ADAR en la periferia (sangre) podría predecir una importante alteración de la edición en el cerebro que podría explicar los efectos secundarios sobre el estado de ánimo de varios tratamientos ya utilizados en varios campos terapéuticos.
Tabla 4
Claims (16)
1. Un método que implementa una sola muestra biológica seleccionada del grupo de muestras biológicas que consisten en tejidos periféricos que contienen células, para evaluar la alteración patológica de una edición de ARNm en el cerebro y en donde dicha edición de ARNm es una edición de ARNm de A a I dependiente de ADAR;
- en donde dicho tejido periférico que contiene células se selecciona del grupo que consiste en muestra de sangre entera o muestra de sangre que contiene capa leucoplaquetaria;
- en donde dicho ARNm editado es ARNm de 5HTR2C;
- evaluándose la alteración patológica de la edición del ARNm de 5HTR2C en el cerebro mediante la determinación de los productos de expresión de ADAR, las isoformas 150 y/o 110 de ADAR1, y los productos de expresión del gen ADAR2 expresados en dicha muestra.
2. Método para identificar in vitro si un paciente presenta una patología o está en riesgo de desarrollar una patología relacionada con una alteración del mecanismo de edición del ARNm de 5HTR2C, en donde este método comprende las siguientes etapas:
a) determinar los productos de expresión de ADAR, las isoformas 150 y/o 110 de ADAR1, y los productos de expresión del gen ADAR2 en una muestra biológica que contiene células sanguíneas obtenidas del paciente a analizar;
b) identificar si dicho paciente presenta o está en riesgo de desarrollar dicha patología comparando la cantidad de las ADAR expresadas en dicha muestra con el perfil de las ADAR expresadas obtenido para pacientes normales o para pacientes que presentan patologías relacionadas con una alteración del mecanismo de esta edición de ARNm.
3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicha patología se selecciona del grupo que consiste en trastornos mentales, esquizofrenia, depresión, suicidio por depresión o comportamiento alimentario anómalo.
4. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicha patología se selecciona del grupo que consiste en depresión y comportamiento suicida por depresión.
5. El método de la reivindicación 1, para determinar in vitro si una patología presentada por un paciente está relacionada con una alteración del mecanismo de edición del ARNm del 5HTR2C, en donde este método comprende las siguientes etapas:
a) determinar la cantidad de las ADAR expresadas en una muestra biológica que contiene células sanguíneas obtenidas del paciente;
b) identificar si dicho paciente presenta o está en riesgo de desarrollar dicha patología comparando la cantidad de las ADAR expresadas en dicha muestra con el perfil de las ADAR expresadas obtenido a partir de pacientes normales o a partir de pacientes que presentan patologías que se conoce que no están relacionadas con una alteración del mecanismo de esta edición de ARNm.
6. Un método para identificar in vitro un agente que modula in vivo la edición del ARNm de 5HTR2C en un mamífero, que comprende la siguiente etapa de:
- comparar los productos de expresión de ADAR, las isoformas 150 y/o 110 de ADAR1, y los productos de expresión del gen ADAR2 en una muestra biológica que contiene células sanguíneas obtenidas del mamífero después del tratamiento con dicho agente con los productos de expresión de ADAR obtenidos de la muestra de sangre de control obtenida de dicho mamífero.
7. Un método para identificar in vitro un agente que modula la edición del ARNm de 5HTR2C en un mamífero, que comprende las siguientes etapas:
a) poner en contacto una muestra biológica que contiene una línea de células sanguíneas de mamífero en presencia de un modulador candidato de dicha edición de ARNm de 5HTR2C; y b) determinar los efectos de dicho modulador sobre los productos de expresión de ADAR, las isoformas 150 y/o 110 de ADAR1, y los productos de expresión del gen ADAR2 expresados en dicha muestra de células sanguíneas, comparando la cantidad de las ADAR expresadas obtenidas a partir de la muestra biológica de la etapa a) con la cantidad de las ADAR expresadas obtenidas a partir de una muestra de tejido de control de células sanguíneas de dicho mamífero.
8. Un método para determinar in vitro en un paciente la eficacia de un fármaco utilizado para la prevención o para el tratamiento de una patología relacionada con una alteración del mecanismo de edición del ARNm del 5HTR2C, que comprende las siguientes etapas:
a) determinar los productos de expresión de ADAR, las isoformas 150 y/o 110 de ADAR, y los productos de expresión del gen ADAR2 en una muestra de sangre que contiene células sanguíneas obtenidas del paciente; y
b) determinar la eficacia de dicho fármaco comparando los productos de expresión de ADAR, las isoformas 150 y/o 110 de ADAR1, y los productos de expresión del gen ADAR2 obtenidos en la etapa a) con los productos de expresión de A d a R obtenidos del paciente durante y/o después del tratamiento con dicho fármaco,
en donde una modulación de los productos de expresión de ADAR expresados que dé lugar a productos de expresión de ADAR expresados parecidos o iguales a los observados en pacientes normales, es significativa de la eficacia del tratamiento.
9. Método para determinar si un paciente responde o no a un tratamiento de una patología resultante o provocada por la alteración del mecanismo de edición del ARNm del 5HTR2C, que comprende las siguientes etapas:
a) determinar los productos de expresión de ADAR, las isoformas 150 y/o 110 de ADAR1, y los productos de expresión del gen ADAR2 en una muestra de sangre que contiene células sanguíneas obtenidas del paciente antes de iniciar el tratamiento;
b) determinar si el paciente responde o no responde al tratamiento observando la modificación de los productos de expresión de ADAR después de un periodo de tratamiento por comparación con la cantidad de productos de expresión de las ADAR obtenidos en la etapa a) antes del inicio del tratamiento.
10. El método según las reivindicaciones 1 a 9, en donde el paciente o el mamífero es un ser humano, un ratón o una rata.
11. Un método según las reivindicaciones 1 a 10, en donde los productos de expresión de ADAR son las isoformas 150 y/o 110 de ADAR1, y los productos de expresión del gen ADAR2 del gen humano que codifica la proteína ADAR1, isoformas 150-kD y/o 110-kD, y la proteína ADAR2.
12. Un método según las reivindicaciones 1 a 11, en donde los productos de expresión de ADAR son los ARNm de ADAR.
13. Un método según la reivindicación 12, en donde), la determinación del ARNm de ADAR se lleva a cabo mediante un método que comprende las siguientes etapas:
A) extracción de los ARN totales de dichas células de la muestra de sangre, seguida, en su caso, de purificación de los ARNm;
B) transcripción inversa de los ARN extraídos en la etapa A); y
C) amplificación por PCR de los ADNc obtenidos en la etapa B) utilizando al menos un par de cebadores específicos para cada uno de los ARNm de ADAR a cuantificar y/o analizar cualitativamente.
14. Un método según la reivindicación 13, en donde en la etapa C), el par de cebadores específicos para la amplificación por PCR del ARNm de ADAR se selecciona del grupo que consiste en:
- para la amplificación del ARNm de la isoforma 150 de ADAR1 humana:
Directo: 5 '-GCCTCGCGGGCGCAATGAATCC-S ' (Id. de sec. n.2: 41),
Inverso: 5 '-CTTGCCCTTCTTTGCCAGGGAG-S ' (Id. de sec. n.2: 42);
- para la amplificación del ARNm de la isoforma 110 de ADAR1 humana:
Directo: 5 '-CGAGCCATCATGGAGATGCCCTCC-3 ' (Id. de sec. n.2: 43),
Inverso: 5 '-CATAGCTGCATCCTGCTTGGCCAC-S ' (Id. de sec. n.2: 44);
- para la amplificación de ARNm de ADAR2 humana:
Directo: 5 '-GCT GCGCAGT CT GCCCTGGCCGC-S ' (Id. de sec. n.2: 45),
Inverso: 5 '-GTCATGACGACTCCAGCCAGCAC-S ' (Id. de sec. n.2: 46);
- para la amplificación del ARNm de la isoforma 150 de ADAR1 de ratón:
Directo: 5 '-GTCTCAAGGGTTCAGGGGACCC-S ' (Id. de sec. n.2: 47),
Inverso: 5 '-CT CCT CT AGGGAATTCCT GGATAC-S ' (Id. de sec. n.2: 48);
- para la amplificación del ARNm de la isoforma 110 de ADAR 1 de ratón:
Directo: 5 '-TCACGAGTGGGCAGCGTCCGAGG-S ' (Id. de sec. n.2: 49),
Inverso: 5 '-CTCCTCTAGGGAATTCCTGGATAC-3 ' (Id. de sec. n.2: 48); y
- para la amplificación del ARNm de ADAR2 de ratón:
Directo: 5 '-GCTGCACAGTCTGCCTTGGCTAC-S ' (Id. de sec. n.2: 50),
Inverso: 5 '-GCATAAAGAAACCTGAGCAGGGAC-S ' (Id. de sec. n.2: 51).
15. Un método según las reivindicaciones 1 a 14, en donde los productos de expresión de ADAR son las proteínas ADAR.
16. Un método según la reivindicación 15, en donde la determinación de las proteínas ADAR se lleva a cabo mediante un método que comprende las siguientes etapas:
A) la extracción de las proteínas totales contenidas en dichas células de la muestra de sangre, seguida, en su caso, de una etapa de purificación de proteínas; y
B) la determinación de la presencia y/o la concentración de cada proteína ADAR contenida en dichas células de la muestra de sangre mediante la implementación de anticuerpos capaces de reconocer específicamente dichas proteínas ADAR.
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