ES2310057B1 - Metodo de analisis molecular y tratamiento en demencia de cuerpos de lewy. - Google Patents
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Abstract
Método de análisis molecular y tratamiento en
demencia de cuerpos de Lewy.
La presente invención describe métodos de
análisis molecular de una forma concreta de
a-sinucleinopatía, la demencia de cuerpos de Lewy
(DLB) asociados a los niveles de Ubiquitina
C-terminal hidrolasa L1 (UCH-L1) o
la alteración de su actividad ubiquitil-ligasa.
Asimismo, también se refiere al uso de compuestos que permiten la
modificación de los niveles de UCH-L1 o de la
actividad enzimática de la UCH-L1. Esta invención
tiene aplicación en el diagnóstico y el tratamiento de pacientes
afectados de DLB.
Description
Método de análisis molecular y tratamiento en
demencia de cuerpos de Lewy.
La presente invención se refiere a un método de
análisis molecular y de tratamiento de la enfermedad conocida como
demencia de cuerpos de Lewy, tanto en su forma pura como en su
forma común, que puede ser utilizado como criterio de diagnóstico
de dichas demencias así como en la prevención y tratamiento de las
mismas.
En las sociedades desarrolladas el
envejecimiento de la población está produciendo un incremento del
número de pacientes afectados de demencia. La mayoría de estos
individuos padecerán la más común de entre ellas: la enfermedad de
Alzheimer (AD); pero existen toda una gama de demencias de orígenes
muy diversos. Entre ellas destaca por su frecuencia la demencia con
cuerpos de Lewy (DLB). La DLB designa un síndrome
clínico-patológico de demencia asociado con la
presencia cortical y subcortical de cuerpos de Lewy en diferentes
grados, entre ellos podemos mencionar enfermedad por cuerpos de
Lewy difusos, demencia senil tipo cuerpos de Lewy y también variante
con cuerpos de Lewy de la enfermedad de Alzheimer. La clasificación
clínico-patológica de esta disfunción, a la que se
ha dado en llamar demencia con cuerpos de Lewy (DLB) (McKeith IG,
Galasko D, Kosaka K, et al. Consensus guidelines for the
clinical and pathological diagnosis of Dementia with Lewy bodies
(DLB): report on the Consortium on DLB InteARNtional Workshop.
Neurology 1996; 47: 1113-24.2000; 54:
1050-8) recoge también algunos rasgos que son
comunes con las características de la AD y de la enfermedad de
Parkinson (PD). En su conjunto, los datos clínicos de la enfermedad
pueden sugerir el diagnóstico de enfermedad de cuerpo de Lewy
difusa, si bien no existen pruebas diagnósticas definitivas para
tal diagnóstico. El examen neuropatológico es actualmente la única
forma de diagnóstico al demostrar las alteraciones patognomónicas
por sus características, localización y distribución propias de la
enfermedad.
Los criterios neurológicos de diagnóstico
atienden a los síntomas o signos Nucleares. Así en la valoración de
la Demencia con Cuerpos de Lewy se consideran deficiencias
atencionales, ejecutivas y visuoespaciales frecuentemente peores;
memoria a corto plazo relativamente mejor que en AD. En la
valoración de Cognición fluctuante se evalúa un curso temporal
variable de niveles alterados de atención y conciencia y el hecho
de no observase el síndrome crepuscular. Otro síntoma clave es la
presencia de alucinaciones visuales, en DLB son recurrentes, muy
elaboradas e incluyen típicamente sujetos animados con un grado
variable de penetración En DLB, los signos extrapiramidales
espontáneos son; rigidez, bradiquinesia y anormalidad en la marcha;
el temblor en reposo es infrecuente. La presencia de fluctuaciones
clínicas de un día a otro o de una semana a otra, especialmente al
inicio, son aspectos que apoyan el diagnóstico de DLB. Un aspecto
que podría mejorar la sensibilidad diagnóstica es en la
determinación de criterios para definir el umbral y la escala de los
rasgos nucleares de los signos motores
extra-piramidales y de las alucinaciones visuales.
Otra limitación de los criterios actuales es el hecho de que las
características sugestivas para el diagnóstico no se incluyen
explícitamente en el algoritmo utilizado para determinar la
naturaleza posible o probable de la DLB. Para conseguir una mayor
precisión en el diagnóstico de la DLB, sería necesario acometer
investigaciones sobre la utilidad de los rasgos sugestivos para el
diagnóstico diferencial y la posible contribución de los trastornos
del sueño (Kaufer DI. Dementia and Lewy bodies Rev Neurol. 2003 Jul
16-31;37(2):127-30.
Review.).
Review.).
Desde el punto de vista histopatológico, los
signos diferenciales para un diagnóstico de DLB es la presencia de
cuerpos de Lewy en el cortex y el tronco del encéfalo, aunque en
ocasiones se detectan, presencia de neuritas de Lewy, placas
seniles corticales, signos de taupatía o cambios espongiformes (K.A.
Jellinger, Morphological substrates of mental dysfunction in Lewy
body disease. An update. J Neurol Transm Suppl 59 (2000), pp.
185-21). Como se ha mencionado, las características
de las lesiones (cuerpos y neuritas de Lewy), su localización (en
neuronas procesos neuronales) y su distribución (difusa en el
tronco del encéfalo, amígdala, núcleo basal de Meynert y corteza
cerebral) son específicos de la enfermedad.
Un estudio reciente señala una incidencia
clínica de DLB de 26/100.000 casos anuales, con una tasa máxima
para el intervalo de edad 80-84 años de 68,6/100.000
casos anuales. Esto implica una tasa menor frente a la AD, que en
un trabajo previo fue de 93/100.000 casos anuales pero mayor que la
demencia fronto-temporal (FTD), que se estimó en
14/100.000 casos anuales. El mismo estudio detecta una predominancia
masculina de la DLB descrita en la literatura, con un porcentaje de
varones con DLB respecto a AD fue de 63,2% frente a 23,1%. En este
estudio deben considerarse diversas limitaciones metodológicas ya
que se trata de un estudio con una muestra hospitalaria de
pacientes no representativos de la población general. Además, debe
tenerse en cuenta que la sensibilidad insuficiente de los criterios
clínicos actuales puede producir la infraestimación de las tasas
reales, lo cual hace suponer que la incidencia en la población
general es ligeramente superior. (S. López-Pousa, J.
Garre-Olmo, A. Turon-Estrada, E.
Gelada-Batlle, M. Lozano-Gallego, M.
Hernández-Ferrándiz, V.
Morante-Muñoz, J. Peralta-Rodríguez,
M.M. Cruz-Reina Incidencia clínica de la demencia
por cuerpos de Lewy. REV NEUROL 2003; 36 (8): 715-
720).
720).
La etiología de la enfermedad es desconocida y
los mecanismos moleculares de su progresión también. No obstante,
la característica histopatológica fundamental de esta enfermedad, la
acumulación de cuerpos de Lewy han empezado por aportar algunas de
las primeras pistas o indicaciones. Los cuerpos de Lewy son
depósitos proteicos compuestos básicamente de depósitos proteicos
insolubles cuyos componentes principales son la
a-sinucleina, la ubiquitina y la presencia de
proteínas ubiquitinadas. Todos ellos son componentes de un sistema
subcelular llamado Sistema UPS
(Ubiquitina-proteasoma) que es responsable de la
degradación fisiológica de proteínas citoplasmáticas que son
defectuosas o se encuentran en exceso (Herschko A, Ciechanover A
(1998) The ubiquitin system. Annu Rev Biochem 67:
425-479). El mal funcionamiento de este sistema ha
sido asociado como una de las causas implicadas en el origen o
desarrollo de ciertas enfermedades
neuro-degenerativas como AD, PD, la enfermedad de
Huntington (HD) o la esclerosis amiotrófica lateral (ALS)
(Petrucelli L & Dawson TM. Mechanism of neurodegenerative
disease: role of the ubiquitin proteasome system. Ann Med.
2004;36(4):315-20). (Tran PB, Miller RJ.
Aggregates in neurodegenerative disease: crowds and power? Trends
Neurosci. 1999 May; 22(5):194-7).
Uno de los elementos de este Sistema UPS
(Ubiquitina-proteasoma) responsable de la
degradación fisiológica de proteínas citoplasmáticas que son
defectuosas es la UCH-L1 (Ubiquitina
C-terminal hidrolasa -1), una
tiol-proteasa responsable de hidrolizar los enlaces
peptídicos de los complejos proteicos unidos a la glicina
carboxiterminal de la ubiquitina que conllevan a la destrucción
regulada de proteínas sobrantes en el citoplasma celular y
liberando ubiquitina que queda así disponible para unirse a nuevas
proteína que deben eliminarse. La correlación entre la
UCH-L1 y el parkinsonismo ya había sido puesta de
manifiesto con la detección de una mutación en una familia alemana
con un historial de PD, esta mutación tiene características
dominantes (Leroy E, Boyer R, Auburger G, Leube B, Ulm G, Mezey E,
Harta G, Brownstein MJ, Jonnalagada S, Chernova T, Dehejia A,
Lavedan C, Gasser T, Steinbach PJ, Wilkinson KD, Polymeropoulos MH
(1998) The ubiquitin pathway in Parkinson's disease. Nature 395:
451-452). También se había observado que en ratones
defectivos para UCH-L1 los niveles neuronales de
ubiquitina in vivo eran menores de lo normal y que en
sistemas de líneas celulares la sobrexpresión de
UCH-L1 producía un incremento en los niveles de
ubiquitina libre. (Osaka H, Wang YL, Takada K, Takizawa S, Setsuie
R, Li H, Sato Y, Nishikawa K, Sun YJ, Sakurai M, Harada T, Nara Y,
Kimura I, Chiba S, Namikawa K, Kiyama H, Noda M, Aoki S, Wada K
(2003) Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 binds
to and stabilizes monoubiquitin in neuron. Hum Mol Genet 12:
1945-1958). También se ha demostrado que la
UCH-L1 colocaliza con otras proteínas del sistema
UPS como proteínas ubiquitiladas, HSP70,
gamma-tubulina y, en menor medida, el proteasoma 20S
y la chaperona BiP (Ardley HC, Scott GB, Rose SA, Tan NG, Robinson
PA. UCH-L1 aggresome formation in response to
proteasome impairment indicates a role in inclusion formation in
Parkinson's disease. J Neurochem. 2004
Jul;90(2):379-91). Recientemente, también se
han descrito alteraciones en el estado oxidativo de
UCH-L1 en AD y PD esporádicas (Choi J, Levey Al,
Weintraub ST, Rees HD, Gearing M, Chin LS, Li L (2004) Oxidative
modifications and down-regulation of ubiquitin
carboxyl-terminal hydrolase L1 associated with
idiopatic Parkinson's and Alzheimer's disease. J Biol Chem 279:
13256-13264.).
A pesar de que las rutas de degradación y
homeostasis proteica subcelular como el sistema UPS y las
diferentes proteínas intervinientes en el mismo han sido propuestas
como actores centrales en el desarrollo de algunas enfermedades ya
mencionadas en los párrafos anteriores como PD o AD que comparten
algunos síntomas con la DLB, lo cierto es que se sigue sin conocer
las causas y los mecanismos de evolución de esta demencia que es la
segunda más frecuente tras el Alzheimer.
Las posibilidades terapéuticas que se ofrecen a
los pacientes de DLB son desgraciadamente muy limitadas, a menudo
se resumen en tratamiento sintomático para controlar los síntoma
psiquiátricos y parkinsonianos. Sin embargo, a menudo la medicación
antiparkinsoniana que produce mejoras en el temblor y en la pérdida
de movilidad produce empeoramientos agudos y notables, en algunos
casos fatales, de los síntomas alucinatorios y del cuadro
psicótico. De la misma forma el tratamiento neuroléptico prescrito
para los síntomas psiquiátricos produce un empeoramiento notable
del cuadro motor. Dependiendo del cuadro que presenta el paciente,
inhibidores de acetilcolinesterasa, agonistas de dopamina,
benzodiazepinas de vida corta y media y antidepresivos pueden ser
de ayuda limitada. (Rampello L, Cerasa S, Alvano A, Butta V V,
Raffaele R, Vecchio I, Cavallaro T, Cimino E, Incognito T, Nicoletti
F. Dementia with Lewy bodies: a review. Arch Gerontol Geriatr. 2004
Jul-Aug; 39(1):1-14).
Por lo tanto, existe una necesidad en el estado
del arte de identificar nuevos genes y/o mutaciones responsables
y/o indicadores de la demencia de cuerpos de Lewy.
La identificación de este/estos genes permitiría
un diagnóstico molecular selectivo y respecto a otras demencias y
permitiría incluirlo/s en la práctica clínica habitual.
Al mismo tiempo produciría un ahorro enorme de
costes sanitarios y sociales asociados a este tipo de demencias
terriblemente incapacitadoras.
También permitiría la adopción de nuevos
criterios pronósticos y de orientación terapéutica en los casos
positivos ya que permitiría adaptar terapias más severas y
personalizadas a aquellos casos en los que el carácter parkinsoniano
del enfermo quedara establecido.
Finalmente la identificación de este/estos genes
y de los posibles compuestos que alteran su expresión retardando o
deteniendo la progresión de la enfermedad permitiría no solo un
diagnóstico molecular selectivo y respecto a otras demencias sino
que permitiría el diseño de terapias selectivas destinadas a
inactivar estos genes.
La presente invención tiene por objeto un método
de análisis molecular para la demencia de cuerpos de Lewy (DLB) en
pacientes con sospecha clínica de inicio de demencia, caracterizado
porque comprende analizar una muestra obtenida de un paciente para
determinar el nivel de expresión del gen Ubiquitina
C-terminal hidrolasa L-1
(UCH-L1) o la actividad enzimática de la proteína
codificada por dicho gen, donde una disminución del nivel de
expresión del gen o de la actividad de la proteína con relación al
nivel de expresión o a la actividad de la proteína que presenta un
individuo sano es indicativo de la presencia de Demencia de cuerpos
de Lewy.
En particular, dicha muestra puede ser ARN o
proteína y puede aislarse a partir de células obtenidas por biopsia
o cualquier otro método de extracción de tejido nervioso o
cualquier otro método de extracción de cualquier otro tejido o a
partir de fluidos biológicos como líquido cefalorraquídeo, suero u
orina.
El método de análisis molecular de la presente
invención comprende adicionalmente una detección mediante una
amplificación por PCR, SDA o cualquier otro método de amplificación
de DNA que permita una estimación cuantitativa de los niveles de
trascrito de UCH-L1.
Optativamente, la detección se puede llevar a
cabo mediante biochips de DNA realizados con oligonucleótidos
depositados por cualquier mecanismo, por biochips de DNA realizados
con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante
fotolitografía o por cualquier otro mecanismo.
También la detección se puede llevar a cabo
mediante una detección por análisis de cantidad de proteína
presente realizado mediante Western-blot, análisis
mediante "protein-chip" utilizando anticuerpos
específicos contra UCH-L1 o mediante perfiles
proteicos realizados por espectrometría de masas o por cualquier
otro mecanismo que permita una estimación cuantitativa de los
niveles de proteína UCH-L1.
Optativamente, la detección se puede llevar a
cabo mediante análisis directo o indirecto de las actividad
enzimáticas de UCH-L1 in vitro o in
vivo entendiendo como tales la actividad hidrolítica de los
ésteres y amidas de ubiquitina como la actividad
ubiquitil-ligasa.
También la detección se puede llevar a cabo
mediante una detección donde la muestra analizada y cuantificada es
la proteína codificada por dicho gen o fragmentos de la misma.
Optativamente, la detección se puede llevar a
cabo mediante análisis directo o indirecto del producto de la
actividad ligasa de la UCH-L1, es decir de la
presencia de formas dimerizadas o polimerizadas de
poliubiquitinina.
Por otra parte, la presente invención tiene
también por objetivo adicional proporcionar un método de análisis
de compuestos para identificar agentes terapéuticos basados en su
capacidad de potenciar los niveles de la enzima
UCH-L1 para detener o revertir la progresión de
este tipo de demencias. Estos compuestos pueden ser promotores
específicos de la trascripción del gen UCH-L1 o
inhibidores específicos de la degradación de la proteína codificada
por el gen UCH-L1.
Asimismo, es objeto de la presente invención el
uso de compuestos para incrementar o acelerar la actividad
hidrolítica de la enzima UCH-L1 para detener o
revertir la progresión de este tipo de demencias. Estos compuestos
pueden afectar la velocidad máxima o la afinidad de la
UCH-L1 frente a los esteres a o amidas de
peptidil-ubiquitina.
También es objeto de la presente invención el
uso de compuestos para eliminar o disminuir la actividad ligasa de
la enzima UCH-L1 para detener o revertir la
progresión de este tipo de demencias. Estos compuestos pueden ser
inhibidores específicos competitivos o no competitivos de la
actividad ubiquitil-ligasa de la proteína codificada
por el gen.
Por otra parte, la presente invención tiene
también por objetivo adicional proporcionar un método de análisis
de compuestos de potencialidad terapéutica en demencia de cuerpos
de Lewy basado en el análisis de la variación de la actividad
hidrolítica de UCH-L1 en sistemas in vitro
como cultivos celulares u otros.
Por otra parte, la presente invención tiene
también por objetivo adicional proporcionar un método de análisis
de compuestos de potencialidad terapéutica en demencia de cuerpos
de Lewy basado en el análisis de la variación de la actividad
ubiquitil-ligasa de UCH-L1 en
sistemas in vitro como cultivos celulares u otros.
La presente invención tiene asimismo por
objetivo adicional proporcionar un compuesto farmacéutico basado en
la información de la secuencia tales como oligonucleótidos
antisentido o de interferencia de ARN u otros basados en la
desestabilización y eliminación del mARN o del mARN producido por un
alelo que confiere actividad ligasa y el impedimento de su
traducción a proteína.
La presente invención tiene asimismo por
objetivo adicional proporcionar un compuesto farmacéutico basado en
la información de la secuencia génica o proteica de
UCH-L1 tales como anticuerpos específicos que
producen al unirse a la proteína un incremento de su actividad
enzimática en términos de afinidad o velocidad máxima o de
oligonucleótidos antisentido o de interferencia de ARN u otros
basados en la desestabilización y eliminación del mARN o del mARN
producido por un alelo que confiere interferencia o reducción en
trans respecto al alelo con actividad hidrolítica normal y el
impedimento de su traducción a proteína.
La presente invención está basada en el
descubrimiento realizado a partir de análisis genómicos en DNA
chips con oligonucleótidos diseñados de forma específica para
representar 627 genes de especial interés realizados sobre corteza
cerebral de que en una cohorte de pacientes afectos de Demencia de
cuerpos de Lewy (DLB) tanto en su forma pura como en la forma
denominada común, que manifiesta además algunos síntomas
concomitantes de enfermedad de Alzheimer. En estos casos los niveles
de ARNm del gen UCH-L1 se encontraban disminuidos
respecto a los controles y respecto a una cohorte de pacientes
afectos de enfermedad de Alzheimer (AD) y de Parkinson (PD). Este
dato fue corroborado por técnicas independientes como la
cuantificación de ARNm mediante PCR en tiempo real. La
significación de este descenso en los niveles de mARN fue además
comprobada en relación a los procesos generales y específicos de
degradación que sufren las diferentes especies de ARNm en los
tejidos post-mortem. Experimentos en los que
la misma muestra post-mortem era procesada y
el ARN obtenido tras haber estado el tejido a temperatura ambiente
durante diferentes tiempos mostraban que los niveles de
UCH-L1 permanecían constantes comprados con los de
transcritos constituvos o poco variables como el de la
\beta-actina.
También se comprobó que los niveles de proteína,
analizados mediante experimento de Western-Blot
empleando anticuerpos específicos
anti-UCH-L1, se encontraban
asimismo disminuidos en la corteza cerebral en la DLB, pero no en la
PD.
Estas disminuciones de los niveles de ARNm y de
proteína UCH-L1 eran estadísticamente
significativas comparadas con los controles con unos niveles de
significación de 0.99 para la forma pura de la DLB y 0.95 para la
forma común.
La demencia de cuerpos de Lewy (DLB) es la
segunda demencia más común después de la enfermedad de Alzheimer
(AD). Histopatológicamente se caracteriza por una acumulación de
cuerpos hialinos (los cuerpos o acumulos de Lewy) en ciertos
núcleos del tracto cerebral, médula espinal y ganglios autónomos. En
PD también se producen cuerpos de Lewy y ambas (PD y DLB) son
consideradas a-sinucleopatías por el acumulo de
esta proteína en los cuerpos de Lewy. Aunque DLB tiene un cierto
solapamiento sintomático con PD, ambas enfermedades presentan
cuadros neurológicos muy diferenciados y la afectación cerebral es
también distinta. Así por ejemplo, DLB presenta afectación cortical
que es inexistente en PD y un cuadro neurológico alucinatorio
inexistente en PD, el tratamiento sintomático
anti-PD en enfermos de DLB complica de forma muy
grave el cuadro neurológico de estos pacientes. Existe un consenso
clínico y neurológico bien establecido de que ambas son enfermedades
claramente
diferentes.
diferentes.
UCH-L1 es un enzima implicado en
los mecanismos del Sistema UPS
(Ubiquitina-proteasoma) responsable de la
degradación fisiológica de proteínas citoplasmáticas que son
defectuosas,mutantes o están en exceso. UCH-L1 es
una tiol-proteasa responsable de hidrolizar los
enlaces peptídicos de los complejos proteicos unidos a la glicina
carboxiterminal de la ubiquitina que conllevan a la destrucción
regulada de proteínas sobrantes en el citoplasma celular y
liberando ubiquitina que queda así disponible para unirse a nuevas
proteína que deben eliminarse.
En PD, una enfermedad que comparte algunos
síntomas con DBL, pero que contrariamente a esta no muestra nunca
afectación cortical, ya se había hecho notar la posible importancia
de estos mecanismos de regulación de las proteínas sobrantes en el
citoplasma celular en el desarrollo de la enfermedad ya que la
parkina una proteína que interacciona con la ubiquitina está mutada
en ciertos casos de PD hereditario (McNaught KS, Olanow CW (2003)
Proteolytic stress: a unifying concept for the etiopathogenesis of
Parkinson's disease. Ann Neurol 53: S73-84). También
UCH-L1 se ligó a PD al descubrirse que existe una
mutación puntual (I93M) que, con un cierto grado de dominancia,
confiere susceptibilidad de producir la enfermedad (Leroy E, Boyer
R, Auburger G, Leube B, Ulm G, Mezey E, Harta G, Brownstein MJ,
Jonnalagada S, Chernova T, Dehejia A, Lavedan C, Gasser T,
Steinbach PJ, Wilkinson KD, Polymeropoulos MH (1998) The ubiquitin
pathway in Parkinson's disease. Nature 395:
451-452) y en un estudio colaborativo donde se
analizaron los 11 estudios realizados hasta la fecha en 1970 casos
de PD y 2224 controles no relacionados, se determinó que existía
una asociación inversa estadísticamente significativa entre el alelo
S18Y y la enfermedad de Parkinson (odds ratio (OR) de 0.84 (95%
intervalo de confianza [CI], 0.73-0.95) y
homozigotos para la variante alélica (Y/Y vs S/S más Y/S) tenían un
OR de 0.71 (95% CI, 0.57-0.88) lo que confirmaba
UCH-L1 como un gen de susceptibilidad para el PD.
(Maraganore, D. M.; Lesnick, T. G.; Elbaz, A.;
Chartier-Harlin, M.-C.; Gasser, T.; Kruger, R.;
Hattori, N.; Mellick, G. D.; Quattrone, A.; Satoh, J.; Toda, T.;
Wang, J.; Ioannidis, J. P. A.; de Andrade, M.; Rocca, W. A.;
UCH-L1 Global Genetics Consortium:
UCH-L1 is a Parkinson's disease susceptibility gene.
Ann. Neurol. 55: 512-521, 2004). También
recientemente se ha descrito una disminución de los niveles de
UCH-L1 y la presencia de ciertas modificaciones
oxidativas en Alzheimer y Parkinson idiopático (Choi J, Levey Al,
Weintraub ST, Rees HD, Gearing M, Chin LS, Li L (2004) Oxidative
modifications and down-regulation of ubiquitin
carboxyl-terminal hydrolase L1 associated with
idiopatic Parkinson's and Alzheimer's disease. J Biol Chem 279:
13256-
13264).
13264).
No obstante, la posible conexión entre los
niveles de UCH-L1 y la Demencia de cuerpos de Lewy
no había sido descrita hasta la fecha. Por lo tanto, la presente
invención demuestra una clara correlación entre los niveles de ARNm
y de proteína UCH-L1 de la corteza cerebral en los
enfermos de DLB respecto a los controles. Además nuestros
experimentos muestran con claridad como la reducción de los niveles
proteicos de UCH-L1 en pacientes afectos de DLB no
muestran decrementos concomitantes de otras proteínas claves del
complejo ubiquitina-proteasoma como las subunidades
20SX, 20SY, complejo 19S y la subunidad 11 Sa del activador PA28.
Esto indica un papel específico y selectivo de la represión de los
niveles de UCH-L1 en el cuadro patológico de la DLB
en el cortex
cerebral.
cerebral.
Actualmente, los enfermos con sospecha de DLB
son básicamente analizados neurológicamente, Deterioro mental
progresivo detectado por síntomas tempranos como dificultades en
solucionar problemas y dificultades visuales y espaciales, así como
fluctuaciones en la función cognitiva y la aparición de
alucinaciones bien definidas y, posteriormente, la aparición de
signos motores constituyen las características centrales para un
diagnóstico discriminatorio de DLB frente a otras demencias (McKeith
IG, Galasko D, Kosaka K, Perry EK, Dickson DW, Hansen LA, Salmon
DP, Lowe J, Mirra SS, Byrne EJ, Lennox G, Quinn NP, Edwardson JA,
Ince PG, Bergeron C, Burns A, Miller BL, Lovestone S, Collerton D,
Jansen EN, Ballard C, de Vos RA, Wilcock GK, Jellinger KA, Perry RH
(1996) Consensus guidelines for the clinical and pathologic
diagnosis of dementia with Lewy bodies (DLB): Report of the
consortium on DLB inteARNtional workshop. Neurology 47:
1113-1124 y McKeith IG, Ballard CG, Perry RH, Ince
PG, O'Brien JT, Neill D, Lowery K, Jaros E, Barber R, Thompson P,
Swann A, Fairbairn AF, Perry EK. Prospective validation of
consensus criteria for the diagnosis of dementia with Lewy bodies.
Neurology. 2000 Mar 14;54(5):1050-8). Un
diagnóstico inequívoco temprano permitiría disponer de un margen
terapéutico que reduzca o detenga el avance de la enfermedad.
De acuerdo con el método de diagnóstico de la
presente invención el análisis de DLB quedaría de la siguiente
forma un paciente que tiene un cuadro de sospecha de inicio de
demencia y con una apreciación clínica-familiar no
definitiva sería diagnosticado por una microbiopsia y una
cuantificación de los niveles de UCH-L1.
También se contempla como parte de la presente
invención el uso de una terapia anti-DLB dirigida
de forma específica a modificar la capacidad de regenerar el pool
intracelular de ubiquitina libre mediante el incremento de los
niveles de ARNm o proteína de UCH-L1 o mediante la
modificación de una o las dos de las actividades enzimáticas de
UCH-L1.
En efecto, el conocimiento de las actividades
enzimáticas de UCH-L1, la actividad hidrolasa que
libera la ubiquitina (Larsen CN, Krantz BA, Wilkinson KD. Substrate
specificity of de-ubiquitinating enzymes: ubiquitin
C-terminal hydrolases. Biochemistry. 1998; 37:
3358-68. y Larsen CN, Price JS, Wilkinson KD.
Substrate binding and catalysis by ubiquitin
C-terminal hydrolases: identification of two active
site residues. Biochemistry. 1996; 35: 6735-44) y
la actividad ubiquitil-ligasa (Liu Y, Fallon L,
Lashuel HA, Liu Z, Lansbury PT (2002) The UCH-L1
gene encodes two opposing enzymatic activities that affect
a-synuclein degradation and Parkinson's disease
susceptibility. Cell 111: 209-218) permite diseñar
métodos de análisis de compuestos y permite comprobar la eficacia de
moléculas que interfieran las actividades de UCH-L1
en la dirección deseada.
La terapia anti-DLB comienza por
determinar la presencia de niveles disminuidos de
UCH-L1 en tejido nervioso o en CSF o en fluidos
periféricos. En ratones defectivos de UCH-L1, se ha
observado un decremento de la ubiquitina libre en neuronas y en
ratón transgénico sobrexpresando UCH-L1 y en
sistemas de cultivos celulares la sobrexpresión de
UCH-L1 implica un incremento de los niveles de
ubiquitina, (Osaka H, Wang YL, Takada K, Takizawa S, Setsuie R, Li
H, Sato Y, Nishikawa K, Sun YJ, Sakurai M, Harada T, Nara Y, Kimura
I, Chiba S, Namikawa K, Kiyama H, Noda M, Aoki S, Wada K (2003)
Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 binds to and
stabilizes monoubiquitin in neuron. Hum Mol Genet 12:
1945-1958.). Además, la colocalización de
a-sinucleina y ubiquitina en los cuerpos de Lewy y
en las neuritas de Lewy (McNaught KS, Olanow CW (2003) Proteolytic
stress: a unifying concept for the etiopathogenesis of Parkinson's
disease. Ann Neurol 53: S73-84.; McNaught KS,
Mytilineou C, Jnobaptiste R, Yabut J, Shashidharan P, Jennert P,
Olanow CW (2002b) Impairment of the
ubiquitin-proteasome system causes dopaminergic
cell death and inclusion body formation in ventral mesencephalic
cultures. J Neurochem 81: 301-306) así como
nuestras de que otros componentes importantes del complejo UPS no
se encuentran disminuidas en el cuadro de DLB debido de forma
principal a una disminución de la actividad UCH-L1
hacen que sea una hipótesis muy verosimil que el sistema
ubiquitina-proteasoma está implicado en la
patogénesis de PD y de
DLB.
DLB.
Por lo tanto, el establecimiento de la clara
correlación entre los niveles de UCH-L1 y la
enfermedad DLB permite considerar de forma novedosa la aplicación de
tecnologías y de compuestos bien para el incremento de los niveles
de enzima activo, bien de la inactivación de la actividad
ubiquitil-ligasa o bien para la activación de la
actividad hidrolasa. Esta aplicación de tecnologías y/o compuestos
activos pueden suponer la contención y/o regresión de la enfermedad
ya que producen el incremento de la ubiquitina libre disponible en
el pool citoplasmático celular y por tanto permite a las neuronas
catabolizar correctamente las proteínas que deben ser eliminadas
causando la disminución en la concentración de
a-sinucleína y otras proteínas que son los
responsables de los cuerpos de
Lewy.
Lewy.
Un ejemplo de aproximación de sobrexpresión de
UCH-L1 sería la inserción de un casette codificante
para la forma S18Y de UCH-L1 que tiene una capacidad
ubiquitil-ligasa reducida en un vector de expresión
adenoviral, retroviral o de otro tipo. Este tipo de vector podría
ser introducido mediante transplante en células madre nerviosas
(neural steam cell) de procedencia embrionaria o adulta (derivadas
de la zona subventricular u otra) portadoras del vector de
expresión. Una aproximación similar podría ser el trasplante de
células madre codificantes para un factor de transcripción que
exalte la transcripción del gen UCH-L1 endógeno.
Recientemente se ha demostrado que un factor de transcripción:
B-Myb, que se identificó por su similaridad con
v-Myb un oncogen de retrovirus de pollo y que
modula la transición G1/S del ciclo celular (N. Nomura, M.
Takahashi, M. Matsui et al., Isolation of human cdna clones
of myb-related genes, a-myb and
b-myb. Nucleic Acids Res. 16 (1988), pp.
11075-11089 published erratum appears in Nucleic
Acids Res. 1989 February 11;17(3):1282), es capaz estimular
la expresión de UCH-L1 tanto in vitro como
in vivo en pulmón de rata (Long EM, Long MA, Tsirigotis M,
Gray DA. Stimulation of the murine UCH-L1 gene
promoter by the B-Myb transcription factor. Lung
Cancer. 2003 Oct;42(1):9-21).
Otro ejemplo en esta línea podría introducir
versiones mutadas de la UCH-L1 con la actividad
hidrolítica exaltada.
Un ejemplo demostrativo de este efecto puede
postularse con líneas celulares neuronales del mesencéfalo ventral
de rata donde la inhibición de UCH-L1 produce
agregados de a-sinucleina y la sobrexpresión produce
incremento en la cantidad de ubiquitina libre.
Otro ejemplo experimental es el obtenido en la
línea celular de neuroblastoma SHS5Y donde tratamientos con
5-100 microM de MPP+, el metabolito activo de MPTP,
induce apoptosis en las células SH-SY5Y en los 4
días siguientes a tratamiento y además en este proceso reproducen
la sobrexpresión de a-sinucleina que forman los
agregados de Lewy propios de la DLB (Gomez-Santos C,
Ferrer I, Reiriz J, Vinals F, Barrachina M, Ambrosio S. MPP+
increases alpha-synuclein expression and
ERK/MAP-kinase phosphorylation in human
neuroblastoma SH-SY5Y cells. Brain Res. 2002 May
10;935 (1-2):32-9).
Una pequeña parte de las demencias puede además
tener un carácter familiar, tal como se ha descrito en el caso de
PD donde una mutación en UCH-L1 (la mutación
alemana I93M) provoca un decremento de la actividad hidrolítica de
un 50% (Lansbury PT, Brice A (2002) Genetics of Parkinson's disease
and biochemical studies of implicated gene products. Curr Opin
Genet Dev 13: 299-306.). También algunos de los
subtipos de DLB parece que podrían presentar un cierto grado de
dominancia autosómica (Harding AJ, Das A, Kril JJ, Brooks WS, Duffy
D, Halliday GM. Identification of families with cortical Lewy body
disease. Am J Med Genet. 2004 Jul
1;128B(1):118-22). La mutación de
UCH-L1 I93M tiene también una cierta dominancia si
bien la penetrancia de la misma no es absoluta, lo que ha llevado a
postular fenómenos de compensación alélica en trans (Liu Y, Fallon
L, Lashuel HA, Liu Z, Lansbury PT (2002) The UCH-L1
gene encodes two opposing enzymatic activities that affect
a-synuclein degradation and Parkinson's disease
susceptibility. Cell 111: 209-218).
En este contexto, tienen sentido aproximaciones
de inhibición químicas o por anticuerpos que se han probado con
cierto éxito en otros campos terapéuticos como el oncológico, donde
hay ejemplos como la beta-catenina en el cáncer
colorrectal y con BCR-ABL en leucemia mieloide
crónica. Estas observaciones sugieren que ciertos oncogenes podrían
ser susceptibles de una disrupción provocando la caída del fenotipo
tumoral o permitiendo la eficacia del tratamiento estándar
combinado. De entre los mecanismos de disrupción génica
disponibles, la interferencia por ARNs de pequeño tamaño (ARNi) es
una de las aproximaciones más prometedoras, inicialmente
descubierto en petunias (Napoli C, Lemieux C, and Jorgensen R.
(1990) Introduction of a chalcone synthase gene into Petunia
results in reversible co-suppression of homologous
genes in trans. Plant Cell 2: 279-289) su mecanismo
molecular de acción ha sido descrito (Hammond SM, Caudy AA, Hannon
GJ. (2001) Post-transcriptional Gene Silencing by
Double-stranded ARN. Nature Rev Gen 2:
110-119) y ha suscitado una gran expectativa en sus
aplicaciones antitumorales (Kittler R, Buchholz F.ARN interference:
gene silencing in the fast lane. Semin Cancer Biol. 2003
Aug;13(4):259-65; Deveraux QL,
Aza-Blanc P, Wagner KW, Bauerschlag D, Cooke MP,
Hampton GM. Exposing oncogenic dependencies for cancer drug target
discovery and validation using ARNi. Semin Cancer Biol. 2003
Aug;13(4):293-300; Bedford JS, Liber HL
Applications of ARN interference for studies in DNA damage
processing, genome stability, mutagenesis, and cancer. Semin Cancer
Biol. 2003 Aug;13(4):301-8). De forma
similar, una aproximación antisentido podría reducir el nivel de
mensajero producido por el alelo I93M u otro que confiera un
decremento de la actividad
hidrolitica.
hidrolitica.
Para un tratamiento específico con RNA de
interferencia de pequeño tamaño (19-mer to
22-mers) hay que seleccionar secuencias específicas
dentro del cDNA para su uso como diana anti-alelo
I93M o similar. Usando el programa de diseño de oligos Tethys,
desarrollado por Oryzon, se hace una evaluación previa para
determinar cual es el oligo que demuestra menor potencial de
hibridación cruzada con otros secuencias expresadas presentes en el
genoma, para reducir la probabilidad que afecte a la expresión de
otros genes. Igualmente usando Tethys, se determina cual es la
posición mas favorable de la base diferencial en el oligo para
maximizar el efecto de reducción de expresión del alelo deseado.
Igualmente usando Tethys se evalúa cual es el tamaño del oligo mas
favorable en función de la secuencia diana, tal como se observa en
la Figura 6.
También se contempla como parte de la presente
invención el uso de sistemas in vitro para realizar análisis
de compuestos terapéuticos y/o composiciones farmacéuticas que
puedan remediar el daño neuronal producido por los agregados de
Lewy. Líneas celulares de tipo líneas de neuroblastoma SHS5Y donde
tratamientos con 5-100 microM de MPP+, el
metabolito activo de MPTP, inducen apoptosis en las células
SH-SY5Y y además en este proceso reproducen la
sobrexpresión de a-sinucleina que forman los
agregados de Lewy propios de la DLB (Gomez-Santos C,
Ferrer I, Reiriz J, Vinals F, Barrachina M, Ambrosio S. MPP+
increases alpha-synuclein expression and
ERK/MAP-kinase phosphorylation in human
neuroblastoma SH-SY5Y cells. Brain Res. 2002 May
10;935 (1-2):32-9). En estas líneas
celulares se pueden comprobar la eficacia de los compuestos
monitorizando los niveles de UCH-L1, su actividades
enzimáticas, los depósitos de a-sinucleina y la
propia apoptosis de las células. Estos compuestos terapéuticos y/o
composiciones farmacéuticas pueden unirse a la proteína
UCH-L1 e inhibir de forma no competitiva la
actividad ubiquitil-ligasa y restaurar la capacidad
de liberación de ubiquitina normal de la misma. De forma
alternativa, estos compuestos terapéuticos y/o composiciones
farmacéuticas pueden modificar la expresión de vías de señalización
celular provocadas por la sobre-acumulación de
proteínas como consecuencia de una alteración del Sistema
UPS.
UPS.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: A) Representación gráfica de la
amplificación de UCH-L1 mediante diluciones
seriadas de ARN procedente de área 8 cortical de cerebro humano. La
línea horizontal representa el umbral ajustado manualmente en la
fase exponencial. La intensidad de la fluorescencia se incrementa
con los ciclos de PCR. El número de ciclos a partir del cual la
intensidad de fluorescencia excede la línea umbral es definido como
el valor umbral CT en el cual se basa la cuantificación. B) Curvas
estándar representativas para la \beta-actina y
la UCH-L1 construidas a partir de diferentes
concentraciones de ARN procedente de cerebro control humano. Los
valores CT (eje y) vs log de las diferentes concentraciones de ARN
de muestras control (eje x) muestran una correlación lineal
inversa.
Figura 2: Niveles de expresión relativa del gen
UCH-L1 en el córtex frontal de controles (C, n=6),
Enfermedad de Parkinson (PD, n=6), Enfermedad de cuerpos de Lewy
difusa, Demencia con cuerpos de Lewy, forma pura (DLBp, n=7) y forma
común (DLBc, n=6). (A) Niveles de ARNm de UCH-L1
(promedio \pm SEM) normalizados con la
\beta-actina. B) Niveles proteicos de
UCH-L1 (dos bandas de aproximadamente 25 KDa),
detectados por Western Blot en los homogenados totales de córtex
frontal (área 8). La \beta-actina (45 kDa) se
detecta como control de carga proteica. La imagen es representativa
de todas las muestras estudiadas e indicadas en la Tabla I. C)
Análisis densitométrico de los niveles proteicos de
UCH-L1 (promedio \pm SEM) con el programa TotalLab
v2.01. Los valores proteicos de UCH-L1 fueron
normalizados con los de la \beta-actina. Los
valores encontrados son estadísticamente significativos con
*p<0.05 y **p<0.01 comparando con las muestras control (ANOVA
con el test post-hoc
LSD).
LSD).
Figura 3: Estabilidad
post-mortem de los niveles proteicos de
UCH-L1 (dos bandas de 25 kDa aproximadamente)
detectados por Western blot en homogenados totales de córtex
frontal de una muestra individual (con 3 h de
post-mortem). Las muestras se congelaron en
nitrógeno líquido directamente (0 h) o dejadas a temperatura
ambiente durante 3, 6 o 22 h y entonces congeladas en nitrógeno
líquido. La imagen no muestra una degradación aparente de
UCH-L1 hasta las 22 h.
Figura 4: Niveles proteicos de
UCH-L1 detectados por Western blot en suero de
individuos control. La imagen muestra una banda específica
correspondiente con el peso molecular aparente de
UCH-L1.
Figura 5: Niveles proteicos de las subunidades
del proteosoma en el córtex frontal de controles (C, n=6),
Enfermedad de Parkinson (PD, n=6), Enfermedad de cuerpos de Lewy
difusa, Demencia con cuerpos de Lewy, forma pura (DLBp, n=7) y
forma común (DLBc, n=6): subunidades \beta del complejo 20S, 20SX
y 20SY, complejo 19S y el activador 11Sa. La
\beta-actina es detectada para controlar la carga
proteica en el gel. La imagen es representativa de todas las
muestras indicadas en la Tabla I. Análisis densitométrico de los
niveles proteicos de las subunidades del proteosoma (promedio \pm
SEM) usando el programa TotalLab v2.01. Los valores proteicos de
UCH-L1 fueron normalizados con los de la
\beta-actina. No se detectan diferencias
estadísticamente significativas entre los casos control y
patológicos.
patológicos.
Figura 6: Valores de temperatura de hibridación
y de hibridación cruzada de oligonucleótidos diseñados
específicamente para amplificar el alelo específico I93M de
UCH-L1 comparado con los valores de los oligos que
son complementarios del alelo normal o salvaje. Tm: temperatura de
hibridación del oligo específico para gen UCH-L1
I93M con su oligo complementario. Tm cross: temperatura de
hibridación del oligo específico para gen UCH-L1
I93M con el oligo complementario para el del gen
UCH-L1 salvaje. Delta Tm: Tm-Tm
cross.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describe una realización
preferente, aunque no limitativa, de la invención.
En la siguiente tabla se resumen los casos
estudiados con los datos neuropatológicos de la presente serie:
Enfermedad de Parkinson (PD), Demencia con cuerpos de Lewy en forma
pura (DLBp) y en forma común (DLBc), y controles M: hombre, F:
mujer. NFT: ovillos neurofibrilares (neurofibrillary tangle).
Estadios Braak indica los cambios de enfermedad de
Alzheimer(AD) asociados con DDLB descritos por (Braak H,
Braak E (1999) Temporal sequence of Alzheimer's disease related
pathology. In: Cerebral cortex, vol 14, Neurodegenerative and
age-related changes in structure and function of
cerebral cortex (Peters A, Morrison JH, eds), pp
475-512. New York, Boston, Dordrecht, London,
Moscow: Kluwer Academic/Plenum Publishers).
De las muestras obtenidas de los pacientes se
obtuvo con el correspondiente permiso ético las muestras de ARN y
de proteína como se describen a continuación.
Obtención de ARN de las muestras de área 8
cortical de los diferentes pacientes y controles. La obtención
del ARNm se realizó en dos pasos. Se obtuvo el ARN total utilizando
el reactivo TRizol (Life Technologies) y a continuación se obtuvo
ARNm sin ARN de transferencia ni los ARN ribosomales 5S y 5.8S
utilizando el kit RNeasy Protect Mini Kit (Qiagen). El tejido
cerebral humano congelado se homogenizó directamente en 1 ml del
reactivo TRizol por 100 mg de tejido, y el ARN total se extrajo
siguiendo el protocolo indicado por la casa comercial. Este ARN
total purificado se resuspendió en 100 \mul de agua libre de
ARNsas, y la purificación del ARNm se obtuvo siguiendo las
especificaciones indicadas en el RNeasy Protect Mini Kit con
modificaciones menores; el tratamiento con DNasa I no se realizó ya
que el ADN genómico fue eliminado durante la extracción con el
reactivo TRizol. La concentración de cada muestra se obtuvo con las
mediciones realizadas a una absorbancia de 260 nm, y la integridad
del ARN se confirmó realizando una electroforesis con geles de
agarosa-formaldehído.
DNA arrays. Para los análisis
transcriptómicos, las muestras de ARN se analizaron adicionalmente
empleando el Agilent 2100 BioAnalyzer que calcula el tamaño de
fragmentos y la concentración de la muestra así como el ratio entre
los picos de los ARN 16S y 28S. Todas las muestras se marcaron
mediante el Kit MessageAmp ARN de Ambion, la primera cadena de la
síntesis de cDNA se cebó utilizando cebadores oligodT. Las muestras
de ARNa marcadas se analizaron en oligo DNA-chips
representando 627 genes de especifico interés, cada uno de ellos
representado por dos veces cinco óligos dispuestos al azar en la
superficie del DNA-chip. Los oligos se sintetizaron
utilizando un instrumento Geniom I benchtop DNAchip synthesis de la
firma FEBIT una plataforma de microarray que integra todas
las funciones en un único instrumento (Baum M, Bielau S, Rittner N,
Schmid K, Eggelbusch K, Dahms M, Schlauersbach A, Tahedl H, Beier M,
Guimil R, Scheffler M, Hermann C, Funk JM, Wixmerten A, Rebscher H,
Honig M, Andreae C, Buchner D, Moschel E, Glathe A, Jager E, Thom
M, Greil A, Bestvater F, Obermeier F, Burgmaier J, Thome K,
Weichert S, Hein S, Binnewies T, Foitzik V, Muller M, Stahler CF,
Stahler PF. Validation of a novel, fully integrated and flexible
microarray benchtop facility for gene expression profiling. Nucleic
Acids Res 2003;31:e151). Los datos crudos se normalizaron siguiendo
el método no-linear de Lowess (Workman C, Jensen
LJ, Jarmer H, Berka R, Gautier L, Nielser HB, Saxild HH, Nielsen C,
Brunak S, Knudsen S. A new non-linear normalization
method for reducing variability in DNA microarray experiments.
Genome Biol 2002;3:9).
En estos experimentos estableciendo un limite de
exclusión (cut-off) de 0.75 veces el nivel de
expresión (fold change) para genes reprimidos un de 1.5 para
genes sobrexpresados en DBL respecto a controles obtuvimos 1 gen
sobrexpresado y 16 reprimidos, de ellos varios estaban implicados
en la ruta de degradación UPS y de forma relevante el
UCH-L1. Para confirmar esta variación se procedió a
utilizar técnicas complementarias.
Síntesis del cDNA y PCR Taqman. Por cada
10 \mul de reacción de transcripción reversa, 200 ng de ARN
humano (en 3.85 \mul de agua) se mezclaron con 2.5 \muM del
cebador oligodT, tampón 1x RT TaqMan, 5.5 mM MgCl_{2}, 500 \muM
de cada dATP, dTTP, dCTP y dGTP, 0.08 U inhibidor de ARNsas y 0.31
U de la transcriptasa reversa MultiScribe (Applied Biosystems). Las
reacciones se realizaron a 25ºC durante 10 minutos para maximizar
la unión cebador-molde de ARN, seguido por una
temperatura de 48ºC durante 30 minutos, y una incubación a 95ºC
durante 5 minutos para desactivar la transcriptasa reversa. Se
realizaron reacciones paralelas en ausencia de la transcriptasa
reversa MultiScribe para asegurar la ausencia de ADN genómico
contaminante. La sonda TaqMan (Applied Biosystems) se anilla a una
de las cadenas del molde de ADN entre los cebadores directo e
inverso de PCR. Contiene un fluoróforo, el cual es hidrolizado por
la Taq polimerasa durante la fase exponencial, siendo la
fluorescencia originada proporcional a la cantidad de producto
acumulado generado en la reacción de PCR. Tanto los cebadores como
las sondas específicas para los genes humanos
UCH-L1 y \beta-actina fueron
comprados como Assays-on-Demand a
Applied Biosystems. La \beta-actina humana fue
utilizada como control endógeno.
Los ensayos de PCR TaqMan para el
UCH-L1 y el control endógeno
\beta-actina fueron realizados por triplicado
sobre muestras de cDNA en placas ópticas de 96 pocillos utilizando
el termociclador ABI Prism 7700 Sequence Detection system (PE
Applied Biosystems). La placa se tapó con tiras ópticas (Applied
Biosystems). Por cada 20 \mul de reacción TaqMan, 9 \mul de cDNA
(diluido 1/50, lo que corresponde aproximadamente a cDNA obtenido a
partir de 4 ng de ARN) fue mezclado con 1 \mul de sonda TaqMan 20X
y 10 \mul de 2X TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied
Biosystems). Ensayos paralelos fueron realizados para cada muestra
con los cebadores y la sonda de la \beta-actina
para normalizar. La reacción se realizó siguiendo los parámetros
que a continuación se indican: 50ºC durante 2 minutos, 95ºC durante
10 minutos, y 40 ciclos a 95ºC durante 15 segundos, 60ºC durante 1
minuto. Las curvas estándar para UCH-L1 y la
\beta-actina se prepararon utilizando diluciones
seriadas de ARN convertido a cDNA de cerebro humano control. Por
último, todos los datos de la PCR TaqMan fueron capturados con el
programa Sequence Detector Software (SDS version 1.9; Applied
Biosystems).
Electroforesis y Western blotting. Para
comprobar que los niveles de proteína de UCH-L1 se
encontraban disminuidos, muestras de córtex frontal congelado (100
mg) se homogeneizaron directamente en 1 ml de tampón de Tisis (20
mM Hepes, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl_{2}, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM
DDT, 2 mM PMSF, 1 \mug/ml aprotinina, leupeptina y pepstatina) y
posteriormente se sonicó. Los lisados fueron centrifugados a 5,000
rpm durante 10 minutos a 4ºC y la concentración proteica se
determinó con el método de BCA (Pierce). 50 \mug de proteína
total fue hervida a 95ºC durante 3 minutos y cargada en geles de
SDS-poliacrilamida con tampón
Tris-glicina. Las proteínas fueron separadas en el
gel utilizando el sistema mini-protean
(Bio-Rad) y transferidas a membranas de
nitrocelulosa (Bio-Rad) con una cámara de
transferencia Trans-Blot SD
Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad)
durante 45 minutos a 40 mA. Las membranas de nitrocelulosa fueron
bloqueadas con Tween 20 TBS (TBST) conteniendo un 5% de leche
desnatada durante 30 minutos. A continuación, fueron incubadas a 4ºC
durante toda la noche con el anticuerpo primario correspondiente
preparado en tampón TBST conteniendo un 3% de BSA. Los anticuerpos
utilizados fueron: anti-UCH-L1
(AB5937, Chemicon), anti-UCH-L1
(MCA-2084, Serotec),
anti-\beta-actina (clone
AC-74, Sigma), anti-proteosomA 19S
1\beta (PA1-973, Affinity BioReagents),
anti-activador del proteosoma 11 Sa
(PA1-960, Affinity BioReagents),
anti-proteosoma 20SX (PA1-977,
Affinity BioReagents) and anti-proteosoma 20SY
(PA1-978, Affinity BioReagents). Todos los
anticuerpos se utilizaron a una dilución de 1:500. Después de la
incubación con el anticuerpo primario, las membranas fueron lavadas
tres veces con el tampón TBST durante 5 minutos a temperatura
ambiente, y entonces se incubaron con el anticuerpo secundario
correspondiente, IgG marcada con peroxidasa (Dako) a una dilución
1:1,000 (1:5,000 para la \beta-actina) durante 1
h a temperatura ambiente. A continuación, las membranas se lavaron
cuatro veces durante 5 minutos cada lavado, con el tampón TBST a
temperatura ambiente y reveladas con el kit quimioluminiscente ECL
Western blotting system (Amersham/Pharmacia) seguido de la
superposición de las membranas con una película autoradiográfica
(Hyperfilm ECL, Amersham). La cuantificación de los niveles de
UCH-L1 se puede realizar en tejido periférico como
suero o líquido cefalorraquídeo. Tal como se muestra en la figura 4
se pueden detectar los niveles endógenos de UCH-L1
en estos fluidos biológicos.
Análisis cuantitativo de los datos. La
cuantificación densitométrica de las bandas del Western Blot se
realizó con el programa TotalLab v2.01. Para los análisis
estadísticos se utilizó el programa Statgraphics Plus v5.
Claims (16)
1. Método de análisis molecular para la demencia
de cuerpos de Lewy (DLB) en pacientes con sospecha clínica de
inicio de demencia, caracterizado porque comprende analizar
una muestra obtenida de un paciente para determinar el nivel de
expresión del gen Ubiquitina C-terminal hidrolasa
L-1 (UCH-L1) o la actividad
enzimática de la proteína codificada por dicho gen, donde una
disminución del nivel de expresión del gen o de la actividad de la
proteína con relación al nivel de expresión o a la actividad de la
proteína que presenta un individuo sano es indicativo de la
presencia de Demencia de cuerpos de Lewy.
2. Método de análisis molecular según la
reivindicación 1, caracterizado porque la muestra a analizar
es ARN o proteína.
3. Método de análisis molecular según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque la
muestra analizada y cuantificada es la proteína codificada por el
gen UCH-L1 o fragmentos de la misma.
4. Método de análisis molecular según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la
muestra es aislada de células de tejido nervioso obtenidas por
biopsia o cualquier otro método de extracción.
5. Método de análisis molecular según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la
muestra es aislada de células de cualquier otro tejido como células
neuroendocrinas periféricas obtenidas por biopsia o cualquier otro
método de extracción.
6. Método de análisis molecular según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la
muestra es aislada a partir de fluidos biológicos como líquido
cefalorraquídeo, suero u orina.
7. Método de análisis molecular según cualquiera
de las reivindicación 1 a 6, caracterizado porque se realiza
una detección mediante una amplificación por PCR, SDA o cualquier
otro método de amplificación de cDNA que permita una estimación
cuantitativa de los niveles de transcrito de
UCH-L1.
8. Método de análisis molecular según cualquiera
de las reivindicación 1 a 6, caracterizado porque se lleva a
cabo una detección por biochips de DNA realizados con
oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo.
9. Método de análisis molecular según cualquiera
de las reivindicación 1 a 6, caracterizado porque se lleva a
cabo una detección por biochips de DNA realizados con
oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía
o por cualquier otro mecanismo.
10. Método de análisis molecular según
cualquiera de las reivindicación 1 a 6, caracterizado porque
se lleva a cabo una detección por análisis de cantidad de proteína
presente realizado mediante Western-blot, análisis
mediante "protein-chip" utilizando anticuerpos
específicos contra UCH-L1 o mediante perfiles
proteicos realizados por espectrometría de masas o por cualquier
otro mecanismo que permita una estimación cuantitativa de los
niveles de proteína UCH-L1.
11. Método de análisis molecular según
cualquiera de las reivindicación 1 a 6, caracterizado porque
se lleva a cabo una detección por análisis directo o indirecto de
las actividad enzimáticas de UCH-L1 in vitro
o in vivo comprendiendo tanto la actividad hidrolítica de
los ésteres y amidas de ubiquitina como la actividad
ubiquitin-ubiquitin ligasa.
12. Método de análisis molecular según la
reivindicación 11, caracterizado porque la muestra analizada
y cuantificada es la presencia de formas dimerizadas o
polimerizadas de poliubiquitinina fruto de la actividad ligasa de la
UCH-L1.
13. Método de análisis molecular según la
reivindicación 11, caracterizado porque la muestra analizada
y cuantificada es la presencia de formas libres de
mono-ubiquitinina fruto de la actividad hidrolasa
de la UCH-L1.
14. Método de análisis de compuestos de
potencialidad terapéutica en demencia de cuerpos de Lewy basado en
el análisis de la variación de la actividad
ubiquitil-ligasa de UCH-L1 en
sistemas in vitro como cultivos celulares u otros.
15. Método según la reivindicación 14, donde los
compuestos son compuestos obtenidos de la información de la
secuencia tales como oligonucleótidos antisentido o de
interferencia de ARN u otros basados en la desestabilización y
eliminación del mARN o del mARN producido por un alelo que confiere
actividad ligasa y el impedimento de su traducción a proteína.
16. Método de análisis de compuestos de
potencialidad terapéutica en demencia de cuerpos de Lewy basado en
el análisis de la variación de la actividad hidrolítica de
UCH-L1 en sistemas in vitro como cultivos
celulares u otros.
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