ES2529692T3

ES2529692T3 - Diagnóstico de paraplejias espásticas hereditarias (PEH) por detección de una mutación en el gen o la proteína KIAA1840

Info

Publication number: ES2529692T3
Application number: ES07825693.0T
Authority: ES
Inventors: Hamid Azzedine; Alexis Brice; Giovanni Stevanin; Filippo Santorelli; Paola Denora
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2006-09-11
Filing date: 2007-09-11
Publication date: 2015-02-24
Anticipated expiration: 2027-09-11
Also published as: WO2008032218A2; EP1897891A1; US8728727B2; US9546402B2; US20170175196A1; EP2061809A2; EP2061809B1; US20140308665A1; US20110129819A1; US10519503B2; WO2008032218A3; US20160348172A9; US20130034849A1

Abstract

Un procedimiento ex vivo de diagnóstico o predicción de una paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva con cuerpo calloso delgado (PEH-AR-CCD), en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la detección de una mutación en el gen o la proteína KIAA1840 (espatacsina), en comparación con una población de control, en el que dicha mutación es indicativa de una paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva con cuerpo calloso delgado (PEH-AR-CCD).

Description

Diagnóstico de paraplejias espásticas hereditarias (PEH) por detección de una mutación en el gen o la proteína KIAA1840.

[0001] La invención se refiere a la identificación de mutaciones en el gen o la proteína KIAA1840, asociadas con paraplejias espásticas hereditarias (PEH), y a las aplicaciones diagnósticas que se benefician de esta identificación.

[0002] Las paraplejias espásticas hereditarias (PEH) son trastornos mendelianos genéticamente 10 heterogéneos caracterizados por debilidad, espasticidad y pérdida de sentido de la vibración en las extremidades inferiores (Harding y col. 1983 y Tallaksen y col. 2001). Se revelan clínicamente por dificultades en la deambulación que evolucionan posiblemente hacia parálisis total de las dos piernas. La fisiopatología de este grupo de enfermedades se encuentra, hasta la fecha, relativamente mal documentada; sin embargo, los datos anatomopatológicos hacen posible concluir que el ataque se limita a los tractos piramidales responsables de la 15 motricidad voluntaria en la médula espinal (Reid, 1997). La incidencia de PEH, que sigue siendo difícil de estimar debido a la escasez de estudios epidemiológicos y a la considerable variabilidad clínica, se sitúa en 0,9:100.000 en Dinamarca, de 3 a 9,6:100.000 en algunas regiones de España (Polo y col., 1991) o en 14:100.000 en Noruega (Skre, 1974) (aproximadamente 3:100.000 en Francia). Existen varias formas clínicas y genéticas de PEH. Las denominadas PEH "puras", que corresponden a espasticidad aislada de las extremidades inferiores, se distinguen 20 clínicamente de las PEH "complejas", para las cuales la espasticidad de las piernas se asocia con otros signos clínicos de tipo neurológico o no neurológico (Bruyn y col., 1991).

[0003] Aunque se han reconocido formas de PEH desde hace más de un siglo, regularmente se describen nuevos fenotipos, lo que revela una amplia heterogeneidad clínica. Genéticamente, se observan formas autosómicas 25 dominantes (AD), autosómicas recesivas (AR) y ligadas al cromosoma X y se han identificado casi 32 locus genéticos, aunque sólo se han clonado 12 genes (Flink y col. 2006). De acuerdo con las posibles funciones de estos genes, en la degradación de los axones de los tractos piramidales en estos trastornos se ha implicado el plegamiento de proteínas y el transporte axonal.

[0004] Las formas más comunes de PEH-AD, que suponen aproximadamente el 40-50% de los casos, son causadas por mutaciones en los genes SPG4 y SPG3A que codifican la espastina y la atlastina, respectivamente (Hazan y col. 1990, Zhao y col. 2001 y solicitud de patente internacional WO-01/18.198). A diferencia de las formas AD, la PEH-AR no se le se asocia ningún gen principal, lo que es menos habitual y más variado en presentación clínica, e implica una mayor heterogeneidad genética. Los cuatro genes de PEH-AR clonados hasta ahora, que 35 codifican la paraplejina (SPG7, MIM#607259 (base de datos OMIM, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM)) (Casari y col. 1998), la espartina (SPG20; MIM#275900), (Patel y col. 2002) y la maspardina (SPG21, MIM 248900) (Simpson y col. 2003), así como el gen responsable de la dolencia relacionada conocida como ataxia espástica de Charlevoix-Saguenay (ARSACS, MIM#270550) (Engert y col. 2000), representan probablemente menos del 5% de todos los casos (Fink y col. 2003). 40

[0005] Una forma muy común de PEH-AR se asocia a paraplejia espástica, déficit mental o cognitivo y cuerpo calloso delgado (Winner y col. 2005). La mayoría de las familias parecen tener ligamiento a SPG11 en el cromosoma 15, que fue el tercer locus de PEH-AR identificado (Martinez y col. 1999). Esta entidad es especialmente prevalente en Japón (Shibasaki y col. 2000), pero también se encuentra en Norteamérica, Oriente Medio y Europa (Martinez y 45 col. 1999 y Lossos y col. 2006 y Casali y col. 2004 y Winner y col. 2004 y Stevanin y col. 2006). Las características clínicas típicas de SPG11 consisten en paraplejia espástica de inicio temprano (normalmente <20 años), disfunción de la vejiga urinaria, déficits sensoriales profundos en las piernas y deterioro cognitivo que progresa insidiosamente a discapacidad funcional grave durante un periodo de 10-20 años. Algunos pacientes desarrollan también afectación en los brazos, disartria, contracturas y atrofia muscular. Los estudios auxiliares identifican frecuentemente un cuerpo 50 calloso delgado (CCD) con lesiones en la materia blanca y atrofia cortical cerebral variable en la resonancia magnética (RM), hipometabolismo de la glucosa cortical y talámico variable en tomografía por emisión de positrones y neuropatía periférica motora o sensorimotora predominantemente axonal en estudios de conducción nerviosa (Winner y col. 2004).

[0006] Hasta ahora se ha comunicado ligamiento al cromosoma 15q en 31 familias en las que los pacientes presentaban el fenotipo SPG11 típico. En el estudio inicial, se detectó una puntuación LOD multipunto combinada máxima de 3,14 en siete familias con PEH-AR en una región entre D15S1007 y D15S1012, aunque sólo los pacientes de 2 grupos de ascendencia norteamericana e italiana presentaron CCD (Martinez y col. 1999). Un

segundo estudio comunicó un grupo de 10 entre 13 familias japonesas con un fenotipo homogéneo de PEH-AR-CCD con una puntuación LOD acumulada de 9,68 en el intervalo de D15S971 a D15S117 (Shibasaki y col. 2000). Casali y col. también comunicaron 5 grupos de ascendencia italiana que mostraron un ligamiento significativo (Z = 3,35) con el intervalo flanqueado por los marcadores D15S1007 y D15S978 (Casali y col. 2004). Más recientemente, el análisis de 8 grupos de ascendencia adicionales (Z = 11,5) que incluía 3 grandes familias consanguíneas, permitió 5 limitar el locus, por los autores de la invención, al intervalo de 6 cM entre los marcadores D15S1044 y D15S143 (Lossos y col. 2006 y Stevanin y col. 2006), una región que no se solapaba con el intervalo definido en las familias estudiadas originalmente (Martinez y col. 1999), lo que mostraba por tanto heterogeneidad genética entre familias con ligamiento al 15q y que se asemeja más estrechamente al locus para esclerosis lateral amiotrófica ALS5 (Hentati y col., 1998). Debe observarse que en el trabajo publicado por Martinez y col. (1999), sólo 2 de 8 árboles 10 genealógicos presentaron el fenotipo SPG11 típico con CCD y los pacientes de estas 2 familias mostraban ligamiento con una región mayor en el cromosoma 15 que se solapaba con la región descrita en informes recientes (Lossos y col. 2006 y Stevanin y col. 2006). Más recientemente, el locus de SPG11 fue redefinido adicionalmente en la región de 4,6 cM (según el mapa genético de Marschfield, http://research.marshfieldclinic.org/genetics/GeneticResearch/compMaps.asp) entre los marcadores D15S968-15 D15S132 (Olmez y col., 2006) lo que confirma los resultados de los autores de la invención (figura 2).

[0007] Los autores de la invención han identificado ahora el gen responsable de la forma más frecuente de paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva (PEH-AR). De hecho han demostrado que la enfermedad está causada por mutaciones en el gen KIAA1840 (también conocido como FLJ21439), lo que afecta a la expresión de la 20 proteína espatacsina (Stevanin y col., 2007). Esta conclusión está respaldada por cuatro elementos de evidencia. En primer lugar, los autores de la invención han excluido 17 de aproximadamente 40 genes asignados al intervalo candidato de SPG11 después de una reducción significativa de su tamaño al intervalo de 3,2 cM (según el mapa genético de Marschfield) entre los marcadores D15S778 y D15S659 (figuras 1 a 4). El análisis de 2 de estos genes ha sido referido anteriormente (Stevanin y col., 2006). En segundo lugar, los autores de la invención han identificado 25 43 mutaciones diferentes que se segregan en 47 familias (figuras 5 a 9), en 16 de las cuales se había detectado anteriormente ligamiento con el locus de SPG11 con una puntuación LOD máxima de 28,1 altamente significativa (figuras 1 y 2), 8 de ellas ya publicadas como poseedoras de ligamiento (Casali y col., 2004; Lossos y col., 2006 y Stevanin y col., 2006). En tercer lugar, los autores de la invención han identificado mutaciones, ausentes en al menos 140 cromosomas de control, que todas ellas, condujeron a un empalme anómalo del ARN mensajero y/o que 30 condujeron a una proteína truncada. Finalmente, los autores de la invención han demostrado que todas las familias con mutaciones, excepto 2 en las que no pudo realizarse resonancia magnética (TUN2 y TUN14), presentaban el fenotipo de PEH-AR-CCD típico. Además, varias de estas familias compartían la misma mutación con haplotipos circundantes similares cuando procedían del mismo origen geográfico, lo que sugiere efectos regionales de tipo fundador (figuras 6 y 7). Las mutaciones en KIAA1840 afectaban a 47 de 91 familias de PEH-AR-CCD en el estudio 35 realizado por los autores de la invención, lo que hacía esta entidad genética muy frecuente entre PEH-AR-CCD (se había estimado un 75% en un estudio anterior, Stevanin y col., 2006). La invención proporciona por tanto la identificación del gen principal responsable de PEH-AR-CCD y probablemente de PEH-AR en general y abre de este modo nuevas oportunidades para mejorar el diagnóstico y el asesoramiento genético de dicha enfermedad. Por otra parte, la invención proporciona también un medio para mejorar el manejo de la atención médica de los pacientes 40 afectados por dicha enfermedad. Además, como la mayoría de los pacientes con paraplejia espástica presentan formas aisladas, puede contemplarse que este nuevo gen explicaría asimismo una pequeña proporción de estos pacientes. De hecho, en Europa, debido al pequeño tamaño de las familias, las enfermedades de herencia recesiva se encuentran a menudo en casos aparentemente aislados.

[0008] La presente invención se refiere así a un procedimiento ex vivo de diagnóstico o predicción de una paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva con cuerpo calloso delgado (PEH-AR-CCD), en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la detección de una mutación en el gen o la proteína KIAA1840 (espatacsina), en comparación con una población de control, en el que dicha mutación es indicativa de una paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva con cuerpo calloso delgado (PEH-AR-CCD). 50

[0009] En una realización en particular, dicha mutación de KIAA1840 se selecciona entre el grupo que consiste en:

-: las sustituciones: c.6100C>T, c.2198T>G, c.118C>T, c.1235C>G, c.2833A>G, c.1951C>T, c.5974C>T, 55

-: las deleciones: c.529-533delATATT, c.6451delG, c.6832_6833delAG, c.1203delA, c.1549_1550delCT, c.6737_6740delTTGA, c.733_734delAT, y

-: las inserciones: c.7029_7030insT, c.2850_2851insT, c.2842_2843insG; en el que cada mutación está numerada según la CDS de la KIAA1840 humana tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1.

[0010] La presente invención también se refiere a un ácido nucleico aislado que puede hibridarse específicamente en una región de la secuencia del gen KIAA1840 que contiene una mutación seleccionada entre el 5 grupo que consiste en

-: las sustituciones: c.6100C>T, c.2198T>G, c.118C>T, c.1235C>G, c.2833A>G, c.1951 C>T, c.5974C>T,

-: las deleciones: c.529-533delATATT, c.6451delG, c.6832_6833delAG, c.1203delA, c.1549_1550delCT, 10 c.6737_6740delTTGA, c.733_734delAT, y

-: las inserciones: c.7029_7030insT, c.2850_2851insT, c.2842_2843insG; en el que dicho ácido nucleico es complementario de una región de la secuencia del gen KIAA1840 que contiene una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en: 15

-: las sustituciones: c.6100C>T, c.2198T>G, c.118C>T, c.1235C>G, c.2833A>G, c.1951C>T, c.5974C>T,

-: las deleciones: c.529-533delATATT, c.6451delG, c.6832_6833delAG, c.1203delA, c.1549_1550delCT, c.6737_6740delTTGA, c.733_734delAT, y 20

[0011] Otro objeto de la invención se refiere al uso de un ácido nucleico aislado según la invención como un 25 cebador o una sonda.

[0012] Otro objeto de la invención se refiere a un ácido nucleico aislado, que comprende o consiste en una secuencia del gen KIAA1840 que contiene una o varias mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en

-: las inserciones: c.7029_7030insT, c.2850_2851insT, c.2842_2843insG o una secuencia complementaria de las mismas; en el que cada mutación está numerada según la CDS de la KIAA1840 humana tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1; y en el que dicho ácido nucleico consiste en al menos 10 nucleótidos.

[0013] Otro objeto de la invención se refiere a un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de 40 aminoácidos de KIAA1840 que contiene una o varias mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en p.Q40X, p.1177_F178delfsX178, p.M245VfsX246, p.K401 KfsX415, p.S412X, p.L517LfsX556, p.R651X, p.L733X, p.R945G, p.L950FfsX953, p.V948GfsX953, p.R1992X, p.R2034X, p.A2151 PfsX2172, p.12246_E2247delfsX2260, p.S2278LfsX2338, y p.V2344CfsX2349; en el que cada mutación está numerada según la secuencia de aminoácidos de la KIAA1840 humana tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2. 45

[0014] La invención también se refiere a un anticuerpo monoclonal o policlonal aislado que reconoce específicamente una proteína KIAA1840 que contiene una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en p.Q40X, p.1177_F178delfsX178, p.M245VfsX246, p.K401 KfsX415, p.S412X, p.L517LfsX556, p.R651X, p.L733X, p.R945G, p.L950FfsX953, p.V948GfsX953, p.R1992X, p.R2034X, p.A2151PfsX2172, p.12246_E2247delfsX2260, 50 p.S2278LfsX2338 y p.V2344CfsX2349; en el que cada mutación está numerada según la secuencia de aminoácidos de la KIAA1840 humana tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2, en el que dicho anticuerpo no realiza reacción cruzada con la proteína KIAA1840 de tipo natural.

[0015] En la presente memoria descriptiva se describe la identificación de mutaciones en el gen o la proteína 55 KIAA1840, asociadas con paraplejias espásticas hereditarias (PEH), y la aplicación diagnóstica que se beneficia de esta identificación.

[0016] En la presente memoria descriptiva se describe también un ácido nucleico aislado, que puede

hibridarse específicamente en una región de la secuencia del gen KIAA1840 que contiene una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en

-: las sustituciones: c.6100C>T, c.2198T>G, c.118C>T, c.1235C>G, c.2833A>G, c.1951C>T, c.869+1G>A, c. 1679C>G, c.2316+1G>A, c.2444G>T, c.2444+1G>C, c.2697G>A, c.5470C>T, c.5870C>G, c.6091C>T, c.6477+4 5 A>G, c.6856C>T, c.1282A>T y c.5974C>T,

-: las deleciones: c.529-533delATATT, c.6451delG, c.6832_6833delAG, c.1203delA, c.1549_1550delCT, c.6737_6740delTTGA, c.1471_1472delCT, c.1692delA, c.2716delC, c.1668delT, c.704_705delAT, c.5989_5992delCTGT, 10

[0017] c.5532_5533delCA, c.5769delT, c.6739_6742delGAGT, c.4307_4308delAA y c.733_734delAT, y

-: las inserciones: c.7029_7030insT, c.2850_2851insT, c.3741_3742insA, c.5982_5983insCTCT, c.5986_5987insT, c.3075_3076insA y c.2842_2843insG. 15

[0018] Dicho ácido nucleico aislado puede usarse como un cebador o una sonda.

[0019] En la presente memoria descriptiva se describe también un ácido nucleico aislado, que comprende una secuencia del gen KIAA1840 que contiene una o varias mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste 20 en

-: las sustituciones: c.6100C>T, c.2198T>G, c.118C>T, c.1235C>G, c.2833A>G, c.1951C>T, c.869+1G>A, c. 1679C>G, c.2316+1G>A, c.2444G>T, c.2444+1 G>C, c.2697G>A, c.5470C>T, c.5870C>G, c.6091 C>T, c.6477+4 A>G, c.6856C>T, c.1282A>T c.5974C>T, 25

-: las deleciones: c.529-533delATATT, c.6451delG, c.6832_6833delAG, c.1203delA, c.1549_1550delCT, c.6737_6740delTTGA, c.1471_1472delCT, c.1692de1A, c.2716delC, c.1668delT, c.704_705delAT, c.5989_5992delCTGT, c.5532_5533delCA, c.5769delT, c.6739_6742delGAGT, c.4307_4308delAA c.733_734delAT, y 30

-: las inserciones: c.7029_7030insT, c.2850_2851insT, c.3741_3742insA, c.5982_5983insCTCT, c.5986_5987insT, c.3075_3076insA c.2842_2843insG o una secuencia complementaria de las mismas.

[0020] En la presente memoria descriptiva se describe también un polipéptido aislado que comprende la 35 secuencia de aminoácidos de KIAA1840 que contiene una o varias mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en p.Q40X, p.1177_F178delfsX178, p.H235RfsX246, p.M245VfsX246, p.K401KfsX415, p.S412X, p.K428X, p.L491DfsX556, p.L517LfsX556, p.F556LfsX577, p.S560X, p.V564VfsX577, p.R651X, p.L733X, p.R815M, p.W899X, p.Q906SfsX920, p.R945G, p.R945GfsX950, p.L950FfsX953, p.V948GfsX953, p.E1026RfsX1029, p.P1248TfsX1264, p.Q1436RfsX1442, p.R1824X, p.S1844SfsX1857, p.S1923RfsX1950, p.S1957X, p.R1992X, p.L1995LfsX2000, 40 p.C1996LfsX1999, p.L1997_1998delfsX2056, p.R2031X, p.R2034X, p.A2151PfsX2172, p.I2246_E2247delfsX2260, p.E2247_S2248delfsX2260, p.S2278LfsX2338, p.R2286X y p.V2344CfsX2349.

[0021] En la presente memoria descriptiva se describe también un anticuerpo monoclonal o policlonal aislado que reconoce específicamente una proteína KIAA1840 que contiene una mutación seleccionada entre el grupo que 45 consiste en p.Q40X, p.I177_F178delfsX178, p.H235RfsX246, p.M245VfsX246, p.K401 KfsX415, p.S412X, p.K428X, p.L491DfsX556, p.L517LfsX556, p.F556LfsX577, p.S560X, p.V564VfsX577, p.R651X, p.L733X, p.R815M, p.W899X, p.Q906SfsX920, p.R945G, p.R945GfsX950, p.L950FfsX953, p.V948GfsX953, p.E1026RfsX1029, p.P1248TfsX1264, p.Q1436RfsX1442, p.R1824X, p.S1844SfsX1857, p.S1923RfsX1950, p.S1957X, p.R1992X, p.L1995LfsX2000, p.C1996LfsX1999, p.L1997_1998delfsX2056, p.R2031X, p.R2034X, p.A2151PfsX2172, p.12246_E2247delfsX2260, 50 p.E2247_S2248delfsX2260, p.S2278LfsX2338, p.R2286X y p.V2344CfsX2349.

[0022] En la presente memoria descriptiva se describe también el uso de un anticuerpo monoclonal o policlonal que reconoce la proteína de tipo natural para identificar formas truncadas de la proteína.

Definiciones

[0023] Una "secuencia de codificación" o una secuencia "codificante " de un producto de expresión, tal como un ARN, polipéptido, proteína o enzima, es una secuencia de nucleótidos que, cuando se expresa, da lugar a la

producción de ese ARN, polipéptido, proteína o enzima, es decir, la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos para ese polipéptido, proteína o enzima. Una secuencia de codificación para una proteína puede incluir un codón de iniciación (normalmente ATG) y un codón de terminación.

[0024] El término "gen" se refiere a una secuencia de ADN que codifica o se corresponde con una secuencia 5 de aminoácidos determinada que comprende parte o la totalidad de una o más proteínas o enzimas, y que puede incluir o no secuencias de ADN reguladoras, tales como secuencias de promotor, que determinan por ejemplo, las condiciones en las cuales se expresa el gen. Algunos genes, que no son genes estructurales, pueden transcribirse a partir de ADN a ARN, pero no se traducen en una secuencia de aminoácidos. Otros genes pueden actuar como reguladores de genes estructurales o como reguladores de transcripción de ADN. En particular, el término gen 10 puede aplicarse a la secuencia genómica que codifica una proteína, es decir, una secuencia que comprende secuencias de regulador, promotor, intrón y exón.

[0025] Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico, generalmente de al menos 10, preferentemente al menos 15, y más preferentemente al menos 20 15 nucleótidos, preferentemente no más de 100 nucleótidos, más preferentemente no más de 70 nucleótidos, y que puede hibridarse en un ADN, ADNc o ARNm genómico de KIAA1840. Los oligonucleótidos pueden marcarse mediante cualquier técnica conocida en la técnica, tal como radiomarcadores, marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, etiquetas de secuencia, etc. Un oligonucleótido marcado puede usarse como sonda para detectar la presencia de un ácido nucleico de KIAA1840 mutado. Alternativamente, pueden usarse oligonucleótidos 20 (uno o los dos de los cuales pueden estar marcados) para amplificar un ácido nucleico de KIAA1840, por ejemplo, mediante PCR (Saiki y col., 1988), con el fin de detectar la presencia de una mutación. Generalmente, los oligonucleótidos se preparan de forma sintética, preferentemente en un sintetizador de ácidos nucleicos. En consecuencia, los oligonucleótidos pueden prepararse con enlaces análogos de fosfoéster de ocurrencia no natural, tales como enlaces de tioéster, etc. 25

[0026] Una molécula de ácidos nucleicos es "hibridable" o "se hibrida" con otra molécula de ácidos nucleicos, tales como ADNc, ADN genómico o ARN, cuando una forma monocatenaria de la molécula de ácidos nucleicos puede hibridarse con la otra molécula de ácidos nucleicos en las condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de la solución (Sambrook y col., 1989). 30

[0027] Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "fidelidad" de la hibridación. En cribado preliminar de ácidos nucleicos homólogos, pueden usarse condiciones de hibridación de baja fidelidad, correspondientes a una Tf (temperatura de fusión) de 55°C, por ejemplo, 5x SSC, SDS al 0,1%, leche al 0,25%, y no formamida; o formamida al 30%, 5x SSC, SDS al 0,5%). Las condiciones de hibridación de fidelidad moderada 35 corresponden a una Tf más elevada, por ejemplo, formamida al 40%, con 5x o 6x SCC. Las condiciones de hibridación de fidelidad alta corresponden a la máxima Tf, por ejemplo, formamida al 50%, 5x o 6x SCC. SCC es NaCl 0,15 M, citrato de Na 0,015 M. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la fidelidad de la hibridación, son posibles desapareamientos entre bases. La fidelidad apropiada para hibridación de ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y 40 del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor es el grado de semejanza u homología entre dos secuencias de nucleótidos, más elevado es el valor de Tf para híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a una Tf más elevada) de las hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el orden siguiente: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han deducido ecuaciones para el cálculo de Tf (véase Sambrook y col., 1989, 9.50-9.51). 45 Para hibridación con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de los desapareamientos se hace más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook y col., 1989 II.7-11.8). La longitud mínima para un ácido nucleico susceptible de hibridación es de al menos 10 nucleótidos aproximadamente, preferentemente al menos 15 nucleótidos aproximadamente, y más preferentemente la longitud es de al menos 20 nucleótidos aproximadamente. 50

[0028] En una realización específica, el término "condiciones de hibridación estándar" se refiere a una Tf de 55°C, y usa las condiciones tal como se expone anteriormente. En una realización preferida, la Tf es de 60°C. En una realización más preferida, la Tf es de 65°C. En una realización específica, "fidelidad alta" se refiere unas condiciones de hibridación y/o de lavado a 68°C en 0,2 X SSC, a 42°C en formamida al 50%, 4 X SSC, o en 55 condiciones que permiten niveles de hibridación equivalentes a los observados en cualquiera de estas dos condiciones.

[0029] Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, un "cebador de amplificación" es un

oligonucleótido para la amplificación de una secuencia diana por extensión del oligonucleótido después de hibridación a la secuencia diana o por ligamiento de múltiples oligonucleótidos que son adyacentes cuando se hibrida a la secuencia diana. Al menos una parte del cebador de amplificación se hibrida a la diana. Esta parte se refiere como secuencia de unión diana y determina la especificidad de diana del cebador. Además de la secuencia de unión diana, algunos procedimientos de amplificación requieren secuencias de unión no diana especializadas en 5 el cebador de amplificación. Estas secuencias especializadas son necesarias para que prosiga la reacción de amplificación y normalmente sirven para añadir la secuencia especializada a la diana. Por ejemplo, los cebadores de amplificación usados en la Amplificación de Desplazamiento de Cadena (SDA, Strand Displacement Amplification) incluyen un sitio 5’ de reconocimiento de endonucleasa de restricción para la secuencia de unión diana (patente de EE.UU. nº 5.455.166 y patente de EE.UU. nº 5.270.184). Los cebadores de amplificación basados en Amplificación 10 Basada en Ácidos Nucleicos (NASBA, Nucleic Acid Based Amplification), replicación de secuencia autosostenida (3SR) y transcripción necesitan un promotor de ARN polimerasa ligado a la secuencia de unión diana del cebador. El ligamiento de dichas secuencias especializadas a una secuencia de unión diana para su uso en una reacción de amplificación seleccionada es rutinaria en la técnica. En cambio, procedimientos de amplificación como la PCR que no requieren secuencias especializadas en los extremos de la diana emplean generalmente cebadores de 15 amplificación que consisten en secuencia de unión de sólo diana.

[0030] Tal como se usan en la presente memoria descriptiva, los términos "cebador" y "sonda" se refieren a la función del oligonucleótido. Un cebador se extiende normalmente por polimerasa o ligamiento después de hibridación a la diana mientras que una sonda normalmente no lo hace. Un oligonucleótido hibridado puede 20 funcionar como una sonda si se usa para capturar o detectar una secuencia diana, y el mismo oligonucleótido puede actuar como un cebador cuando se emplea como una secuencia de unión diana en un cebador de amplificación. Por tanto se observará que cualquiera de las secuencias de unión diana desveladas en la presente memoria descriptiva para amplificación, detección o cuantificación de KIAA1840 puede usarse como sondas de hibridación o como secuencias de unión diana en cebadores para la detección o amplificación, ligados opcionalmente a una secuencia 25 especializada requerida por la reacción de amplificación seleccionada o para facilitar la detección.

[0031] Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "gen KIAA1840" (o sus sinónimos: FLJ21439, ENSG00000104133 o SPG11) denota un gen KIAA1840 de cualquier especie, especialmente humana, pero también otros mamíferos o vertebrados a los que pueden aplicarse los procedimientos de la invención. EL gen 30 KIAA1840 humano codifica una gran proteína de 2.443 aminoácidos (aa) de función desconocida que los autores de la invención han llamado Espatacsina (SEQ ID NO: 2). El gen KIAA1840 de Homo sapiens está localizado en el cromosoma 15 y su secuencia de codificación (CDS) está depositada en Genebank con el número de acceso NM_025137, o AB058743 (cadena directa 5’-3’ mostrada SEQ ID NO: 1). El gen KIAA1840 humano comparte un 85% de identidad con la proteína homóloga del perro, y el 76% y el 73% de identidad con los homólogos de ratón y 35 rata y el 59% con el homólogo del pollo. La homología es inferior al 25% con proteínas ortólogas, de tamaños inferiores, en Tetraodon y Drosophila. Las proteínas homólogas de KIAA1840 en la base de datos NCBI son: perro XP_544657, gallo XP_413940.1, ratón BAE27954, rata XP_242139.3, y en la base de datos Ensembl; Drosophila CG13531, Tetraodon GSTENG00003909001. El gen KIAA1840 humano contiene 40 exones que se extienden a 101 kbases de ADN genómico en el cromosoma 15q21.1. La estructura de intrón-exón de la cadena complementaria del 40 gen KIAA1840 se indica adicionalmente en la tabla 1 mostrada a continuación y en la figura 5.

Tabla 1: Límites de exón-intrón del gen KIAA1840 humano (según la base de datos Ensembl)

Nº: Exón/intrón Posición en la SEQ ID NO: 1 Longitud (pb) Secuencia

: Secuencia en la dirección 5’ ..........cgacgcagtcaggttccggcgaaagtgaccggaagtaaccgccgggccaa

: ENSE00001183257

: Intrón 1-2 2.774 gtaagtgctgagggagagttgggcc........aataaatctaaactttttttcttag

: ENSE00001183253

: Intrón 2-3 1.128 gtaagtatctacaggtggtctttca.........gaaataatatccttttgttttgtag

: ENSE00001183250

: Intrón 3-4 1.782 gtatccttggtggtagaagtgttga........attttcttttaactctaactaaaag

: ENSE00001183246

: Intrón 4-5 4.828 gtatgtagatgactgcagtttctaa........tgtctatcattatttttaaatgtag

: ENSE00001183241

: Intrón 5-6 gtacagaaacttccttttcatgtag.......aagttatattttaccttgtttccag

: ENSE00001183238

: Intrón 6-7 2.479 gtgagactgtcttgtattagattga........aagctaacttttatttttcctatag

: ENSE00001183236

: Intrón 7-8 15.228 gtaacagaattaaatgcccaagaac..........atttttattttcctcctcatttcag

: ENSE00001105929

: Intrón 8-9 4.116 gtaagtggaataaagatttctacat..........gttaatttctttggttctttctcag

: ENSE00001105933

: Intrón 9-10 gtaagaatagcagctaggaaggggg......attggcacattggtattttccatag

: ENSE00001105923

: Intrón 10-11 2.161 gtaagtacgaataatcatcacttct.......aaggcaaacgtttttcttttcctag

: ENSE00001105941

: Intrón 11-12 3.531 gtgagtggtgtaatccataaagtct.......ttttggttttctatgtttattttag

: ENSE00001183220 GGGTTTGATGTAAAAGGCCAATTGCTCAAGATCTGCTTCTATACAACTAATAAAAATATACGTGACTTTTTG

: Intrón 12-13 gtaggtaaaggtgagactacatagt.......ctgctttaattactttttattcaag

: ENSE00001183213

: Intrón 13-14 gtagtctcattagtcctcttttgat......aaaaaatttatatcactgtttttag

: ENSE00001183208

: Intrón 14-15 1.355 gcaagtgtgagagagcctgaaatat..........ttaaaatgtgttttttttcatgtag

: ENSE00001183204

: Intrón 15-16 4.623 gtattataactgttgaactaatacc......tgacatcctataaatctgtccatag

: ENSE00001047610

: Intrón 16-17 1.826 gtgagtactgagaatgcatttgtcc........aggtttttgtttgttttatatacag

: ENSE00001287244

: Intrón 17-18 2.444 gtatgggtatactgtattaaacaca........aaaaacactgtcttttattttccag

: ENSE00001047605 ATCCCAAACTGATCTTCCAGGCTAGCCTTGCAAATGCTCAGATTTTGATTCCCACCAATCAGGCCAGTGTAAAGTATGCTATTGGAAGGACATACCCTCCTGGCCCTTGCTACTACAATGTATTCTCCTGGGGGTGTCAGTCAG

: Intrón 18-19 2.234 gtatggatagcactttatgacaaaa.......acctgttatctgtttttttacttag

: ENSE00001047617

: Intrón 19-20 2.352 gtacagtatttaggtggccaatatt........ctgtttaacttttcccctttttcag

: ENSE00001047612 TCATTATCACCCTTTGATCCTAGCAGATTGTTTGGCTGGCAGTCTGCTAACACACTAGCTATAGGAG

: Intrón 20-21 5.392 gtaagtcatcatgggtacttcttga.........taatattgttttactttccccctag

: ENSE00001047594

: Intrón 21-22 1.630 gtgagtatttaaaatataattttgt.....tgattttgattcctttctttttcag

: ENSE00001047598

: Intrón 22-23 gtacagcaccttttatctggcctgc........attttgttgtttatatttcttacag

: ENSE00001047622

: Intrón 23-24 1.321 gtttgtgagttgcagtctcagcctc........cccccacctctaattctgattatag

: ENSE00001047619

: Intrón 24-25 gtaagccactaattgttagcagtca........tttaatcatctgatatgccttctag

: ENSE00001047603

: Intrón 25-26 gtgaggatcatgagaagcctgaagt........tgttattttatttatcccggcag

: ENSE00001047590

: Intrón 26-27 2.820 gtagtgatagttgcttcacttcttt.........atttttttcaaactctttgtcaaag

: ENSE00001047613

: Intrón 27-28 2.916 gtaagttggaattatggtgctcttt.........ctaagcttctctttttctttcatag

: ENSE00001047595

: Intrón 28-29 3.401 gtaagacaatccttacagttaagtt..........ttatatccttttctctttggcacag

: ENSE00001047608

: Intrón 29-30 1.077 gtatcatcggtcttttttttttttt.........aaatctgctttgttaaatttcacag

: ENSE00001047607

: Intrón 30-31 8.772 gtaagtgaaggagatcagatggccc.........ccctcagacttgtatttgcttccag

: ENSE00001047614 1.156

: Intrón 31-32 gtatgtgccaaggggtggggctcct.........ttgactggctttgtcttcctctcag

: ENSE00001123435

: Intrón 32-33 gtgccctaccccccggggattccca........cctgtcttcacacctctctgtacag

: ENSE00001123426

: Intrón 33-34 2.024 gtaagttattgacctttttcttaca.........atcttaccagtgcccaccctcccag

: ENSE00001123415

: Intrón 34-35 1.019 gtaagtagccccctcaaccccagtc.........tgcgagctgtcctcccacttcacag

: ENSE00001123405

: Intrón 35-36 1.805 gtaggtgcaaagtaatgagctccag.......gctttttcccttttattctgggacag

: ENSE00001123397

: Intrón 36-37 1.118 gtgagtgaggtcacagccacactac.........caaatcttctttatttcccctacag

: ENSE00.000684756

: Intrón 37-38 gtaacccaaaggcttttttcagact..........gtgcctctccacccttgttcctcag

: ENSE00.000684735

: Intrón 38-39 1.155 gtgagcaagaaagcaaactgtagcc..........gtccttcttcacctctccttttaag

: ENSE00.000684706

: Intrón 39-40 1.245 gtaagtattaaaagttgactgtaaa..........ctgtacattatgtttctttatctag

: ENSE00.000884381

: Secuencia en la dirección 3’ aattcagtgtatgtcattattactgctaaggaaatcttagcccttgtctg.........

[0032] Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "espatacsina" denota la espasticidad con proteína del síndrome del cuerpo calloso delgado, que es codificada por el gen KIAA1840. La secuencia de la forma humana se muestra en la SEQ ID NO: 2.

[0033] Los términos "mutante" y "mutación" se refieren a cualquier cambio detectable en el material genético, por ejemplo, ADN, ARN, ADNc, o cualquier proceso, mecanismo o resultado de dicho cambio. Ello incluye mutaciones génicas, en las que la estructura (por ejemplo, secuencias de ADN) de un gen está alterada, cualquier gen o ADN que proceda de cualquier proceso de mutación y cualquier producto de expresión (por ejemplo, proteína o enzima) expresado por una secuencia modificada de gen o ADN. Generalmente una mutación se identifica en un 10 sujeto por comparación de la secuencia de un ácido nucleico o polipéptido expresado por dicho sujeto con el ácido nucleico o polipéptido correspondiente expresado en una población de control. Una mutación en el material genético también puede ser "silenciosa", es decir, la mutación no produce una alteración de la secuencia de aminoácidos del producto de expresión.

[0034] En el contexto de la presente solicitud, las mutaciones identificadas en el gen KIAA1840 se designan de acuerdo con la nomenclatura de Den Dunnen y col. 2001 (http://www.genomic.unimelb.edu.au/mdi/mutnomen/). Tal como definen Dunnen y Antonarakis en el nivel de ácidos nucleicos, las sustituciones se designan mediante "c.posición(nt)>(nt)", por ejemplo, "c.118C>G” denota que en el nucleótido 118 de la secuencia de referencia C se cambia por una G. La mutación en el nivel de proteínas se denota por p.Q40X: que significa que una glutamina (Q) 20 en la posición 40 codificada por CAG es sustituida por un codón de TERMINACIÓN (TAG) (Q40X). Las deleciones se designan por "del" después del intervalo de deleción (seguido por los nucleótidos suprimidos). Por ejemplo, 529_533delATATT denota una deleción ATATT de los nucleótidos 529 a 533. La consecuencia de esta deleción, p.H77_F178delfsX, es una deleción de aminoácidos en las posiciones 177 y 178 y un marco de lectura (fs) en la secuencia de codificación que conduce a la aparición de un codón de TERMINACIÓN prematuro (X). Una 25 nomenclatura alternativa consiste en indicar la posición del codón de terminación en la proteína resultante después de la X; p.I177_178delfsX178 indica que el codón de terminación resultante de la mutación está en el codón 178. Las inserciones se designan por "ins”, seguido por los nucleótidos insertados. Por ejemplo, c.7029_7030insT denota que se ha insertado una T después del nucleótido 7029. Esto conduce a la sustitución de valina (V) por cisteína (C) en la posición 2344 y a un marco de lectura de la secuencia de codificación y un codón de TERMINACIÓN 30 prematuro en el aminoácido 2349 (fsX): p.V2344CfsX o p.V2344CfsX2349. Cuando se predice que una mutación alterará el empalme del ARNm debido a que la variante modifica un nucleótido de la secuencia de consenso para empalme (sitio aceptor o donador), la "r.?" denota que las consecuencias de la mutación no podrían verificarse en el nivel de ARN, aunque es probable (tal como se verifica en http://rulai.cshl.edu/new_alt_exon_db2/HTML/puntuación.html). 35

[0035] El término "paraplejias espásticas hereditarias (PEH)" denota trastornos mendelianos heterogéneos genéticamente caracterizados por debilidad, espasticidad y pérdida de sentido de la vibración en las extremidades inferiores. El término "paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva" o "PEH-AR" denota paraplejia espástica que se transmite como un rasgo autosómico recesivo. Los pacientes con PEH o PEH-AR pueden tener un fenotipo 40 puro, o, más a menudo, un fenotipo complejo que se asocia a varios signos neurológicos (ataxia cerebelosa, retraso mental, neuropatía periférica, etc.). El término "PEH-AR-CCD" denota un PEH-AR con cuerpo calloso delgado asociado normalmente con déficit mental o cognitivo y neuropatía periférica. Las familias sin CCD demostrado pueden tener también mutaciones en este gen bien por una lenta progresión de la enfermedad en el paciente o porque la resonancia magnética (RM) no pudo realizarse por negativa del paciente o por imposibilidad (pacientes 45 muy alejados de las ciudades en el norte de África, como sucede con las familias FSP400, FSP393 y FSP343).

[0036] Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "sujeto" denota un mamífero, tal como un roedor, un felino, un cánido y un primate. Preferentemente el sujeto según la invención es un ser humano.

Mutaciones en el gen KIAA9840 y proteína espatacsina

[0037] Los autores de la invención identificaron varias mutaciones en el gen KIAA1840.

[0038] De hecho se identificaron 43 mutaciones diferentes en el gen KIAA1840 humano en 47 familias, 55 incluyendo las 16 con ligamiento, todas en el estado homocigoto, excepto en 16 grupos de ascendencia. En la secuencia de codificación había mutaciones sin sentido (n = 13), deleciones (n = 17), inserciones (n = 7) o mutaciones en el sitio de empalme (n = 6), y en todos los casos produjeron teóricamente un ARNm con empalme anómalo o una proteína truncada.

[0039] En una familia, con ligamiento con una puntuación LOD multipunto máxima de 3,1 para SPG11, se segregaron mutaciones R945G de sentido erróneo en el estado homocigoto en los dos pacientes y no se detectó en 150 cromosomas de control. La mutación probablemente no sólo afecta a la naturaleza del aminoácido. La posición de esta variante estaba en la secuencia de consenso del sitio de empalme en 5’ (2 bases antes del final del exón 5 15). La puntuación de la secuencia de empalme en 5’ cambió de 4,9 para el tipo natural a 2,7 para la variante (Base de datos de empalmes alternativos: http://rulai.cshl.edu/new alt exon db2/HTML/score.html) lo que sugiere que esta variante podía actuar tanto en el nivel del ARN (efecto de empalme) como en el nivel de la proteína (cambio de sentido erróneo). De hecho, este hecho se confirmó mediante secuenciación directa (usando los cebadores GCTCTGTGGTGGGATCAACT y TGCTTACACTGGCCTGATTG) en ARNm aislado a partir de linfoblastos de un 10 miembro de una familia afectada (FSP670-5) en el que se genera un sitio de empalme alternativo en la dirección 3’ en el intrón 15 que condujo a una inserción de 65 pb y a un codón de terminación prematuro (c.2833A>G, r.2834+1_2834+65ins, p.R945GfsX950). Sin embargo, no puede excluirse que el empalme se produzca en su lugar normal en una pequeña cantidad de ARN mensajero y que se genere una proteína de longitud completa con la variante G en la posición 945. Análogamente, la mutación c.2444G>T, p.R815M afecta probablemente no sólo al 15 aminoácido sino también al empalme del exón 13 ya que la puntuación del empalme se reduce de 3,7 a 0,2 para la mutación. Además, c.869+1G>A, c.2316+1G>A, c.2444+1G>C y c.6477+4A>G afectan todos claramente a la secuencia de consenso del empalme del aceptor (véanse las puntuaciones de empalme en la tabla 2) y probablemente alteran el empalme de los exones 4, 12, 13 y 34, respectivamente. En la Tabla 2 siguiente se presentan las mutaciones identificadas por los autores de la invención. 20

Tabla 2: Mutaciones identificadas en la CDS de KIAA1840 (SEQ ID NO: 1) y proteína (SEQ ID NO: 2)

Exones: Mutaciones Código de familia (orígenes) en el estado homocigoto Código de familia (orígenes) en el estado heterocigoto

: Variantes de nucleótidos Variantes de ARNm o proteína SEQ ID NO:

: c.118C>T, p.Q40X FSP672 (Israel)

: c.529_533delATATT p.1177_F178>S977fsX1 78 FSP386 (Portugal) FSP754 (Portugal) FSP831 (Portugal) ITA17 (Brasil)

: c.704 705delAT p.H235RfsX246 SPD199 (Turquía)

: c.733_734delAT, p.M245VfsX246 TUN2 (Túnez) TUN3 (Túnez) TUN4 (Túnez) TUN22 (Túnez) FSP117 (Francia)

Intrón 4: c.869+1G>A r.? Descenso de puntuación de empalme de 9,8. a -0,9 FSP847 (Argentina)

: c.1203delA, p.K401KfsXA15 PE (Italia)

: c.1235C>G, p.S412X FSP393 (Portugal)

: c.1282A>T p.K428X FSP830 (Portugal)

: c.1471_1472delCT p.L491DfsX556 FSP522 (Francia)

: c.1549_1550delCT, p.L517LfsX556 FSP343 (Argelia) (no típico)

: c.1668delT p.F556LfsX577 SAL646 (Francia)

: c.1679C>G p.S560X ITA16SB (Italia)

: c.1692delA p.V564VfsX577 DKD (Italia)

: c.1951C>T, p.R651X MP (Italia) FSP683 (Rumania) ITA28VAC (Italia)

: c.2198T>G, p.L733X OS (Italia)

Intrón 12: c.2316+1G>A r.? Descenso de puntuación de empalme de 6,2 a -4,5 FSP892 (Noruega)

: c.2444G>T p.R815M y/o r.? Descenso de puntuación de empalme de 3,7 a 0,2 ITA28VAC (Italia)

Intrón 13: c.2444+1 G>C r.? Descenso de puntuación de empalme de 3,7 a -7 ITA16 (Brasil)

: c.2697G>A p.W899X ITA10 (Italia)

: c.2716delC p.Q906SfsX920 ITA9 (Italia)

: c.2833A>G r.2834+1_2834+65ins, p.R945G o p.R945GfsX950 Descenso de puntuación de empalme de 4,9 a 2,7 FSP670 (Israel) ITA14 (Italia)

: c.2842_2843insG, p.V948GfsX953 PE (Italia)

: c.2850_2851insT, p.L950FfsX953 MP (Italia)

: c.3075_3076insA p.E1026RfsX1029 ITA8 (Alemania)

: c.3741 3742insA p.P1248TfsX1264 ITA17 (Brasil)

: c.4307_4308delAA p.Q1436RfsX1442 FSP398 (Israel) ITA16 (Brasil)

: c.5470C>T p.R1824X ITA8 (Alemania)

: c.5532_5533delCA p.S1844SfsX1857 FSP522 (Francia)

: c.5769delT p.S1923RfsX1950 FSP838 (Arabia Saudí)

: c.5870C>G p.S1957X ITA16SB (Italia)

: c.5974C>T, p.R1992X FSP117 (Francia)

: c.5982_5983insCTCT p.L1995LfsX2000 DKD (Italia)

: c.5986_5987insT p.C1996LfsX1999 FSP398 (Israel)

: c.5989_5992delCTGT p.L1997_Y1998>M1997f sX2056 FSP683 (Rumania)

: c.6091C>T p.R2031X ITA1 (Turquía)

: c.6100C>T, p.R2034X FSP446 (Marruecos), FSP221 (Argelia) FSP732 (Argelia) FSP400 (Argelia) FSP792 (Argelia) FSP845 (Marruecos) TUN9 (Túnez) TUN12 (Túnez) TUN14 (Túnez)

: c.6451delG, p.A2151PfsX2172 SAL1608 (Francia)

Intrón 34: c.6477+4 A>G r.? Descenso de puntuación de empalme de 9,6 a 6,6 FSP830 (Portugal)

: c.6737_6740delTTGA, p.12246_E2247>S2246f sX2260 FSP920 (Japón) FSP343 (Argelia)

: c.6739_6742delGAGT p.E2247_S2248>L2247f sX2260 SAL646 (Francia)

: c.6832_6833delAG, p.S2278LfsX2338 FSP75 (Portugal)

: c.6856C>T p.R2286X ITA14 (Italia)

: c.7029_7030insT, p.V2344CfsX2349 FSP515 (Túnez)

[0040] Cada mutación se numera en la presente memoria descriptiva según la CDS de la KIAA1840 humana y la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.

[0041] En la presente memoria descriptiva se describe un ácido nucleico aislado que puede hibridarse específicamente en una región de la secuencia de codificación del gen KIAA1840 (SEQ ID NO: 1) que contiene una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en

-: las sustituciones c.6100C>T, c.2198T>G, c.118C>T, c.1235C>G, c.2833A>G, c.1951C>T, c.869+1G>A, c. 5 1679C>G, c.2316+1G>A, c.2444G>T, c.2444+1G>C, c.2697G>A, c.5470C>T, c.5870C>G, c.6091C>T, c.6477+4 A>G, c.6856C>T, c.1282A>T y c.5974C>T,

-: las deleciones: c.529-533delATATT, c.6451delG, c.6832_6833delAG, c.1203delA, c.1549_1550delCT, c.6737_6740delTTGA, c.1471_1472delCT, c.1692delA, c.2716delC, c.1668delT, c.704_705delAT, 10 c.5989_5992delCTGT, c.5532_5533delCA, c.5769delT, c.6739_6742delGAGT, c.4307_4308delAA y c.733_734delAT, y

[0042] En una realización de este aspecto de la invención, el ácido nucleico aislado según la invención consiste en al menos 10 nucleótidos, preferentemente 20 nucleótidos, más preferentemente 40 nucleótidos.

[0043] En la presente memoria descriptiva se describe un ácido nucleico aislado que puede hibridarse 20 específicamente en una región que consiste en 10 nucleótidos en la dirección 5’ y 10 nucleótidos en la dirección 3’ de una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en

-: las sustituciones: c.6100C>T, c.2198T>G, c.118C>T, c.1235C>G, c.2833A>G, c.1951C>T, c.869+1G>A, c. 1679C>G, c.2316+1G>A, c.2444G>T, c.2444+1G>C, c.2697G>A, c.5470C>T, c.5870C>G, c.6091C>T, c.6477+4 25 A>G, c.6856C>T, c.1282A>T c.5974C>T,

-: las deleciones: c.529-533delATATT, c.6451delG, c.6832_6833delAG, c.1203delA, c.1549_1550delCT, c.6737_6740delTTGA, c.1471_1472delCT, c.1692delA, c.2716delC, c.1668delT, c.704_705delAT, c.5989_5992delCTGT, c.5532_5533delCA, c.5769delT, c.6739_6742delGAGT, c.4307_4308delAA c.733_734delAT, 30 y

-: las inserciones: c.7029_7030insT, c.2850_2851insT, c.3741_3742insA, c.5982_5983insCTCT, c.5986_5987insT, c.3075_3076insA c.2842_2843insG,

de la secuencia del gen KIAA1840.

[0044] Preferentemente, "que puede hibridarse específicamente" significa "que puede hibridarse en condiciones de 68°C en 0,2 X SSC, a 42°C en formamida al 50%, 4 X SSC, o en condiciones que permiten niveles de hibridación equivalentes a los observados en cualquiera de estas dos condiciones". 40

[0045] En una forma alternativa, una secuencia "que puede hibridarse específicamente" a una secuencia diana se refiere a una secuencia que muestra un porcentaje de identidad de secuencia con la secuencia complementaria de dicha secuencia diana de al menos aproximadamente el 70%, preferentemente al menos aproximadamente el 80%, más preferentemente al menos aproximadamente el 90%, con la máxima preferencia al 45 menos aproximadamente el 95%.

[0046] Dicho ácido nucleico según la invención puede ser un oligonucleótido.

[0047] Preferentemente, dicho ácido nucleico u oligonucleótido es complementario de una región del gen 50 KIAA1840 que contiene al menos una de las mutaciones identificadas.

[0048] En una realización de este aspecto de la invención, el ácido nucleico aislado según la invención consiste en al menos 10 nucleótidos, preferentemente 20 nucleótidos, más preferentemente 40 nucleótidos.

[0049] Dicho ácido nucleico según la invención puede usarse ventajosamente como un cebador o una sonda.

[0050] En la presente memoria descriptiva se describe también un ácido nucleico aislado, que comprende o consiste en una secuencia de codificación del gen KIAA1840 (SEQ ID NO: 1) que contiene una o varias mutaciones

seleccionadas entre el grupo que consiste en

-: las sustituciones: c.6100C>T, c.2198T>G, c.118C>T, c.1235C>G, c.2833A>G, c.1951C>T, c.869+1G>A, c. 1679C>G, c.2316+1G>A, c.2444G>T, c.2444+1G>C, c.2697G>A, c.5470C>T, c.5870C>G, c.6091C>T, c.6477+4 A>G, c.6856C>T, c.1282A>T c.5974C>T, 5

-: las deleciones: c.529-533delATATT, c.6451delG, c.6832_6833delAG, c.1203delA, c.1549_1550delCT, c.6737_6740delTTGA, c.1471_1472delCT, c.1692delA, c.2716delC, c.1668delT, c.704_705delAT, c.5989_5992delCTGT, c.5532_5533delCA, c.5769delT, c.6739_6742delGAGT, c.4307_4308delAA c.733_734delAT, y 10

-: las inserciones: c.7029_7030insT, c.2850_2851 insT, c.3741_3742insA, c.5982_5983insCTCT, c.5986_5987insT, c.3075_3076insA c.2842_2843insG

o una secuencia complementaria de las mismas. 15

[0051] En una realización de este aspecto de la invención, el ácido nucleico aislado según la invención consiste en al menos 10 nucleótidos, preferentemente 20 nucleótidos, más preferentemente 40 nucleótidos.

[0052] En la presente memoria descriptiva se describe también un polipéptido aislado que comprende la 20 secuencia de polipéptidos de KIAA1840 que contiene una o varias mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en p.Q40X, p.1177_F178delfsX178, p.H235RfsX246, p.M245VfsX246, p.K401 KfsX415, p.S412X, p.K428X, p.L491DfsX556, p.L517LfsX556, p.F556LfsX577, p.S560X, p.V564VfsX577, p.R651X, p.L733X, p.R815M, p.W899X, p.Q906SfsX920, p.R945G, p.R945GfsX950, p.L950FfsX953, p.V948GfsX953, p.E1026RfsX1029, p.P1248TfsX1264, p.Q1436RfsX1442, p.R1824X, p.S1844SfsX1857, p.S1923RfsX1950, p.S1957X, p.R1992X, p.L1995LfsX2000, 25 p.C1996LfsX1999, p.L1997_1998delfsX2056, p.R2031X, p.R2034X, p.A2151PfsX2172, p.12246_E2247delfsX2260, p.E2247_S2248delfsX2260, p.S2278LfsX2338, p.R2286X y p.V2344CfsX2349.

Método diagnóstico

[0053] Los autores de la invención han demostrado además que los mutantes de KIAA1840 se asocian con paraplejias espásticas hereditarias (PEH) que se caracterizan por debilidad, espasticidad y a menudo pérdida del sentido de la vibración en las extremidades inferiores. Más en particular, los autores de la invención han demostrado que las mutaciones de KIAA1840 tal como se describe anteriormente están correlacionadas en todos los pacientes con deterioro mental leve, un cuerpo calloso delgado (CCD) (PEH-AR-CCD) y frecuente polineuropatía (72% de los 35 pacientes) en una serie de 45 familias con los criterios clínicos completos de SPG11. En los otros 2 grupos de ascendencia no pudo disponerse de pruebas de imágenes cerebrales para verificar la presencia de un cuerpo calloso delgado (TUN2 y TUN14).

[0054] Por tanto en la presente memoria descriptiva se describe un procedimiento ex vivo de diagnóstico o 40 predicción de una paraplejia espástica hereditaria (PEH) en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la detección de una mutación en el gen o la proteína KIAA1840 (espatacsina), en comparación con una población de control, en el que la presencia de una mutación es indicativa de una paraplejia espástica hereditaria (PEH).

Ensayos de ácidos nucleicos: 45

[0055] Según una primera realización las mutaciones pueden detectarse mediante el análisis de una molécula de ácidos nucleicos de KIAA1840. En el contexto de la invención, las moléculas de ácidos nucleicos de KIAA1840 incluyen ARNm, ADN genómico y ADNc obtenido de ARNm. El ADN o el ARN pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Estos pueden usarse, por ejemplo, para la detección por amplificación y/o 50 hibridación con una sonda.

[0056] Así, en la presente memoria descriptiva se describe un procedimiento ex vivo de diagnóstico o predicción de una paraplejia espástica hereditaria (PEH), en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la etapa que consiste en la detección de una mutación de KIAA1840 en una muestra de ácidos nucleicos obtenida a partir del 55 sujeto, en el que la presencia de una mutación es indicativa de una paraplejia espástica hereditaria (PEH).

[0057] La muestra de ácidos nucleicos puede obtenerse de cualquier fuente celular o biopsia de tejidos. Entre los ejemplos no limitativos de fuentes celulares disponibles se incluyen sin limitación glóbulos de la sangre, células

bucales, células epiteliales, fibroblastos o cualquier célula presente en un tejido obtenido por biopsia o post mórtem. También pueden obtenerse células de los líquidos corporales, tales como sangre, plasma, suero, linfa, etc. El ADN puede extraerse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, tal como se describe en Sambrook y col., 1989. El ARN también puede aislarse, por ejemplo, de biopsia de tejidos, usando procedimientos estándar bien conocidos para el experto en la materia tales como extracción de tiocianato-fenolcloroformo de guanidinio 5 (Chomocyznski y col., 1987).

[0058] Una mutación de KIAA1840 según la invención puede encontrarse y localizarse en muchos exones, entre ellos el exón 1 y el exón 39 (Tabla 2).

[0059] Las mutaciones de KIAA1840 pueden detectarse en una muestra de ARN o ADN, preferentemente después de la amplificación. Por ejemplo, el ARN aislado puede someterse a transcripción inversa y amplificación acopladas, por ejemplo transcripción inversa y amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), usando cebadores de oligonucleótidos específicos que son específicos para un sitio mutado o que permiten la amplificación de una región que contiene el sitio mutado. Según una primera alternativa, las condiciones para 15 hibridación de cebadores pueden elegirse de manera que se garantice una transcripción inversa específica (cuando resulte apropiado) y una amplificación; de manera que la aparición de un producto de amplificación sirva como diagnóstico de la presencia de una mutación de KIAA1840 en particular. En caso contrario, el ARN puede ser sometido a transcripción inversa y amplificación, o bien el ADN puede ser amplificado, después de que pueda detectarse un sitio mutado en la secuencia amplificada por hibridación con una sonda adecuada o por secuenciación 20 directa, o cualquier otro procedimiento apropiado conocido en la técnica. Por ejemplo, un ADNc obtenido de ARN puede ser clonado y secuenciado para identificar una mutación en una secuencia de KIAA1840.

[0060] Actualmente se dispone de numerosas estrategias para análisis de genotipos (Antonarakis y col., 1989; Cooper y col., 1991; Grompe, 1993). De forma sucinta, puede someterse a ensayo la molécula de ácidos 25 nucleicos en busca de la presencia o la ausencia de un sitio de restricción. Cuando una mutación de sustitución de bases crea o suprime el sitio de reconocimiento de una enzima de restricción, ello permite una prueba enzimática directa simple para la mutación. Entre las estrategias adicionales se incluyen, pero no se limitan a, secuenciación directa, análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP); hibridación con oligonucleótidos específicos de alelos (ASO) que son cortas sondas sintéticas que se hibridan sólo a una secuencia perfectamente 30 emparejada en condiciones de hibridación adecuadamente restringidas; PCR específica de alelos; PCR que usa cebadores mutágenos; PCR de ligasas, escisión HOT; electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante de temperatura (TGGE), polimorfismo conformacional monocatenario (SSCP) y cromatografía líquida de alto rendimiento desnaturalizante (DHPLC) (Kuklin y col., 1997). La secuenciación directa puede conseguirse mediante cualquier procedimiento, lo que incluye sin limitación 35 secuenciación química, usando el método de Maxam-Gilbert; por secuenciación enzimática, usando el método de Sanger; secuenciación por espectrometría de masas; secuenciación usando una tecnología de chips (véase, por ejemplo, Little y col., 1996); y PCR cuantitativa en tiempo real. Preferentemente, primero se somete el ADN de un sujeto a amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores de amplificación específicos. Sin embargo se dispone de otros varios procedimientos, lo que permite estudiar el ADN 40 independientemente de la PCR, como, por ejemplo, la amplificación de círculo rodante (RCA), InvaderTMassay, o ensayo de ligamiento a oligonucleótidos (OLA). El OLA puede usarse para revelar las mutaciones de sustitución de bases. Según este procedimiento, se construyen dos oligonucleótidos que se hibridan con secuencias adyacentes en el ácido nucleico diana, de manera que la unión se sitúa en la posición de la mutación. La ligasa de ADN se unirá de forma covalente con los dos oligonucleótidos sólo si están perfectamente hibridados (Nickerson y col., 1990). 45

[0061] Los autores de la invención diseñaron una serie de cebadores, manualmente o usando Oligo6 (MBI, Cascade, CO), con el fin de amplificar todos los exones de codificación de 18 genes del intervalo candidato (cebadores y condiciones disponibles a petición), lo que incluía el gen KIAA1840 mutado (véase Tabla 4). A continuación se purificaron los fragmentos amplificados por PCR de ADN genómico usando exonucleasa 1 (New 50 England Biolabs, 2 U/5 l de producto de PCR) y fosfatasa alcalina de gamba (Roche, 1 U/5 l de producto de PCR) y se secuenciaron usando el método terminador de didesoxi fluorescente (BigDye v3, Applied Biosystem) en un secuenciador ABI-3730 automatizado según las recomendaciones del fabricante. Con el uso del paquete de software SeqScape (Applied Biosystems), se alinearon las secuencias y se compararon con las secuencias de consenso. 55

Ensayos de proteínas

[0062] Según una segunda realización dicha mutación puede detectarse en la proteína KIAA1840 o puede

detectarse una forma truncada de la proteína KIAA1840, en comparación con una población de control.

[0063] Todas las mutaciones identificadas del gen KIAA840 crean algunas deleciones de la parte del extremo C de la proteína espatacsina, en algunos casos debido a un empalme aberrante (figura 5). Estas deleciones producen proteínas truncadas de las secuencias SEQ ID NO: 149 a SEQ ID NO: 164 y SEQ ID NO: 166 a SEQ ID 5 NO: 188, respectivamente. Esto se debe a un empalme aberrante, que aunque muy probable, no podría precisarse ya que no es posible evidenciar la modificación del empalme directamente en el ARNm, excepto en la familia FSP670 (r.2834+1_2834+65ins, p.R945GfsX950). Sin embargo, no puede excluirse que pueda sintetizarse un fragmento corto de proteína debido a la activación de nuevas ATG después del codón de terminación.

[0064] Dicha mutación puede detectarse según cualquier procedimiento apropiado conocido en la técnica. En particular puede ponerse en contacto una muestra, como una biopsia de tejido, obtenida de un sujeto con anticuerpos específicos de la forma mutada de la proteína KIAA1840, es decir, anticuerpos que son capaces de distinguir entre una forma mutada de KIAA1840 y la proteína de tipo natural (o cualquier otra proteína), para determinar la presencia o ausencia de una KIAA1840 especificada por el anticuerpo. También podría usarse un 15 anticuerpo que reconozca la proteína de tipo natural para verificar la presencia de la proteína o su posición o tamaño anómalos y podría usarse a continuación también como instrumento diagnóstico.

[0065] Los anticuerpos que reconocen específicamente una proteína KIAA1840 mutada también forman parte de la invención. Los anticuerpos son específicos de la proteína KIAA1840 mutada, es decir, no realizan reacción 20 cruzada con la proteína KIAA1840 de tipo natural.

[0066] Puede usarse un anticuerpo monoclonal o policlonal que reconoce la proteína KIAA1840 de tipo natural para detectar la presencia de la proteína de tipo natural o una de sus formas truncadas. Por ejemplo, un anticuerpo que reconoce la parte en el extremo N de la proteína KIAA1840 de tipo natural también puede reconocer 25 una o varias formas truncadas y puede usarse para revelar por inmunotransferencia, las diferentes formas, de tipo natural y truncadas, según sus pesos moleculares. Puede usarse un anticuerpo que reconoce la proteína KIAA1840 de tipo natural, pero que no reconoce las formas truncadas, para inmunotransferencia o en inmunoensayo como ELISA; en cuyo caso, la ausencia de señal revela la presencia de una forma truncada en la muestra o la ausencia de síntesis de una proteína estable en comparación con un control positivo que comprende la proteína KIAA1840 de 30 tipo natural.

[0067] Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos monoclonales policlonales, anticuerpos quiméricos monocatenarios o bicatenarios, anticuerpos humanizados o partes de una molécula de inmunoglobulina, incluyendo aquellas partes conocidas en la técnica tales como los fragmentos de unión a antígeno 35 Fab, Fab’, F(ab’)2 y F(v). También pueden estar inmunoconjugados, por ejemplo, con una toxina, o anticuerpos marcados.

[0068] Si bien pueden usarse anticuerpos policlonales, se prefieren los anticuerpos monoclonales ya que son más reproducibles a largo plazo. 40

[0069] Los procedimientos para preparar "anticuerpos policlonales" también son bien conocidos. Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse a partir del suero de un animal inmunizado contra el complejo de la espatacsina, que puede producirse por ingeniería genética, por ejemplo, según procedimientos estándar bien conocidos por el experto en la materia. Normalmente, dichos anticuerpos pueden prepararse mediante la 45 administración de la proteína KIAA1840 mutada o péptidos de esta proteína por vía subcutánea a conejos blancos de Nueva Zelanda que primero han sido sangrados para obtener suero preinmunitario. Los antígenos pueden inyectarse hasta un volumen total de 100 l por sitio en seis sitios diferentes. Cada material inyectado puede contener adyuvantes con o sin gel de acrilamida pulverizado que contiene la proteína o polipéptido después de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. A continuación se somete a sangrado a los conejos dos semanas 50 después de la primera inyección y se aplica un refuerzo periódicamente con el mismo antígeno tres veces cada seis semanas. A continuación se recoge una muestra de suero 10 días después de cada refuerzo. Después se recuperan los anticuerpos policlonales del suero mediante cromatografía de afinidad usando el antígeno correspondiente para capturar los anticuerpos. Este y otros procedimientos para preparar anticuerpos policlonales han sido desvelados por Harlow y col. (1988) y se incorporan en la presente memoria descriptiva como referencia. 55

[0070] Un "anticuerpo monoclonal" en sus diversas formas gramaticales se refiere a una población de moléculas de anticuerpos que contienen sólo una especie de anticuerpo que combina un sitio capaz de inmunorreacción con un epítopo determinado. Un anticuerpo monoclonal presenta así normalmente una única

afinidad de unión por cualquier epítopo con el que experimenta una inmunorreacción. Por tanto, un anticuerpo monoclonal puede contener una molécula de anticuerpos que tiene una pluralidad de sitios de combinación de anticuerpos, cada uno de ellos inmunoespecífico para un epítopo diferente, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal biespecífico. Aunque históricamente un anticuerpo monoclonal se producía por inmortalización de una línea secretora de inmunoglobulinas pura en términos de clones, también puede prepararse una población 5 monoclonalmente pura de moléculas de anticuerpos mediante los procedimientos de la presente invención.

[0071] Los procedimientos de laboratorio para preparar anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y col., 1988). Los anticuerpos monoclonales (AcM) pueden prepararse mediante inmunización de proteína KIAA1840 mutada purificada en un mamífero, por ejemplo, un ratón, una rata, un ser 10 humano y otros mamíferos. Las células de producción de anticuerpos en el mamífero inmunizado se aíslan y se fusionan con células de mieloma o heteromieloma para producir células híbridas (hibridoma). Las células de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales se usan como fuente del anticuerpo monoclonal deseado. Este procedimiento estándar de cultivo de hibridomas se describe en Kohler y Milstein (1975).

[0072] Si bien los AcM pueden producirse mediante cultivo de hibridomas la invención no se limitará a este aspecto. También se contempla el uso de los AcM producidos por un ácido nucleico de expresión clonado a partir de un hibridoma de la presente invención. Es decir, el ácido nucleico que expresa las moléculas secretadas por un hibridoma de la presente invención puede transferirse a otra línea celular para producir un transformante. El transformante es distinto genotípicamente del hibridoma original pero también es capaz de producir las moléculas de 20 anticuerpos de la presente invención, lo que incluye los fragmentos inmunológicamente activos de moléculas completas de anticuerpos, correspondientes a las secretadas por el hibridoma. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.642.334 para Reading; publicación PCT nº; las publicaciones de patente europea nº 0.239.400 para Winter y col. y nº 0.125.023 para Cabilly y col.

[0073] También se contemplan las técnicas de generación de anticuerpos que no implican inmunización como, por ejemplo, el uso de tecnología de expresión de fagos para examinar bibliotecas nuevas (de animales no inmunizados); véase Barbas y col. (1992), y Waterhouse y col. (1993).

[0074] Los anticuerpos preparados contra la proteína KIAA1840 mutada pueden experimentar reacción 30 cruzada con la proteína KIAA1840 de tipo natural. En consecuencia se requiere una selección de anticuerpos específica para la proteína KIAA1840 mutada. Esto puede conseguirse mediante el agotamiento de la reserva de anticuerpos de aquellos que se muestran reactivos con la proteína KIAA1840 de tipo natural, por ejemplo, remitiendo los anticuerpos preparados a una cromatografía de afinidad contra la proteína KIAA1840 de tipo natural.

[0075] Alternativamente, pueden usarse agentes de unión distintos de anticuerpos para el objetivo de la invención. Estos agentes pueden ser, por ejemplo, aptámeros, que son una clase de molécula que representa una alternativa a los anticuerpos en términos de reconocimiento molecular. Los aptámeros son secuencias de oligonucleótidos u oligopéptidos con la capacidad de reconocer prácticamente cualquier clase de moléculas diana con alta afinidad y especificidad. Dichos ligandos pueden aislarse a través de Evolución Sistemática de Ligandos por 40 Enriquecimiento Exponencial (SELEX) de una biblioteca de secuencias aleatorias, tal como se describe en Tuerk C. y Gold L., 1990. La biblioteca de secuencias aleatorias puede obtenerse mediante síntesis química combinatoria de ADN. En esta biblioteca, cada miembro es un oligómero lineal, en su caso modificado químicamente, de una única secuencia. Las posible modificaciones, usos y ventajas de esta clase de moléculas se han revisado en Jayasena S.D., 1999. Los aptámeros peptídicos consisten en una región variable de anticuerpos restringida en términos 45 conformacionales expresada por una proteína de plataforma, tal como tiorredoxina A de E. coli que se seleccionan entre las bibliotecas combinatorias mediante dos procedimientos híbridos (Colas y col., 1996).

Kits

[0076] Según otro aspecto de la invención, la mutación de KIAA1840 se detecta mediante la puesta en contacto del ADN del sujeto con una sonda de ácidos nucleicos, que opcionalmente está marcada.

[0077] Los cebadores también pueden ser útiles para amplificar, analizar (por dHPLC, Southern...) o secuenciar la parte del gen KIAA1840 que contiene las posiciones mutadas de interés. 55

[0078] Dichas sondas o cebadores son ácidos nucleicos que son capaces de hibridarse específicamente con una parte de la secuencia del gen KIAA1840 que contiene las posiciones mutadas de interés. Esto significa que son secuencias que se hibridan con la secuencia de ácidos nucleicos de KIAA1840 de la parte mutada a los que se

refieren en condiciones de fidelidad alta.

[0079] La presente invención proporciona además kits adecuados para determinar al menos una de las mutaciones del gen KIAA1840.

[0080] Los kits pueden incluir los siguientes componentes:

(i) una sonda, normalmente hecha de ADN, y que puede estar marcada previamente. Alternativamente, la sonda puede no estar marcada y los ingredientes para el marcado pueden incluirse en el kit en recipientes separados; y

(ii) reactivos de hibridación: el kit puede contener también otros reactivos y materiales empaquetados 10 adecuadamente necesarios para el protocolo de hibridación en particular, lo que incluye matrices de fase sólida, si son aplicables, y patrones.

[0081] En otra realización, los kits pueden incluir:

(i) cebados de amplificación o determinación de secuencias: los cebadores de secuenciación pueden estar marcados previamente o pueden contener una fracción de unión o purificación de afinidad; y

(ii) reactivos de amplificación o determinación de secuencias: el kit puede contener también otros materiales y reactivos empaquetados de forma adecuada necesarios para el protocolo de amplificación de secuenciación en particular. En una realización preferida, el kit comprende un panel de cebadores de amplificación o secuenciación, 20 cuyas secuencias corresponden a secuencias adyacentes a al menos una de las posiciones polimórficas, así como un medio para detectar la presencia de cada secuencia polimórfica.

En una realización en particular, se proporciona un kit que comprende un par de cebadores de oligonucleótidos específicos para la parte de amplificación o la totalidad del gen KIAA1840 que comprende al menos una de las 25 posiciones mutadas que se identifican anteriormente (véase la Tabla 2).

[0082] Más preferentemente, los kits de la invención comprenden un par de cebadores seleccionados entre los pares mostrados en la Tabla 3 ya sea para detección por secuenciación directa o por cribado por dHPLC cuando puedan configurarse (segundo conjunto de pares de cebadores). 30

Tabla 3: Cebadores usados para PCR o para dHPLC (entre paréntesis)

Exones: Mutaciones Cebadores For/Rev SEQ ID NO:

: c.118C>T, p.Q40X ccacaggaaacgaatggaat /ggttctgtgalggaaaccacg 3/4

: c.529_533delATATT, p.I177_F178delfsX 5/7 (6)/(8)

: c.733_734delAT, p.M245VfsX c.704_705delAT, p.H235RfsX246 c.869+1G>A, r.? 9/10 (11)/(12)

: c.1203delA, p.K401 KfsX; c.1235C>G, p.S412X c.1282A>T, p.K428X 13/15 (16)

: c.1549_1550delCT, p.L517LfsX 17/19 (20)

: c.1668delT, p.F556LfsX577 c.1679C>G, p.S560X c.1692delA, p.V564VfsX577 cttgccccagattgcataat/tccaaaaagtacgtaaaatccca 57/58

: c.1951C>T, p.R651X cccaggactaatcatgaagga /atccccaaaccgataaaacc 21/22

: c.2198T>G, p.L733X 23/25 (24)/(26)

: c.2316+1G>A, r.? tttgaaagagcagaaagctatgg/tgaaggggttgtcacactttt 61/62

: c.2444G>T, p.R815M y/o r.? c.2444+1G>C, r.? ttgtggcaaaagaaaatttgtg/gagaatgcaggctcagttcc 63/64

: c.2833A>G, r.2834+1_2834+65ins, p.R945GfsX950 o p.R945G c.2697G>A, p.W899X c.2716delC, pQ906SfsX920 cacagcgagatcctgtctca /cctcactgtaagatgatgccc 27/28

: c.2842_2843insG, 29/31 p.V948GfsX; c.2850_2851insT, p.L950FfsX (30)/(32)

: c.3075_3076insA, p.E1026RfsX1029 ttgtttccagatcatgaagaatatg/tcagatagctgaccacagcc 67/68

: c.3741_3742insA, p.P1248TfsX1264 agtcagcttaagggaagcgg/gaagataaccattttctcccca 77/78

: c.4307 4308delAA, p.Q1436RfsX1442 aaaaggcaccatacagctttg/ggaaacacatgctggaacct 83/84

: c.5470C>T, p.R1824X c.5532_5533delCA, p.S1844SfsX1857 c.5769delT, p.S1923RfsX1950 tgaggtgggaggatctcttg/gatgtgttcagagcagccaa y taagctggaggagctggaga/ttgttgtccccttaacttgg 93/94 95/96

: c.5974C>T, p.R1992X c.5870C>G, p.S1957X c.5982_5983insCTCT, p.L1995LfsX2000 c.5986_5987insT, p.C1996LfsX1999 c.5989 5992delCTGT, p.L1997_Y1998>M1997fs X2056 tttgaagtatcccagggtgg /ccaccattccccaaagataa 33/34

: c.6100C>T, R2034X c.6091C>T, p.R2031X 35/37 (36)(38)

: c.6451delG, p.A2151PfsX c.6477+4 A>G, r.? atgttggcaggaactccatc /ctcctttggagcaacctctg 39/40

: c.6737_6740delTTGA, p.12246_E2247delfsX c.6739_6742delGAGT, p.E2247_S2248>L2247fs X2260 41/43 (42)/(44)

: c.6832_6833delAG, p.S2278LfxX 45/47 (46)/(48)

: c.6856C>T, p.R2286X ttttgtccttgggctctttc/cctggttctgtcactagccc 101/102

: c.7029_7030insT, p.V2344CfsX 49/51 (50)/(52)

Procedimientos terapéuticos

[0083] Los autores de la invención han demostrado que todas las mutaciones identificadas en el gen KIAA1840, excepto una, provocan truncamiento de la proteína, lo que sugiere que la patogenia proviene de la pérdida de función. 5

[0084] Estos resultados identifican el gen KIAA1840 mutado como diana para el tratamiento preventivo o curativo de una paraplejia espástica hereditaria.

[0085] Así, en la presente memoria descriptiva se describe también un procedimiento de tratamiento de una 10 PEH que comprende la etapa de administración a un sujeto necesitado del mismo de un ácido nucleico de KIAA1840, es decir, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína KIAA1840 de tipo natural, de manera que la espatacsina se expresa in vivo por la acción de las células del sujeto que han experimentado transfección con dicho ácido nucleico. En consecuencia, dicho procedimiento conduce a una sobreexpresión de la espatacsina de tipo natural que compensa la expresión de la proteína KIAA1840 mutada defectuosa. 15

[0086] En la presente memoria descriptiva se describe también el uso de un ácido nucleico de KIAA1840 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de una PEH.

[0087] En el contexto de la invención, el término "tratar" o "tratamiento", tal como se usa en la presente 20 memoria descriptiva, se refiere a la reversión, alivio, inhibición del progreso o prevención del trastorno o dolencia a los que se aplica el término, o de uno o más síntomas de dicho trastorno o dolencia.

[0088] Preferentemente dicho ácido nucleico de KIAA1840 se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad mínima de agente activo (por ejemplo, ácido 25 nucleico de KIAA1840) que es necesaria para impartir un beneficio terapéutico a un sujeto. Por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente eficaz" para un mamífero es una cantidad tal que induce, mejora o produce una mejoría por cualquier otro medio en los síntomas patológicos, la progresión de la enfermedad o los problemas fisiológicos asociados o confiere resistencia para no sucumbir a un trastorno.

[0089] El polinucleótido administrado comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1, o cualquier secuencia homóloga o similar tal como se define a continuación:

a) una secuencia que muestra al menos el 70%, preferentemente al menos el 75% o el 80% o el 85% o el 90% o el 95% o el 99%, de semejanza de secuencia con SEQ ID NO: 1; 35

b) una secuencia que se hibrida con SEQ ID NO: 1, o su secuencia complementaria, en condiciones rigurosas;

c) una secuencia que codifica una proteína de secuencia SEQ ID NO: 2, o cualquier secuencia sustancialmente similar a SEQ ID NO: 2. 40

[0090] El término "semejanza de secuencia" en todas sus formas gramaticales se refiere al grado de identidad o correspondencia entre las secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos de proteínas que pueden compartir o no un origen evolutivo común. Preferentemente el grado de identidad de secuencia se calcula por comparación con la totalidad de una secuencia de referencia. 45

[0091] Tal como se describe en la presente memoria descriptiva, dos secuencias de ADN son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando al menos el 70%, preferentemente al menos el 75% o el 80% o el 85% o el 90% o el 95% o el 99%, de los nucleótidos mantienen correspondencia en toda la longitud definida de las secuencias de ADN, según se determina mediante algoritmos de comparación de 50 secuencias, tales como BLAST, FASTA, DNA Strider, etc. Las secuencias que son sustancialmente homólogas pueden identificarse comparando las secuencias mediante el uso de software estándar disponible en bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridación Southern, por ejemplo, en condiciones rigurosas tal como se define para ese sistema en particular.

[0092] Análogamente, tal como se describe en la presente memoria descriptiva, dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente similares" cuando más del 80%, preferentemente del 85% o el 90% o el 95% o el 99%, de los aminoácidos son similares (funcionalmente idénticos). Los polipéptidos "funcionalmente idénticos" son aquellos en los que se ha modificado un residuo de aminoácido dado sin alterar la conformación y la función

globales del polipéptido, lo que incluye, pero no se limita a, sustitución de un aminoácido por uno que tiene propiedades similares (como, por ejemplo, polaridad, potencial de unión a hidrógeno, acidez, basicidad, hidrofobia, condición aromática, y similares). Los aminoácidos con propiedades similares son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la arginina, la histidina y la lisina son aminoácidos básicos hidrófilos y pueden ser intercambiables. Análogamente, la isoleucina, un aminoácido hidrófobo, puede ser sustituida por leucina, metionina o valina. Según 5 se espera, estos cambios tendrán un efecto reducido o nulo en el peso molecular aparente o el punto isoeléctrico de la proteína o el polipéptido. Preferentemente, las secuencias similares se identifican por alineación usando, por ejemplo, el programa de apilamiento GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Versión 7, Madison, Wisconsin), o cualquiera de los programas descritos anteriormente (BLAST, FASTA, etc.).

[0093] Preferentemente la secuencia de ácidos nucleicos de KIAA1840 descrita en la presente memoria descriptiva se asocia con elementos que permiten la regulación de su expresión, como una secuencia de promotor.

[0094] Dicho ácido nucleico puede estar en la forma de un vector de ADN. El término "vector" alude al vehículo a través del cual puede introducirse una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen extraño) en una 15 célula hospedadora, de manera que transforme el hospedador y promueva la expresión (por ejemplo, transcripción y translación) de la secuencia introducida. Un tipo de vector común es un "plásmido", que generalmente es una molécula autocontenida de ADN bicatenario, normalmente de origen bacteriano, que puede aceptar fácilmente ADN (extraño) adicional y que puede introducir fácilmente una célula hospedadora adecuada. A menudo un vector de plásmido contiene ADN de codificación y ADN promotor y tiene uno o más sitios de restricción adecuados para 20 insertar ADN extraño.

[0095] El ácido nucleico de KIAA1840 puede introducirse en una célula diana por medio de cualquier procedimiento conocido para el suministro de ácidos nucleicos en el núcleo de células, ex vivo, en células en cultivo o extraído de un animal o un paciente, o in vivo. 25

[0096] La introducción ex vivo puede ser realizada mediante cualquier procedimiento estándar bien conocido por el experto en la materia, por ejemplo, transfección, electroporación, lipofección, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitado de fosfato de calcio, o uso de un cañón de genes.

[0097] Los procedimientos anteriores no limitan el alcance de la invención y debe entenderse que el experto en la materia puede hacer uso fácilmente de cualquier otro procedimiento conocido apropiado para suministrar un ácido nucleico a una célula in vivo o in vitro.

[0098] En la presente memoria descriptiva se describe también el uso de proteína KIAA1840 de tipo natural 35 (espatacsina) para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de una PEH.

[0099] Así en la presente memoria descriptiva se describe también un procedimiento de tratamiento de una PEH que comprende la etapa de administración a un sujeto necesitado de la misma de una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína KIAA1840 de tipo natural. 40

[0100] La proteína KIAA1840 puede introducirse en una célula diana por medio de cualquier procedimiento conocido para el suministro de proteínas a células, ex vivo, en células en cultivo o extraídas de un animal o un paciente, o in vivo.

[0101] El suministro de proteínas es el proceso según el cual una proteína cruza la membrana plasmática de la célula. Tradicionalmente, entre los procedimientos para introducir anticuerpos, péptidos u otras moléculas impermeables en la membrana en células se incluyen la microinyección y la electroporación.

[0102] Se ha desarrollado también una serie de dominios de transducción de proteínas (DTP) que median en 50 el suministro de proteínas en las células. Estos DTP o secuencias de péptidos de señal son polipéptidos de ocurrencia natural de 15 a 30 aminoácidos, que normalmente median en la secreción de proteínas en las células. Están compuestos por un extremo amino de carga positiva, un núcleo central hidrófobo y un sitio de escisión en el extremo de carboxilo reconocido por una peptidasa de señal. Entre los ejemplos de dichos péptidos de transducción de membrana se incluyen péptidos troyanos, proteína de activación transcripcional (TAT) del virus de 55 inmunodeficiencia humana (VIH)-1 o sus péptidos de dominios funcionales, y otros péptidos que contienen dominios de transducción de proteínas (DTP) obtenidos de proteínas de translocación tales como factor de transcripción homeótico de Drosophila Antennapedia (Antp) y proteína de unión a ADN del virus del herpes simplex, VP22, y similares. Algunos péptidos disponibles comercialmente como, por ejemplo, penetratina 1, Pep-1 (reactivo de

Chariot, Active Motivo Inc., CA) y fragmento (519-541) GP41 de VIH, pueden usarse para el suministro de proteínas.

[0103] Recientemente, se ha mostrado también el uso de liposomas lipídicos o similares que pueden formar complejos con una proteína de interés y promueven el suministro de la proteína en la célula. Pueden usarse productos disponibles comercialmente, como BioPORTER (Gene Therapy Systems), o ProVectin (Imgenex, San 5 Diego, California).

[0104] Los procedimientos anteriores no limitan el alcance de la invención y debe entenderse que el experto en la materia puede hacer uso fácilmente de cualquier otro procedimiento conocido apropiado para suministrar una proteína a una célula in vivo o in vitro. 10

[0105] A continuación se ilustrará la invención mediante las siguientes figuras y ejemplos.

FIGURAS

[0106]

Figuras 1 y 2: Análisis de ligamiento multipunto realizado en 16 familias para 34 marcadores de microsatélites a partir del cromosoma 15q. cM = centimorgan.

(Figura 1) Valores de puntuación LOD multipunto para cada familia, * Posición relativa en el mapa genético del cromosoma 15 (según http://research.marshfieldclinic.org/genetics).

(Figura 2) Puntuaciones LOD acumuladas multipunto en las 16 familias con ligamiento representadas según el mapa genético del cromosoma 15. 25

Figuras 3 y 4: Árboles genealógicos de 2 familias SPG11 que redujeron el intervalo de candidatos. Los círculos negros (mujeres) y los cuadrados negros (hombres) indican miembros afectados en comparación con las publicaciones anteriores. Los números actúan como una referencia interna para cada individuo de la muestra. Los asteriscos indican los sujetos de la muestra. Se recoge la reconstrucción de haplotipos para marcadores de 30 microsatélites seleccionados colocados según la secuencia de borrador del genoma humano (www.ncbi.nlm.nih.gov, www.ensembl.org). El haplotipo homocigoto, en el que se ha localizado el gen mutado, está flanqueado por cuadros negros. Las flechas indican la posición de probables episodios de recombinación. cM = centimorgan (según http://research.marshfieldclinic.org/genetics).

Figura 5: Región crítica de SPG11. (a) Mapa físico del cromosoma humano 15q15-21 con marcadores genéticos seleccionados y genes candidatos que fueron secuenciados. Las distancias en megabases se indican con respecto al cromosoma 15 según la base de datos Ensembl. Los marcadores que definen el intervalo de candidatos reducido se muestran en negrita. # indica que estos genes (SEMA6D y MAP1A) fueron analizados en un estudio anterior (Stevanin y col., 2006). > y < indican la orientación del marco de lectura abierta (ORF) de cada gen. (b) Estructura de 40 exón-intrón de 101 Kb del gen KIAA1840e, también conocido como FLJ21439, con posiciones de mutaciones identificadas en 17 familias SPG11. (c) Posibles dominios funcionales (cuadros) y sus posiciones en la secuencia de proteínas. TM = dominios de transmembrana. Las regiones I y II corresponden a dominios estructuralmente similares basados en su estado de hidrofobia analizado con el software DomHCA.

Figuras 6 a 17: Árboles genealógicos y segregación de las 17 mutaciones detectadas en KIAA1840. Los símbolos de cuadrados corresponden a hombres, los círculos corresponden a mujeres. Los símbolos rellenos son individuos afectados, los símbolos grises o con ? indican pacientes con un estado desconocido. Los números son una referencia interna para cada individuo de la muestra. Las estrellas indican sujetos de la muestra. M o m = mutación; + = tipo natural. Se muestran los electroferogramas sólo para las mutaciones homocigotas. (6, 7) Familias con 50 orígenes comunes comparten las mismas mutaciones. Se resaltan los haplotipos para tres microsatélites cercanos que se segregan con las mutaciones. Se indica la correspondencia entre la numeración de alelos y el tamaño de sus pares de bases. (8, 10 a 14) Otras mutaciones homocigotas. (15) Nuevas mutaciones homocigotas. (9, 16, 17) Mutaciones heterocigotas compuestas.

Figura 18: Duplicación estructural interna en la espatacsina

(a) Representaciones de análisis de grupos hidrófobos (HCA) de la duplicación interna de dos regiones en la secuencia humana. El método HCA se basa en el uso de una representación bidimensional (representación HCA) a

partir del dibujo de la secuencia 1D en una hélice alfa (3,6 residuos/vuelta, distancia de conectividad de 4 residuos que separan dos grupos diferentes) que, según se ha comprobado, ofrece la mejor correspondencia entre grupos y estructuras secundarias regulares. El examen de la representación HCA de una secuencia de proteínas permite distinguir fácilmente regiones globulares de las no globulares y, en las regiones globulares, las estructuras secundarias que se identificarán. Esta signatura 2D, que se conserva de forma mucho mejor que la secuencia 1D y 5 puede enriquecerse a partir de la comparación de familias de secuencias altamente divergentes, permite detectar con éxito las semejanzas relevantes para bajos niveles de identidad de secuencia. La forma de los grupos es indicativa en general del tipo de estructuras secundarias (los grupos verticales se asocian a menudo con cadenas beta mientras que los horizontales se corresponden a menudo con hélices alfa). Software DomHCA: http://www.lmcp.jussieu.fr/%7Emornon/hca.html. Se usan símbolos especiales para algunos aminoácidos: estrella 10 para prolina, cuadrado y cuadrado discontinuo para treonina y serina, rombo para glicina.

(b) Alineación múltiple de los dominios de repetición estructural (I y II, fig. 3) correspondiente a las representaciones HCA (software DomHCA). Con la alineación múltiple, los residuos altamente conservados se indican mediante una letra mayúscula cuando están conservados estrictamente o en minúsculas si existe alguna homología. El carácter 15 "&" significa que esta posición está ocupada siempre por un residuo hidrófobo (aminoácidos FILMVW e Y).

Figura 19: Perfil de expresión de KIAA1840 examinado por inmunotransferencia Northern en encéfalo humano adulto. Los transcritos estaban presentes en todos los tejidos encefálicos. Debe observarse que el transcrito de 8 Kb se expresó con más intensidad en el cerebelo, mientras que el transcrito de 5,5 Kb se encuentra principalmente en 20 la corteza cerebral.

Tabla 1: Límites de exón-intrón en el gen KIAA1840.

Tabla 2: Mutaciones encontradas en el gen KIAA1840 en familias con PEH-AR-CCD. 25

Tabla 3: Cebadores usados para detectar las mutaciones por secuenciación directa o por dHPLC.

Tabla 4: Cebadores usados para la amplificación de todos los exones del gen KIAA1840 y condiciones de amplificación por PCR. 30

Tabla 5: Condiciones de PCR y condiciones de dHPLC para analizar los exones de KIAA1840.

Tabla 6: Cebadores de dHPLC para analizar los exones de KIAA1840.

EJEMPLO:

Procedimiento:

Sujetos: 211 individuos, entre ellos 83 miembros afectados y 44 miembros sin mutación, de 91 familias. 40

[0107] Todos los pacientes fueron examinados por un neurólogo. Se seleccionaron entre 216 familias con paraparesia espástica hereditaria compatible con transmisión recesiva recogidas en nuestro centro de referencia neurogenético en colaboración con la red SPATAX. Estos pacientes presentaban un fenotipo "SPG11" típico definido como la presencia de paraparesia espástica progresiva asociada con cuerpo calloso delgado en RM cerebral y 45 retraso mental y neuropatía.

[0108] Se obtuvieron muestras de sangre después del consentimiento por escrito de todos los pacientes afectados y de sus familiares con aprobación del comité local de Ética de París-Necker (aprobación n° 03.12.07 del Comité Consultivo para la Protección de las Personas y la Investigación Biomédica, a A.D). El ADN genómico se 50 extrajo de leucocitos usando procedimientos estándar.

[0109] Análisis de ligamiento: Se realizó una exploración del genoma en la familia FSP221 usando 400 microsatélites, separados regularmente en todos los cromosomas (ABI-Prism mapping set v2, Applied Biosystems, Foster City, CA) y se usaron 50 marcadores polimórficos adicionales para analizar los resultados. Los genotipos se 55 determinaron por PCR con un cebador marcado por fluorescencia, migración electroforética en un secuenciador ABI-3730 (Applied Biosystems) y análisis con Genescan 3.5 (Applied Biosystems). Se usó Allegro 1.2c para calcular las puntuaciones LOD en dos puntos y multipunto entre el fenotipo de la enfermedad y cada uno de los marcadores o el mapa de los marcadores suponiendo una penetración completa, frecuencias iguales de los alelos para los

marcadores y una frecuencia de alelos mutados de 0,0005 (Gudbjartsson y col. 2000). El orden de los marcadores y las distancias genéticas se obtuvieron a partir de las bases de datos Ensembl (http://www.ensembl.org) y Marshfield (http://research.marshfieldclinic.org/genetics), respectivamente.

[0110] Detección de mutaciones: Se diseñó una serie de cebadores manualmente o usando Oligo6 (MBI, 5 Cascade, CO) con el fin de amplificar todos los exones codificantes de 18 genes a partir del intervalo de candidatos (cebadores y condiciones disponibles a petición). A continuación se purificaron los fragmentos amplificados por PCR de ADN genómico usando exonucleasa 1 (New England Biolabs, 2 U/5 l de producto de PCR) y fosfatasa alcalina de gamba (Roche, 1 U/5 l de producto de PCR) y se secuenciaron usando el procedimiento de terminación por didesoxi fluorescente (BigDye v3, Applied Biosystem) en un secuenciador ABI-3730 automatizado según las 10 recomendaciones del fabricante. Con el uso del paquete de software SeqScape (Applied Biosystems), se alinearon las secuencias y se compararon con las secuencias de consenso.

[0111] En la tabla 4 mostrada a continuación se ofrece una lista de los cebadores usados para la amplificación del gen KIAA1840. 15

[0112] Las condiciones del programa de PCR son las siguientes:

95°C, 12 min

a continuación 40 ciclos de:

95°C, 30 s

Temperatura de hibridación (véase Tabla 4), 30 s, 25

72°C, 30 s

a continuación

72°C, 10 min, y

15°C, 15 min.

[0113] Se llevó a cabo PCR en 25 l de volumen final usando 10 pmol de cada cebador, a concentraciones 35 finales de MgCl2 1,5 mM y dNTP 0,24 mM.

[0114] Se usó Taq pol, que está disponible comercialmente en Quiagen excepto para los exones 6, 12 y 40B en los que se usó Taq GOLD (Applied Biosystems).

Tabla 4:

Exón: Temperatura de hibridación SEQ ID NO: Cebador directo Cebador inverso

ex1: 60°C 3/4 ccacaggaaacgaatggaat ggttctgtgaggaaaccacg

ex2: 60°C 53/54 ctgagccccacatttttgtt caagtgctcaatagccccat

ex3: 60°C 5/7 cagggacattgtaggccatc tcccagctcccaaaactaaa

ex4: 60°C 9/10 caggttctttattgtggcatca cgaggatatttttaacctcttatca

ex5: 62°C 55/56 gctaactgcccttaatagagtaaaa aaagggtacagcgtcagcat

ex6: TD62-58 13/15 gaacatctttgccctggttt caggcactgaggcagaagta

ex7: 60°C 17/19 aaaaatcaattcctaaatcataatcc tcttttaaagccaaaaagggtaaa

ex8: 60°C 57/58 cttgccccagattgcataat tccaaaaagtacgtaaaatccca

ex9: 60°C 59/60 cagcaaaagggtaatagcagtg cccaaatgtagtaaatggcg

ex10: 60°C 21/22 cccaagactaatcatgaagga atccccaaaccgataaaacc

ex11: 60°C 23/25 cggtgtgtcttccactagctc acccagccattctcagtgtt

ex12: TD62-58 61/62 tttgaaagagcagaaagctatgg tgaaggggttgtcacactttt

ex13: 60°C 63/64 ttgtggcaaaagaaaatttgtg gagaatgcaggctcagttcc

ex14: 60°C 65/66 atgtggaactgagcctgcat cgacttgcattttaaagaacctg

ex15: 60°C 27/28 cacagcgagatcctgtctca cctcactgtaagatgatgccc

ex16: 62°C 29/31 cctttaaatactacagtggtgcaga ccaactgttgagatggagaaaa

ex17: 56°C 67/68 ttgtttccagatcatgaagaatatg tcagatagctgaccacaacc

ex18: 60°C 69/70 tccctcttaaggagaaaaacactg accgggccgagatataaaat

ex19: 60°C 71/72 gctagtttgtcttagaaccagaaca ttttgggttgtctcactatcaca

ex20: 60°C 73/74 aaggaacatagccagttctgtttt tgcgaactatttttcctttgg

ex12: 60°C 75/76 tgcaacttctcaggtacacatct aggctagagtgcagtggcat

ex22: 60°C 77/78 agtcagcttaagggaagcgg gaagataaccattttctcccca

ex23: 60°C 79/80 ttgtgagtgtttggggagaa ggggatttagtgaaaacacca

ex24: 64°C 81/82 tttgttggagaatacactgtgctt catgtctacacaacagaaagaatgc

ex25: 60°C 83/84 aaaaggcaccatacagctttg ggaaacacatgctggaacct

ex26C: 55°C 85/86 cttctgtctgcttcttggtctt tatcatcattatctgttgttgg

ex27: 60°C 87/88 ttaggtgatcccactggctc cccaggagttcaaggctgta

ex28: 60°C 89/90 ctgaggagggcttgtttttg tctgtaacttgtttactcccagttg

ex29: 60°C 91/92 gatcacaccactgcattcca ggcacctgtagtcccagcta

ex30A: 60°C 93/94 tgaggtgggaggatctcttg gatgtgttcagagcagccaa

ex30B: 60°C 95/96 taagctggaggagctggaga ttgttgtccccttaacttgg

ex31: 60°C 33/34 tttgaagtatcccagggtgg ccaccattccccaaagataa

ex32: 60°C 35/37 ttacctggatttggctttgg tgcaatccagaaacttgagaga

ex33: 60°C 97/98 caataggccaaggatttcaa tataactcctgctggagggc

ex34: 62°C 39/40 atgttggcaggaactccatc ctcctttggagcaacctctg

ex35: 60°C 99/100 ggtaqcctggaaattagccc tgaaccagaatctgaagcca

ex36: 62°C 41/43 ttccaacaggaaagcacaca cagctacttgggagactgag

ex37: 60°C 45/47 gcattagaaggggcactgaa ctcacaacggtattcacccc

ex38: 60°C 101/102 ttttgtccttgggctctttc cctggttctgtcactagccc

ex39: 60°C 49/51 aagggtttaagataatttgggga ggattcttgatactgctttgcc

ex40A: 60°C 103/104 aattagccagggtggtgaca cccacaaaggactgatatgg

ex40B: TD62-58 105/106 aaggaccctcagacaggttg tcctttaaggcagacaaggg

TD = TouchDown 10 ciclos de disminución de la temperatura de hibridación, a continuación 25 ciclos estables. Temperaturas en grados Celsius.

[0115] Para algunos exones, fue posible establecer condiciones de dHPLC para detectar variantes. Se diseñaron específicamente cebadores diferentes de los usados para secuenciación directa pero pueden usarse también para secuenciación directa. Las condiciones de PCR condiciones y las condiciones de dHPLC se indican en la tabla 5. 5

Tabla 5:

Condiciones de dHPLC para analizar los exones de KIAA1840. Temperatura en grados Celsius.

Exón: Tamaño T° PCR T° DHPLC


: 62°-1’-35x 55,3°


: 58°-1’- 35x 55,1°


: 62°-1’-35x 54,8°-52,8°


: 60°-1’-35x 54,9°


: 58°-1’-35x 54°-53°


: 58°-1’-35x 50,6°-52,6°


: 62°-1’-35x 54,1


: 57°-1’-35x 54,6°


: 62°-1’-35x 52,5°


: 62°-1’-35x 51,5°


: 62°-1’-35x 55,8°


: 62°-1’-35x 55,2°


: 62°-1’-35x 53,9°


: 58°-1’-35x 53°-50°


: 62°-1’-35x 52,3°


: 62°-1’-35x 55,8°


: 62°-1’-35x 53,1°


: 60°-1’-35x 57,1°


: 60°-1’-35x 56,6°


: 62°-1’-35x 53,6°


: 62°-1’-35x 53,5°


: 56°-1’-35x 54,2°-56,2°


: 60°-1’-35x 58,8°


: 62°-1’-35x 57,6°


: 62°-1’-35x 54°


: 62°-1’-35x 52°


: 62°-1’-35x 57,6°


: 62°-1’-35x 56,9°


: 62°-1’-35x 53,2°


: 62°-1’-35x 54,4°


: 58°-1’-35x 54,2°

Tabla 6: Cebadores dHPLC para analizar los exones de KIAA1840

Exón: CEBADORES F (5’-3’)/R (5’-3’) SEQ ID NO:

: accaggtcaactaaactgttctct/tatgctgaaagaccacctgtaga 107/108

: ccagttgtaaaattgtgacc/tcaatcaacacttctaccac 6/8

: gttaggcatacttacaaaactggc/cgaggatatttttaacctcttatca 11/12

: caggagcagtagtaacacaa/aaagggtacagcgtcagcat 109/110

: ctgtgacaggtgttaagtta/atctaatacaagacagtctc 14/16

: tagtactgaagtattgagta/ttaagtaatgttcttgggca 18/20

: gcaggtaataagcctgcagaa/cccccttcctagctgctatt 111/112

: gttacataaatgtataatccctg/cattttaagactttatggattac 24/26

: tgttcaaaatagttccattacaaaa/tttcttccaaggttttcttcca 113/114

: tttgcaaaagtgcttgatttt/tgcaggctcagttccacata 115/116

: ggaatgatgcctttttctcc/tctcacacttgccttctgga 117/118

: tgtgggcatgatttggtcta/acctgctcaaggacaaatgc 30/32

: aatcatcgcctgagcaaaat/ccagtgactgatccaaagca 119/120

: ccctcttaaggagaaaaacac/cagccttatcctctgctctt 121/122

: tggaaaaggggagcagacta/tgcgaactatttttcctttgg 123/124

: gaggaggccacaaatcacat/gccttagacctcgtcacacc 125/126

: tgctcaggttttgactttttctc/tttcactgatggcaagatgc 127/128

: accacccccacctctaattc/ctacacaacagaaagaatgc 129/130

: ccagctgaaactgaaagttgg/ctgggtacttacttcaggct 131/132

: cactgtgccctgccttatta/tgtgcctgagtaaccgagtg 133/134

: tcccagatttggaggttttg/tgcattttaatttcctaactaccc 135/136

: gctgtagtggcattttattg/cctgggtgacagagcaagac 137/138

: cctggcttctaaaagtggcc/aagcacaacatccaaatcctt 36/38

: agctgcagagctccataagc/taggcatccagagcaggaac 139/140

: ggcatctgaaagcaaccact/ccctccattttcccaagagt 141/142

: caacaggaaagcacacatgc/gtgtggctgtgacctcactc 42/44

: aacatggctgggatgtttct/ttcctggttggcctatgatg 46/48

: ggggtgaataccgttgtgag/acctctgggttccatgagtg 143/144

: aatgccaaacacacacctga/ctcaaagcagaggcaaggag 50/52

: agactgctcctctgcactcc/ccgggattgttcaactttagc 145/146

: cagtatcttaacctgtacat/ccgggattgttcaactttagc 147/148

[0116] Estudios de sobreexpresión: El ADNc de KIAA1840 del clon pf01011 (Kazusa DNA research Institute, 5 Japón) se obtuvo del vector pBluescript II SK(+) usando las enzimas de restricción XhoI/Notl y se clonaron en fusión con EGFP en un vector pEGFP-C1 digerido en Sall/Bsp120I Clontech). Se verificó la construcción por secuenciación directa después de ligamiento, transformación y extracción de plásmidos usando procedimientos estándar.

[0117] Se mantuvieron las células COS-7 en DMEM (Invitrogen) suplementado con suero fetal bovino al 10%, 10 penicilina (100 Ul/ml) y estreptomicina (100 g/ml). Se sembraron en placa las células 24 h antes de la transfección

en cubreobjetos recubiertos con polietilenimina y se sometieron a transfección con reactivos de Lipofectamina-PLUS según las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Para placas de 6 pocillos se usaron 1-2 g de ADN de plásmido por pocillo. Se analizaron las células mediante inmunofluorescencia 120 h después de la transfección. Se observó la proteína de fusión espatacsina-EGFP directamente después de la fijación durante 15 min con formaldehído al 4%. Se realizó immunocitoquímica, usando procedimientos clásicos con los siguientes anticuerpos: anti-Cox2 de conejo 5 (1/200, por amable cesión de A. Lombes, París) y anti-alfa-COP de conejo (1/1000e; Affinity Bioreagent). Se sometieron las células a contratinción con DAPI (1 g/ml, Sigma) y se montaron con Fluoromount-G (Southern Biotech). Se observaron las muestras con un microscopio confocal Leica SP1. Para adquirir las imágenes se usó un software de Leica confocal.

[0118] Análisis por inmunotransferencia Northern (Humano): Se extrajo ARN total de la corteza cerebral post mórtem humana de un individual sano (Brain Bank of INSERM U679) usando el minikit RNAeasy (Qiagen). Se sintetizaron los ADNc correspondientes usando hexámeros aleatorios en presencia de transcriptasa inversa Thermoscript tal como recomendaba el proveedor (Invitrogen). Se amplificó una serie de 7 sondas de 1,2 Kb que cubrían todo el ADNc de KIAA1840 mediante PCR a una temperatura de hibridación de 60°C (secuencias de 15 cebadores disponibles a petición). Se hibridó tejido múltiple humano por inmunotransferencias Northern (Clontech) a 68°C durante 1 hora con una mezcla de estas sondas marcadas con aP32 por cebado aleatorio (kit Prime-it II Random Primer Labeling, Stratagene) y se purificó usando microcolumnas ProbeQuant G-50 (Amersham Biosciences) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para alcanzar una actividad específica de al menos 1 x 109 cpm/g. A continuación se lavaron las membranas según recomienda Clontech y se expusieron a película de 20 rayos X para autorradiografía.

[0119] Hibridación in situ (rata): Se sacrificó a ratas Sprague Dawley jóvenes (P1, P6, P15 y P21, n = 1 cada una) y adultas (P68, 200g, n = 2) (Charles River) por decapitación y rápidamente se extrajo el encéfalo y se congeló en isopentano a -50°C. Se prepararon secciones con un criostato a -20°C, desde la médula al cuerpo estriado (+1,7 25 desde el bregma) separados 600 m, se montó descongelado en portaobjetos de vidrio y se almacenó a -80°C hasta su uso. Se analizó la expresión de ARNm de KIAA1840 usando 3 oligonucleótidos antisentido diseñados usando el software de diseño Helios ETC oligo (Helios Biosciences, París, Francia) en la secuencia de ARNm (XM-242139) de Rattus norvegicus similar a la proteína hipotética FLJ21439 (LOC311372). Se usó cada oligonucleótido o una mezcla de los 3 oligonucleótidos para la etapa de hibridación y produjo resultados idénticos. Como control negativo se usó 30 una mezcla de tres oligonucleótidos de sentido directo.

[0120] La hibridación in situ se realizó tal como se describe en Moutsimilli y col. (2005). Brevemente, se marcaron oligonucleótidos con [35S]-dATP (Amersham Biosciences) usando transferasa terminal (Amersham Biosciences) para una actividad específica de 5 x 108 dpm/g. El día del experimento, se fijaron portaobjetos en 35 formaldehído al 4% en PBS, se lavó con PBS, se deslavó con agua, se deshidrató en etanol al 70% y se secó al aire. A continuación se cubrieron las secciones con 140 l de medio de hibridación (Helios Biosciences, París, Francia) que contenía 3-5 x 105 dpm de la mezcla de oligonucleótidos marcados. Se incubaron los portaobjetos durante toda la noche a 42°C, se lavaron y se expusieron a una placa de imagen BAS-SR Fujifilm durante 5-10 días. Se estudiaron las placas con un analizador Fujifilm Biolmaging BAS-5000 y se analizaron con Multi Gauge Software 40 (Fuji).

[0121] Para experimentos con marcado doble, se procesaron los encéfalos como en la hibridación in situ. Después de la última etapa de lavado, se fijaron las secciones en paraformaldehído al 4% en PBS y se preincubaron en PBS que contenía suero de cabra al 6% y tritón al 0,1%. A continuación se incubaron las secciones con 45 anticuerpos murinos dirigidos contra Neu-N (Chemicon International, 1/250), en el mismo tampón, se procesaron con anticuerpos IgG antirratón de caballo biotinilados y reactivos ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se enviaron a autorradiografía de emulsión. Se observó el marcado con la sonda antisentido en comparación con la contratinción específica neuronal Neu-N.

[0122] Bioinformática: Se buscaron dominios funcionales usando herramientas bioinformáticas en BABEL (http://babel.infobiogen.fr:1984/), Ressource Parisienne en Bioinformatique Structurale (http://bioserv.rpbs.jussieu.fr/RPBS) y PSORT (http://psort.nibb.ac.jp/). Se usó Psi-blast (www.ncbi.nlm.nih.gov) para buscar proteínas o péptidos homólogos. Se realizó la alineación de proteínas homólogas usando CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Se verificó la alteración de los sitios de empalme en la base de datos Alternative 55 Splicing Database en http://rulai.cshl.edu/new_alt_exon_db2/HTML/score.html.

[0123] HCA es un método que permite representar una secuencia de proteínas en un esqueleto bidimensional que incrementa la densidad de los aminoácidos, y en consecuencia, evidencia la compacidad local de

los residuos hidrófobos. Forman grupos según una conectividad que es la de una hélice alfa. Se ha revelado que los centros de los grupos y los centros de las estructuras secundarias guardan una correspondencia estadística, (Woodcocks y col. 1992) y por otra parte la forma de un grupo está relacionada con la naturaleza de la estructura secundaria (Callebaut y col. 1997). HCA es una herramienta muy eficaz para la recuperación de duplicación interna altamente divergente de dominios y para la detección de límites de dominios globulares. 5

Resultados:

[0124] Se seleccionó una serie de 91 familias de orígenes europeos o norteafricanos, todas sin mutaciones en el gen SPG7 y con un fenotipo PEH-AR-CCD típico. Seis de estas familias se habían referido anteriormente como 10 poseedoras de ligamiento a SPG11 usando un subconjunto de marcadores polimórficos del intervalo (Casali y col., 2004; Stevanin y col., 2006; Lossos y col., 2006). Las otras familias eran nuevas. Se obtuvo el genotipo de todos los miembros de las familias disponibles de las 16 familias con mayor capacidad informativa usando 34 marcadores de microsatélites para ligamiento a tres locus sucesivos en el cromosoma 15 que se han asociado con cuerpo calloso delgado; SPG11, SPG21 y el locus de agenesia de cuerpo calloso con polineuropatía (ACCPN). Se obtuvieron 15 puntuaciones LOD multipunto positivas comprendidas entre 0,60 y 3,85 y correspondientes a los valores esperados máximos en los árboles genealógicos en las 16 familias con mayor capacidad informativa (figuras 1 y 2). Se excluyeron las mutaciones en los locus ACCPN o SPG21 por secuenciación directa en todas familias que mostraron ligamiento positivo a estas regiones (datos no mostrados). Se alcanzó una puntuación LOD multipunto combinada significativa de 28,1 en el intervalo de 3,3 cM flanqueado por los marcadores D15S778 y D15S659 en los grupos de 20 ascendencia con ligamiento (figuras 1 y 2). Las reconstrucciones de haplotipos identificaron dos episodios críticos de recombinación que permitían restringir el intervalo de candidatos a 6,6 cM entre los marcadores D15S1044 y D15S123. Los 3,2 cM del intervalo D15S778-D15S659 se consideró la región con mayor probabilidad de contener el gen responsable basándose en la homocigosidad en todos los pacientes consanguíneos de dos familias con ligamiento significativo; la familia FSP221 con ligamiento a SPG11 con una puntuación LOD máxima de 3,85 y la 25 familia FSP672 con ligamiento al mismo locus con un valor de puntuación LOD de 2,6 (figuras 3 y 4). Además, un extenso cribado genómico realizado en la familia FSP221 a una resolución de 10 cM en todos los cromosomas sólo identificó otras tres posibles localizaciones con puntuaciones LOD multipunto de 2,2 a 2,5 que se excluyeron usando 18 marcadores de microsatélites adicionales (datos no mostrados), lo que apoyaba por tanto un alto ligamiento a SPG11. 30

[0125] El estrecho intervalo contenía 40 genes de acuerdo con las bases de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) y del Ensembl. Dos se excluyeron en estudios anteriores (SEMA6D y MAP1A, Stevanin y col., 2006). Se evaluaron 16 genes adicionales a partir del intervalo como candidatos para SPG11, priorizando aquellos con una función conocida o posible en el metabolismo mitocondrial, tráfico intracelular o 35 integridad del citoesqueleto (figura 5). Se secuenciaron todos los exones codificantes y no codificantes así como sus sitios de empalme con al menos 50 pb de secuencias intrónicas en cada lado en ADN genómico de 5 pacientes índice de 5 familias con ligamiento. No se encontraron mutaciones en 15 genes aunque se encontraron variaciones en las secuencias en el gen KIAA1840. A continuación se cribó un miembro afectado de las 16 familias con ligamiento así como de los grupos de ascendencia no informativos y se verificó a todos los demás miembros de las 40 familias, cuando estaban disponibles, para buscar variaciones de secuencias. Se identificaron 43 mutaciones diferentes en 47 familias, incluidas las 16 con ligamiento, 31 en el estado homocigoto, (figuras 5 a 9). Se trataba de mutaciones sin sentido (n = 13), deleciones (n = 17), inserciones (n = 7) o mutaciones en el sitio de empalme (n = 6) en la secuencia de codificación, y dieron como resultado una proteína truncada anómalamente o predicción para alterar el empalme del ARN mensajero en todos los casos. En dos familias (FSP670 y ITA28VAC, figura 8), se 45 encontró un cambio de sentido (R945G o R815M) que afectaba al nucleótido del consenso de sitio de empalme 5’ y se predijo que alteraría el empalme del ARNm. Esto pudo confirmarse en la familia FSP670 mediante el análisis de ARNm de un paciente (c.2833A>G, r.2834+1_2834+65ins, p.R945GfsX950). Cuatro mutaciones afectaron a la parte intrónica de la secuencia de consenso para el sitio de empalme del aceptor (véase Tabla 2) lo que también afectaría probablemente al empalme del ARNm. Las mutaciones se segregaron completamente en las familias con la 50 enfermedad y no se encontraron en al menos 140 cromosomas de individuos de control no relacionados de origen europeo y norteafricano, lo que sugiere que estas mutaciones no eran polimorfismos. Sólo 4 mutaciones se encontraron en más de un árbol genealógico (figuras 6 y 7). Se identificó una sustitución c.6100C>T que sustituye una arginina por un codón de terminación en el exón 32 (R2034X), lo que acortaba la proteína de 2.443 a 2.034 aminoácidos (SEQ ID NO: 160), en el estado homocigoto, en 4 grupos de ascendencia consanguíneos de Argelia, 3 55 de Túnez y 2 de Marruecos (Figura 6). Se encontró una deleción de 5 pb en el exón 3 (c.529_533delATATT) que condujo a un marco de lectura y un codón de terminación en aa 178 (SEQ ID NO: 150) en el estado homocigoto en todos los pacientes de 3 familias portuguesas y en el estado heterocigoto de un grupo de ascendencia brasileño (Figura 7). De forma interesante, los alelos en marcadores de flanqueo próximos eran en parte similares en familias

con mutaciones idénticas (cuando se pudieron someter a ensayo) lo que sugería efectos de tipo fundador en el norte de África y Portugal para estas mutaciones. La mutación c.733_734del AT también se encontró en 4 árboles genealógicos tunecinos, que compartían haplotipos comunes parciales (datos no mostrados), y en un grupo de ascendencia francés. Finalmente, se encontró la variante c.1951C>T en el estado heterocigoto en 2 grupos de ascendencia italianos y uno de Rumania para los que los autores de la invención están extendiendo los árboles 5 genealógicos con el fin de verificar la conservación de haplotipos.

[0126] No se encontraron mutaciones en 44 familias, lo que sugiere que las mutaciones responsables estaban en regiones no codificantes de KIAA1840 o en otro gen no identificado.

[0127] Así pues, se encontraron mutaciones SPG11 en la mayoría de las familias con la PEH-AR-CCD típica estudiada en la presente memoria descriptiva (47/91). La mayoría de las familias procedían de la cuenca mediterránea. Un examen completo de 22 miembros afectados (Stevanin y col., 2007), 12 hombres y 10 mujeres, mostró una media de edad de 24,8 ± 9,5 años comprendida entre 12 y 49. El inicio de la enfermedad se produjo siempre antes de los 24 años (media de edad 11,8 ± 5,5 años; intervalo 2-23) y consistió en marcha espástica (57%, 15 12/21) o deterioro cognitivo (19%, 4/21), diagnosticado a veces como retraso mental. Después de aproximadamente 10 años de evolución, el cuadro clínico completo consistía en paraplejia espástica progresiva y grave con consunción distal y problemas cognitivos. En varios casos (n = 6), la disfunción cognitiva empeoró claramente con la progresión de la enfermedad. Los estudios de imágenes cerebrales mostraron un cuerpo calloso delgado, pero también cambios en la materia blanca periventricular y atrofia cortical, en la mayoría de los pacientes. La disartria 20 seudobulbar era frecuente (54%, n = 12) y voz distónica observada en un paciente. De forma interesante, aunque algunos pacientes tenían registros electromiográficos normales, la neuropatía periférica era frecuente (72%, 13 de 18 pacientes) y se asoció principalmente con cambios motores puros. Ocasionalmente se observaron signos adicionales, como atrofia óptica, retinitis pigmentosa, signos cerebelosos leves, cataratas y clinodactilia, un hallazgo que amplía el espectro clínico de esta entidad. 25

[0128] El gen KIAA1840 humano contiene 40 exones que se extienden a 101 kilobases de ADN genómico en el cromosoma 15q21.1. El transcrito de longitud completa codifica una proteína predicha de 2.443 aminoácidos de función desconocida denominada espatacsina para espasticidad con proteína del síndrome del cuerpo calloso delgado o atrofiado. La secuencia de espatacsina se conserva sólidamente a través de la evolución con ortólogos en 30 mamíferos y otros vertebrados: el KIAA1840 humano comparte el 85% de identidad con la proteína homóloga en el perro, el 76 y el 73% con los homólogos de ratón y de rata y el 59% con el homólogo de pollo, todos ellos de tamaños similares. Se encontró menos semejanza con proteínas homólogas de menor tamaño de Fugu (44%), Tetraodon (39%) y Drosophila (22%).

[0129] Ni el gen ni la proteína predicha que codifica en muchas especies muestran ninguna semejanza de secuencia significativa con secuencias de ADNc o de proteínas conocidas. A continuación, los autores de la invención buscaron motivos y dominios de proteínas (Figura 3). Se predijeron cuatro posibles dominios de transmembrana mediante diversos algoritmos (aa 163-194, 200-240, 1239-1267 y 1471-1493). También se detectó una signatura F1 de glucosil-hidrolasa (aa 482-490). Este motivo se basa en un residuo de ácido glutámico 40 conservado que se ha revelado en la beta-glucosidasa de varias bacterias y plantas y en la lactasa-floricina hidrolasa de mamíferos, una glucoproteína de membrana integral que divide la lactosa en el intestino delgado. De forma interesante, esta proteína se asigna a una superfamilia de dioxigenasa de compuestos aromáticos debido a una identidad del 22% con la secuencia de consenso entre aa 2104-2381. También se identificó una cremallera de leucina (aa 611 a 632), implicada en la dimerización de numerosas proteínas reguladoras de genes (familia de 45 factores de transcripción C/EBP, CREB, CRE-BP1, ATF y Jun/AP1) y un dominio Myb (aa 1766 a 1774), que interviene en la unión a ADN de myb de Drosophila y vertebrados y proteínas relacionadas. De forma interesante, existe un 47% de identidad, sobre 44 aa, con péptidos de tipo timosil, pequeños péptidos que desempeñan un papel importante en la organización del citoesqueleto; estos péptidos se unen a monómeros de actina y los secuestran, con lo que inhiben la polimerización de actina (Low y Golstein 1985). Además, estaba presente también un probable 50 dominio de hélice arrollada de 33 residuos de 1556 a 1590 y dichos dominios se refieren en proteínas estructurales o motoras tales como espectrina, laminina, dineína o proteínas de neurofilamentos.

[0130] A continuación los autores de la invención investigaron la estructura de la proteína predicha. El nivel de hidrofobia (34,2%) en toda la secuencia era típico de una proteína globular. Debido a su tamaño, se trata 55 probablemente de una sucesión de dominios globulares y los autores de la invención intentaron identificarlos por medio de la identificación de regiones interdominio, correspondientes a una baja densidad de grupos hidrófobos con el software DomHCA (Prat-Albeau y col., 2006). A excepción de pequeños agentes de ligamiento situados entre las posiciones 1410 y 1440, no se evidenció separación de dominios. A partir de las representaciones HCA, se confirmó

una de las posibles regiones de transmembrana en los aminoácidos 200 a 240 en la espatacsina de 5 vertebrados, pero estaba ausente en las secuencias homólogas de Tetraodon y Drosophila, ya que estas dos últimas secuencias presentaban un dominio acortado en el extremo N. Un análisis minucioso de posible duplicación destacó dos regiones estructuralmente similares (aa 560-700 y 2250-2390) en todos los homólogos de vertebrados de la proteína con el 19% de identidad de secuencia en secuencias humanas (Figura 10). La proporción de aminoácido muestra 5 una distribución no estándar en algunos casos: alta cantidad de leucinas (13,8% frente al 9,6% en bases de datos de referencia estándar), un bajo nivel de metioninas (1,9% en lugar de 2,38%) y glicinas (3,9% frente a 6,93% en Swiss Prot). La proporción de cisteínas fue más de 2 veces superior (2,9%) en comparación con la media en las bases de datos, pero no dio lugar a puentes de disulfuro, según las predicciones del software CysState (Mucchielli-Girgi, 2002). Las formas de los grupos indican un comportamiento básicamente helicoidal de esta proteína, lo que se 10 confirma mediante herramientas de predicción estándar.

[0131] La proteína espatacsina, fusionada con GFP, tuvo una distribución citosólica y nuclear difusa que a veces excluía al núcleo de las células COS-7. En casos raros (< 5%), la espatacsina formaba pequeños puntos perinucleares o estructuras de tipo agresoma en células con altos niveles de expresión después de 4 días 15 postransfección que no se colocalizaron con el marcador mitocondrial Cox2 o el marcador Golgi alfa-COP.

[0132] Estudios anteriores de los perfiles de expresión del gen SPG11 revelaron que se expresa de forma ubicua en bajos niveles en los tejidos de ratón, incluido el encéfalo (Nagase y col., 2001). La expresión ubicua de bajo nivel, incluso en estructuras aparentemente no relacionadas con el fenotipo, se ha mostrado para otros genes 20 responsables de enfermedades neurodegenerativas (Paisan-Ruiz y col., 2004). Los autores de la invención amplificaron con éxito siete fragmentos superpuestos de ADNc a partir de ARNm de KIAA1840 extraído de la corteza cerebral humana y los usaron como sondas de inmunotransferencias Northern de múltiples tejidos de adultos. Se detectaron al menos tres transcritos alternativos en todas las estructuras de encéfalo adulto. El transcrito de longitud completa (∼8 Kb) alcanzó su máxima expresión en el cerebelo, y el transcrito de 5,5 Kb en la corteza cerebral 25 (Figura 11).

[0133] Cuando se investigó la expresión temporal y regional del ARNm de KIAA1840 de ratón mediante hibridación in situ en encéfalo de rata, fue indetectable en ratas recién nacidas (P1). Sin embargo, se detectó en el cerebelo, de P6 a P21. En la edad adulta (P68), la expresión se encontró en todo el encéfalo. La expresión era 30 generalmente baja, aunque se observaron señales más intensas en la glándula pineal, los bordes de los ventrículos laterales, la capa granular del cerebelo y el hipocampo. A diferencia de las inmunotransferencias Northern en seres humanos adultos, se detectó sólo una expresión débil en la corteza cerebral. La comprensión de la función de la espatacsina en estas estructuras sería de ayuda para explicar las principales características del fenotipo de la enfermedad: por ejemplo, la expresión en el hipocampo podría estar relacionada con el deterioro cognitivo 35 observado en los pacientes. Además, debe investigarse aún si el marcado de los bordes de los ventrículos laterales, en los que se sitúan los oligodendrocitos progenitores, está relacionado con los cambios en la materia blanca en los pacientes.

[0134] El estudio de los autores de la invención identificó el gen responsable de la paraplejia espástica con 40 cuerpo calloso delgado con ligamiento a SPG11, KIAA1840. Esta conclusión es respaldada por cuatro elementos de evidencia; primero, se excluyeron 17 de los 40 genes asignados al intervalo de candidatos de SPG11; segundo, se identificaron 43 mutaciones diferentes segregadas en 47 familias, en 16 de las cuales se había encontrado anteriormente ligamiento con el locus de SPG11, y no se encontró en al menos 140 cromosomas de control; tercero, todas estas mutaciones condujeron a una proteína truncada y/o con ARNm con un empalme anómalo, y cuarto, 45 todas las familias con mutación presentaban el fenotipo típico de PEH-AR-CCD o al menos un fenotipo compatible en 2 familias en las que no pudo disponerse de estudios de imágenes cerebrales. Las mutaciones en KIAA1840 afectaban a 47 de 91 familias con PEH-AR-CCD en este estudio, lo que hace que esta entidad sea muy frecuente entre PEH-AR-CCD (52%), con estimación del 75% en un estudio anterior (Stevanin y col., 2006), pero también entre paraplejias espásticas recesivas. Sin embargo, podría existir al menos otro gen tal como se reveló 50 anteriormente (Lossos y col., 2006; Stevanin y col., 2006; Casali y col., 2004).

[0135] Este gen tiene una expresión de bajo nivel extendida, incluido el encéfalo en el que se expresa con la máxima intensidad en el cerebelo, la corteza cerebral, el hipocampo, la glándula pineal y los bordes de los ventrículos. Se supone que las paraplejias espásticas proceden de mecanismos de debilitamiento de los exones y el 55 metabolismo mitocondrial o el transporte axonal se han relacionado en varias entidades genéticas de PEH (Crosby y col., 2002). De hecho, tres genes causantes identificados en PEH-AR se han relacionado en el tráfico intracelular defectuoso: mutaciones en la proteína de metaloproteasa mitocondrial paraplejina degrada el transporte axonal en SPG7; las mutaciones en la espartina (SPG20) afectan al tráfico endosómico y en la dinámica de los microtúbulos;

las mutaciones en la maspardina (SPG21) pueden interferir en el transporte de vesículas endosómicas/trans-Golgi. Aunque la función de la espatacsina sigue siendo desconocida, dada su expresión basal en todos los tejidos y su alta conservación en todas las especies, esta proteína podría tener una función crucial que podría explicar la degeneración de los tractos corticospinales que podrían depender de las modificaciones postraduccionales o de la modelización/transporte de otras proteínas que intervienen en el transporte axonal, el metabolismo mitocondrial así 5 como en el desarrollo cerebral. La presencia de al menos un dominio de transmembrana sugiere que la espatacsina puede actuar como receptor de un transportador.

[0136] Todas las mutaciones identificadas hasta ahora en el gen KIAA1840 provocan, o pueden provocar según las predicciones, un truncamiento de la proteína, lo que sugiere que la patogenia procede de la pérdida de 10 función. Están situadas en muchos exones, entre ellos el exón 1 y el exón 39, lo que sugiere que el dominio en el extremo C de la proteína tiene también una función o un efecto importante en la estructura de la proteína. Puede pensarse también que, dada su posición en la secuencia de consenso del sitio de empalme 5’, la mutación de sentido erróneo R815M afectaría también a la transcripción del gen tal como se demuestra para la mutación c.2833A>G, r.2834+1_2834+65ins, p.R945GfsX950. Análogamente, las mutaciones encontradas en la parte 15 intrónica de los sitios de empalme de aceptores en los intrones 4, 12, 13 y 34 (Tabla 2) pueden alterar probablemente el empalme de los exones circundantes y por tanto la síntesis y/o estabilidad del ARNm o la proteína. Sin embargo, hasta ahora no se dispone de tejidos de pacientes para validar esta hipótesis.

[0137] La identificación del gen SPG11 mejorará el procedimiento diagnóstico, así como el tratamiento de los 20 pacientes, y permitirá un asesoramiento genético más preciso. Este hecho tiene un valor incalculable para los pacientes y para sus familias.

Referencias

[0138]

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LISTADO DE SECUENCIAS

[0139]

<110> Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) 15

<120> Diagnóstico de PEH por identificación de una mutación en el gen o la proteína KIAA1840

<130> BET 06P0875

<160> 188

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1 25

<211> 7751

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 1 30

<210> 2

<211> 2443

<212> PRT 5

<213> homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 3

ccacaggaaa cgaatggaat 20

<210> 4 15

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 20

<223> cebador

<400> 4

ggttctgtga ggaaaccacg 20 25

<210> 5

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial 30

<220>

<223> cebador

<400> 5

cagggacatt gtaggccatc 20

<210> 6

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 6

ccagttgtaa aattgtgacc 20

<210> 7

<211> 20

<212> ADN 20

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 7

tcccagctcc caaaactaaa 20

<210> 8 30

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 35

<223> cebador

<400> 8

tcaatcaaca cttctaccac 20 40

<210> 9

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial 45

<220>

<223> cebador

<400> 50

9 caggttcttt cttgtggcat ca 22

<210> 10

<211> 25 55

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 10

cgaggatatt tttaacctct tatca 25 5

<210> 11

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial 10

<220>

<223> cebador

<400> 11 15

gttaggcata cttacaaaac tggc 24

<210> 12

<211> 25 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 25

<400> 12

cgaggatatt tttaacctct tatca 25

<210> 13

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 13

gaacatcttt gccctggttt 20

<210> 14

<211> 20

<212> ADN 45

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 14

ctgtgacagg tgttaagtta 20

<210> 15 55

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 15

caggcactga ggcagaagta 20

<210> 16

<211> 20

<212> ADN 10

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 16

atctaataca agacagtctc 20

<210> 17 20

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 25

<223> cebador

<400> 17

aaaaatcaat tcctaaatca taatcc 26 30

<210> 18

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial 35

<220>

<223> cebador

<400> 18 40

tagtactgaa gtattgagta 20

<210> 19

<211> 24 45

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 50

<400> 19

tcttttaaag ccaaaaaggg taaa 24

<210> 20

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 20 5

ttaagtaatg ttcttgggca 20

<210> 21

<211> 21 10

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 15

<400> 21

cccaggacta atcatgaagga 21

<210> 22

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 22

atccccaaac cgataaaacc 20

<210> 23

<211> 21

<212> ADN 35

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 23

cggtgtgtct tccactagct c 21

<210> 24 45

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 50

<223> cebador

<400> 24

gttacataaa tgtataatcc ctg 23 55

<210> 25

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 25

acccagccat tctcagtgtt 20

<210> 26 10

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 15

<223> cebador

<400> 26

cattttaaga ctttatggat tac 23 20

<210> 27

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial 25

<220>

<223> cebador

<400> 27 30

cacagcgaga tcctgtctca 20

<210> 28

<211> 21 35

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 40

<400> 28

cctcactgta agatgatgcc c 21

<210> 29

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 29

cctttaaata ctacagtggt gcaga 25

<210> 30

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 5

<400> 30

tgtgggcatg atttggtcta 20

<210> 31

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 31

ccaactgttg agatggagaa aa 22

<210> 32

<211> 20

<212> ADN 25

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 32

acctgctcaa ggacaaatgc 20

<210> 33 35

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 40

<223> cebador

<400> 33

tttgaagtat cccagggtgg 20 45

<210> 34

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial 50

<220>

<223> cebador

<400> 34 55

ccaccattcc ccaaagataa 20

<210> 35

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 5

<223> cebador

<400> 35

ttacctggat ttggctttgg 20 10

<210> 36

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial 15

<220>

<223> cebador

<400> 36 20

cctggcttct aaaagtggcc 20

<210> 37

<211> 22 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 30

<400> 37

tgcaatccag aaacttgaga ga 22

<210> 38

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 38

aagcacaaca tccaaatcct t 21

<210> 39

<211> 20

<212> ADN 50

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 39

atgttggcag gaactccatc 20

<210> 40

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 40

ctcctttgga gcaacctctg 20

<210> 41

<211> 20

<212> ADN 15

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 41

ttccaacagg aaagcacaca 20

<210> 42 25

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 30

<223> cebador

<400> 42

caacaggaaa gcacacatgc 20 35

<210> 43

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial 40

<220>

<223> cebador

<400> 43 45

cagctacttg ggaggctgag 20

<210> 44

<211> 20 50

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 55

<400> 44

gtgtggctgt gacctcactc 20

<210> 45

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial 5

<220>

<223> cebador

<400> 45 10

gcattagaag gggcactgaa 20

<210> 46

<211> 20 15

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 20

<400> 46

aacatggctg ggatgtttct 20

<210> 47

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 47

ctcacaacgg tattcacccc 20

<210> 48

<211> 20

<212> ADN 40

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 48

ttcctggttg gcctatgatg 20

<210> 49 50

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 55

<223> cebador

<400> 49

aagggtttaa gataatttgg gga 23

<210> 50

<211> 20

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 50

aatgccaaac acacacctga 20

<210> 51 15

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 20

<223> cebador

<400> 51

ggattcttga tactgctttg cc 22 25

<210> 52

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial 30

<220>

<223> cebador

<400> 52 35

ctcaaagcag aggcaaggag 20

<210> 53

<211> 20 40

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 45

<400> 53

ctgagcccca catttttgtt 20

<210> 54

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 54

caagtgctca atagccccat 20

<210> 55

<211> 25 5

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador 10

<400> 55

gctaactgcc cttaatagag taaaa 25

<210> 56

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 56

aaagggtaca gcgtcagcat 20

<210> 57

<211> 20

<212> ADN 30

<213> Artificial

<220>

<223> cebador

<400> 57

cttgccccag attgcataat 20

<210> 58 40

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 45

<223> cebador

<400> 58

tccaaaaagt acgtaaaatc cca 23 50

<210> 59

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial 55

<220>

<223> cebador

<400> 59

cagcaaaagg gtaatagcag tg 22

<210> 60 5

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 10

<223> cebador

<400> 60

cccaaatgta gtaaatggcg 20 15

<210> 61

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial 20

<220>

<223> cebador

<400> 61 25

tttgaaagag cagaaagcta tgg 23

<210> 62

<211> 21 30

<212> ADN

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<220>

<223> cebador

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<220>

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<220>

<221> misc_feature

<222> (40)..(40)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de ocurrencia natural

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<221> misc_feature

<222> (178)..(178)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de ocurrencia natural

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<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

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<221> misc_feature

<222> (246)..(246) 10

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de ocurrencia natural

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<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

<221> misc_feature

<222> (415)..(415)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de ocurrencia natural 10

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<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

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<222> (412)..(412) 10

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de ocurrencia natural

<400> 153

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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de ocurrencia natural 10

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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de ocurrencia natural

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<222> (953)..(953) 10

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de ocurrencia natural

<400> 158

<210> 159

<211> 1992

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1992)..(1992) 10

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de ocurrencia natural

<400> 159

<210> 160

<211> 2034

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (2034)..(2034) 10

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de ocurrencia natural

<400> 160

<210> 161

<211> 2172

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (2172)..(2172) 5

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de ocurrencia natural

<400> 161

<210> 162

<211> 2260

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (2260)..(2260) 5

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de ocurrencia natural

<400> 162

<210> 163

<211> 2338

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature 10

<222> (2338)..(2338)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de ocurrencia natural

<400> 163

<210> 164

<211> 2349

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

<221> misc_feature

<222> (2349)..(2349)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de ocurrencia natural 10

<400> 164

<210> 165

<211> 2443

<212> PRT 5

<213> homo sapiens

<400> 165

<210> 166

<211> 245

<212> PRT 5

<213> homo sapiens

<400> 166

<210> 167

<211> 427

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 167

<210> 168

<211> 555

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 168

<210> 169

<211> 576

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<400> 169

<210> 170

<211> 559

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 170

<210> 171

<211> 576

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 171

<210> 172

<211> 2443

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<400> 172

<210> 173

<211> 898

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 173

<210> 174

<211> 919

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 174

<210> 175

<211> 1028

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 175

<210> 176

<211> 1263

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 176

<210> 177

<211> 1441

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 177

<210> 178

<211> 1823

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 178

<210> 179

<211> 1856

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 179

<210> 180

<211> 1949

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 180

<210> 181

<211> 1956

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<400> 181

<210> 182

<211> 1999

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 182

<210> 183

<211> 1998

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 183

<210> 184

<211> 2055

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 184

<210> 185

<211> 2030

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 185

<210> 186

<211> 2259

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 186

<210> 187

<211> 2285

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 187

<210> 188

<211> 949

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<400> 188

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento ex vivo de diagnóstico o predicción de una paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva con cuerpo calloso delgado (PEH-AR-CCD), en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la detección de una mutación en el gen o la proteína KIAA1840 (espatacsina), en comparación con una población de 5 control, en el que dicha mutación es indicativa de una paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva con cuerpo calloso delgado (PEH-AR-CCD).
2. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende la etapa que consiste en la detección de una mutación de KIAA1840 en una muestra de ácidos nucleicos obtenida a partir del sujeto, en comparación con 10 una población de control, en el que la presencia de una mutación es indicativa de una paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva con cuerpo calloso delgado (PEH-AR-CCD).
3. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha mutación de KIAA1840 se selecciona entre el grupo que consiste en: 15

-

las sustituciones: c.6100C>T, c.2198T>G, c.118C>T, c.1235C>G, c.2833A>G, c.1951 C>T, c.5974C>T,

-

las deleciones: c.529-533delATATT, c.6451delG, c.6832_6833delAG, c.1203delA, c.1549_1550delCT, c.6737_6740delTTGA, c.733_734delAT, y 20

-

las inserciones: c.7029_7030insT, c.2850_2851insT, c.2842_2843insG;

en el que cada mutación está numerada según la CDS de la KIAA1840 humana tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1. 25
4. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende la etapa que consiste en la detección de una mutación en la proteína KIAA1840 o en la detección de una forma truncada de la proteína KIAA1840 contenida en una muestra obtenida a partir del sujeto, en comparación con una población de control, en el que la presencia de una mutación en la proteína KIAA1840 o de una forma truncada de la proteína KIAA1840 es indicativa de una 30 paraplejia espástica hereditaria autosómica recesiva con cuerpo calloso delgado (PEH-AR-CCD).
5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que se usa un anticuerpo monoclonal o policlonal que reconoce la proteína KIAA1840 de tipo natural para detectar la presencia de la proteína de tipo natural o una de sus formas truncadas. 35
6. El procedimiento según la reivindicación 4 ó 5, en el que la proteína KIAA1840 truncada se selecciona entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 149 a SEQ ID NO: 164.
7. Un ácido nucleico aislado que puede hibridarse específicamente en una región de la secuencia del 40 gen KIAA1840 que contiene una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en

-

las sustituciones: c.6100C>T, c.2198T>G, c.118C>T, c.1235C>G, c.2833A>G, c.1951C>T, c.5974C>T,

-

las deleciones: c.529-533delATATT, c.6451delG, c.6832_6833delAG, c.1203delA, c.1549_1550delCT, 45 c.6737_6740delTTGA, c.733_734delAT, y

-

las inserciones: c.7029_7030insT, c.2850_2851insT, c.2842_2843insG;

en el que dicho ácido nucleico es complementario de una región de la secuencia del gen KIAA1840 que contiene 50 una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en:

-

las sustituciones: c.6100C>T, c.2198T>G, c.118C>T, c.1235C>G, c.2833A>G, c.1951C>T, c.5974C>T,

-

las deleciones: c.529-533delATATT, c.6451delG, c.6832_6833delAG, c.1203delA, c.1549_1550delCT, 55 c.6737_6740delTTGA, c.733_734delAT, y

-

las inserciones: c.7029_7030insT, c.2850_2851insT, c.2842_2843insG;

en el que cada mutación está numerada según la CDS de la KIAA1840 humana tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1.
8. El ácido nucleico aislado según la reivindicación 7 en el que dicho ácido nucleico puede hibridarse específicamente en una región que consiste en 10 nucleótidos en la dirección 5’ y 10 nucleótidos en la dirección 3’ 5 de la mutación seleccionada.
9. El ácido nucleico aislado según la reivindicación 7 u 8, que consiste en al menos 20 nucleótidos.
10. El uso de un ácido nucleico aislado según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 como un cebador o 10 una sonda.
11. Un ácido nucleico aislado, que comprende o consiste en una secuencia del gen KIAA1840 que contiene una o varias mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en

-

las sustituciones: c.6100C>T, c.2198T>G, c.118C>T, c.1235C>G, c.2833A>G, c.1951C>T, c.5974C>T,

-

las deleciones: c.529-533delATATT, c.6451delG, c.6832_6833delAG, c.1203delA, c.1549_1550delCT, c.6737_6740delTTGA, c.733_734delAT, y

-

las inserciones: c.7029_7030insT, c.2850_2851insT, c.2842_2843insG o una secuencia complementaria de las

mismas;

en el que cada mutación está numerada según la CDS de la KIAA1840 humana tal como se muestra en la SEQ ID NO: 1; y 25

en el que dicho ácido nucleico consiste en al menos 10 nucleótidos.
12. Un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos de KIAA1840 que contiene una o varias mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en p.Q40X, p.1177_F178delfsX178, p.M245VfsX246, 30 p.K401KfsX415, p.S412X, p.L517LfsX556, p.R651X, p.L733X, p.R945G, p.L950FfsX953, p.V948GfsX953, p.R1992X, p.R2034X, p.A2151PfsX2172, p.I2246_E2247delfsX2260, p.S2278LfsX2338 y p.V2344CfsX2349;

en el que cada mutación está numerada según la secuencia de aminoácidos de la KIAA1840 humana tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2.
13. Un anticuerpo monoclonal o policlonal aislado que reconoce específicamente una proteína KIAA1840 que contiene una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en p.Q40X, p.I177_F178delfsX178, p.M245VfsX246, p.K401KfsX415, p.S412X, p.L517LfsX556, p.R651X, p.L733X, p.R945G, p.L950FfsX953, p.V948GfsX953, p.R1992X, p.R2034X, p.A2151PfsX2172, p.I2246_E2247delfsX2260, p.S2278LfsX2338 y p.V2344CfsX2349; 40

en el que cada mutación está numerada según la secuencia de aminoácidos de KIAA1840 humana tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2,

en el que dicho anticuerpo no realiza reacción cruzada con la proteína KIAA1840 de tipo natural. 45