JP5653673B2 - 皮膚血管機能評価法 - Google Patents
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Description
[1]皮膚血管機能を評価する方法であって、次の(1)〜(3)のステップを含む方法。
(1)個体から皮膚の試料を得るステップ
(2)皮膚の試料からミトコンドリア電子伝達系遺伝子及び/又は血管成長因子遺伝子に対応するmRNA量を定量化するステップ
(3)ステップ(2)で算出したmRNA量を用いて皮膚血管機能を評価するステップ
[2]ミトコンドリア電子伝達系遺伝子がSLC25A5、ATP5F1、ATP5H及びNDUFS3から選択される1種又は2種以上の遺伝子であることを特徴とする[1]記載の皮膚血管機能評価法。
[3]血管成長因子遺伝子がVEGFAであることを特徴とする[1]記載の皮膚血管機能評価法。
[4]VEGFAが、VEGFA121、VEGFA165及びVEGFA189から選択される1種又は2種以上のアイソフォームに対するmRNA量を対象とすることを特徴とする[3]記載の皮膚血管機能評価法。
[5]mRNA量の定量化がポリメラーゼ連鎖反応法(PCR法)によって行われる、[1]〜[4]いずれか一項記載の皮膚血管機能評価法。
[6]皮膚の試料が被験対象の皮膚より採取した角質である、[1]〜[5]いずれか一項記載の皮膚血管機能評価法。
(1)被験対象の皮膚より採取した角質を用意するステップ、
(2)前記角質から抽出したRNAを試料としてmRNAの定量化を行い、ミトコンドリア電子伝達系遺伝子及び/又は血管成長因子遺伝子に対するmRNA量を算出するステップ、
及び
(3)ステップ(2)で算出したmRNA量を用いて、皮膚血管機能を評価するステップである。
(a)顆粒層や有棘層等を傷つけないように、最外層である角質層の一部を剥離する。例えば、粘着性のテープを皮膚へ付着させた後に剥がし(必要に応じて、数回繰り返す)、角質を採取する。
(b)採取した角質を、SLS、β−メルカプトエタノール、グアニジンイソチオシアネート等を含む溶解性緩衝液に浸した後、蛋白質分解酵素を加え反応させる。
(c)反応終了後、例えば、超音波破砕機等の物理的な力によって角質を破砕する。
(d)角質破砕物を含む溶液から、周知の核酸抽出法に準じた方法や市販されたキットを用いた方法により、RNAを抽出する。例えば、グアニジンイソチオシアネート、フェノール又はクロロホルムを用いたRNA抽出法や、ニッポンジーン社のISOGEN、インビトロジェン社のTrizol Reagent、あるいはQIAGEN社のRNeasy KitやAmbion社のRNAqueous−4PCR Kit等を用いる方法によってRNAを抽出する。
(e)必要に応じて、DNA分解酵素を反応させDNAを除去する。
(f)必要に応じて、エタノール沈殿等の核酸濃縮法を用いてRNAを濃縮する。
(a)抽出したRNAを鋳型に、逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。
(b)cDNAを鋳型に、ターゲットとなる遺伝子に対応するプライマーを用いてPCR反応を行い、当該遺伝子に対応するDNA断片を得る。
(c)内部標準となるような遺伝子(β−アクチン、GAPDH、ケラチン6B、CTSL2等)の反応も並行して行う。
(d)得られたDNA断片の電気泳動を行った後、エチジウムブロマイド等で染色してバンドの強度を測定し、その遺伝子のmRNA量とする。
(e)必要に応じて、SYBR green等の蛍光色素やTaqman probe等の蛍光プローブを用いて定量PCR反応を行い、mRNAを定量する。
(f)内部標準となる遺伝子のmRNA量に対する、当該遺伝子のmRNA量の比率を算出する。
(例1)皮膚血管機能(低い):比率<a、(中程度):a≦比率<b、(高い):b≦比率
健常男性14名(平均年齢35.1歳)を対象とし、洗顔料を用いて洗顔後、室温25℃、湿度50%に設定した人工気象室にて20分間安静状態を維持した。その後、レーザードップラー血流計moor LDI(MONTE社)を用いた顔面部の皮膚血流量測定を行った。さらに、直径1cm、円形のBlendermテープ(3M)を顔面部の皮膚血流量を測定した部位の近傍に貼付しテープが十分に接着していることを確認した後、テープを剥がし取り角質を得た。一人の被験対象者より、同一箇所に4枚の粘着テープを繰り返し貼付して角質を採取した。
実験例1にて得られた角質に含まれるRNAを、RNA抽出キット(Ambion社、RNAqueous−4PCR Kit)を用いて抽出した。すなわち、角質の付着したテープ4枚を、テープごとLysis/Binding Solutionに入れ、proteinase K(Invitrogen社)を添加し、56℃でインキュベートした。その後、超音波破砕機を用いて分散させた後、64%エタノールを加えて攪拌してテープを取り除き、角質抽出液を得た。付属のFilter CartridgeにRNAを吸着させた後、溶出液でRNAを溶出した。得られた溶出液にDNaseIを加え、残存しているDNAを完全に除去した後、エタノールを用いてRNAを沈殿させて濃縮した。得られたRNAのペレットを必要量の水に溶解し、角質に含まれるRNAを得た。
皮膚角質より、実験例2の方法で得たRNAを、SuperScript III One−Step RT−PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase(Invitrogen社)を用いたRT−PCR反応に供し、ミトコンドリア電子伝達系遺伝子の中からSLC25A5、ATP5F1、ATP5H及びNDUFS3のmRNAに対するcDNAを合成した。RT−PCR反応後、リアルタイムPCR反応により、合成したcDNA量を測定し、これを各遺伝子に対するmRNA量とした。また、同時に、内部標準として、CTSL2に対するmRNA量について、同様の方法にて解析し、各遺伝子の数値をCTSL2の数値にて除したものを、相対mRNA量とした。尚、CTSL2、SLC25A5、ATP5F1、ATP5H及びNDUFS3のmRNAに対するRT−PCR反応に使用したプライマーは、次の通りである。
TCGCGTCCTCAAGGCAATCAGGGCT(配列番号1)
TGGGGTAGCTGGCTGCTGTGGCG(配列番号2)
SLC25A5用のプライマーセット
ACCAAGGCTTTAACGTGTCTGT(配列番号3)
TTATTGCTTCCCATTTTCAACC(配列番号4)
ATP5F1用のプライマーセット
TGAATACGGAGGAAAAGTTCGT(配列番号5)
GTGCTTCTCCACCCAATTTATC(配列番号6)
ATP5H用のプライマーセット
CCGTGGGCAGCCAGGGTCGGTG(配列番号7)
AGGGCCAGAGCTTCCTCCTGGACTCA(配列番号8)
NDUFS3用のプライマーセット
CACCAATGCACAGTTCAAATCT(配列番号9)
CAATCATAGATAAGGCGCTGTC(配列番号10)
CTSL2用のプライマーセット
CGGCTTTGAAGGAGCAAATTC(配列番号11)
GGACCCCAGCTGTTTTTGAC(配列番号12)
SLC25A5用のプライマーセット
GCAAAGGAACTGACATCATGTACAC(配列番号13)
AAAAGCTTTGCCTCCTTCATCA(配列番号14)
ATP5F1用のプライマーセット
AGAAGTCACAACAGGCACTGGTT(配列番号15)
CAATGTTATTCCTTTGCACATCAAA(配列番号16)
ATP5H用のプライマーセット
CTTGTGCTGAGTGGGTGTCTCT(配列番号17)
TCATCTTCTCCATCTCTTTCTCATATTC(配列番号18)
NDUFS3用のプライマーセット
CCGTGTGAAGACCTACACAGATG(配列番号19)
GTTGGCTGCCTTGAACACAGA(配列番号20)
皮膚角質より、実験例2の方法でRNAを得た。各RNAをSuperScript III One−Step RT−PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen社)を用いたRT−PCR反応に供し、VEGFAに対するmRNA量を測定した。本法にてRT−PCR反応を行うと、VEGFA121、VEGFA165、VEGFA189のそれぞれに対応する3種のPCR産物を検出することができる。RT−PCR反応後、アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色にて検出した。同時に、内部標準として、CTSL2の発現について、同様の方法にて解析した。デンシトメータにて、各バンド強度を測定し、3種それぞれのVEGFAの数値をCTSL2の数値にて除したものを、各VEGFAに対するmRNA量として解析に用いた。尚、VEGFA及びCTSL2に対するmRNA量の測定に使用したプライマーは、次の通りである。
TGCGATGCGGGGGCTGCTGCAA(配列番号21)
CCCGCCCGGGAATGCTTCCGCC(配列番号22)
CTSL2用のプライマーセット
TCGCGTCCTCAAGGCAATCAGGGCT(配列番号1)
TGGGGTAGCTGGCTGCTGTGGCG(配列番号2)
健常女性12名(平均年齢43.9歳)を対象として、1日2回、1ヶ月間、顔面の自己マッサージを実施させた。マッサージ実施前及び実施1ヶ月後の2回、洗顔料を用いて洗顔後、気温25℃、湿度50%に設定した人工気象室にて20分間安静状態を維持した。その後、レーザードップラー血流計を用いた顔面部の皮膚血流量測定を行った。さらに、2cm×2cmの正方形のBlendermテープを、顔面部に貼付して剥がし取る方法により、角質を得た。一人の被験対象者より、同一箇所に2枚の粘着テープを繰り返し貼付して角質を採取した。
Claims (3)
- 皮膚血管流を評価する方法であって、次の(1)及び(2)のステップを含む方法。
(1)個体から得られた皮膚の試料からSLC25A5及び/又はVEGFA165に対応するmRNA量を定量化するステップ
(2)ステップ(1)で算出したmRNA量を用いて皮膚血管流を評価するステップ - 前記mRNA量の定量化がポリメラーゼ連鎖反応法(PCR法)によって行われる、請求項1記載の皮膚血管流評価法。
- 前記皮膚の試料が被験対象の皮膚より採取した角質である、請求項1又は2記載の皮膚血管流評価法。
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