JP5653684B2 - 皮膚損傷の程度を検査する方法 - Google Patents
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Description
[1]皮膚のstratifinタンパクをコードする遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、皮膚損傷の程度を検査する方法。
[2]前記皮膚損傷が紫外線曝露による皮膚損傷である、[1]に記載の方法。
[3]皮膚のstratifinタンパクをコードする遺伝子の発現量を基に、紫外線曝露による皮膚損傷の程度を検査する方法であって、
(1)被験対象から皮膚のサンプルを得る工程、
(2)該サンプルのstratifinタンパクをコードする遺伝子の発現を定量化する工程、
(3)工程(2)にて測定した遺伝子発現量を用いて、紫外線曝露による皮膚損傷の程度を検査する工程
を含む方法。
[4]前記遺伝子発現の定量化がポリメラーゼ連鎖反応法により行われる、[3]に記載の皮膚検査方法。
[5]前記皮膚サンプルが被験対象の皮膚から採取した角質である、[3]〜[4]のいずれかに記載の皮膚検査方法。
(1)被験対象の皮膚(非露光部位及び露光部位)から採取した角質を用意するステップ
(2)前記角質から抽出したmRNAを試料として遺伝子発現の定量化を行い、stratifinタンパクをコードする遺伝子の発現量を算出するステップ
(3)ステップ(2)にて算出した発現量を用いて、紫外線曝露による皮膚損傷の程度を検査するステップ
(a)顆粒層や有棘層等を傷つけないように、最外層である角質層の一部を剥離する。例えば、粘着性のテープを皮膚へ付着させた後に剥がし(必要に応じて、数回繰り返す)、角質を採取する。
(b)採取した角質を、SLS、β−メルカプトエタノール、グアニジンイソチオシアネート等を含む溶解性緩衝液に浸した後、タンパク質分解酵素を加え、反応させる。
(c)反応終了後、例えば、超音波破砕機等の物理的な力により、角質を破砕する。
(d)角質破砕物を含む溶液から、周知の核酸抽出法に準じた方法や市販されたキットを用いた方法により、RNAを抽出する。例えば、グアニジンイソチオシアネート、フェノール又はクロロホルムを用いたRNA抽出法、ニッポンジーン社のISOGEN、Invitrogen社のTrizol Reagent、或いは、QIAGEN社のRNeasy Kit、Ambion社のRNAqueous−4PCR Kit等を用いる方法によりRNAを抽出する。
(e)必要に応じて、DNA分解酵素を反応させ、DNAを除去する。
(f)必要に応じて、エタノール沈殿等の核酸濃縮法を用い、RNAを濃縮する。
(a)抽出したRNAを鋳型に、逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。
(b)cDNAを鋳型に、ターゲットとなる遺伝子に対応するプライマーを用いてPCR反応を行い、目的の遺伝子に対応するDNA断片を得る。
(c)内部標準となるような遺伝子(β−アクチン、GAPDH、ケラチン6B等)の反応も並行して行う。
(d)得られたDNA断片の電気泳動を行った後、エチジウムブロマイド等にて染色してバンドの強度を測定し、その遺伝子の発現量とする。
(e)必要に応じて、SYBR green等の蛍光色素やTaqman probe等の蛍光プローブを用いて定量PCR反応を行い、発現量を定量する。
(f)内部標準となる遺伝子の発現量に対する、目的の遺伝子の発現量の比率を算出する。
(例)皮膚損傷の程度(低い):比率<a、(中程度):a≦比率<b、(高い):b≦比率
培養細胞を用いて、紫外線曝露によるstratifinタンパクをコードする遺伝子発現の定量化を行った。すなわち、6cmシャーレにヒトケラチノサイトを播種し、37℃、5%CO2条件下にて培養した。コンフルエントな状態になったところで、30mJ/cm2のUVBを曝露し、更に6時間培養した。その後、細胞よりTrizol Reagent(Invitrogen社)を用いて総RNAの抽出を行い、細胞から抽出した総RNAを基に、RT−PCR法によりstratifin mRNA発現量の測定を行った。同時に、内部標準として、GAPDH mRNA発現量の測定を行った。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。
AGATGCCGCCCACCAA(配列番号1)
ATCTCGTAGTGGAAGACGGAAAAG(配列番号2)
GAPDH用のプライマーセット
TGAACGGGAAGCTCACTGG(配列番号3)
TCCACCACCCTGTTGCTGTA(配列番号4)
培養細胞を用いて、紫外線曝露によるstratifinタンパクの定量化を行った。すなわち、6cmシャーレにヒトケラチノサイトを播種し、37℃、5%CO2条件下にて培養した。コンフルエントな状態になったところで、30mJ/cm2のUVBを曝露し、更に24時間培養した。その後、細胞よりISOGEN(ニッポンジーン社)を用いて総タンパクの抽出を行った。stratifinタンパク量の測定は、細胞から抽出した総タンパクを基にしてウエスタンブロット法により行った。すなわち、2mg/mlの総タンパクをSDS−PAGE後、トランスファーメンブレンであるImmobilon−P(Millipore社)にブロッティングした。次に、anti−stratifin抗体(Anti−14−3−3σ、clone CS112−2A8、Millipore社)と室温にて1時間反応させた後、Peroxidase−conjugated AffiniPlus F(ab’)2 Fragment Goat Anti−Mouse IgG (H+L)(Jackson ImmunoResearch LABORATORIES社)と室温にて1時間反応させた。その後、ECL Western Blotting Detection Reagents(Amersham社)と室温にて反応させ、発光パターンを撮影した。撮影後、30kD付近に現れたバンドを定量化した。
1.角質に含まれるRNAの抽出
男性被験者29名(26〜59歳)の非露光部位である上腕内側、及び、露光部位である顔面の皮膚に、半径1cmの円状のテープ(3M、Blenderm社)を1枚貼付し、十分に接着していることを確認した後、テープを剥がし取り、角質を含むテープを得た。この操作を4回繰り返し、同一部位から4枚のテープストリップサンプルを得た。得られた角質に含まれるRNAを、RNA抽出キット(RNAqueous−4PCR Kit、Ambion社)を用いて抽出した。すなわち、角質の付着したテープ4枚を、テープごとLysis/Binding Solutionに入れ、proteinase K(Invitrogen社)を添加し、56℃にてインキュベートした。その後、超音波破砕機を用いて分散させた後、64%エタノールを加えて攪拌してテープを取り除き、角質抽出液を得た。付属のFilter CartridgeにRNAを吸着させた後、溶出液にてRNAを溶出した。得られた溶出液にDNaseIを加え、残存しているDNAを完全に除去した後、エタノールを用いてRNAを沈殿させてRNAを濃縮した。得られたRNAのペレットを必要量の水に溶解し、角質に含まれる残存RNAを得た。
上腕内側及び顔面の皮膚の角質より、上記実験例3の1.の方法にて残存RNAを得た。各RNAをRT−PCRキット(SuperScript III Platinum SYBR Green Two−step qRT−PCR kit、Invitrogen社)を用いたRT−PCR反応に供し、stratifin mRNAの発現量を定量した。stratifin mRNAの発現量は、β−アクチン mRNAの発現量にて規格化(ノーマライズ)した。尚、stratifin mRNA発現の測定に使用したプライマーは、上記実験例1と同様のものである。β−アクチン mRNAのプライマーは、次の通りである。
AGCGCGGCTACAGCTTCA(配列番号5)
CTTAATGTCACGCACGATTTCC(配列番号6)
上腕内側のΔΔCt=(上腕内側のstratifin mRNAのCt値―上腕内側のβ−アクチン mRNAのCt値)―(基準となるstratifin mRNAのCt値―基準となるβ−アクチン mRNAのCt値)
顔面のΔΔCt=(顔面のstratifin mRNAのCt値―顔面のβ−アクチン mRNAのCt値)―(基準となるstratifin mRNAのCt値―基準となるβ−アクチン mRNAのCt値)
遺伝子発現比率=2−ΔΔCt
上記実験例3の1.及び2.と同じ男性被験者のうち、顔面/上腕内側のstratifin mRNAの発現比率が高い8名及び低い8名に、紫外線に対する防御への意識アンケートを行った。すなわち、「屋外で行動する時、日焼け止め化粧品を塗るか?」の質問に対しては、「必ず塗る」、「時々塗る」、「ほとんど塗らない」の3つの解答を選択させた。又、「日焼け止め化粧品をこまめに塗り直すか?」の質問に対しては、「こまめに塗り直す」、「ほとんど塗り直さない」の2つの解答を選択させた。
Claims (2)
- 皮膚のstratifinタンパクをコードする遺伝子の発現量を基に、紫外線曝露による皮膚損傷の程度を検査する方法であって、
(1)被験対象から得られた角質のサンプルのstratifinタンパクをコードする遺伝子の発現を定量化する工程、
(2)工程(1)にて測定した遺伝子発現量を用いて、慢性的な紫外線曝露による皮膚損傷の程度の検査を補助する工程
を含む方法。 - 慢性的な紫外線曝露による皮膚損傷が日焼け、色素沈着、シワ・タルミ、良性腫瘍、前がん症(日光角化症、悪性黒子)、皮膚がんから選ばれる皮膚損傷である、請求項1記載の方法。
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